酿酒酵母

酿酒酵母（精选5篇）

酿酒酵母 篇1

0 引言

酿酒酵母是目前研究的最为彻底的真核微生物之一,它一直被普遍应用于食品与饮料用酒精的生产上。人们广泛的研究酿酒酵母是由于它对人类毫无伤害且具备良好的生产性状,1996年公布的酵母全基因组序列使得构建新的菌种的遗传操作日渐成熟[1]。氮是构成蛋白质和核酸的重要元素,是生命物质的基本组成部分。因此,研究酿酒酵母中氮的基础代谢是有其应用价值与意义所在的。

1 氮代谢的核心反应

酿酒酵母对氮的吸收分两步:首先通过特定的透性酶吸收有效的氮源;其次降解氮源参与氮代谢途径[2]。其主要的氮同化作用途径如下:

反应(1)由依赖NADPH的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,NADPH-GDH)催化,NADPH-GDH的两个同功酶由GDH1/GHD3编码。GDH1的表达受到氮(Gln3p和Gcn4p)和碳(HAP复合体)的代谢的转录激活因子的调控[3]。GDH3的表达也受到Gln3p的调控。GDH3在葡萄糖生长培养基中,GDH3的表达被抑制,这点与GDH1正好相反;在呼吸状态下或固定阶段,GDH3被诱导表达[4]。

反应(2)由GLN1基因编码的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)催化,GLN1的转录受到3个系统的调控。第1个系统依赖于正向作用元件GLN3的产物。第2个系统是氨基酸的调控,通过正向元件Gcn4p进行调控。第3个系统是嘌呤抑制,没有发现其特定的调控元件,但是在gln3/gcn4的突变体的嘌呤饥饿条件下发现了GS的去阻遏。

反应(3)由GDH2基因编码的依赖NADH的NADH-GDH催化,GDH2的启动子基因有6个不同的序列元件,其中2个元件作为上游的激活位点,剩下4个位点用来阻遏2个USAS的作用,GDH2的转录也依赖于Gln3p。当在谷氨酰胺上生长时,GDH2的转录会降低。当在非发酵碳源或限制葡萄糖的量甚至在减少氮源谷氨酰胺的培养基上生长时,会出现抑制谷氨酰胺的情况,这时NAD-GDH的表达水平会有所上升。

反应(4)由GLT1基因编码的依赖NADH的谷氨酸合酶(glutamate synthase,GOGAT)催化。GLT1的启动子包含Gcn4p,Dal80p的连接位点和3个可能作为操纵UASNTR的GATAA序列。丰富氮源对GLN1的表达有抑制作用,但是GLN3可以激活其表达[5]。

2 氮源的吸收与作用

2.1 不同氮源的代谢及其作用

氮源的类型直接影响到酿酒酵母对氮的利用率。自然界中野生型的酵母主要利用的是尿素、铵盐以及氨基酸等氮源。利用营养缺陷型菌株研究证明,一类含氮化合物(多胺,甲硫氨酸,赖氨酸)能够从环境中获得,而另一些含氮化合物(苏氨酸,芳香类氨基酸,异亮氨酸和缬氨酸)必须由酵母合成[6]。丰富的氮源如氨、谷氨酸、天冬酰胺,贫乏的氮源如脯氨酸、尿素。当在含有丰富的氨或可转化为氨的氮源上生长时,主要发生途径(1)的反应,反应生成的谷氨酸接着和NH4+在GS催化下合成谷氨酰胺的反应(2)。反应(3)在这一条件不会发生。

当谷氨酸作为氮源时,利用GS催化的反应(4)合成谷氨酰胺,该反应的氨由NAD-GDH催化的反应(3)产生。当谷氨酰胺作为独立氮源时,谷氨酸通过GOGAT或者NADPH-GDH来合成。GS催化的反应(2)是谷氨酰胺合成的唯一途径,要想使缺乏GS的细胞正常生长,必须对它提供谷氨酰胺。在缺失GDH1的突变体中氨的利用依靠反应(4)由GLT1编码的GOGAT催化作用。反应(2)和反应(4)一起催化α-酮戊二酸与NH4+合成谷氨酸的反应。整体反应催化酶系规定为GS-GOGAT[2,7,8]。

其它氮源的利用如图1[2,9]所示。

把丰富型氮源加入仅含贫乏型氮源的培养基中时,利用贫乏氮源的基因的转录会受到抑制,相关产物会选择性失活和降解。这涉及到NCR(Nitrogen Catabolite Repression)机制,它是一种选择最优氮源的机制,如在利用铵(ammonium)或谷氨酸盐(glutamine)的细胞中,GATA转录因子Gln3在细胞质中被Ure2捕获,然而再利用某些贫乏氮源时Gln3能进入细胞核中[10]。这一机制的一个最好的实例是对脯氨酸的利用[2]。

2.2 NH4+的转运

酿酒酵母对NH4+的转运依靠NH4+转运蛋白Mep(ammonium transport protein)。目前已知的至少有3种透性酶:Mep1p,Mep2p和Mep3p。MEP1编码高疏水的含492个氨基酸、54k Da的Mep1p,其主要功能是在氮限制的条件下同化培养基中低浓度的NH4+(0.1~5m M),以实现酿酒酵母的最优生长。当细胞生长在低浓度NH4+或者贫乏氮源(如尿素、脯氨酸)培养基中时,Mep1p会得以高表达。在高浓度NH4+或丰富氮源(如谷氨酰胺、天冬酰胺)情况下会出现抑制的作用。MEP2编码高疏水的、含499个氨基酸的Mep2p,与Mep1p的序列有41%的相似性,它比Mep1p的转运要慢。当把Mep2p的MEP3编码含489个氨基酸的Mep3p,与Mep1p和Mep2p有分别为79%和39%的序列的高相似性。在NH4+浓度饱和的情况下,Mep3p支持酿酒酵母的最优生长;当NH4+浓度低于1m M时它会表现的非常敏感[11]。

这3种酶对NH4+的亲和力以Mep2p(km:1~2m M)最高,其次是Mep1p(Km:5~10m M),最低的是Mep3p(km:1.4~2.1m M)。当NH4+的浓度低于5m M时,却使这3个酶的编码基因的突变体不能正常生长,但是表达其中的任何一个MEP基因突变体都可以在培养基中正常生长。当NH4+的浓度高于20m M时,不需要任何的Mep转运蛋白来转运NH4[2,7,11]。

3 氮代谢对其他代谢生理现象的影响

3.1 影响葡萄糖的利用

酿酒酵母优先利用葡萄糖而非其它碳源。转运葡萄糖到酵母细胞内的转运子是发酵中的糖利用的关键因素,拥有多种己糖转运子。其中,Hxt6和Hxt7是高亲合的转运子,在表达上有相似性:细胞进入稳定期后,可同化氨的耗尽触发诱导表达,而且在这一期间持续不变。除了存在大量己糖的情况外,当细胞处于氮饥饿时,这两个己糖转运子都会稳定地表达[12]。

还有学者认为这一调控是由于其它糖的转运子的代谢失活作用引起的。研究葡萄糖利用的糖的转运失活得到结果:这一失活是由氮饥饿引起的蛋白质的构型变化而引起的,因为培养基中添加氮源时会强烈抑制这一失活作用[13]。另外,有研究表明,Snf1蛋白激酶调控多种由去除葡萄糖而引起的压力反应,而Snf1与氮信号密切相关[14]。

3.2 影响发酵的能力

厌氧饥饿情况在工业发酵中时常发生,它会影响细胞的性质。氮浓度对发酵时的基因表达起到决定性作用,使得酵母细胞在低氮浓度时表现出与碳饥饿类似的现象[15]。在稳定期,细胞生长到饱和状态,在之后的24h厌氧条件下会出现碳或氮的饥饿现象,氮饥饿的细胞仍保持了大部分的饥饿前细胞的发酵能力,且不依赖于之前的生长条件,这一速率要比碳饥饿的细胞高很多,有氧与厌氧的情况下这一变化并没有明显的差别。而氮抑制的细胞在碳饥饿条件下失去了几乎所有的发酵能力。原因可能是由于ATP的量在碳饥饿时减少[16,17]。在发酵过程中降低温度和添加氮可减少发酵时间,使发酵更为完全,当酵母指数生长时期加入效果最明显[18,19]。

由于氮被消耗掉,发酵细胞从氮的阻遏环境转到氮的去阻遏环境。这两者之间会有不同的NH4+和氨基酸的消耗。精氨酸和丙氨酸在氮阻遏的情况下几乎不被利用,而支链和芳香物族的氨基酸的利用率会增加[20]。

4 氨同化作用的代谢工程

4.1 减少甘油的合成

甘油是酒精发酵的主要副产物之一,催化甘油生成的3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPD)有两个同功酶基因编码,单基因的缺失突变体不能有效地减少甘油的合成,而双基因缺失的突变体由于NADH在胞内的积累而在厌氧条件下无法存活[21]。由此,通过阻断甘油合成的途径是行不通的。引入氨的同化作用来竞争性的利用NADH,可以有效地减少甘油合成途径的流量。Nissen等[22]通过实验证实:酿酒酵母在厌氧条件下生长,通过减少过剩的NADH的形成和增加生物合成中ATP的消耗可以减少甘油的形成并且增加酒精的产量。过表达GLT1和GLN1的目的菌株TN19(gdh1-A1 PGK1p-GLT1 PGK1p-GLN1)与野生型菌株相比,酒精产量增加10%,甘油产量下降38%。

4.2 优化氧化还原代谢

Santos等[23]通过改变重组菌株氨的同化作用得以增加NADPH的利用率。他们对比了有氧与无氧条件下引入铵同化作用的发酵,结果有氧条件下甘油的产量较无氧条件下会减少。

Roca等[24]在木糖利用的重组菌株的基础上构建了删除GDH1、过表达GDH2或GLT1和GLN1的重组菌株。过表达GDH2的菌株的酒精产量从0.43提升到0.51mol/碳(Cmol)Cmol(-1),同时减少了44%的木糖醇的产生。过表达GS-GOGAT复合体的菌株,在分批培养条件下转化木糖到酒精并没有改进,但是在低稀释速率的碳限制的连接培养条件下,有16%的酒精产量增加。

Grotkjaer等[25]也进行了相关的研究:他们对比两个重组酿酒酵母菌株TMB3001和CPB.CR4的木糖发酵。在限制性葡萄糖(2.5g L(-1))和木糖(13g L(-1))的培养基中厌氧连续培养两种菌株,木糖还原酶的活性已经从使用NADPH转为使用NADH作为氧化还原的辅酶因子。这一转变有利于解决氧化还原的引起的辅酶因子NADPH/NADH的不平衡,同时CPB.CR4菌株的发酵结果有25%酒精产量的增加,也可以证实这一分析。

5 结语

酿酒酵母的氨同化作用中氨的功能不仅局限在作为氮源上,同样是连接降解和生物合成途径的一个中间代谢物。酿酒酵母的氨的同化作用的调控有3个主要的元素:一是含氮化合物的合成与互相转换;二是作用于含氮化合物吸收的透性酶;三是调控酶和透性酶活性的转录因子和膜交换蛋白。氨的表达调控机理已经很明确,但是代谢机制还需要进一步的建立。

酿酒酵母 篇2

采用废啤酒酵母分析了pH值、加菌量等影响啤酒酵母吸附Cu2+的主要因素,结果表明:pH4.5,吸附时间1-1.5h,加菌量0.01g・ml-1为最佳吸附条件;酵母对Cu2+的吸附符合Langmuir模型,表现为单分子层吸附;酵母菌细胞壁表面的.-COOH,-NH3以及脂肪在其吸附铜离子时起着重要作用,NaOH处理的酵母吸附能力大大增加.

作 者：张爱茜 刘伟 吴海锁 韩朔睽 王连生 ZHANG Ai-qian LIU Wei WU Hai-suo HAN Shuo-kui WANG Lian-sheng  作者单位：张爱茜,刘伟,韩朔睽,王连生,ZHANG Ai-qian,LIU Wei,HAN Shuo-kui,WANG Lian-sheng(南京大学环境学院,污染控制与资源化国家重点实验室,南京,210093)

吴海锁,WU Hai-suo(江苏省环境科学研究院,南京,210008)

刊 名：环境化学  ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL CHEMISTRY 年，卷(期)：2005 24(6) 分类号：X13 关键词：酵母菌   生物吸附   铜离子  

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酿酒酵母 篇3

1.1 GUT2基因与甘油代谢

在酿酒酵母细胞中, 存在着如下两条甘油分解的代谢途径[2]。第一条主要途径是:在胞质中甘油先经由GUT1基因编码的甘油激酶催化生成3-磷酸甘油, 后者再经线粒体由GUT2基因编码的FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶催化生成磷酸二羟丙酮 (Dihydroxyacetone-P, DHAP) , 最后DHAP再转化为3-磷酸甘油醛, 参与能量代谢[2]。GUT1基因与GUT2基因编码调节的蛋白质在细胞中的位置不同, 所发挥的生物学功能也不同。经过对酿酒酵母细胞甘油代谢途径的研究发现, 在以甘油为碳源的培养基上缺失GUT2基因的菌株不能生长, 这为甘油工业生产提供了一定的理论基础[3]。

在酿酒酵母细胞中, 还存在着另一条分解甘油的途径。在该代谢途径中, 甘油先经过由GCY1与YPR1基因编码的NADP+-甘油脱氢酶催化生成二羟丙酮, 后者在DAK1和DAK2基因编码的二羟丙酮激酶的参与下生成DHAP, 继而进入糖酵解途径[4]。由于缺失GUT1/GUT2基因的菌株在以甘油为唯一碳源的情况下不能进行生长代谢, 因此尚不清楚这条分解代谢途径在酵母细胞中发挥怎样具体的生理功能。

1.2 GUT2基因与3-磷酸甘油穿梭反应

在酿酒酵母生长过程中, 大量NADH在胞内产生。无氧代谢条件下, 酵母细胞氧化NADH的唯一途径是产生甘油;在有氧条件下, 有两大主要机制可将胞内的NADH转运到线粒体电子传递链中, 即线粒体外的NADH脱氢反应和3-磷酸甘油穿梭反应 (Glycerol-3P, G3P shuttle) , 前者即Nde1p和Nde2p催化的NADH脱氢反应[5,6]。在酵母细胞较低的比生长速率下, 这两大机制均能够维持细胞的呼吸生长[5]。G3P shuttle反应涉及到依赖FAD的Gut2p和辅因子Gpd1p。Gut2p存在于线粒体内膜上, 其催化位点指向细胞质, 是维持胞内氧化还原平衡的主要因素之一[7]。G3P shuttle反应过程如下:在胞浆NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶的催化下, 首先NADH使DHAP还原为3-磷酸甘油, 然后3-磷酸甘油被线粒体FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶再氧化为DHAP。在这个反应系统之中, 当NADH催化DHAP转化为3-磷酸甘油时, NADH也被3-磷酸甘油脱氢酶即Gpd1p转化为NAD+, 接着3-磷酸甘油由Gut2p将其电子传递到呼吸链中, 参与能量代谢[8,9]。

在不同条件下, 这两大机制的重要性各有所不同[8]。在高浓度葡萄糖有氧生长的情况中, G3P shuttle失活, 呼吸作用部分受抑制, 原因是GUT2基因受到葡萄糖的阻遏作用, 这种阻遏效应作用在转录水平, 表现为Gut2p受高葡萄糖浓度抑制。在低浓度葡萄糖有氧生长的情况下, NADH脱氢酶和G3P shuttle同时作用, 其中NADH脱氢酶发挥更加重要的作用, 表现为在低浓度葡萄糖中, 缺失Nde1p/Nde2p的菌株比缺失Gut2p的菌株受到的影响更为严重[10]。另外有研究表明, 低流量NADH形成时, G3P shuttle足够维持细胞内的氧化还原平衡, 而当NADH代谢流高于某一特定值时, 线粒体外的NADH脱氢反应就变得非常必要。因此G3P shuttle真正起作用是在酵母细胞低生长率的情况下, 甚至是饥饿状态[11,12]。

G3P shuttle中, Gut2p活性受到ATP/ADP和NADH脱氢酶激活作用的抑制。Gut2p对ATP的抑制敏感, 即在非常低的ATP浓度下, Gut2p大部分的活性仍被抑制[13]。GUT2基因的表达受到碳源的调控, 当细胞在葡萄糖等发酵性碳源上培养时转录被抑制, 而在甘油或乙醇等非发酵性碳源上培养时转录被诱导。但无论是利用哪种碳源, GUT2基因的缺失导致的G3P shuttle功能丧失都不会引起酿酒酵母细胞的生长缺陷[14]。

1.3 GUT2基因作为一个全新的线粒体内膜肽酶作用物被发现

1.3.1 线粒体内膜肽酶IMP的基本认知

线粒体在细胞的生命活动中有着非常重要的作用, 不仅为细胞代谢提供能量, 还参与细胞周期的调控、细胞凋亡等生命活动。这些生物功能由线粒体中的蛋白质来执行, 其中绝大部分蛋白质都是经过细胞核编码, 再在核糖体上合成后运输到线粒体的各个部位。线粒体是通过一套完备的蛋白质转运系统来转运线粒体前体蛋白质的[15]。线粒体具有外膜、内膜、膜间隙、基质4个功能区隔, 进入不同部位的蛋白质转运途径也不同[16]。

线粒体的前体蛋白定位分选信号分为可剪切的前导序列和非剪切的多种整合定位信号两类[16]。前导序列存在于线粒体前体蛋白的N端, 含有10~80个氨基酸残基, 能将蛋白质定位到线粒体基质中[17]。此外前导序列之后还有一段疏水分选信号, 它决定了前体蛋白在内膜或膜间隙中的定位。对于内膜蛋白, 其分选信号是成熟蛋白的一部分并可辅助前体蛋白定位于线粒体内膜上;对于膜间隙蛋白, 其分选信号可被在内膜外侧的线粒体内膜肽酶 (inner membrane peptidase, IMP) 所剪切, 所形成的成熟蛋白被释放至线粒体膜间隙中[17,18]。除了IMP, 内膜上还有多种其他蛋白酶参与膜间隙前体蛋白分选信号的剪切, 如Oct1、m-AAA等, 这些蛋白酶在线粒体蛋白质定位分选中起着重要的作用[18]。1.3.2 GUT2基因是Imp1的酶作用物IMP酶加工从线粒体基质输出到膜间隙的前体蛋白, 该酶复合体包含两种起催化作用的组分Imp1和Imp2, 它们发挥催化作用的位点在膜间隙。这两种组分含有三种保守区域, 其中包含了同源的信号肽酶和在区域I中起催化作用的丝氨酸[19,20]。

GUT2基因编码的线粒体3-磷酸甘油脱氢酶存在于线粒体内膜上, 参与细胞的碳水化合物代谢和甘油利用。有研究显示, 缺失GUT2基因的突变体在含有甘油的培养基中表现出线粒体缺失pet表现型, 而在含有乙醇或者醋酸盐的培养基中的生长则与正常细胞相差无几。在缺失GUT2基因的菌株中导入带有GUT2基因的质粒, 该菌株在甘油培养基上又可正常生长。这在一定程度上说明GUT2基因与菌株在甘油培养基上呈现出的线粒体缺失pet表现型有关[19]。另外在正常菌株和Imp1缺失的菌株中, 导入带有GUT2基因的质粒后, 分别对两类菌株表达的蛋白质进行电泳, 可检测到不同的条带, 间接说明了Imp1影响GUT2基因的表达[19]。

1.3.3 Imp1酶作用物p Gut2和p Cytb2的导肽被功能性地交换

在线粒体前体蛋白转运过程中, 对于膜间隙蛋白, 当细胞色素b2 (cytochrome b2, Cytb2) 整合至线粒体内膜后首先由线粒体加工肽酶 (mitochondrial processing peptidases, MPP) 切掉前导序列, 然后由内膜外侧的IMP水解疏水分选信号, 前体蛋白成熟并被释放至膜间隙[16]。在这个过程中, IMP也起着信号肽酶 (signal peptidase) 的作用。信号肽酶指的是在质膜蛋白插入到质膜中后去除信号肽的一组肽内切酶。导肽又称导向序列, 是新生蛋白N-末端的一段肽链, 通常是20~80个带正电荷的碱性氨基酸[20,21]。导肽对于蛋白质的定位起着重要作用。

通过交换p Cytb2和p Gut2的导肽, 构建出两个嵌合体质粒, 将质粒导入到正常和Imp1缺失的菌株中, 分别标记为WT+p Cytb2-m Gut2、WT+p Gut2-m Cytb2、△imp1+p Cytb2-m Gut2和△imp1+p Gut2-m Cytb2菌株。研究结果显示, 导肽互换后的嵌合体菌株可以检测到较为一致的条带, 另外在△imp1+p Gut2-m Cytb2中被表达的短的GUT2序列不如△imp1+p Gut2-m Cytb2菌株中长的Cytb2序列表达的效能高[19]。以上结果都说明在酵母细胞中存在着Imp1酶作用物p Gut2和p Cytb2的导肽被功能性交换的现象, 并且p Gut2和p Cytb2被功能性地交换后均能正常表达[19,22]。

2 GUT2基因的工业应用

甘油是一种十分重要的工业原料和添加剂, 用途非常广泛, 可应用于多个行业。甘油的生产通常有三种方法:油脂皂化水解法、化学合成法和发酵法。在发酵法中, 研究较多的便是利用酿酒酵母来发酵生产甘油[23]。根据酿酒酵母细胞中甘油的代谢途径, 可通过以下三条途径来提升酵母发酵过程中甘油的产量: (1) 缺失编码线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的GUT2基因, 甘油降解途径失效, 同时也造成了甘油异化途径缺陷, 使甘油大量聚集; (2) 缺失编码线粒体外部NADH脱氢酶的两个同功酶NDE1和NDE2基因[2], NADH脱氢酶失活, 甘油降解途径失活; (3) 缺失编码调节甘油跨膜运输蛋白Fps1p的FPS1基因的N-末端区域, 细胞不能合成Fps1p, 从而使胞内合成甘油无法通过甘油通道排出, 甘油在胞内聚集[24]。

利用一步基因置换法缺失GUT2、NDE1、NDE2基因, 切断了胞质NADH线粒体呼吸链的氧化反应;利用两步基因置换法部分缺失FPS1基因的N-末端区域, 导致甘油运输通道失控。根据遗传学原理, 对等位基因进行分离, 并将不同基因型的酿酒酵母细胞融合, 修饰重组以下4个基因GUT2、NDE1、NDE2和FPSL, 分别得到不同基因重组的菌株。实验结果表明, 各个菌株均在一定程度上提高了甘油的产量, 其中同时缺失以上4个基因的菌株在切断甘油降解途径的同时促进了甘油的生产, 因此甘油产量大幅度提高, 从而获得了期望的高产甘油酵母菌株。

3 结语

酿酒酵母 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) YS2和大肠杆菌DH5α由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心提供;质粒pUG6、pSH65购自EUROSCAR。

1.1.2 酶和试剂

rTaq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司;G418和Zeocin分别购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京迈晨科技有限公司;德国ROCH甘油检测试剂盒;引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

按照引物设计原则和要求 (见图1) , 设计4对引物 (见表1) :其中引物L1、L2含有45bp序列分别与HOR2基因上下游序列同源, 另外的19bp、22bp序列是扩增筛选标记的正反向引物。

1.1.3 仪器

JS-380A 自动凝胶图像分析仪 (上海培清科技有限公司) ;TGL-16M高速台式冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司) ;DYY26B型稳压流电泳仪 (北京市六一仪器厂) ; LRH-150恒温培养箱 (上海一恒科学仪器有限公司) ;THZ-82A恒温摇床 (国华企业) ;ABI 2720型基因扩增仪 (上海天呈科技有限公司) ;5973N-6890气相色谱仪 (安捷伦科技有限公司) 。

1.1.4 培养基

(1) 完全培养基YPD (%) :

酵母膏1, 蛋白胨2, 葡萄糖2, 琼脂糖2.0;

(2) 筛选培养基:

在YPD中添加终浓度为200μg/ml的G418或10μg/ml的Zeocin。

(3) 诱导培养基YPG:

更换YPD中的葡萄糖为半乳糖。

1.2 方法

1.2.1

提取酿酒酵母YS2的基因组DNA[5]

1.2.2 验证YS2中HOR2基因的存在

以基因组DNA为模板, 分别用A-B、A-D、C-D引物对进行PCR。根据结果来验证HOR2的存在。PCR条件为:95℃ 3min、 (94℃ 30s、52.5℃ 30s、72℃ 1.5min) ×33循环、72℃ 10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3

制备质粒pUG6和pSH65[6]

1.2.4 构建HOR2基因敲除组件

以质粒pUG6为模板, 用引物L1-L2进行PCR得到转化敲除组件。PCR条件:95℃ 3min、 (94℃ 30s、53.9℃ 30s、72℃ 1min42s) 33个循环、72℃ 10min, 纯化回收目的产物。

1.2.5 转化HOR2基因敲除组件及筛选克隆子

采用醋酸锂转化[7]将HOR2基因敲除组件转化至酿酒酵母YS2细胞中。转化后的菌液涂布在含G418的YPD平板上, 28℃培养2～4d, 将单菌落影印至新的含G418的YPD平板上继续培养至单菌落出现。

1.2.6 验证克隆子

分别用引物对A-D、A-KanB、KanC-D、L1-L2通过菌落PCR来扩增转化子的基因组DNA。通过比较扩增产物与预期产物的大小来挑选阳性克隆子。PCR条件为:95℃ 5min、 (94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min 20s) ×33循环、72℃ 10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析, 根据验证结果确定阳性克隆子。

1.2.7 切除kanr筛选标记

采用相同转化法将pSH65质粒转入阳性克隆子, 在YPG (乳糖) 培养基中摇床培养3～5h, 取适量涂布YPD平板, 获得单菌落, 分别影印含G418和含Zeocin的不同YPD平板, 筛选Kanr抗性标记丢失的菌株。并用引物A-D、A-KanB、KanC-D进行菌落PCR验证。PCR条件同上。将得到的菌株在YPD培养基中连续传代12次, 丢失质粒pSH65, 从而获得HOR2单倍体缺陷菌株

1.2.8 获得HOR2基因敲除双倍体菌株

以上一步实验获得的菌株出发, 重复1.2.4～1.2.7的实验, 敲除HOR2另外一条等位基因最终获得HOR2基因敲除双倍体菌株, 该菌株命名为YS2-HOR2。

2 结果与分析

2.1 YS2中HOR2 基因的验证

以YS2基因组DNA为模板, 用引物A-D、C-D、A-B进行PCR验证, PCR产物电泳结果 (图2) 显示产物大小与引物设计时所预期的相一致说明该菌中存在HOR2基因。

M:200bpMarker;1:C-DPCR产物, 573bp;2:A-BPCR产物, 532bp;3:A-D PCR产物, 1 430bp。M:200bpMarker;1:C-D productofPCR, 573bp;2:A-Bproductof PCR, 532bp;3:A-D productofPCR, 1 430bp.

2.2 HOR2基因敲除组件的构建

以质粒pUG6作为模板, 使用引物L1-L2进行PCR得到HOR2基因敲除组件, PCR产物电泳结果 (图3) 符合HOR2基因敲除组件的理论大小1 703bp。

M:200bpMarker;1:HOR 2基因敲除组件序列, 1 703bp。M:200bpMarker;1:HOR 2geneknockoutcassette, 1 703bp.

2.3 克隆子的验证

YS2转化HOR2基因敲除组件后在含G418的平板上筛选整合kanr标记的转化子后进一步用引物A-D、A-KanB、KanC-D、L1-L2通过菌落PCR验证 (图 4) , 其扩增产物大小与预期结果相符, 表明HOR2敲除组件与目标基因HOR2发生了正确重组。

M:200bpMarker;1:C-D PCR产物, 573bp;2:A-B PCR产物, 532bp;3:KanC-D PCR产物, 755bp;4:A-KanBPCR产物, 1 075bp;5:L1-L2PCR产物, 1 703bp;6:A-D PCR产物, 2 270bpand 1430bp M:200bpMarker;1:C-D productofPCR, 573bp;2:A-B productof PCR, 532bp;3:KanC-DproductofPCR, 755bp;4:A-KanBproduct ofPCR, 1 075bp;5:L1-L2productofPCR, 1 703bp;6:A-Dproduct ofPCR, 2 270bpand 1 430bp

2.4 kanr筛选标记切除的HOR2单倍体缺陷菌株的验证

整合kanr标记的HOR2杂合菌株转化pSH65后经半乳糖诱导切除抗性标记后在原始HOR2基因位置留下一loxP位点。用引物A-D进行PCR扩增 (图 5) , 分别得到828bp、1 430bp目的条带, 表明抗性标记基因已被正确切除。

2.5 YS2-HOR2突变株的获取

kanr标记切除的HOR2单倍体缺陷菌株经过连续传代培养移除质粒pSH65后再次转化HOR2基因敲除组件, 最终获得的阳性克隆子经菌落PCR验证 (图 6) , 其扩增产物大小与预期结果相符, 表明成功获得了HOR2双倍体缺陷菌株YS2-HOR2。

2.6 突变株YS1-SFA1发酵产乙醇分析

对YS2和YS2-HOR2进行摇瓶发酵, 气相色谱分析乙醇产量 (图7) , 试剂盒测定甘油含量 (图8) 。通过比较, YS2-HOR2甘油产量较出发菌株YS2降低3.34%, 乙醇产量增加1.96%。

3 讨论

甘油是酒精生产中主要副产物之一。甘油的生成因菌株、原料与工艺的不同会消耗4%～10%的总碳源[8]。如果这些碳源用来生成酒精, 这将大幅度提高酒精生产效率。本研究YS2-HOR2甘油产量降低3.34%, 乙醇得率提高了1.96%, 实现了副产物总碳源20%～49%的转化, 因而具有一定的经济和社会价值。

M:200bpMarker;1:A-KanBPCR产物, 0bp;2:KanC-DPCR产物, 0bp;3:C-D PCR产物, 573bp;4:A-B PCR产物, 532bp;5:A-DPCR产物, 1 430bpand 828bp。M:200bpMarker;1:A-KanBproductofPCR, 0bp;2:KanC-D productofPCR, 0bp;3:C-D productofPCR, 573bp;4:A-B productof PCR, 532bp;5:A-D productofPCR, 1 430bpand 828bp.

M:200bpMarker;1:A-BPCR产物, 0bp;2:C-D PCR产物, 0bp;3:A-D PCR产物, 828bp。M:200bpMarker;1:A-B productofPCR, 0bp;2:C-D productof PCR, 0bp;3:A-D productofPCR, 828bp.

由于3-磷酸甘油酯酶含有两个同功酶, 分别由两个基因编码, 即RHR2 (GPP1) 和HOR2 (GPP2) 。其中HOR2为渗透调节型, RHR2为厌氧调节型[9]。本实验所实现的甘油产量降低不多, 一个原因可能是由于代谢得到了另外一个同功酶的补充。另外, 酿酒酵母甘油代谢也受到GPD1和GPD2等[10,11]其他相关基因的调节和渗透压的影响[12,13], 因此HOR2基因若能结合其它相关基因的敲除将会对酵母甘油和乙醇合成产生更明显的效果。本研究通过Cre/loxP系统筛选标记重复利用的原理, 成功地获得了YS2-HOR2突变株, 其突变发生在染色体水平, 遗传稳定, 不需添加其他营养物质即可稳定生长。由于敲除基因后会在目的基因处留下一个loxP位点, 因此如果要连续敲除多个基因, 还必须考虑到Cre酶发挥作用的范围以及单个或多个loxP位点本身重组对菌株造成的影响。

摘要：目的:构建酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株并研究其对甘油和乙醇产量的影响。方法:以PCR为基础, 通过同源重组的方式使目的基因缺失。结果:通过设计含有与HOR2 (GPP2) 基因两侧序列同源的长引物, 以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件, 转化酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) YS2, 获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒PSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记, 在原ORF基因处保留一个loxP位点, 丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。发酵实验表明, 突变株甘油产量降低3.34%, 乙醇产量提高1.96%。结论:成功获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株, 并命名为YS2-HOR2。

酿酒酵母 篇5

RNA剪接 (RNA splicing) 是t RNA、r RNA, 特别是m RNA加工与成熟的重要生物学过程, 也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一, 在基因表达调控中扮演着重要的角色[2]。RNA剪接需要多种因子参与, 包括杂性核RNA (heterogeneous nuclear I A, hnRNA) 结合蛋白hnRNP (heterogeneousnuclear ribonucleoprotein) 、小型核RNA (small nuclear RNA, snRNA) 结合蛋白snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) 等。核pre-m RNAs剪接由剪接体执行, 剪接体包含有5种 (U1, U2, U4/6, 和U5) sn RNPs和其他non-snRNP剪接因子。[3]在真核细胞内, RNA原初转录物的分子很大, 通过剪接产生成熟的m RNA分子.

1 P re-RNA剪接反应机制概述

真核生物细胞核基因初始转录物 (pre-m RNA) 剪接由两步连续进行的转酯反应完成 (Padgett, 1984Ruskin, 1984) 。首先, 分支位点 (branch site) 处的腺苷酸2’羟基亲核攻击5’剪接位点的3’一5’磷酸二酯键, 产生两种剪接中间体分子:一为5’外显子对应的线性RNA分子;一为由内含子5’一端鸟苷酸与分支点腺苷酸之间通过2’一5’磷酸二酯键形成的套索状分子, 该分子包含了内含子和3’外显子序列。紧接着5’一外显子的3’羟基攻击3’剪接位点的磷酸二酯键, 去除套索状结构的内含子序列, 同时将相邻的两个外显子连接起来[4]。

2 剪接体组装中的内含子和外显子的界定

U1snRNP结合上5’剪接位点SF1结合到分支区域促使U2AF结合到聚嘧啶区域和3’剪接位点上, 导致早期复合体的形成 (E complex) 。在A复合体中U2snRNP和m RNA前体形成稳定的sn RNA-branch-region duplex。U4-U5-U6 3snRNP结合到A复合体上产生C复合体, 一个成熟的剪接体。 (1) 内含子界定:m RNA前体含有1个内含子和2个外显子, 在E复合体上的剪接因子结合在剪接位点上跨过内含子。 (2) 外显子界定:在m RNA前体中含有多个内含子和外显子, E复合体中的剪接因子结合在剪接位点上在外显子定义的早期复合体上 (EDE complex) , 随后形成了A复合体 (EDA complex) , 在组装成熟剪接体的过程中有一个内含子界定的复合体的过渡[5]。

3 剪接体的组装过程

m RNA前体原始转录物被蛋白 (hnRNP Proteins;putative AU-biding proteins in plants) 结合上, 这类蛋白中的一些可能会结合上特殊的序列或者结合剪接因子.U1snRNP和蛋白的相互作用 (比如U2AF) 形成一个复合体。结合U2 snRNP形成剪接体的前体, 再结合上U4/U6-U5就形成了剪接体。随着这个复合体一系列的RNA-RNA间的相互作用和重组的改变, 剪接反应发生了。剪接后, 间接产物和剪接后复合体被释放, 内含子被降解, 剪接体结合在内含子上而后进入新的一轮循环中[6]。

4 mRNA前体剪接因子

4.1 SR蛋白

SR蛋白家族是近些年来为人们广泛关注的一类剪接因子, 它在剪接复合体的聚集形成, 以及剪接因子在m RNA前体链上结合位点的识别过程中起着关键作用。其成员包括SC35 (spliesome component of 35kD) 、SF2/ASF (splicing factor2/alternative splicing factor) 、SRP20、SRP30、SRP40、SRP55和SRP70等。SR家族剪接因子的结构特点是氨基酸序列中富含丝氨酸一精氨酸残基。其中RNA结合结构域 (RNA binding domain) 位于氨基末端 (N末端) , 具有结合RNA的能力。而位于竣基末端的是含不同丝氨酸和精氨酸残基数量的RS结构域 (RSdomain) , 它能够与具有RS结构域的U2AF (U2 auxiliary factor) 的35kD亚基和U1snRNP7OkD的蛋白质相互作用, 因而能够促进U2AF和U1snRNP与剪接位置结合。所以, SR蛋白在高等真核生物细胞中介导U1snRNP同5’剪接位点结合与U2AF同3'剪接位点结合, 起着“桥”的作用。关于SR蛋白在选择性剪接中对剪接位点的调控, 主要是通过与不同的几个顺式调节因子作用。如通过与外显子的剪接增强子 (exonic splicing enhancer, ESE) 、内含子的剪接增强子 (intronic splicing enhancer, ISE) 、外显子的剪接沉默子 (exomc splicing silencer, ESS) 和内含子的剪接沉默子 (Intronic splcing silencer, ISS) 的结合, 来增强或减弱对其附近3’或5’弱剪接位点的识别和利用[7]。Wang等[8]使用ESE finder的软件 (web一based) , 对人类SR蛋白可识别的细胞中存在着的ESE序列进行筛选和评分, 这些蛋白质包括SF2/ASF、SRP40、SRP55和SC35;进一步证实了与ESE序列相关的SR蛋白, 在外显子的定位过程以及组成性剪接和选择性剪接过程中的重要作用。另一方面, 人类的很多疾病都与SR蛋白非正常结合剪接位点有关。Stickeler等[9]对肿瘤的研究发现, 在肿瘤形成之前, 不同组织细胞中SR蛋白的表达类型各不相同, 一般只表达1个家族中的1个亚型;随着肿瘤的发展, SR蛋白表达类型逐渐增多而各不相同。以至最后, 恶性肿瘤中SR蛋白的表达类型变得十分复杂。另外, Li等[10]发现SR蛋白SF2/ASF在维持基因组的稳定方面也起作用。

4.2 hnRNP形成因子

多聚嘧啶区域结合蛋白 (PTB) 是一种分子量为58kD的可以与RNA结合的新型核不均一核糖核蛋白 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNp) 形成因子, 它参与各种与RNA代谢相关的过程, 也包括RNA的剪接。PTB能与U2AF竞争结合多聚嘧啶区域, 对3’剪接位点起调控作用。PTB也能抑制5’剪接位点, 并且可能通过包裹外显子使其不被剪接体结合而使外显子被跳过。

hnR N P A1也是一类hnRNP形成因子, 有人对其进行晶体结构分析表明, 它有两个独立折叠的与RNA结合的结构域, 两者之间有一个连接体。两个RNA结合域 (RNA binding domain, RBD) 对于U1部分区域具有很高的同源性, 这可以解释两者之间的对于剪接位点结合的竞争关系。而在空间位置上, 两个RBD呈反平行排列且彼此靠近, 构成RNA结合平台, 依靠两对Arg一As P离子键来实现结构的相对稳定。这种反平行RNA结合平台的存在, 使得RNA能够形成浓缩状态结合并集聚于平台上, 从而有利于RNA分子的剪接和运输[10]。

4.3 RNA解旋酶类剪接因子

在酵母细胞中发现一类需要水解特定的核苷三磷酸进而发挥其功能的剪接因子。其中的代表是特定氨基酸位点是天冬氨酸一谷氨酸一随机氨基酸一组氨酸/天冬氨酸基序的核苷三磷酸酶 (Asp一Glu一x一His/Asp box NTPase, DEx H/D一box NTPase) 。这类蛋白质因子具有“解旋酶”的结构域, 有类似于核酸蛋白酶 (RNPases) 的功能, 且极为保守。属DEx H/D一box NTPases蛋白家族的成员有Prps、Prp2、Prpl6、Prp22和Prp43等。

通过实验, 人们发现Ppr5对于剪接复合体的聚合至关重要, Prp2催化复合体构象的改变以顺应第一步的RNA酯交换反应, Prpl6p参与第二步的RNA酯交换反应, Prp22p在m RNA的释放过程中发挥作用, 而内含子的释放与Prp43的参与有关。另外, Prp28和Brr2是U5snRNP中的两个DEx H/D一box ATPase, 它们在U1和U4snRNP从剪接复合体中释放过程中起作用[11]。对于剪接复合体来说, 在完成一轮的剪接反应后解聚是很有必要的, 因为这对于参与剪接的蛋白质因子的重新利用而促进下一轮的剪接反应很重要。

在剪接催化过程中, U5snRNP扮演了重要角色, 而Snull4和Prp8似乎是组成了U5snRNP的核心。其中, Snull4和核糖体转运酶 (translocase) EF一G有很高的同源性, Small等[12]发现, Snull4催化GTP水解然后引发剪接复合体激活和解聚。

另外, 人们发现一种蛋白复合体Ppr19, 又称NTC (NineTeen complex) , 在剪接过程中加到原先的剪接复合体上[13]。对于U1或者U4的解离, NTC并非必需, 但是它们可在U4的解离后在剪接复合体上稳定U5和U6, 使得U5和U6与m RNA前体形成一种高度易于催化反应的状态。这表明, NTC在调节复合体结构改变过程中起着关键作用。利用基因工程的方法, 目前已鉴定出8种蛋白质因子参与了NTC的组成。这些蛋白质因子是在U4脱离剪接复合体后一起加到复合体上去的, 提示这些蛋白质可能以整体的一个复合体的形式发挥功能。

5 酿酒酵母和拟南芥的剪接顺式作用元件保守序列的比较 (14) :

上图中A表示5’剪接位点, B表示分支位点, C表示3’剪接位点。每个字母的高低对应着碱基在相应位置出现的频率。比较酵母和拟南芥5’剪接位点和分支位点, 不难发现拟南芥相对酵母碱基出现的频率没酵母的高, 相对来说剪切位点碱基保守性不高。所以从序列保守性来看, 5’剪接位点和分支位点是拟南芥植物基因在酵母中表达比较重要顺式作用元件。

6 展望与结语

在多数情况下, 真核m RNA内含子的存在可以提高基因的表达水平, 因为其剪接过程会影响m RNA新陈代谢的多个阶段, 包括转录、RNA编辑、pre-m RNA的加工、m RNA的出核运输、翻译和无义衰变等。真核m RNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用, 是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。

植物内含子序列在3’剪接位点前没有聚嘧啶序列 (polypyrimidine tract) , 也没有保守的分支位点序列和酵母比较。然而, 植物内含子富含AU序列在3’剪接位点前。AU-rich序列在酵母中可能和在植物中的作用相似, 能帮助剪接因子识别其他的顺式作用元件例如剪接位点。植物内含子在酵母中表达的过程中可能会出现转录起始位点提前和隐藏剪接位点等复杂的问题。

植物基因在酵母中的表达具有重要的意义, 可应用于工程菌, 对跨物种基因表达也具有重要的作用。

摘要：RNA剪接是一个多步骤、形成多种中间状态复合物的复杂过程。跨物种的基因表达更显得复杂, RNA剪接是基因表达调控中重要的步骤。这里讨论酵母和植物的剪接位点保守序列的差异, 指出可能对植物基因在酵母中表达有重要作用的顺式作用元件。