四环素类药物（共6篇）
四环素类药物 篇1
四环素类抗生素 (TCs) 是由链霉菌产生的一类广谱抗菌药, 主要有四环素 (TC) 、金霉素 (CTC) 、土霉素 (OTC) 、多西环素 (DOTC) 和美他霉素 (METC) 等[1], 在畜禽生产中被广泛用于药物添加剂, 用于防治肠道感染和促生长, 容易诱导耐药菌株和导致食品残留。四环素、土霉素和金霉素是我国应用最广、应用时间最长的动物保健性抗生素, 一些不法分子为了经济效益, 常滥用这类药物, 致使在动物性食品中大量残留, 不仅危害人体健康, 而且更为严重的是畜禽产品中残留高浓度的土霉素、金霉素和四环素容易诱导各种致病菌产生耐药性, 不利于对人类和畜禽类疾病的治疗。欧盟及我国均规定动物组织中四环素类抗生素的最大残留限量为:肾0.6 mg/kg、肝0.3 mg/kg、肌肉0.1 mg/kg[2]。
目前用于该种药物的检测方法有:微生物法、薄层色谱法、分光光度法、化学发光法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[3]。已有的方法存在灵敏度不高、前处理繁琐或重现性不好等问题, 很难满足对药物残留的确证检测[4]。本方法选用鸭肌肉组织为分析对象, 建立了一种检测四环素类药物的快速、简便、灵敏度高的液相色谱-串联质谱 (LC-MS-MS) 方法, 可以满足当前该类药物的残留检测。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
Waters2695 Quattro micro液质联用仪 (美国WATERS公司) ;高速冷冻离心机 (美国Sigma公司) ;固相萃取装置 (美国Supelco公司) ;旋转混合器 (IKA公司) ;PL203电子天平 (瑞士Mettler-toledo公司) ;氮吹仪 (美国OA-SYS公司) ;酸度计PB-21 (美国Orion公司) ;Sep-pak C18 6CC萃取小柱 (500 mg) 。
四环素、土霉素和金霉素的盐酸盐标准品购自中国兽医药品监察所, 纯度>99.5%;甲醇、乙腈为默克公司的色谱纯;甲酸为美国ACS恩科公司的色谱纯;柠檬酸 (含一个结晶水) 、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯;所用水为屈臣氏瓶装纯净水。
1.2 试验方法
1.2.1 标准储备液配制
分别取盐酸四环素、盐酸土霉素和盐酸金霉素对照品适量, 精密称定。按四环素、土霉素和金霉素计, 用甲醇溶解并稀释成浓度均为1 mg/m L的溶液, 作为标准储备液。置-20℃冰箱中保存。
1.2.2 四环素、土霉素和金霉素工作液
精密量取标准储备液适量, 用甲醇-水 (3:7, V/V) 溶液稀释成适宜浓度的四环素、土霉素和金霉素标准工作液。
1.2.3 Mc Ilvaine-Na2EDTA缓冲液
分别取柠檬酸12.9 g, 磷酸氢二钠10.9 g, 乙二胺四乙酸二钠37.2 g, 加水900 m L溶解, 用1 mol/L氢氧化钠溶液调p H值至4.0±0.5, 加水稀释至1 000 m L, 即得。
1.2.4 样品前处理方法
称取均质的鸭肌肉组织2.0 g, 置于50 m L离心管中, 加入Mc Ilvaine-Na2ED-TA缓冲液8 m L, 涡旋充分混匀, 10 000 r/min离心10 min (温度为4℃) , 取上清液于另一离心管中。重复提取一次, 合并上清液, 经快速滤纸过滤后备用。Sep-pak C18固相萃取柱依次用甲醇5 m L、水5 m L预洗。取备用液8 m L过柱, 用3 m L10%甲醇水溶液淋洗, 减压抽干。用5 m L5%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 氮气吹干 (温度低于40℃) 。最后用甲醇-水 (3:7) 1.0 m L溶解残留物, 过滤膜后作为试样溶液, 供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3 色谱条件
色谱柱:Xbridge C18 2.1*150 mm, 粒径5μm。流动相A为0.3%甲酸乙腈溶液;B为0.3%甲酸水溶液。柱温:35℃, 进样体积20μL, 流速:0.2 m L/min。流动相梯度洗脱条件见表1。
1.4 质谱条件
采用电喷雾正离子检测;毛细管电压:3.8 k V;锥孔电压:25 V;离子源温度110℃;雾化温度:350℃。质谱参数见表2。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
分别精密量取标准储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 m L置于10 m L容量瓶, 稀释成含四环素、土霉素和金霉素分别为5、10、20、50、100、200、400 ng/m L的溶液, 见表3。
2.2 方法的检出限和定量限
将标准溶液用样品空白基质稀释后进样, 进样量为20μL, 以信噪比为3倍时的溶液浓度为检出限, 由此得出四环素、土霉素、金霉素的检出限 (LOD) 分别为5 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L, 结果见表3。以信噪比为10倍的溶液溶度为定量限, 称样量为2.0 g, 前处理后定容至1.0 m L, 则四环素、土霉素、金霉素的定量限均为20 ng/m L。
2.3 方法的精密度和准确度试验
取经检测四环素、土霉素、金霉素含量低于检测限度的鸭肉, 分别添加一定浓度的标准溶液, 相当于50、100和200ug/kg (即1/2的MRLVDs、MRLVDs和2倍的MRLVDs) 3个浓度水平, 每个浓度5组平行样, 按1.2.2所述方法提取制备后进行处理, 进行回收率试验和精密度试验, 回收率均在80.6%~106.3%, RSD均在0.6%~4.2%, 符合方法学要求, 结果见表4。
3 结论
本研究建立了鸭肉中四环素类抗生素的定性和定量方法。样品在4℃条件下高速冷冻离心, 可以较好地去除油脂类杂质, 同时, 收集液用快速滤纸过滤, 极大地加快了固相萃取小柱的净化洗脱速度, 整个前处理过程具有分离度高、快速的特点, 最后用甲醇-水溶解残余物, 可以确保样品溶液的稳定性和检测的灵敏度。
采用该方法, 检测了南方樱桃谷肉鸭生态养殖技术集成与示范项目的鸭肉192批次, 结果均未检测出该类药物, 说明该方法可用于实际样品的测定。
注:带*为定量离子。
摘要：采用液相色谱-串联四极杆质谱多离子反应监测定量法, 通过对试样净化预处理、色谱条件、质谱参数等的优化选择, 进行回收率、精密度等的验证, 建立了快速、准确测定鸭肉组织中四环素、土霉素、金霉素的检测方法。在10400 ug/L浓度范围内, 3种四环素类药物均呈线性, 相关系数r均大于0.99, 回收率均在80.6%106.3%。采用该方法检测了樱桃谷肉鸭192批, 均为阴性。
关键词：液相色谱-串联质谱法,四环素,土霉素,金霉素
参考文献
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四环素类药物 篇2
本文在参考GB/T20764-2006基础上进行改进, 建立一种能同时分离和定量猪肉中四环素类抗生素的新方法。
材料与方法
主要仪器
LC-20AT HPLC, Inertsep PLS-2柱, 265 mg/20m L, BP211D电子天平, TDC-40B离心机, FJ-200匀浆机, SHB-Ⅲ真空泵。
试剂及配制
甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯, 磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、草酸为分析纯。0.2mol/L磷酸氢二钠溶液, 0.1 mol/L柠檬酸溶液, Mcllvaine缓冲溶液, 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液, 自配。
色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-SP, 5μm, 4.6×150 mm;检测波长:350 nm;柱温:25℃;流速:0.5 m L/min;进样量:20μL;流动相:乙腈-甲醇-0.01mol/L草酸溶液 (2+1+7) 。
标准曲线
配制系列混合标准溶液, 浓度为1、0.5、0.2、0.1、0.05μg/m L, 从低浓度到高浓度依次进样, 以峰面积为横坐标, 浓度为纵坐标, 建立标准曲线。
试样制备
称取有代表性的猪肉样品约1Kg, 于匀浆机中匀浆, 备用。
样品提取
取猪肉匀浆5±0.05 g, 置于50m L离心管中, 加入30 m L Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲液, 振荡10 min, 分别加入0.68 mol/L硫酸溶液和14%钨酸钠溶液各3 m L, 4000 r/min离心5 min, 上清液经中性快速滤纸过滤到100 m L锥形瓶中。离心管中残留物用10 m L、10 m L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液重复提取2次, 振荡10 min, 4000 r/min离心5 min, 一并过滤于锥形瓶中。此为备用液, 待净化。
样品的净化
PLS-2柱依次用10m L甲醇、10m L水活化, 5m LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液平衡, 取备用液分次全部过萃取柱, 待液体全部流出后用l Om L5%甲醇溶液淋洗, 真空抽干5min。用10m L甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液于刻度试管中, 40℃水浴氮气吹扫浓缩至0.5~lm L, 用流动相定容至5m L, 过0.45μm滤膜, 供HPLC测定。
结果与分析
色谱柱的分离
样品添加土霉素、四环素、金霉素标准溶液的出峰时间为8.041、9.728、19.833, 空白样品在该时间处无杂峰干扰 (见图l、图2) 。
标准曲线及检出限
将不同质量浓度的标准溶液在上述的色谱条件下进行测定, 以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线, 实验结果表明, 土霉素、四环素、金霉素在0.05-1.0μg/m L线性关系良好。
取空白猪肉5.00 g, 做5个平行, 按照“1.6”“1.7”项的方法处理, 测得基线噪音值, 并求其平均值。结果见表1。
回收率及变异系数
称取空白猪肉组织5.00 g, 置于50 m L离心管中, 设高、中、低三个添加水平, 按“1.6”“1.7”项的方法处理, 取20μL进样分析, 每个浓度重复进样5次。根据峰面积计算添加回收率和变异系数。
结论
四环素类药物 篇3
1 材料与方法[1]
1.1 材料
1.1.1 主要仪器
Agilent 1200超高效液相色谱仪,AB 3200QTRAP四级杆串联质谱仪,配有电喷雾电离源(ESI)。
1.1.2 主要试剂
四环素、土霉素、金霉素和强力霉素标准品均购自Dr Erenstorger公司(纯度均高于97.0);甲醇、甲酸,色谱纯;乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA),分析纯;超纯水由四川沃特尔水处理设备有限公司超纯水机制备。Mcllvaine-EDTA2Na缓冲溶液:称取12.9 g柠檬酸-水合物,10.9g磷酸氢二钠,37.2 g EDTA-2Na溶解于1 000 ml水,以此作为四环素类抗生素的提取液。
1.2 方法[1,2,3,4,5,6]
1.2.1 单标准储备液和混合标准工作液的制备
(1)单标准储备液。将四环素、土霉素、金霉素和强力霉素药物用甲醇配制成浓度为100 mg/L的标准储备溶液,在-18℃避光保存。
(2)混合标准工作液。根据所需标样浓度,移取适量单标准储备液于100 ml容量瓶中,用甲醇水溶液(3∶7,V/V)定容,混合标准工作液系列浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/ml,用前配制。
1.2.2 样品提取
称取饲料样品2.00g于50 ml离心管中,加入提取液20ml摇匀,超声波提取20.0 min,摇床振荡5.0 min,10 000 r/min离心5.0 min,prehensive Technology,Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Huizhou,Guangdong 516006)取出上清液5.00 ml待净化。
1.2.3 净化
固相萃取小柱活化:依次加入3.00 ml甲醇和2.00 ml水;上样:加入5.00 ml提取液;淋洗:2.00 ml水溶液淋洗,减压抽干3.0 min;洗脱:5.00 ml甲醇洗脱,收集洗脱液于试管中。在45℃下旋转蒸发至近干,用30%甲醇的水溶液定容至2.00 ml,混匀振荡1.0min后,过0.2μm微孔滤膜,装瓶,待上机测定。
1.2.4 超高效液相色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C183.0 mm×100.0 mm,粒径1.7μm;柱温:40℃;流量:0.25 ml/min;进样量:10μl。流动相A为0.1%甲酸水,B为甲醇。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化结果
分别将4种化合物的标准物质配制成1.0 mg/L的溶液,用于注射泵连续进样,优化质谱参数(表1)。根据目标物的性质和分子结构,选择ESI(+)作为电离模式,分别对裂解电压(DP)、进口电压(EP)、碰撞能(CE)、离子源温度、辅助气体、气帘气等条件进行了优化。优化后质谱条件为:离子化方式:ESI(+);离子源温度:350℃;气帘气20;辅助气Gas1:35,Gas2:45。
2.2 液相条件的优化结果
试验中使用了5和15 min的走样时间,结果发现5 min的响应值较高,但峰形较差;15 min的峰形很好,但响应值较低。综合考虑,使用12 min的检测时间,在该时间下,得到了较好的响应值和峰形。流动相梯度见表2,四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的标准液色谱图见图1~4。
2.3 标准曲线与线性范围
配制质量浓度分别为5、10、20、50、100、200μg/L的四环素类混合标准溶液,按仪器工作条件进行测定,以四环素类药物定量离子的峰面积(y)对其质量浓度(x)绘制标准曲线。结果发现,各四环素类药物的质量浓度在5~200μg/L范围内,与峰面积呈良好的线性关系(表3)。
2.4 方法的回收率、精密度和测定低限
用不含四环素类抗生素的饲料样品进行添加水平回收率和精密度试验,结果见表4。
从表4可以看出,在5~50μg/kg添加范围内,其回收率在76.8%~105.8%,相对标准偏差在3.2%~6.8%。
3 结论
由试验结果可知,各四环素类药物的质量浓度在5~200μg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系;该方法的相对标准偏差为3.2%~6.8%,检测回收率为76.8%~105.8%。该方法前处理简单,可方便、快速、准确地测定饲料中的四环素类药物残留,能够获得较高的回收率和精密度。
摘要：[目的]探索建立饲料中四环素类药物残留的高效测定方法。[方法]利用超高效液相色谱-串联质谱法,测定饲料中的四环素、金霉素、土霉素和强力霉素残留。[结果]各四环素类药物的质量浓度在5～200μg/L范围内与峰面积线性关系良好;该方法的相对标准偏差(RSD)为3.2%～6.8%,检测回收率为76.8%～105.8%。[结论]该方法前处理简单,方便、快捷、准确,可迅速测定饲料中的四环素类药物残留。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱法,四环素,金霉素,土霉素,强力霉素,饲料,残留
参考文献
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四环素类药物 篇4
Tian Y等[1]的试验结果表明,四环素耐药菌株中约44%存在tetM基因,24%存在tetO基因。tetM基因编码细菌核糖体保护蛋白能阻遏四环素类与细菌核糖体结合,从而使细菌耐药。而tetO基因则是利用三磷酸鸟苷供能使四环素从核糖体释放出来导致细菌耐药。由于不同地区猪链球菌对四环素的耐药性存在差别,且耐药机制亦不同,了解猪链球菌对四环素类药物的敏感性和耐药性及其与耐药基因的关系,对有效治疗疾病、防止耐药性形成具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 菌株
猪源链球菌分离株,来自东北部分地区不同规模的养猪场,经致病性试验和生化试验确定为猪链球菌,其中辽宁8株(49c、B1、B8、C3、D6、36a、36b、T3)、黑龙江4株(T2S1、T2S3、3-1、15)。标准2型猪链球菌菌株为ATCC700794(购于美国疾病控制中心)和ATCC853(购自中国微生物药品检定所)。
1.2 试剂
小量质粒抽提纯化试剂盒、小量胶回收试剂盒,均购自上海华舜生物工程有限公司;DL-2 000 Marker、pMD18-T、T4 DNA连接酶和ExTaq聚合酶,购自TaKaRa公司;Proteinase K,购自Merker公司;脑心浸汤和琼脂培养基,购自Oxoid公司;多西环素、土霉素、盐酸金霉素,购于华北制药天星有限公司;链球菌乳胶凝集试剂盒,购于法国梅里埃公司。
1.3 最小抑菌浓度的测定
严格按照美国临床检验标准委员会推荐的标准微量稀释法[2]进行。四环素敏感、中敏和耐药标准分别为 MIC≤2 μg/mL、MIC=4 μg/mL、MIC ≥8 μg/mL。
1.4 12株猪链球菌兰氏分群
按照法国梅里埃公司所提供的链球菌乳胶凝集试剂盒说明书进行操作。
1.5 四环素耐药基因tetM和tetO的扩增
根据GenBank报道的tetM和tetO基因(EF101931、EF472563)序列合成引物tetM和tetO,其引物序列见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。菌株基因组DNA的提取采用水煮法[3]。
1.6 PCR产物的克隆、测序
按分子克隆的常规方法对扩增出来的基因进行连接、转化,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.7 序列分析
用DNA分析软件对克隆的基因序列 与GenBank 中的tetM基因进行同源性分析。
2 结果
2.1 最小抑菌浓度的测定结果(见表2)
猪链球菌对多西环素、土霉素、盐酸金霉素的耐药率分别为91.7%、100%、83.3 %,MIC>64 μg/mL的高度耐药株分别高达66.7%(多西环素)、75.0%(土霉素)和58.3%(盐酸金霉素)。12株猪链球菌中, 4株为高度耐药(MIC>64 μg/mL)株。
2.2 12株猪链球菌兰氏分群结果
兰氏分群结果表明,12株猪链球菌均属于D群。
2.3 四环素耐药基因tetM和tetO的PCR扩增结果
12株菌均扩增出tetM基因(图1a,1 920 bp),但没有扩增出tetO基因(图1b),扩增出的tetM基因已登录GenBank,其核苷酸序列号分别为3-1株(EU350140)、15株(EU350139)、T2S3株(EU182585)。
b.tetO基因 1,2.未扩增出tetO基因;3.水对照; 4. DL-2 000 Marker。
2.4 序列分析结果
12株猪链球菌的tetM基因核苷酸测序结果表明:3-1株与15株,36a株与36b株、T3株、C3株、49c株,T2S1株与T2S3株同源性为100%;与GenBank中的口腔链球菌分离株264-3(AJ580976)、肺炎链球菌 PN34(AY466395)、粪肠球菌F01(X92947)、阴道加德菌(U58986)、淋病奈菌12903质粒pOZ101(L12242)、粪肠球菌分离株9830359-1转座子Tn5397、不动杆菌329转座子Tn2009(DQ223648)、粪肠球菌分离株9830359-1转座子Tn5397(DQ223250)、猪链球菌SC84(EF101931)、粪肠球菌分离株9830409-1和质粒PYA409-1(DQ223244)等的同源性为94%~100%。
3 讨论
按照兰氏分群法,我国猪链球菌病病原主要有C、D、E、L、R、S等群[4]。1993年,陈永林等对国内19个城市的126株致病性猪链球菌分群鉴定,其中C群占72.22%,D群占7.14%。2001年,徐涤平通过血清学分群鉴定湖北、河南和辽宁等省送检的病料,从中分离到63株猪致病性链球菌,其中C群占63.49%,D群占12.7%。本试验中12株猪链球菌均属于D群,与之前报道的结果不一致,说明不同地区链球菌的血清群不完全相同。
四环素类药物抑菌的主要机制是通过与核糖体30S亚基结合,从而抑制氨基酰-tRNA与核蛋白体结合,阻断蛋白质的合成。对四环素耐药的微生物大都产生一种核蛋白体保护蛋白,这种蛋白能与核蛋白体相互作用使其不受四环素的作用,从而使蛋白质合成不受影响[5]。而这种核蛋白体保护蛋白的编码基因就是tetM基因,表明链球菌对四环素的耐药与携带tetM基因密切相关。试验从12株猪链球菌中均检测出tetM基因,未检测出tetO基因,说明东北部分地区猪链球菌对四环素的耐药机制是由tetM基因介导的核糖体保护作用。tetM基因常定位于转座子Tn1545和Tn5251上,与可动元件相关,而且能在大范围的宿主间转移。tetM基因的核苷酸序列与GenBank中肺炎链球菌、口腔链球菌分离株、化脓链球菌、粪肠球菌等的tetM基因、转座子、质粒等具有高度的同源性(94%~100%),说明tetM基因在猪源与人源及其他动物源不同种属细菌间存在广泛的交换。目前已发现27种tet基因,编码外排蛋白、核糖体保护蛋白、四环素酶,猪链球菌中主要有tetM、tetO、tetK、tetX、tetS和tetL基因。
12株猪链球菌的耐药情况为土霉素>多西环素>盐酸金霉素,耐药率达到83.3%以上,所有菌株均对土霉素耐药,有4株是高度耐药,对四环素的高水平耐药结果与之前的研究报道相似[6]。随着抗生素在动物疾病防治中的大量使用,细菌为适应环境变化对某种抗生素产生了耐药变异。另一方面在抗生素选择压力下,质粒和与之相关的转座子使耐药性的转移和传播更加迅速,水平获得耐药基因的亚群可发展成优势菌群并将其垂直遗传给子代[7]。tetM基因在不同菌株之间较高的同源性使其能在不同宿主间转移。由此可见,加强链球菌耐药性监测、开发新药及疫苗等对于减缓耐药性的产生和传播具有十分重要的意义。
参考文献
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四环素类药物 篇5
关键词：城市污水厂,四环素,分布特性,去除率
四环素类抗生素是目前畜禽饲养和临床使用量最大的抗生素之一。不仅高剂量时作为药物广泛用于人类与动物疾病的治疗,同时低剂量时也作为添加剂促进动物生长。其中以四环素、土霉素和金霉素在实际应用过程中应用最广泛、使用量最大[1]。随着四环素类药物的大量使用,四环素抗生素残留在环境中分布广泛,从土壤,到养殖废水,河流,甚至在地下水中都检出了四环素残留的存在。Hamscher G等[2]研究发现土壤中四环素浓度随着土层的变化而不同,其实测德国土壤四环素浓度为86.2 μg·kg-1(0～10 cm)、198.7 μg·kg-1(10～20 cm)、171.7 μg·kg-1(20～30 cm)。Mackie R I等[3]检测了长期施用粪肥土壤地下水中的四环素类抗生素及其分解产物,结果显示各物质含量均小于0.5 mg·L-1。
城市污水厂作为水循环和水污染控制的重要节点,对常规污染物的去除发挥了重要作用,但对于四环素类新型污染物关注较少,因此近年来,包括抗生素药物在内的PPCPS在污水处理系统中的分布特征和去除规律已经成为国内外研究的热点。本文使用HPLC-MS/MS检测江苏城市污水厂A中3种四环素抗生素分布状况,并利用质量平衡分析其在污水厂中的归趋及去除特性。以期为四环素类抗生素这污染物的控制提供参考。
1 实验部分
1.1 实验药品
本试验选定四环素(TC),土霉素(OTC)和金霉素(CTC)作为四环素类物质的代表来进行分析研究。3种四环素标准样品均购自中国药品生物制品检定所。其它药品除乙腈为分析纯外,都为分析纯。
1.2 样品的采集和前处理
本实验选择江苏某城市污水处理厂A进行采样测定。于2012年1月至2012年3月进行采样,为分析四环素类抗生素在污水厂的分布状况,本实验对污水厂A的各反应池都进行采样测定。污水处理厂A采用A-A2/O工艺,按其工艺流程设7个采样点(进水点,沉砂池点,生化池出水点,二沉池出水点,砂滤出水点,UV出水点,二沉外排污泥点);采集的样品送回实验室后立即处理或低冷藏保存。
(1)污水样品的前处理
用0.45 μm的微孔滤膜过滤水样以除去悬浮颗粒杂质和微生物后,准确量取500 mL过滤水样,置于锥形瓶中并加入0.1 g Na2EDTA,充分摇匀后用稀硫酸调节pH至3。在固相萃取装置上(EASYTAK型12管),美国Supelco公司安装并调试好SPE-HLB小柱,依次用6 mL甲醇、6 mL高纯水、6 mL Na2EDTA的缓冲液(10 mmol·L-1,pH=3)对SPE-HLB小柱进行活化和平衡。而后以3 mL·min-1的流速将各水样缓缓流经SPE-HLB小柱,水样全部萃取后用6 mL高纯水润洗以清洗小柱,接着真空干燥5 min。最后用6 mL甲醇以1 mL·min-1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来,洗脱液收集于15 mL具塞玻璃瓶中。使用氮吹仪在水浴温度40 ℃以高纯氮气将洗脱液吹至近干,加入乙腈:水(体积比7:3)定容。溶液过0.22 μm的针头式过滤器移入棕色进样瓶中保存,于样品瓶中待HPLC-MS/MS分析。
(2)污泥样品的前处理
将取回的污泥样品于8000 r·min-1离心10 min后,取出其中的污泥固体置于冷冻干燥机中真空冷冻干燥24 h,之后捣碎并过50目筛。准确称量1.000 g筛后污泥并置于离心管中,加入10 mL EDTA-Mcllvaine缓冲提取液(0.05 mol·L-1 EDTA+0.06 mol·L-1Na2HPO4+ 0.08 mol·L-1柠檬酸,pH=4),漩涡混合1 min后超声萃取10 min,并以4000 r·min-1离心20 min后,收集上清液。再重复萃取2次,步骤同上。合并3次萃取操作收集的上清液。依次用6 mL甲醇、6 mL高纯水、6 mL Na2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行活化和平衡。而后以3 mL·min-1的流速将超声萃取提取液缓缓流经SPE-HLB小柱,全部萃取后用6 mL高纯水润洗以清洗小柱,接着真空干燥5 min。最后用6 mL甲醇以1 mL·min-1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来,洗脱液收集于15 mL具塞玻璃瓶中。使用氮吹仪在水浴温度40 ℃以高纯氮气将洗脱液吹至近干,加入乙腈:水(体积比7:3)定容。溶液过0.22 μm的针头式过滤器移入棕色进样瓶中保存,于样品瓶中待HPLC-MS/MS分析。
1.3 HPLC-MS/MS分析条件
(1)色谱条件
色谱柱:C8液相色谱柱(美国Phenomenex 公司)。流动相:A相为乙腈:B相为高纯水(含0.28%甲酸)=7:3。流速:0.4 mL·min-1。进样量:20 μL。柱温:40 ℃。
(2)串联质谱条件
型号:Varian 310-MS(美国Varian公司)。离子源:电喷雾电离源正离子模式(ESI+)。检测方式:多反应监测(MRM)离子模式。毛细管电压:3.5 kV ;干燥气为:250 ℃。其它参数参见表1。
备注:a为离子对类型;Q为定量离子对;q为定性离子对。
四环素,土霉素和金霉素的色谱图及质谱图见图1。
1.4 定量分析与质量控制
(1)定量分析
本实验采用5点外标物标准曲线对目标抗生素进行定量分析。实验前需要进行标准样品储备液和混合标准样品工作溶液的配置工作,具体方法如下:
标准样品储备液:按纯度折算校正后分别准确称取三种抗生素,用乙腈溶解摇匀后定容于100 mL棕色容量瓶中,配制成浓度为200 mg·L-1的各种四环素单标准储备液(其中土霉素标准储备液配制时滴加适量稀盐酸以使其溶解完全)。于-4 ℃冰箱避光保存。
混和标准样品标工作溶液:临用时分别准确量取一定体积的标准样品储备液,用乙腈配制成混合标准母液,取混合标准母液用乙腈逐步稀释,配制成浓度范围为10～2000 μg·L-1标准曲线工作液。
(2)质量控制
在空白水样中添加混合标准溶液制成浓度为0.2 μg·L-1的加标混合溶液,采用目标化合物的母离子和特征子离子为选择检测离子对,结合不同的保留时间对目标化合物进行回收率实验,并水平平行测定5次.通过连续注射测定11次浓度为200 μg·L-1的标准溶液来计算平均值和相对标准偏差(RSD)来确定精密度,并以标准偏差的3倍值浓度作为检出限(LOD)。标准曲线等相关结果参见表2,从表2中可看出,方法基本满足污水中此3类抗生素残留分析。
2 结果与讨论
2.1 污水厂中3种抗生素含量水平
三种四环素类抗生素含量的测定结果如表3所示。
注:NA表示未检出。
从表4可以看出:
(1)进水中四环素,土霉素和金霉素三种抗生素都有检出,四环素含量最高,平均值达到336 ng·L-1。与国内相关报道相比,Gulkowska等[4]对香港和深圳的5座污水厂进行检测,进水中四环素浓度在96～1300 ng·L-1,造成结果不同可能是因为污水厂服务区内使用抗生素的情况有所差异。
(2)污泥中3种四环素抗生素含量最高,分别达到四环素656 ng·g-1,土霉素520 ng·g-1和金霉素227 ng·g-1。均高于进水中3种抗生素的含量。许多研究表明四环素抗生素极易吸附于固体颗粒表面,因为四环素类抗生素在pH中性环境条件下,主要以负离子形式存在[5],所以可以通过与金属离子的络合反应和静电效应等相互作用吸附于固体介质表面,如活性污泥、土壤颗粒、河流沉积物等。Kulshrestha等[6]研究显示,土霉素可以两性离子的形式吸附于活性污泥表面。与国内相关报道相比,潘寻在北京检测两个污水厂污泥中土霉素含量为:1314～2296 ng·g-1,金霉素含量为:498～504 ng·g-1,均高于本实验的结果。这可能由于进水中四环素类药物浓度不同及污水处理工艺不同造成的。如Kim等[7]研究显示,污泥本身的物化性质如污泥龄等对四环素的吸附作用影响很大。而且温度、pH值、钙镁离子浓度,溶解性有机物(DOM)等同样可以对四环素和污泥之间的相互吸附作用产生不同的影响[8,9]。
2.2 去除率及质量平衡计算分析
污水厂的各个处理单元对3种四环素类抗生素的去除率可通过下式进行计算[12],
式中:Rd——污水处理各单元对抗生素的去除率
Md——污水厂C各处理单元中抗生素的质量流量
因为3种四环素的亨利常数都很低,故可忽略挥发和曝气对其去除率的影响,因此可以假设其在污水处理中的去除主要是通过生物降解和污泥吸附来完成的,从而可以得出下式计算其质量平衡[12]:
Mi=Me+Mb+Ms (2)
式中:Mi——污水进水中抗生素的质量,g/d
Me——污水最终出水中抗生素的质量,g/d
Mb——通过生物降解作用去除的药物质量,g/d
Ms——通过吸附作用去除的药物质量,即所测的污泥中检测到的抗生素质量,g/d
本实验中,Mi、Me和Ms数值都是直接通过实验测定的,而Mb则是通过式(2)计算得出的。当得出Mb之后,3种四环素抗生素在污水厂C中生物降解率及吸附去除率可通过下式进行计算[12]:
式中:Rb——抗生素在污水厂中的生物降解率
Rs——抗生素在污水厂中的吸附去除率
去除率及质量平衡计算结果见图2。
从图2可知:
(1)污泥吸附对3种抗生素的去除率分别为:四环素28.8%,土霉素38.0%和金霉素34.9%。与其他研究性比,Kim[10],Le-Minh[11]等研究认为污泥吸附是污水厂中四环素去除的主要机制。
(2)生物降解对3种抗生素的去除分别是:四环素为32.5%,土霉素为62.0%,金霉素为65.1%。这个结果要低于高品[12]测定美国East lansing污水厂中四环素类抗生素37%～100%的生物降解率。
(3)污水厂A对四环素的总去除率为61.3%,与其他报道相比,Batt测定污水厂对四环素的总去除率为63.8%(污水厂工艺为采用生物转盘+砂滤+UV消毒)。Gulkowska测定香港Shatin污水厂对四环素的总去除率为73%。
3 结 论
测定结果表明,污水厂A进水中3种四环素抗生素含量分别是:四环素336 ng·L-1,土霉素202 ng·L-1和金霉素96 ng·L-1。而出水中只检测到四环素含量为130 ng·L-1,土霉素和金霉素都未检出。三种四环素抗生素在外排污泥中浓度最大,分别为四环素656 ng·g-1,土霉素520 ng·g-1和金霉素227 ng·g-1,均高于进水浓度。
四环素类药物 篇6
1 材料和方法
1.1 病例选择
选用钙拮抗剂诱导的牙龈增生患者40 例, 男性26 例, 女性14 例, 共172 颗牙。年龄58～68 岁;服药时间6 个月～5 年。所有患者均无糖尿病等其他全身病史, 1 年内未接受牙周治疗。
1.2 操作步骤
将172 颗患牙分为实验组86 颗 (米诺环素软膏联合牙周非手术治疗组) , 对照组86 颗 (牙周非手术治疗组) 。初诊时完成口腔卫生指导和龈上洁治, 1 个月后对探诊深度≥5 mm的受试牙位点进行刮治和根面平整, 实验组立即放置米诺环素, 每周1 次, 共4 次, 对照组不放药。记录患者在基线、治疗后3、6 个月时的菌斑指数、牙龈增生指数[1]、出血指数和探诊深度。每次复诊强化口腔卫生指导, 没有添加机械治疗。
1.3 统计学分析
结果用SPSS 10.0软件包进行统计分析。
2 结 果
治疗后3、6 个月复查时, 2 组与基线比较均有显著改善 (P<0.01) 。在治疗后3 个月时, 实验组与对照组相比菌斑指数、牙龈增生指数、出血指数和探诊深度值差异有显著性 (P<0.01) ; 在治疗后6 个月时, 实验组与对照组相比牙龈增生指数和探诊深度值差异有显著性 (P<0.05或P<0.01) , 菌斑指数和出血指数差异无显著性 (P>0.05) 。
(±s)
注:实验组与对照组比较 ①P<0.05, ②P<0.01
3 讨 论
钙拮抗剂类药物引起牙龈增生的机制尚不十分清楚。有研究发现硝苯地平可引起胶原代谢失衡[2], 其它钙通道拮抗剂如维拉帕米、地尔硫卓等也有类似的引起牙龈增生的作用[3]。Miranda等[4]通过横向研究表明, 服用硝苯地平的患者中牙龈炎症是牙龈增生的易感因素。盐酸米诺环素软膏是一种牙周局部缓释药物, 主要成分为二甲胺四环素, 能抑制大部分牙周病原菌;临床定期应用米诺环素可明显减少微生物的数量[5]。
在治疗后3个月时, 随着牙龈增生程度的逐渐减轻和反复对患者进行口腔卫生宣教, 菌斑指数显著下降, 实验组下降更显著。治疗后6个月2 组间的菌斑指数比较差异无显著性, 可能是患者随着时间的推移对口腔卫生重视程度降低有关。在3、6个月的观察期内, 探诊出血率始终处于较低水平, 表明牙周非手术治疗显著改善了牙周组织的健康状态, 实验组的探诊出血率始终低于对照组, 可能是米诺环素持续释放发挥抑菌作用。治疗3、6个月后2 组的探诊深度和牙龈增生的程度均有显著下降, 实验组下降更显著, 因为米诺环素促进牙周韧带细胞的增殖及生物合成, 有利于牙周新附着的形成[6]。
中老年高血压患者多见, 由于手术治疗的创伤性和复发性, 患者不愿接受, 因此通过米诺环素软膏联合牙周非手术方法辅助治疗药物性牙龈增生可以作为不愿意接受手术治疗的患者的一种选择。
参考文献
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