成年大鼠

成年大鼠（共4篇）

成年大鼠 篇1

摘要：目的:鉴定不同年龄大鼠培养海马神经元的衰老细胞鉴定。方法:取6月龄和18月龄雄性SD大鼠海马进行原代海马神经元培养,分别在培养6d、10d和14d利用衰老相关的β半乳糖苷酶(Senescence associated β-gal-actosidase,SA-β-GAL)进行细胞化学染色。结果:18月龄培养10d和14d的海马神经元SA-β-GAL染色较6月龄培养6d的海马神经元明显增多(p<0.001)。结论:老年大鼠海马神经元体外培养进入衰老状态的时间较青年大鼠早。

关键词：海马神经元,衰老,衰老相关的β半乳糖苷酶

衰老相关的β半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase,SA-β-GAL)是目前被广泛采用的一种生物学标记物,它在衰老细胞中表达升高,因此成为鉴定细胞衰老的一个标志[1,2]。值得提出的是,有些衰老的生物学标记并不具有普遍性,SA-β-GAL作为一个衰老的生物学标记在体外检测复制衰老的细胞已经得到了广泛的认可[3],但其是否能够用于检测衰老神经元,目前尚未得到证实,因此在应用上应加以验证。目前对衰老细胞的研究,衰老细胞从形态学上表现为细胞变大,变扁平[4],然而在除此以外还有端粒变短,细胞周期停滞等特征,而鉴于神经元属于静止细胞,因此在衰老细胞鉴定生物学标记的选择时具有特异性,本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA-β-GAL染色,从而鉴定衰老的海马神经元,同时验证SA-β-GAL在海马神经元应用的可靠性。

1材料与方法

1.1海马神经元原代培养

分别取6月龄及18月龄雄性SD大鼠各2～3只,进行海马神经元原代培养。取海马组织:全身75%酒精消毒,断头取脑,将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+Mg2+)平衡液中,利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。HBSS液洗4次,去除混杂的血管和血液。胰酶消化:用剪刀将海马组织剪成1mm3的小块,用HBSS洗4次,0.25%的胰酶37℃消化15min。终止消化:加入终浓度为10%的胎牛血清孵育5min终止消化,随后用HBSS洗4～5次去除残留的胎牛血清。吹打细胞:在15mL离心管中加入5mL Neurobasal A用Pasteur管吹打组织碎块,将浑浊的上清液收集到另一个15mL离心管中,200g离心10min,弃上清。接种细胞:沉淀用Neurobasal A液加B27重悬,在24孔板中接种在100mg/mL poly-L-lysine处理过的盖玻片上,密度约5～8×105cells/mL,在37℃,5%CO2培养箱中培养。在培养第五天加入10mmoL阿糖胞苷抑制胶质细胞和纤维母细胞生长,从接种第六天起可进行实验。

1.2SA-β-GAL的细胞化学检测

分别取细胞接种后第6d、10d和14d的培养神经元在4%的多聚甲醛中室温固定15min,-20℃保存。接种细胞的盖玻片在室温下放置约30min,用X-Gal洗液(100mM磷酸钠;2mM MgCl2;0.01%脱氧胆酸钠)洗三次,每次15min,用X-Gal染液(100mM磷酸钠,2mM MgCl2,150mM氯化钠,0.01%脱氧胆酸钠,0.02% NP-40,5mM铁氰化钾,5mM亚铁氰化钾,1mg/mL X-gal)在37℃避光16～18h,PBS清洗3次,0.1%核固红室温复染20min。晾干后中性树胶封片,光镜下观察,拍片,计数。

2结果

SA-β-GAL阳性率均随着培养时间延长而增加,在培养6d的神经元SA-β-GAL阳性表达较少,而在10d和14d的神经元中表达明显增加(p<0.001),同时培养10d的18月龄组比6月龄组阳性率明显增加(p<0.05),然而在培养14d时两组阳性率差别不明显,表1所示。

**与培养6天相比p<0.01,▲与6月龄相比p<0.05

3讨论

本研究结果提示,随着培养时间的延长,成年海马神经元中的衰老神经元明显增加,与新生大鼠海马神经元培养相比,成年大鼠神经元存活时间较短,出现SA-β-GAL阳性染色的时间较早(未发表)。在本研究中发现老年大鼠在海马神经元的体外培养中,出现SA-β-GAL标记的衰老细胞较青年大鼠早,然而在延长培养后期,衰老细胞已趋向于饱和,而此时差别并不明显。SA-β-GAL是目前比较普遍应用的衰老生物学标记物[1],多数的研究应用于复制衰老,而复制衰老是指真核细胞在完成有限分裂次数后,丧失合成DNA的能力,导致增殖能力丧失而仅维持细胞基本的代谢能力的状态,比较经典的复制衰老的细胞模型是人二倍体细胞(human diploid fibroblasts,HDFs)[2,5]。然而,神经元属于静止细胞,在体外培养中不再增殖和分裂,并且在体外研究中建立稳定可靠的衰老神经元的模型是研究中枢神经系统衰老的基础,SA-β-GAL在成年大鼠神经元培养中的成功应用,不仅使细胞培养的来源更加广泛,并且缩短了研究周期。除SA-β-GAL标记外,衰老的细胞还具有细胞变大,变扁平的形态学特点,然而在本研究中,延长培养的神经元形态学改变不明显,因此SA-β-GAL是一个比较敏感的生物学指标,在以往的研究中,我们分别在不同年龄大鼠的大脑皮层和海马区应用了SA-β-GAL标记了衰老神经元[6,7],本结果利用体外培养的方式进一步验证了结果的可靠性。

参考文献

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成年大鼠 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象及分组

健康雄性SD大鼠36只,体重130～150 g,取自广东省医学实验动物中心[许可证号:SCXK粤(2003-0002),粤监证字2006A015]。按照数字随机法分成3组,即对照组、低剂量染锰组和高剂量染锰组,每组12只,分笼饲养,光照时间为12∶12 h,实验前于实验环境中适应7～10 d 。

1.1.2 主要实验仪器设备

722分光光度计为上海第3分析仪器厂生产,型号:722;恒温水浴箱为江苏金坛市金成教育仪器厂产品,型号:HH;EPPENDOF离心机为北京安亨仪器厂产品,型号:80-2;TIGER细胞图象分析系统为MediaLybemetics产品(USA)。

1.1.3 主要化学试剂

氯化锰(MnCl2·4H2O,相对分子质量197.91,分析纯,纯度不低于99.0%)由天津市福晨化学试剂厂提供,实验前配制,浓度分别为0.5和5 g/L;一氧化氮合酶(NOS)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;鼠胶质细胞纤维酸蛋白(GFAP)单克隆抗血清(Mouseanti-Glial fibrary acid protein serum,Anti-GFAP,Sigma)稀释度为1∶5000;生物素标记兔抗鼠IgGs(对GFAP/,DAKO,Glostrup,Denmark)稀释度为1∶200;卵白素—生物素过氧化物酶复合物(ABC复合物)(DAKO,Glostrup,Denmark)。

1.2 实验方法

1.2.1 锰接触动物模型的建立

大鼠染毒途径采用饮用水中加入二氯化锰方式进行,即将氯化锰溶于蒸馏水中(新鲜配制),连续染毒60 d,染毒剂量为低剂量染锰组0.5 g/L,高剂量染锰组5.0 g/L,对照组则供用未加入锰的新鲜蒸馏水。

1.2.2 脏器系数的测定

于第60天处死动物前称体重,经2%戊巴比妥钠腹腔内麻醉(2 ml/kg体重),取出肝脏、肾脏、睾丸和脑分别称重,分别计算对照组、低剂量染锰组和高剂量染锰组相应的脏器重/体重比值(以每100 g体重计算)作为相应的脏器系数。

1.2.3 血清和全脑匀浆中NOS和SOD活力的检测

于实验结束日,经麻醉开胸后经左心室抽取3 ml全血,离心取血清,依据试剂盒提供的方法程序,应用722分光光度计分别检测全血中NOS、SOD活力;各组取9只大鼠于取血后立即断头,开颅,取脑,依照试剂盒提供的方法制成10%的全脑匀浆,取其上清液,用生理盐水按1 ∶9稀释到1%全脑匀浆,应用722分光光度计分别检测匀浆中的NOS和SOD活力。

1.2.4 中脑黑质病理组织学(GFAP免疫细胞化学)的检测

各组分别取3只大鼠,于开胸取血后立即经左心室—主动脉作常规灌流固定,待脑块下沉后,选取含有中脑部分的脑块作连续冠状冰冻切片,切片分成3套,其中1套作Nissl常规染色供结构参考用,第2套作GFAP免疫细胞化学反应染色(ABC法),第3套作免疫空白对照。

1.2.5 图像和数据分析

光学显微镜下观察切片的GFAP免疫反应情况,简图记录结果,全片照相分析,并应用TIGER细胞图象分析系统检测GFAP免疫反应阳性胶质细胞数(GV)和阳性产物的平均相对吸光度。所有数据均采用SPSS 11.0统计学软件进行统计分析,用单因素方差分析和t检验进行均数比较,当P<0.05时,认为均数之间的差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 锰对大鼠食物利用率和脏器系数的影响

各组大鼠在实验期内一般情况较好,活动正常,未出现明显的中毒和不良反应。各组大鼠之间脏器系数结果见表1。统计学分析表明,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。

注:*脑/体比动物数为9只(另3只脑经灌流作免疫组织化学研究用)。

2.2 锰对大鼠血清和脑匀浆中NOS和SOD活力的影响

锰对各组大鼠血清和脑匀浆中NOS和SOD活力的影响检测结果见表2和表3。可见,高、低剂量组大鼠血清和全脑匀浆中的NOS活力较对照组有显著升高,而SOD活力则有显著降低,统计学分析表明,其差异有统计学意义。

2.3 锰对中脑黑质DA能神经元和胶质细胞的影响

各组大鼠中脑免疫细胞显示,黑质部均可见到星形胶质细胞纤维酸蛋白(GFAP)反应阳性的胶质细胞,但阳性细胞分布的疏密度均有所区别:在GFAP免疫反应的切片中,高剂量组比低剂量组、低剂量组又比对照组的GFAP免疫反应强度明显增强,细胞突起明显增多增粗,GFAP阳性胶质细胞的分布密度亦明显增大(如图1～3)。应用TIGER细胞图象分析系统对黑质GFAP反应阳性胶质细胞的细胞数密度(Gv)和阳性产物的相对吸光度(A)检测,结果如表4。统计学结果表明,与对照组相比,高、低剂量组大鼠黑质GFAP反应阳性胶质细胞的Gv和阳性产物的相对吸光度(A)则均显著升高。

注:与对照组比较,*P<0.05;**P<0.01。

注:与对照组比较,*P<0.05;**P<0.01。

1.对照组,2.低剂量染锰组,3.高剂量染锰组

3 讨论

以往研究表明:孕期长期过量锰接触的母鼠,其体内过量的锰可透过血胎屏障进入子代,导致子代生长发育指标的的迟缓,如体重减轻、身长缩短等[2]。本实验的高、低剂量组大鼠,在染锰60 d期间生长情况良好,体重、毛发、活动、脏器系数等生长发育指标与对照组无明显差异。由于锰接触对机体生长发育的影响,与染锰的剂量、时间、途径,以及染毒鼠的年龄和机体状况等都有密切关系。本实验使用的大鼠,是130～150 g的代谢旺盛的成年大鼠,对锰中毒的抵抗相对较强,锰接触的时间相对较短等因素,可能对生长发育的宏观指标暂未能造成严重的影响。

注:与对照组比较,①P<0.05,②P<0.01;与低剂量组比较,③P<0.05。

Stuehr等曾报道,经口服途径和经腹腔注射持续染锰3个月后,体内过量的锰可透过血脑屏障干扰脑组织代谢功能,表现为匀浆中多种酶如MAO、Ache、ALT、AST、ALP等活力的改变[3,4,5]。本研究采用口服途径连续给动物染锰60 d,检测全脑匀浆和血清中的NOS和SOD活力的变化。结果表明,2种活力物质在脑匀浆和血清中的变化相一致,即:相比对照组,高、低剂量染锰组大鼠全脑匀浆和血清中的NOS活力显著升高,而SOD活力则均显著降低。

一氧化氮(NO)是哺乳动物机体内最小、最轻并具有独特理化性质和生物学活性的信息和效应分子,它广泛存在于神经系统、心血管系统和免疫系统等的细胞内,发挥着极其重要病理作用。当体内NO过量时,可与其他分子发生不可逆的化学反应,生成一些神经毒性物质,干扰神经细胞DNA合成,导致神经细胞的损害和死亡[4]。NO在体内由NOS催化合成,NOS在体内具有重要作用,一方面,作为信使分子参与体内各种重要生理功能;另一方面,当NOS活力增强,NO合成过多却是人类许多常见疾病的病因或重要促进因素[6]。本实验高、低剂量染锰后都引起NOS活力的明显升高,势必导致体内NO的过量合成,介导兴奋性氨基酸神经毒性,引起相应神经元的损害。并且NO还可通过干扰能量代谢、抑制ATP合成等途径,造成组织和细胞的变性、坏死。本研究结果提示,过量的锰导致细胞内NO合成的加剧,是其造成机体毒性损害的可能机制之一。

在生理条件下,体内过氧化物的生成和清除保持着动态平衡。在脂质过氧化作用增强的情况下,生物膜是脂质过氧化损害的主要部位,细胞膜尤其亚细胞结构的线粒体和溶酶体膜损伤后,膜电位和通透性剧烈改变,溶酶体释放大量的消化酶类,引起细胞结构和功能严重障碍[7]。SOD是需氧生物体内一种含不同金属元素的酶蛋白,是唯一可以消耗超氧化物自由基的酶,测定其活力可间接反映体内自由基产生与消耗的动态平衡状态,而其活力可受体内外多种因素的影响[5,8]。有资料表明,适量的锰有助于对抗自由基氧化,但是过多的锰可以激活细胞色素氧化酶P450的活力,继之产生的自由基可以使巯基耗竭,降低细胞的抗氧化能力[9]。本实验染锰60 d后,高、低剂量组大鼠的血清与脑匀浆中SOD活力均比对照组明显降低的结果表明,体内的过量的锰抑制了SOD活力,使其对超氧阴离子的歧化作用减弱,导致其在体内堆积,进而作用于细胞膜的不饱和脂肪酸,促其氧化而引起脂质过氧化产物生成增加,细胞膜结构受损,代谢障碍。

成年大鼠 篇3

1 材料和方法

1.1 实验动物

9 周龄雌性SD大鼠75 只,体重(250±20) g。根据随机原则将实验动物分为3 组,每组25 只,其中2 组为实验组。动物饲养在同济大学分子生物学实验室。实验组动物戴用统一规格的自制咬合前导矫治器,分别戴用12 h和全天。自制的上颌斜面导板式功能矫治器由金属斜面导板、塑料基托及辅助固位装置组成。斜面导板与上颌平面呈约25°角,大鼠闭合时,下切牙咬在金属斜面导板上,引导下颌前伸。

1.2 组织处理

3 组动物分别在实验后3、7、14、21、30 d处死,充分暴露颧弓,整块取出下颌骨;常规石蜡包埋,包埋时注意调整下颌支与蜡块底面平行,沿髁突中份矢状向进行连续切取至少3 张切片,切片厚5 μm。

1.3 免疫组织化学分析

特异性一抗:兔抗X型胶原抗体(Rabbit Anti- COL10A1)1∶100、EnVision试剂(HRP) 即用型(博士德生物科技公司)。操作流程:切片脱蜡后,在H2O2中浸泡20 min,然后在羊血清中孵育30 min。在37 ℃水浴中与一抗孵育2 h,PBS洗净后与EnVision试剂作用30 min。DAB显色后,镜下观察。

1.4 X型胶原mRNA原位杂交

X型胶原探针序列:采用博士德生物科技公司提供的针对X型胶原的经地高辛标记的寡核苷酸探针。操作程序:切片脱蜡后,梯度乙醇脱水。DEPC水洗,4%PFA固定后用梯度乙醇脱水。在37 ℃湿箱中,与预杂交液孵育2 h,不洗。之后,用原位杂交专用盖玻片覆盖标本,放入湿盒,42 ℃杂交过夜。经系列冲洗后,依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC及生物素化过氧化物酶。DAB显色,充分水洗后,乙醇梯度脱水,封片,显微镜观察。

1.5 图像分析

使用Nikon TE2000- S型光学显微镜下用NIS- Elemnts F 2.20图像分析系统采图,各组切片选取TMJ髁突顶部区域40 倍镜下进行观察,使用Image- Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析。以髁突顶部髁突软骨内阳性信号强度即黄染区累积吸光度(integrated optical density, IOD)为参数进行半定量测量。

1.6 统计分析

使用SPSS 13.0统计软件,用t检验分别对12 h实验组、 24 h实验组与对照组之间进行两两比较,每组各时间点的组内比较用单因素方差分析,P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 X型胶原蛋白表达

低倍镜下观察X型胶原阳性染色为软骨细胞胞质和胞膜着色,DAB显色为棕黄色,主要表达于髁突软骨成熟层及增殖层。高倍镜下观察阳性染色细胞胞质内有棕色颗粒。各实验组在成熟层及增殖层可见明显的X型胶原蛋白表达,表现为棕黄色的条带。24 h实验组在21 d表达最明显(图 1a),而12 h实验组在30 d时表达最显著(图 1b)。对照组相应区域染色面积小,染色程度浅(图 1c、d)。阴性对照(除不加第一抗体外,其余试剂与实验组相同) 动物髁突未见着色。

IOD均值结果显示:第14 天, 24 h组与对照组间

a: 21 d 24 h实验组; b: 30 d 12 h实验组; c: 21 d对照组; d: 30 d对照组

差异具有显著性(P<0.01)。第21 天,24 h实验组的IOD均值在各时间点中最高,与对照组及12 h实验组间差异具有显著性(P<0.01)。同时,对照组与12 h实验组间差异具有显著性(P<0.01)。第30天,24 h实验组的IOD均值与12 h实验组差异无显著性。

组内比较发现,对照组中X型胶原蛋白表达随着观测时间点向后推移,IOD均值持续下降(P<0.05)。在实验组中,12 h实验组的IOD均值在实验时间内一直上升(P<0.05),而24 h实验组的IOD均值在21 d时达到高峰(图 2)。

2.2 X型胶原纤维的mRNA表达

低倍镜下观察X型胶原mRNA阳性表达为软骨细胞胞质和胞膜着色,DAB显色为棕黄色,主要表达于髁突软骨成熟层及增殖层。高倍镜下观察阳性染色细胞胞质内有棕色颗粒。与蛋白表达结果类似,24 h实验组在21 d时mRNA阳性表达最明显(图 3a),而12 h实验组在30 d时表达最显著(图 3b)。对照组相应区域染色面积小,染色程度浅(图 3c、d)。阴性对照组(除不加探针外,其余试剂与实验组相同)其髁突未见着色。

IOD均值结果与蛋白的表达结果类似,详见图 4。

a: 21 d 24 h实验组; b: 30 d 12 h实验组; c: 21 d对照组; d: 30 d对照组

3 讨 论

临床上经常会遇到下颌发育不足的年轻成人患者,但是固定类功能矫治器是否也可应用于年轻成人一直存在争论。McNamara[3]认为功能矫治器并不能明显的增加成人下颌骨的长度。Ruf[4]则认为功能矫治器能够导致成人的髁突发生改建。Tagliaro等[5]通过扫描电镜技术及组织学的方法,来评价下颌骨髁突的改形变化,发现在成年鼠有髁突软骨再生。

本实验选择9 周龄雌性SD 大鼠,能够代表临床上年轻成人患者的年龄段(18~22 岁)[6]。髁突软骨细胞中的增殖细胞核抗原表达,亦即软骨细胞的增殖活性,存在明显的昼夜节律性[7]。大鼠髁突软骨细胞的增殖活动白天比夜晚明显活跃[8]。故本实验12 h实验组的大鼠戴用矫治器的时间选择在上午8 点到晚上8 点。这个时间段可以代表人类的晚上8 点到早上8 点。

X型胶原与一般的胶原纤维不同,不以纤维的形式存在,而是以液态均相的形式分布于细胞外基质内,是细胞外基质的重要组成成分。Rabie[2]发现X型胶原通常只存在于生长发育期的软骨内,由肥大软骨细胞合成,分布在即将骨化的软骨内,并启动软骨骨化[4]。Shen[7]发现凡是软骨内骨化活跃的部位就有X型胶原分布,如生长期的长骨生长板内,生长期的椎骨、胸骨、颅面骨的软骨内,以及骨折愈合过程中的软骨骨痂内,都有X型胶原的分布。因此可以认为X型胶原是反映髁突软骨成骨活跃程度的敏感标志。

本研究通过免疫组化及原位杂交技术,从分子水平考察成年大鼠下颌前伸后髁突改建的变化。本实验结果显示:通过对5 个时间点对照组X型胶原蛋白和mRNA表达情况的比较发现,X型胶原表达量呈现出逐渐减少的趋势,这可能是由于大鼠由生长期过渡到成年期这一过程中大鼠髁突组织生长速度减缓而分泌活动减弱所造成的,即髁突软骨到骨转化这一过程进程减慢。而2 实验组X型胶原表达量均增加,表明下颌前伸后关节盘受到牵拉,软骨细胞周围机械力发生变化引起细胞反应增强,进而导致软骨细胞增加X型胶原的表达。

2 实验组X型胶原蛋白表达在14 d时与对照组相比有显著差异,但mRNA表达在7 d时就表现出差异,这表明X型胶原蛋白和基因表达基本一致,但基因表达较蛋白表达早。12 h实验组X型胶原表达量在实验期间持续增加,在实验的14、21 d,其蛋白和基因表达均低于24 h实验组。24 h实验组在21 d时表达量最高,且为各实验组中最高的。这表明,12 h间歇性加力方式同样能诱导髁突软骨改建,但与24 h持续性加力方式相比,12 h间歇性加力方式的功能刺激强度较低,引起髁突软骨发生反应时间慢且表达量少。

摘要：目的:建立年轻成年大鼠下颌前伸动物模型,以X型胶原为检测指标,观察髁突软骨内成骨及其与下颌前伸持续时间的关系。方法:9周龄雌性大鼠75只,分为3组,其中2组为实验组,另一组为对照组,实验组动物戴用统一规格自制的咬合前导矫治器,分别戴用12h和24h。3组动物分别在实验后3、7、14、21、30d处死后取双侧髁突组织,使用免疫组化和原位杂交方法从蛋白水平和基因水平检测髁突软骨组织切片中X型胶原的表达情况。结果:免疫组化结果显示,24h实验组X型胶原表达量在21d时最高,且高于其他实验组;而12h实验组峰值出现在30d。原位杂交结果与免疫组化结果基本吻合。结论:功能矫治下颌前伸均能诱导年轻成年大鼠髁突软骨发生改建,但与12h间歇性加力方式相比,24h持续加力方式作用效果明显,且见效快。

关键词：安氏Ⅱ类错畸形,下颌前伸,髁突软骨,功能矫治器,Ⅹ型胶原

参考文献

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成年大鼠 篇4

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

地西泮由上海旭东制药有限公司提供 (批号071201) 。5-HT、乙酰胆碱 (Ach) 、左旋硝基精氨酸甲酯 (L-NAME) 、四乙胺 (TEA) 、4-氨基吡啶 (4-AP) 均购自Sigma公司, 氯化钡 (BaCl2) 由上海中邦化工厂生产, 其余试剂为市售分析纯。

1.2 大鼠离体主动脉环标本的制备

SD大鼠, 雄性, 体重220 g～250 g, 由山西医科大学实验动物中心提供。将大鼠直接断头处死, 迅速打开胸腔, 分离胸主动脉, 将取下的胸主动脉放入4 ℃的PSS液中, 仔细剔除血管周围的脂肪及结缔组织, 将动脉剪成3 mm～4 mm 的血管环。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔, 横向悬挂在10 mL浴槽内 (浴槽内含有通以100%氧, pH值为7.4、37 ℃ 的PSS液10 mL) , 下方固定, 上方以一细钢丝连于张力换能器, 使用Powerlab生物信号采集与分析系统记录血管环的张力变化。每个血管环悬挂在浴槽后, 调前负荷至2 g, 平衡1 h, 其间调整静息张力, 使之维持在2 g 的恒定水平, 每15 min换一次营养液。所有血管环用60 mmol/L KCl液刺激3次, 待收缩稳定后, 开始正式实验, 去内皮的实验, 用与血管内径相适的棉棒从管腔擦过, 连续两次, 用60 mmol/L KCl液刺激, 待收缩稳定后加10-5 mol/L的Ach检验血管内皮完整性。当Ach不产生舒张作用或舒张幅度小于预收缩的10%时, 认为内皮已去除。设定60 mmol/L KCl液引起的最大收缩幅度为100%, 以加入不同浓度药物引起的血管收缩幅度与KCl诱导的最大收缩幅度的比率反映血管张力变化。

1.3 大鼠胸主动脉环收缩作用测定

采用内皮完整的胸主动脉环, 加入KCl (60 mmol/L) 待血管环收缩达到稳定后用PSS液洗脱, 使其恢复到稳定静息张力, 在静息张力下累积加入5-HT使浴槽中的终浓度依次递增为10-7 mol/L, 3×10-7 mol/L, 10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L, 观察血管环的张力变化, 制作5-HT的累积浓度-血管反应曲线。

1.4 溶剂组和DZP组对大鼠胸主动脉环收缩作用的影响

采用内皮完整和去内皮的胸主动脉环, 加入KCl (60 mmol/L) 待血管环收缩达到稳定后用PSS液洗脱, 使其恢复到稳定静息张力, 在静息张力下, 溶剂组预孵10-4 mol/L溶剂, DZP低浓度组预孵3×10-6 mol/L的DZP, 高浓度组预孵10-4 mol/L的DZP, 均预孵20 min, 再分别加入累积浓度的5-HT, 观察血管环的张力变化。

1.5 DZP减弱5-HT诱导的血管环收缩作用的机制研究

根据浓度-血管反应曲线, 计算静息张力组、溶剂组、DZP低浓度组和高浓度组5-HT对血管收缩作用达50%时所对应的浓度 (即EC50值) , 其接近3×10-6 mol/L。在内皮完整的胸主动脉环上, 用KCl (60 mmol/L) 诱发血管环收缩达稳定后用PSS液洗脱, 恢复至稳定静息张力后, 对照组预孵低浓度DZP后加入3×10-6 mol/L的5-HT, 观察血管环的张力变化。实验组预孵低浓度DZP后, 再分别预孵L-NAME (10-4 mol/L) , TEA (10-2 mol/L) , 4-AP (10-3 mol/L) , BaCl2 (10-3 mol/L) , 达到稳定收缩坪值后, 加入3×10-6 mol/L的5-HT, 观察血管环的张力变化。同法, 预孵高浓度DZP, 观察血管环的张力变化。

1.6 统计学处理

计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 应用SPSS 13.0作统计分析, 采用t检验。

2 结果

2.1 DZP对大鼠胸主动脉环张力的影响

在静息张力状态下, 5-HT 对大鼠离体胸主动脉环产生浓度依赖性的收缩作用。与静息张力状态下相比, 溶剂组5-HT各浓度收缩作用无明显差异;DZP低浓度组、高浓度组收缩百分率明显降低, 5-HT浓度为3×10-7 mol/L, 10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L时有统计学意义 (P<0.05) , 浓度为10-7 mol/L, 3×10-6 mol/L时无统计学意义。详见图1。

2.2 内皮对DZP减弱5-HT诱导的血管环收缩作用的影响

在去内皮的胸主动脉环上, 预孵低浓度DZP, 再加入浓度递增的5-HT, 血管环呈浓度依赖性收缩, 与内皮完整组相比, 其收缩百分率升高, 即内皮减弱了DZP对5-HT诱导的血管收缩的减弱作用。在浓度为3×10-7 mol/L, 10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L时有统计学意义 (P<0.05) 。同法, 预孵高浓度DZP后, 在浓度为10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L时有统计学意义 (P<0.05) 。详见图2、图3。

2.3 L-NAME、TEA、4-AP、BaCl2对低浓度DZP减弱5-HT诱导的血管环收缩作用的影响

在内皮完整的胸主动脉环上, 对照组血管环出现一个峰值收缩, 实验组预孵阻断药L-NAME、TEA、4-AP、BaCl2后减弱了DZP减弱5-HT诱导的血管环收缩的作用, 表现为收缩峰值的升高 (P<0.05) 。详见图4。

2.4 L-NAME、TEA、4-AP、BaCl2对高浓度DZP减弱5-HT诱导的血管环收缩作用的影响

在内皮完整的胸主动脉环上, 对照组血管环几乎无收缩反应, 实验组预孵阻断药L-NAME、BaCl2后减弱了DZP对血管环的收缩抑制作用, 出现收缩反应, 且有统计学意义 (P<0.05) ;而实验组预孵TEA、4-AP后对血管环作用无统计学意义 (P>0.05) 。详见图4。

3 讨论

地西泮能降低人体动脉血压[3], 在离体胸主动脉环上, 能松弛和抑制氯化钾、氯化钙、去甲肾上腺素、去氧肾上腺素引起的浓度依赖性的血管收缩, 对血管平滑肌具有松弛作用[4,5]。

5-羟色胺为内源性的血管活性因子, 是中枢神经系统重要的神经递质, 同时又是重要的血管调节物质。5-HT受体包括七个类型 (5-HT1-5-HT7) [6]。目前, 已知分布于大血管平滑肌上的5 - HT受体主要为5 - HT2A亚型, 5-HT主要通过血管平滑肌的5-HT2A受体引起血管收缩。受体激动时, 经G蛋白的耦联作用激活磷脂酶C (PLC) , PLC促进二磷酸磷脂酰肌醇水解产生三磷酸肌醇 (IP3) 和二酰甘油 (DG) 。IP3最初促使细胞内Ca2+贮存库释放Ca2+进入胞浆, 随后由Ca2+的释放诱发较长的细胞外Ca2+内流。Ca2+与细胞内的钙调蛋白结合形成复合物, 复合物可结合于肌球蛋白轻链激酶并使之活化, 导致肌球蛋白轻链磷酸化和平滑肌收缩;DG在Ca2+存在下可激活蛋白激酶C (PKC) , 使蛋白质或酶发生磷酸化, 从而引起血管收缩[7,8]。本实验中, DZP使5-HT诱导的血管环的收缩作用减弱, 提示DZP可能通过IP3 -Ca2+信号通路和DG-PKC信号通路, 阻滞内钙释放和外钙内流, 减弱了5-HT对血管的收缩效应。

血管平滑肌的舒缩功能可通过内皮释放的血管活性物质来进行调控, 其中一氧化氮 (NO) 和前列环素 (PGI2) 是典型的内皮释放的血管活性物质, 能产生强大的舒血管作用[9]。NO能刺激可溶性鸟苷酸环化酶, 从而引起血管平滑肌环磷酸鸟苷 (cGMP) 水平的增加, 后者主要通过cGMP依赖性蛋白激酶使钙内流减少, 增加钙ATP酶对钙的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管舒张[10]。本实验中, 经DZP预处理, 去内皮的血管环引起血管收缩幅度的减弱明显弱于内皮完整的血管环。在内皮完整的血管环上, L-NAME预处理后, 减弱了DZP对血管环收缩作用的减弱, 使收缩增强, 提示DZP对5-HT诱导的血管环收缩作用的减弱可能与内皮有关, 可能有NO途径的参与。

K+通道活性的改变可使动脉平滑肌细胞膜电位去极化或超极化, 是参与动脉血管舒缩调节的重要机制[11,12]。当这些K+通道的活性受抑制时, 可使细胞膜去极化, 从而使电压依赖性钙通道开放, 细胞外钙内流, 细胞收缩而导致血管张力增加;相反其被活化时, 可使细胞舒张而导致血管张力降低。本实验分别用TEA、4-AP、BaCl2阻断钾通道, 低浓度DZP减弱了其对血管环收缩作用的减弱, 使收缩增强, 提示低浓度DZP对5-HT诱导的血管环收缩作用的减弱可能有KCa、KV、KIR通道的参与。高浓度DZP则只对BaCl2有作用, 提示高浓度DZP对5-HT诱导的血管环收缩作用的减弱可能只有KIR通道的参与。