14bp基因

14bp基因（精选4篇）

14bp基因 篇1

原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)是临床常见病理妊娠之一。随着分子生物学的发展,人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)G基因及其表达在内的多种相关免疫因素在URSA病理机制中的作用倍受关注。为了解HLA-G 14bp基因多态性与HLA-G mRNA表达水平与原因不明复发性流产的关系,作者对此进行了研究,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象

选择2006年1月至2008年12月在我院就诊的非自愿终止妊娠者39例为URSA组,平均年龄28.3±4.3岁,平均孕龄8.16±2.06周。入选标准:连续2次或2次以上自然流产;经过B超检查确认胚胎已停止发育;过去无死胎、死产、活产史;无内科疾病及传染病史;未曾服用过对胎儿有影响的药物;并经过常规妇科检查、B超检查、必要时输卵管碘油造影检查,排除了生殖器官严重畸形。另选择行人工流产终止妊娠的妇女52例为正常对照组,平均年龄30.3±5.3岁,平均孕龄7.25±1.34周。均为有1次以上正常分娩史,无自然流产、死胎史,其他条件与URSA组相同。

1.2 标本采集与保存

1.2.1 静脉血采集

在人工流产终止妊娠或行清宫术前静脉采血1～2 ml,EDTA抗凝。采用经典酚:氯仿抽提法从EDTA抗凝静脉全血中提取基因组DNA。核酸蛋白检测仪分析DNA纯度和浓度,DNA样本OD260/OD280在1.6～1.8为合格,样本浓度稀释为50 ng/μl ,-20℃保存备用。

1.2.2 绒毛的采集和检测

收集正常对照组行人工流产终止妊娠的绒毛组织及URSA组清宫的绒毛组织,立即放入Trizol液中,即刻提取RNA。核酸蛋白检测仪分析RNA纯度和浓度,RNA样本OD260/OD280在1.8～2.0,琼脂糖凝胶电泳有三条特征性区带为合格样本。Trizol试剂提取总RNA按试剂盒说明书进行,取合格RNA 5 μl(1 μg/μl)逆转录为cDNA,-20℃保存备用。实验中所用耗材均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理和高温消毒。

1.3 主要仪器设备

高速台式冷冻离心机TGL-16GA(Heraeus产品), Light Cycler 1.0扩增仪(Roche产品), PCR扩增仪BIO-RAD MycyclerTM,凝胶成像系统(BIO-RAD产品),垂直电泳槽(BIO-RAD产品),核酸蛋白检测仪(Eppendorf产品),组织匀浆器。

1.4 主要试剂

10×Taq Buffer with (NH4)2SO4,25 mmol MgCl2,10 mmol dNTP,Taq聚合酶,DNA分子量Marker为PUC19 DNA/MspI Marker 23,Trizol试剂盒,cDNA试剂盒,热启动酶,均为美国Fermentas公司产品。丙烯酰胺,N,N′-亚甲双丙烯酰胺,N,N,N′,N′-四甲基乙二胺,过硫酸铵,均为BBI公司产品。

1.5 14bp基因多态性检测

引物参照文献[1]由上海生物工程公司合成。引物序列为 P1:5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGGTGCACC-3′;P2:5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′。PCR反应总体积为25 μl,含10×Taq Buffer with (NH4)2SO4 5 μl, 25 mmol MgCl2 5 μl, 10 mmol dNTP 1 μl,引物各20 pmol,Taq DNA polymerase 1U, 50 ng/μl DNA 1 μl,蒸馏水11 μl。扩增条件为94℃预变性5分钟,94℃ 30秒,64℃ 1分钟, 72℃ 2分钟共30个循环,最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物经7%聚丙烯酰胺凝胶电泳(150 V, 30分钟),EB染色30分钟,在凝胶成像仪下观察,拍照。

结果判读:以Marker为分子量标准判读结果。若扩增产物为一条带,长度210bp,该个体为14bp缺失纯合子﹙-14bp/-14bp﹚;若扩增产物为一条带,长度为224bp,该个体为插入纯合子(+14bp/+14bp);若扩增产物为两条带,长度分别为210bp和224bp,该个体为缺失/插入杂合子(-14bp/+14bp)。选缺失纯合子和插入纯合子各一条带,切胶、纯化,送上海生物工程公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因序列数据库(Gen Bank Blast)中与LHA-G基因序列比对。

1.6 HLA-G mRNA水平检测

β-肌动蛋白和HLA-G引物和探针参照文献[2]由达安基因工程公司合成。HLA-G引物序列为P1:5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGGTGCACC-3′;P2:5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′。荧光探针:5′-FAM-TCACTGGAGCTGCGGTCGCTTAMTA-3′。RNA逆转录为cDNA过程按试剂盒说明书进行。RT-PCR反应总体积为25 μl:PCR混合液20 μl、热启动酶1U、上、下引物各1 μl(20 pmol)、荧光探针1 μl(10 pmol)、 cDNA 2 μl。扩增条件为93℃预变性2分钟后93℃ 5秒,57℃ 45秒进行40个循环。用β-肌动蛋白作为基因相对表达分析的内标,以相同条件同时扩增和结果分析,相对表达量用比较Ct法(2-△△Ct法)进行计算,其结果取对数值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件包,基因型采用χ2检验;相对表达量采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 两组HLA-G

14bp基因多态性比较 URSA组杂合子(-14bp/+14bp)的基因频率较高(64.1%),与正常对照组(42.3%)比较,差异有统计学意义(χ2=6.511,P=0.039);插入纯合子(+14bp/+14bp)与正常对照组比较,差异有统计学意义(χ2=5.425,P=0.020);但缺失纯合子(-14bp/-14bp) 与正常对照组比较,差异无统计学意义(χ2=0.070, P=0.791),两组基因多态性频率和等位基因比较见表1。扩增产物电泳结果见图1。

(Marker;1、2、5为缺失杂合子;3、6为缺失纯合子;4为插入纯合子)

2.2 两组HLA-G mRNA的表达水平

由于抽提RNA未达到合格要求,因此正常对照组和URSA组分别有28例和30例为合格样本。结果显示正常对照组绒毛组织中HLA-G mRNA表达水平明显高于URSA组,差异有高度统计学意义(t=9.681,P=0.000)。见表2。

①HLA-G mRNA的相对表达量为取对数后的平均值

2.3 14bp基因多态性在两组的HLA-G mRNA表达水平 见表3。

由表3可见,单因素方差分析,3种不同基因型即缺失型、插入型及杂合子型在对照组组内之间mRNA表达水平的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在URSA组中,可以观察到杂合子型mRNA表达水平低于缺失型,缺失型低于插入型,但3者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

1993年Harrison等首次报道,在HLA-G 3′UTR 外显子83742位点存在14bp缺失多态性。之后国内外相继报道了不同人群或人种14bp缺失多态性与妊娠的相关性。Tripathi等[3]研究发现,在复发性流产患者中14bp杂合子(+14bp/-14bp)数量增加。Abbas 等[4]对120例3次流产患者和120例正常对照组研究发现, 患者组-14bp/+14bp杂合子数目显著增多,认为HLA-G基因多态性与妊娠反复流产有相关性。薛松果等[5]通过对上海地区24例URSA患者进行研究,发现患者组-14bp/+14bp杂合子比例显著升高,认为中国人群14bp缺失多态性在维持正常的妊娠中可能有重要作用。就14bp基因多态性而言,本组研究结果与上述研究结果一致,在URSA组中-14bp/+14bp杂合子数量显著增多(P<0.05)。因此认为,在不同国家、不同地区人群中,14bp基因多态性与URSA的发生有关。但妊娠妇女携带-14bp/+14bp杂合子时并不一定导致流产发生,也许只是与发病存在关联。

大量的研究结果表明,HLA-G主要表达在人类早期胎盘绒毛外细胞滋养层上,是引起免疫耐受的一种重要分子,在妊娠免疫耐受建立中起重要作用。HLA-G在体内仅以细胞表面的跨膜型蛋白质(membrane bound HLA-G,mHLA-G)和细胞内的胞质可溶性蛋白质(soluble HLA-G,sHLA-G)存在。并且HLA-G在滋养层细胞的正常表达是妊娠成功的必要条件,表达异常可能与复发性流产有关。Rabreau等[6]研究结果认为,正常妊娠绒毛组织HLA-G的表达随妊娠细胞成熟程度而逐渐增加。张天娇等[7]研究认为,妊娠早期孕妇血中sHLA-G水平与妊娠成功有直接关系,sHLA-G水平降低可能会导致URSA的发生。彭冰等[8]报道,习惯性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)患者组的HLA-G mRNA表达强度明显低于正常对照组,认为母胎界面的滋养细胞表面HLA-G mRNA表达水平的下降与RSA的发生密切相关。本研究结果和上述研究结果一致,在URSA患者早期绒毛中HLA-G mRNA表达水平很低,进一步表明HLA-G mRNA的低水平表达与URSA密切相关。提示HLA-G mRNA在绒毛细胞滋养层中的低水平表达,是导致流产发生的病因之一。那么是否可以针对URSA患者再次妊娠时,在孕早期监测孕妇血中s HLA-G的水平预测是否发生流产,我们认为这是一个值得进一步深入研究的问题。

另外,通过单因素方差分析,3种不同基因型(缺失型、插入型及杂合子型)在组内之间的m RNA表达水平差异无统计学意义,但在URSA组中,可以观察到-14bp/+14bp杂合子型HLA-G m RNA表达水平低于缺失型,缺失型低于插入型,即HLA-G m RNA表达水平自杂合子型到缺失型再到插入型间有逐渐增高的趋势,是否提示14bp的多态性可能会影响到HLA-G m RNA和蛋白水平的表达,也可能是14bp的多态性影响到HLA-G基因在m RNA水平的剪接模式,进而导致HLA-G表达水平的差异,从而产生一系列影响。这是不是URSA患者14bp基因多态性为-14bp/+14bp杂合子时更容易发生流产的原因,还需要进行大样本量的进一步深入研究。

参考文献

[1]Hviid TV,Hylenius S,Hoengh AM,et al.HLA-G polymorphisms in couples with recurrent spontaneous abortions[J].Tissue Antigens,2002,60(2):122-132.

[2]陈春玲,廖秦平.小分子干扰RNA对绒毛膜癌细胞人类白细胞抗原G基因表达的影响[J].中华妇产科杂志,2005,40(8):549-552.

[3]Tripathi P,Abbas A,Naik S,et a1.Role of 14-bp deletion in the HLA-G gene in the maintenance of prestmcy[J].Tissue Antigens,2004,64(6):706-710.

[4]Abbas A,Tripathi P,Naik S,et al.Analysis of human leukocyte antigen(HLA)G polymorphism in normal women and in women with recurrent spontaneous abortious[J].Eur J Immunogenet,2004,31(6):275-278.

[5]薛松果,杨珏琴,姚芳娟,等.正常妊娠和原因不明习惯性流产者HLA-G基因14bp缺失多态性研究[J].现代免疫学,2006,26(4):318-321.

[6]Rabreau M,Rouas-Freiss N,Landi M,et al.HLA-G expression in trophoblast cells is independent of embryonic development[J].Hum Immunol,2000,61(11):1108-1112.

[7]张天骄,刘雨生,童先宏,等.早期妊娠中血清sHLA-G水平与妊娠结局的关系[J].临床输血与检验,2008,10(2):148-150.

[8]彭冰,张力,刑爱耘,等.人类白细胞抗原G和在人早孕胎盘组织中的表达及其与反复自然流产的关系[J].四川大学学报(医学版),2008,39(6):976-979.

一个长度为393bp的基因克隆 篇2

1.1 芦荟概述

芦荟属于百合科的一种草本植物, 主要分布于非洲地带, 它是多年生百合科肉质草本植物。其含有较为丰富的维生素、蛋白质、氨基酸、多糖、活性酶以及对人身体非常有益的大量微量元素。它的主要成分是芦荟蒽醌等, 因芦荟含有多种生物活性物质, 在中国民间就被当作美容、护理头发和治疗皮肤疾病的天然药物, 芦荟叶成簇状生长, 呈座状或生于茎顶, 叶常披针形或叶短又宽, 边缘有尖齿状刺。花序呈现伞形、总状、穗状、圆锥形等, 色呈红、黄或具血色斑点, 花瓣六片、雌蕊六枚。花被基部多连合成筒状。根据近年来专家对芦荟的生物学功效的研究结果, 其主要功效包括:治愈炎症;提高免疫力;增强胃肠功能, 治疗胃溃疡;治疗糖尿病;杭癌活性;杭微生物特性以及治疗皮肤被辐射受伤, 调节激素平衡等。此外还报道了芦荟对患者可能存在一定的过敏性反应[1]。

1.2 芦荟分子生物学研究进展

芦荟在医学治疗、保健、美容、食用、观赏等方面有一定的功效, 近几年来对芦荟外用品的开发研究, 倍受喜欢, 应用范围日趋扩大, 成为全世界关注的药食多用植物[2]。人们对芦荟有关活性物质成分的功能机制和结构鉴定的研究将不断深入, 芦荟的有效成分、生物活性物质成分、药用价值将不断被发现和利用。因而芦荟在临床方面的应用及其保健功能性食品的研制将取得许多新进展.芦荟产业的开发和进一步的研究, 对拓展绿色产品市场、发展生态经济、提高广大人民的身体健康和生活质量具有极其重要的意义。

2 材料与方法

2.1 实验材料

从芦荟全长c DNA质粒文库中随机遴选的一个克隆。

2.2 实验方法

2.2.1 质粒提取

采用柱式质粒小样抽提试剂盒, 试剂盒采用常规的碱裂解法裂解细胞, 经沉淀, 离心除去基因组DNA、蛋白质和RNA, 经吸附柱选择性地吸附DNA, 再通过简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质, 洗脱得到纯度较高的质粒[3]。按如下方法进行:

(1) 准备工作

自备试剂:无水乙醇等。

A.试剂盒初次开启, 取1 ml Solution I至标有RNase A的离心管中, 吸打混匀后将其全部都加入Solution I中, 混匀后在瓶身做好标记。储存于2-8°C。

B.Solution II和Solution III在低温下可能会产生沉淀, 使用之前需要检查, 如果有沉淀, 请在37°C温度下溶解沉淀, 待冷却至室温后再使用。

C.按照瓶身标签上的说明在Wash Solution中加入4倍体积的无水乙醇, 混和均匀后在瓶身做上标记。于室温条件下密封保存。切记每次使用结束后将瓶盖盖紧, 减少Wash Solution中的乙醇的挥发。

D.提前将水浴锅调至60°C备用。

(2) 标准抽提步骤

A.在含合适抗生素培养基中接种目标菌株, 于37°C摇床充分振荡培养12-16 h。

B.在菌体沉淀中加入250μl Solution I, 吸打或振荡至彻底悬浮菌体。

C.加入250μl Solution II, 立即温和颠倒离心管5-10次混匀, 室温静置2-4min。

D.加入350μl Solution III, 立即温和颠倒离心管5-10次以充分混匀。12, 000 rpm离心10 min。

E.将上清全部小心移入吸附柱, 8, 000 rpm离心30 sec。倒掉收集管中的液体, 将吸附柱放入同一个收集管中。

F.向吸附柱中加入500μl Wash Solution, 10, 000 rpm离心1min。倒掉收集管中的液体, 将吸附柱放入同一个收集管中。重复步骤F一次。

G.将空吸附柱和收集管放入离心机, 12, 000 rpm离心2 min。

H.将吸附柱放入洁净的1.5 ml离心管中, 在吸附膜中央加入30μl Elution Buffer, 室温静置2 min, 10, 000 rpm离心1 min, 将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

2.2.2 电泳分析

A.制备琼脂糖凝胶

称取1g的琼脂糖粉, 放入锥形瓶中, 加入100ml×TAE电泳缓冲液, 放置微波炉或水浴内加热熔化, 取出摇匀即为1%的琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至60℃后加入溴化乙锭5ul, 使其终浓度为0.5ul/ml。

B.胶板的制备

在制胶槽内插入样品梳, 将琼脂凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后, 取出梳子, 将内槽放入电泳槽内。加入1×TAE电影缓冲液至电泳槽中, 使其没过凝胶表面1~2mm。

C.加样

用移液器将之力DNA3ul与6×上样缓冲液1ul混匀后加入加样孔, 记录点样顺序。

D.电泳

接通电泳槽与电泳仪之间的电源, 调节电压值5V/cm, 开始电泳, 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处, 停止电泳。

E.实验结果的观察

利用凝胶成像系统观察电泳条带[4]。

2.2.3 测序及序列分析

由上海欧弗生物科技有限公司完成, 序列分析用DNAMAN6.0软件, 开放阅读框分析用ORFfinder软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 。

3 结果与分析

3.1 质粒提取

提取出了所需的质粒DNA。

3.2 电泳分析

电泳结果显示, 与核酸标准分子量参照物相比, 在约4.7 kb位置有一目标条带, 表明我们的质粒DNA提取成功。

3.3 测序及序列分析

3.3.1 测序结果

测序结果经DNAMAN软件分析, 结果如图1所示。此序列长度为393个氨基酸。组成:105个腺嘌呤, 76个胞嘧啶, 94个鸟嘌呤, 118个胸腺嘧啶, 没有其他的。成分:26.7%的腺嘌呤, 19.3%的胞嘧啶, 23。9%的鸟嘌呤, 30.0%的胸腺嘧啶, 没有其他的。分子重量 (k Da) :单链重121.63k Da, 双链重242.26k Da。

3.3.2 开放阅读框分析

结果如图2所示。共含3个开放阅读框, 基中两个来自负链, 一个来自正链。

3.3.3 可能的开放阅读框组成

因为本实验所测的为DNA编码链, 所以只可能是编号为正的那个开放阅读框。其详细分析结果如图3所示。开放阅读框区域为克隆片段的第12到116个碱基区域, 编码34个氨基酸

开放阅读框碱基的组成及其编码多肽的氨基酸序列:

12甲硫氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸甲硫氨酸精氨酸精氨酸赖氨酸谷氨酰胺精氨酸谷氨酰胺精氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酸

57丙氨酸酪氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸脯氨酸苏氨酸脯氨酸丙氨酸甘氨酸缬氨酸谷氨酰胺

102半胱氨酸丙氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺116

4讨论

此克隆基因编码的氨基酸有20种, 其中含有8种人体不能合成的、必须通过食物供给的如赖氨酸:色氨酸:苯丙氨酸:蛋氨酸 (甲硫氨酸) ;苏氨酸:异亮氨酸:亮氨酸:缬氨酸, 所以芦荟有很好的营养价值.此克隆基因编码的氨基酸种精氨酸占得比例大, 而精氨酸与脱氧胆酸制成的复合制剂 (明诺芬) 是主治梅毒、病毒性黄疸等病的有效药物。并且组氨酸可作为生化试剂和药剂, 还可用于治疗心脏病, 贫血, 风湿性关节炎等的药物, 所以芦荟还有很好的药用价值.据测定, 以干物质计算, 在芦荟叶片中蛋白质含量约为9.5%左右.经水解后可产生19种氨基酸[5], 而芦荟叶汁中的各种氨基酸含量的组成却比较平衡, 因此芦荟被人们誉为21世纪最有希望的保健食品[6]。此克隆基因的开放阅读框中起始密码子中有atg两个而终止密码子有tag一个, 其中-3开放阅读框编码的氨基酸最多有129个。

参考文献

[1]常秀莲, 冯咏梅, 丛丽华, 田康明, 张华.芦荟的生物学功效研究新进展[J].食品科技, 2007, 5 (4) :10-13.

[2]孙振红, 魏凯, 朱瑞良.芦荟的功效及其在畜禽业的开发潜能[J].中国家禽, 20016, 21 (8) :50-52.

[3]李天东, 罗英, 李俊刚.芦荟多糖生物活性研究进展[J].绵阳师范学院学报, 2008, 2 (4) :11-55.

[4]舒群芳, 张明等.植物基因克隆的方法和策略[J].植物学通报, 1999, 16 (1) :80-85.

[5]田芳, 牟善峰.亚铁氰化钾修饰铂电极测组氨酸[J].中北大学学报 (自然科学版) , 2010, 5 (3) :499-503.

14bp基因 篇3

1 材料

14株NTM菌株(来自吉林省),由吉林农业大学预防兽医学实验室保存,分别命名为 FJ-1～14,其中FJ-1、FJ-6、FJ-11来自猪颌下淋巴结,FJ-4、FJ-12～14来自牛颌下淋巴结,其他菌株均来自牛肠系膜淋巴结。

2 方法

2.1 DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法提取DNA,参照标准方法进行,将提取得到的DNA于-20 ℃保存,备用。

2.2 16S rDNA片段PCR扩增

根据16S rRNA基因高变区位置[4]设计合成 1对引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成),即上游引物P1 5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 62～85位核苷酸处)和下游引物P2 5′-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 626～647位核苷酸处),以上、下游引物扩增16S rRNA基因5′端长为570 bp左右的片段。PCR反应体系(20 μL):10×Ex Taq Buffer(含Mg2+) 2 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/ L)1.5 μL,上、下游引物(10 μmol/ L ) 各0.5 μL,DNA模板1 μL,ExTaq(5 U/μL) 0.25 μL,H2O 14.25 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min。循环结束后取PCR产物3～5 μL用1.0% 琼脂糖凝胶电泳,观察扩增结果。

2.3 PCR 扩增产物纯化及序列测定

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后,应用DNA 回收试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司生产]从凝胶上回收、纯化目的片段,并送至宝生物工程(大连)有限公司测序。

2.4 16S rDNA序列分析

将16S rDNA的测序结果与GenBank上标准序列比较,从中列出与该序列最相近的细菌,相似度达99%以上者为所得到的鉴定结果[7]。用DNAMan软件对14株NTM序列与GenBank上下载的标准16S rDNA序列进行同源性比对,以及构建系统发育树。试验所用的已知NTM菌株16S rDNA序列名称见表1。

3 结果

3.1 16S rDNA片段PCR扩增结果

14株NTM菌株均扩增得到长为570 bp左右目的片段(见图1) ,与预期片段大小相符。

1～4.分别为FJ-1～4菌株PCR扩增结果;5,13.DL- 2 000 Marker; 6～12.分别为FJ-5～11菌株PCR扩增 结果; 14～16.分别为FJ-12～14菌株PCR扩增结果。

3.2 NTM菌株16S rDNA 序列分析

试验所测定的NTM菌株16S rDNA片段5′端500 bp序列既含有属特异性的保守区域,又含有2个种特异性的高变区,分别是位于120～254,388～490位核苷酸的区域。14株NTM菌株中FJ-1与FJ-3,FJ-7、FJ-8与FJ-9,FJ-4与FJ-14 16S rDNA序列重合部分完全一致,其他菌株16S rDNA序列相似水平为94.8%～99.8 %(见表2) ,具有较好的同源性。各分离菌株序列与GenBank 序列库中相同或最相似序列的比较见表3。

3.3 系统发育树构建结果

以14株NTM菌株与从GenBank上下载的5株NTM标准菌株的16S rDNA 5′端570 bp左右序列构建系统发育树(见图2),结果菌株均得到良好区分。

3.4 NTM菌株的鉴定结果

14株NTM菌株16S rDNA的测序结果与GenBank上的标准序列比较结果显示:FJ-2、FJ-6为浅黄分枝杆菌;FJ-1、FJ-3、FJ-11为偶发分枝杆菌;FJ-4、FJ-14为母牛分枝杆菌;FJ-7、FJ-8、FJ-9、FJ-10为新金色分枝杆菌;FJ-5与Mycobacterium sp. Myc399的同源性达99.5%,提示二者可能为同一种型;FJ-12与新金色分枝杆菌,FJ-13与偶发分枝杆菌同源性分别为98.8%与98.6%,显示其亲缘关系非常相近,FJ-12、FJ-13是否为分枝杆菌新种或是这些已知分枝杆菌的亚种仍需进一步确认。

4 讨论

NTM对人的感染途径有3种说法,即环境感染、动物感染及人与人之间的传染,但至今这些观点均未得到证实 [8]。有日本学者报道,可从猪、牛等多种动物体内分离出NTM,因此认为动物作为传播媒介的可能性有探讨的必要。至今,我国关于动物NTM的研究相对较少,相关报道主要集中在人医临床分离与药敏试验方面。2005年,林世平等[9]报道,从广东地区174份牛鼻腔分泌物标本中分离出88株NTM,阳性率高达50.5% ,提示在广东地区NTM可能广泛存在于自然环境中。

目前,基因分析的细菌鉴定方法已成为快速检测和鉴定分枝杆菌的重要手段。rRNA进化速度十分缓慢,具有“分子进化钟”的特点,是目前细菌的系统发育分类与鉴定的最常用的靶基因,其中16S rDNA序列分析是细菌系统分类的“金标准”[10],16S rDNA在分枝杆菌的分类和鉴定中的作用已得到充分肯定[11,12]。

本试验选择的14株NTM中,有3株被证实为偶发分枝杆菌。偶发分枝杆菌是临床上常引起人肺部感染的NTM,其他一些菌株虽属条件致病菌,也有学者报道可引起人类的感染。在本研究中发现,部分菌株16S rDNA与GenBank序列库中的相似程度为98.6%～98.8%。用临床分离菌株的16S rDNA序列和与其最相似的已知NTM菌株的序列构建系统发育树,结果提示这些菌株可能是与新金色分枝杆菌、偶发分枝杆菌密切相关的新种,或是它们的亚种,但这些均需要进一步研究加以证实。本研究结果显示,吉林地区的NTM临床分离株的种类与国内外报道的临床分离的NTM种类有明显的不同,这可能与地域、气候的差异密切相关。本研究为寻找NTM疾病可能的传染源、了解其致病性及今后对家畜NTM的防制提供了科学依据。

摘要：为了对非结核分枝杆菌菌株进行分类与鉴定,试验采用PCR方法从14株非结核分枝杆菌中扩增16S rDNA基因5'端片段,并对所得DNA基因片段进行测序;同时用DNAMan软件对所获得的序列与GenBank中分枝杆菌序列进行比较,计算种间相似性,构建系统发育树。结果表明:14株非结核分枝杆菌中有浅黄分枝杆菌2株、偶发分枝杆菌3株、母牛分枝杆菌2株、新金色分枝杆菌4株,另有3株分别与Mycobacterium sp.Myc399、新金色分枝杆菌与偶发分枝杆菌有较好的亲缘关系。

关键词：非结核分枝杆菌,菌株鉴定,PCR,16SrRNA

参考文献

[1]田艳生,崔幸琨.130株结核分枝杆菌药敏试验结果分析[J].中华检验杂志,2002,25(4):236.

[2]FALKINHAM J O 3rd.Nontuberculous mycobactefia in the environ-ment[J].Clin Chest Med,2002,23(3):529-551.

[3]WILLIAM N R,STUART M G.Tuberculosis[M].USA:LippincootWilliams&Wilkins,2004:651-662.

[4]李良成,扈庆华,刘军,等.一起由龟分枝杆菌脓肿亚种引起院内术后爆发感染的病原学研究[J].中国防痨杂志,1998,20:198.

[5]TURENNE C,CHEDORE P,WOLFE J,et al.Phenotypic andmolecular characterization of clinical isolates of Mycobacterium ele-phantis from human specimens[J].J Clin Microb,2002,40(4):1230-1236.

[6]彭涛,温博海,蹇锐,等.分枝杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(9):772-776.

[7]陈超,徐鹏,李静,等.城市生活饮用水中非结核分枝杆菌调查[J].微生物与感染杂志,2008,3(4):215-218.

[8]郭钓.结核病细菌学研究进展[M].武汉:中国防痨协会武汉分会,1982:213-214.

[9]林世平,杨应周,谭卫国,等.牛鼻腔分泌物非结核分枝杆菌分离培养结果分析[J].中国热带医学,2005,5(6):1207-1209.

[10]温博海.立克次体16S rRNA基因分析[J].中国人兽共患病杂志,1999,15(6):18-20.

[11]KIRSCHNER P,KIEKENBECK M,MEISSNER D,et al.Genet-ic heterogeneity within Mycobacterium fortuitum complex species:genotypic criteria for identification[J].J Clin Microb,1991,30(11):2772-2775.

14bp基因 篇4

YANO等[7]在合浦珠母贝 (Pinctada fucata) 贝壳珍珠层中获得一种分子量约为19 k Da的碱性蛋白, 并命名为N19。体外碳酸钙结晶试验表明, N19具有抑制碳酸钙结晶沉降的功能, 推测其作为负调节因素参与生物矿化, 与贝壳珍珠层形成有关。张立娟等[8]研究了外源生长激素与胰岛素样生长因子-Ⅰ处理对合浦珠母贝5种壳基质蛋白基因表达水平的影响, 发现激素处理下, N19基因的表达水平下调, 认为N19基因的表达受到激素调节通路的抑制作用。SUZUKI等[9,10]从合浦珠母贝贝壳棱柱层中分离得到Prismalin-14, 其蛋白大小约为14 k Da, 是一种极酸性蛋白。体外碳酸钙结晶试验表明, Prismalin-14能明显影响方解石晶体的表面结构, 具有抑制碳酸钙结晶沉降及结合钙离子的功能。Prismalin-14是一种贝壳棱柱层的框架蛋白, 与贝壳棱柱层形成有关[10]。TAKEUCHI和ENDO[11]、INOUE等[12,13]发现Prismalin-14在外套膜边缘区 (ME) 的表达量最大, 而在核心区 (MC) 不表达。但育珠对壳基质蛋白基因N19和Prismalin-14在合浦珠母贝不同组织的表达有何影响尚未见报道。因此, 开展育珠对壳基质蛋白基因表达的研究有助于了解影响珍珠养殖质量的内在因素。

1 材料与方法

1.1 总RNA提取与c DNA合成

合浦珠母贝采集于广东徐闻, 育珠贝和非育珠贝各3只, 2组贝源自相同的种群, 贝龄、性状和生长条件一致。解剖后取闭壳肌、肝胰脏、性腺、鳃、肠、外套膜组织 (育珠贝增加珍珠囊组织) 快速保存于Ta KaRa Sample Protector, -80℃冻藏。按照Total RNA isolation Nucleo SpinRNAⅡ试剂盒 (Macherey-Nagel) 提取总RNA。利用Thermo Nano Drop 2000/2000c微量紫外分光光度计测定RNA浓度, 计算光密度OD260/OD280确定RNA纯度, 利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

c DNA合成按照Prime SCriptRT reagent Kit With g DNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒 (Ta KaRa) 进行。总RNA样品首先经去除基因组DNA处理:RNA 1μg, 5×g DNA Eraser Buffer 2μL, g D-NA Eraser 1μL, 加RNase-free H2O至10μL, 42℃温育2 min, 冰上冷却。后逆转录合成c DNA:5×Prime SCriptBuffer 2 (for Real Time) 4μL、RT Primer Mixture 1μL、Prime SCriptRT Enzyme MixⅠ1μL和RNase-free H2O 4μL, 37℃反应15 min, 85℃保温5 s。反转录产物置于-20℃保存备用。

1.2 N19、Prismalin-14基因组织表达的PCR检测

根据基因库 (Gen Bank) 提供的N19与Prismalin-14序列设计引物N19-F/N19-R和Prismalin-14-F/Prismalin-14-R (表1) , 引物由上海生工生物工程有限公司合成。以各组织的c DNA为模板, 分别用引物N19-F/N19-R和Prismalin-14-F/Prismalin-14-R进行N19和Prismalin-14基因的组织表达差异分析。PCR反应体系为10μL, 包括10×Ex Taq Buffer 1μL, d NTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 0.2μL, 正、反向引物 (10μmol·L-1) 各0.25μL, Ex Taq DNA polymerase 0.05μL, c DNA 0.25μL, RNase-free H2O 8μL。反应程序为94℃预变性5min, 然后35个循环;94℃变性30 s, 67.6℃ (N19) /65.2℃ (Prismalin-14) 退火30 s, 72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min, 4℃保存。用琼脂糖电泳对PCR产物进行检测。

1.3 N19、Prismalin-14基因表达差异的Real-Time FQ-PCR分析

在预试验中发现18S rRNA在合浦珠母贝各组织中的表达量较GAPDH与β-actin稳定[14,15], 因此选用18S rRNA作为该试验的内参基因并设计引物, 其余Real-Time FQ-PCR引物从其他文献中引用 (表1) 。按照Ta KaRa公司的SYBRPremin Ex TaqTM (Tli RNase H Plus) 试剂盒说明书, 分别用引物N19-F-RT/N19-R-RT和Prismalin-14-F-RT/Prismalin-14-R-RT (表1) 进行N19和Prismalin-14基因的荧光定量表达分析, 反应体系为20μL:2×SYBRPremix Ex TaqTM10μL, 正、反向引物 (10μmol·L-1) 各0.4μL, c DNA 1μL, RNase-free H2O8.2μL。反应程序为95℃30 s;95℃5 s, 60℃30 s, 40个循环。采用相对定量CT法 (2-ΔΔCTmethod) 分析数据。CT为荧光信号达到阈值时的PCR扩增循环数, ΔCT为目的基因CT值与内参基因CT值的差值, 将比较组中ΔCT最小的组作校正样标 (笔者试验中所有组均以育珠贝外套膜Prismalin-14的ΔCT为校正样标) , ΔΔCT为各样品ΔCT与校正样标ΔCT的差值, 最后求出2-ΔΔCT值, 表示各样品表达量相对于校正样标的倍数。运用软件SPSS19.0进行单因素方差分析 (ANOVA) , 选用LSD多重比较法分析各组间是否存在显著性差异 (P<0.05为差异显著, P<0.01为差异极显著) 。

2 结果与分析

2.1 N19、Prismalin-14基因的组织表达谱

所提RNA经电泳检测结果可见清晰的28S rRNA和18S rRNA条带 (图1) , 其中闭壳肌、肠和鳃样品中提取的RNA含量较少, 肝胰脏、外套膜和珍珠囊提取的RNA含量较高。

N19与Prismalin-14基因在闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中表达量极低乃至不表达, 在外套膜均有表达。N19在育珠贝珍珠囊表达, Prismalin-14则不表达 (图2和图3) 。

2.2 N19、Prismalin-14 mRNA的荧光定量表达差异

实时荧光定量PCR结果显示, 试验重复性良好, Tm值与预期一致, 表明反应体系和条件都得到很好的优化。同时, PCR扩增结束后所得的溶解曲线为单峰, 无杂峰, 表明试验无污染, 引物的特异性高, Real-Time FQ-PCR的验证结果可信。

育珠贝Prismalin-14 mRNA在外套膜的表达量最高, 是非育珠贝Prismalin-14的1.23倍, 差异极显著 (P<0.01) , 是育珠贝珍珠囊N19表达量的2.16倍, 是育珠贝外套膜N19的25.04倍 (P<0.01) , 是非育珠贝外套膜N19的41.04倍。育珠贝珍珠囊N19的表达量为外套膜N19的11.58倍 (P<0.01) , 是非育珠贝外套膜N19表达量的18.97倍;育珠贝外套膜N19的表达量是非育珠贝的1.64倍。非育珠贝外套膜Prismalin-14表达量是N19的33.30倍 (P<0.01) 。

3 讨论

笔者试验中育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中N19和Prismalin-14的表达量极低, 可看作均无表达, 与SUZUKI等[9]用Northern杂交及原位杂交结果一致。在育珠贝中, N19与Prismalin-14基因在外套膜组织中的表达量均大于非育珠贝, 表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。但不管育珠贝还是非育珠贝, N19 mRNA在外套膜的表达量均远小于Prismalin-14, 表明珍珠贝在生长过程中对Prismalin-14的需求量可能比N19大。Prismalin-14是棱柱层特有的壳基质蛋白基因, N19是珍珠层特有的壳基质蛋白基因, 且在贝壳的组成中, 棱柱层较珍珠层所占比重大, 这2个基因表达水平的差异可能与棱柱层和珍珠层在贝壳所占比重的不同有关。ZHANG等[17]在研究壳基质蛋白基因与贝壳生长性状的关系时发现, Prismalin-14在体积大的贝壳中的表达量相应较高, 而N19的表达量与壳高壳质量呈负相关, 认为棱柱层基质蛋白基因与贝壳的长度大小 (延伸) 有关, 而珍珠层壳基质蛋白基因主要与贝壳的厚度有关[17,18]。表明棱柱层基因的表达量高低可能是珍珠贝壳生长的重要限制性因素。但壳基质蛋白基因的表达水平与贝壳生长之间的关系、作用机制还有待进一步研究。