IL-2基因（精选7篇）
IL-2基因 篇1
白细胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2) 的生物学作用以刺激T淋巴细胞增殖为主。除此之外还有其他重要功能, 如促T淋巴细胞增殖;维护整个NK (自然杀伤) 细胞的活化、分化和增殖, 调节NK细胞, 保持它的自然杀伤力;诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖;诱导淋巴因子活化淋巴细胞产生;促B淋巴细胞增殖、分化作用;以及与其他白细胞介素等的协同作用[1]。许多研究证明, IL-2作为佐剂可提高体液免疫和细胞介导的免疫反应[2,3,4]。
长白猪又称兰德瑞斯猪, 原产于丹麦, 目前世界上养猪业发达的国家均有饲养, 是世界上最著名、分布最广的主导瘦肉型猪种, 是养猪生产不可或缺的优秀猪种。在我国长白猪同样分布广泛, 纯种长白猪不仅生产性能好, 当与其他猪种杂交时, 也有良好的性能表现, 可以有效地提高后代的产仔数, 降低背膘厚度。在现代养猪生产中, 长白猪是品种选育中重要的种质资源。试验选择长白猪, 对其IL-2基因进行扩增和序列测定, 旨在为进一步研究长白猪IL-2功能性蛋白的有效表达、生物学活性及其作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
RPMI 1640培养基, 购自Hyclone公司;TRIzol LS® Reagent、真核表达载体pcDNA3.1 (+) , 购于Invitrogen生物公司;pfuDNA聚合酶, 购于默克生物工程有限公司 (Stratagene) ;pMD19-T载体试剂盒、Taq DNA Polymerase、BamHⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶、DL-2 000 Marker等, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司;胶回收试剂盒、Top 10, 购于TIANGEN公司;刀豆素 (ConA) 、淋巴细胞分离液, 购于北京索莱宝科技有限公司;长白猪, 购于贵州大学种猪场。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据GenBank上已刊载的猪IL-2基因mRNA序列 (X58428) 设计1对引物, 并分别在引物的5′端设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点, 为与载体连接表达做准备。IL-2引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 引物序列如下:F 5′-CGGGATCCCTCACAGTAACCTCAACTCCT-3′, R 5′-CGGAATTCGCCTGATACATTTAACATGAGAG-3′。
1.2.2 淋巴细胞的分离与培养
取无菌健康的长白猪前腔静脉血10 mL, 用3.8%的柠檬酸钠抗凝, 然后加入等量D-Hank’s液稀释;取稀释的外周血, 缓慢加到等量的淋巴细胞分离液中, 2 000 r/min室温离心20 min;吸取雾状层, 加入D-Hank’s液洗涤, 2 000 r/min离心洗涤3次, 弃上清液;沉淀细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮, 加入ConA, 使其终浓度为10 μg/mL, 5% CO2、37 ℃培养24 h。
1.2.3 淋巴细胞总RNA的提取
收取培养24 h的淋巴细胞, 用TRIzol法抽提总RNA。提取的RNA直接用于第1条链cDNA的反转录。
1.2.4 RT-PCR体外扩增
RT反应:取RNA模板5.0 μL, 5×Buffer 2.0 μL, dNTP Mixture 0.5 μL, RNase Inhibitor 0.25 μL, MMLV-RT 0.5 μL, 特异性下游引物1.25 μL, 0.1 mmol/L DTT 0.5 μL。试验同时用pfu E和Taq E按42 ℃、1 h进行反转录反应。PCR反应:cDNA 5.0 μL, 10×PCR Buffer 5.0 μL, dNTP Mixture 4.0 μL, pfu E /Taq E 1.0 μL, 上、下游引物各2.5 μL, ddH2O 30 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性90 s;94 ℃变性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.5 PCR产物回收与克隆
用1%的琼脂糖凝胶电泳分离, 切下含长度为542 bp左右条带的胶, 用凝胶回收试剂盒回收特异性条带。向pfu E 扩增的目的DNA条带中加A, 反应体系:回收DNA 30 μL, 10×PCR Buffer 5.0 μL, 10 mmol/L dATP 2.0 μL, Taq E 1.0 μL, ddH2O 12.0 μL。反应条件:72 ℃反应30 min。取产物5.0 μL进行电泳检测;然后将产物与载体pMD19-T连接, Taq E扩增的片段不需加A就可连接;转化Top 10感受态细胞;取450 μL 均匀铺于含有X-gal、IPTG、Amp (70 μg/mL) 的2×YT琼脂平皿, 37 ℃恒温箱中培养12～16 h;挑取10个白色菌落接种于含Amp (70 μg/mL) 的2×YT琼脂平皿, 同时做菌落PCR;37 ℃培养5～6 h, 取出, 封口, 4 ℃保存。将PCR鉴定含有目的条带的菌落接种于含Amp (70 μg/mL) 的2×YT培养基, 37 ℃振荡培养12 h, 提取质粒。再进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定, 鉴定正确的菌种送Invitrogen生物公司进行序列测定。
1.2.6 长白猪IL-2基因序列分析
用DNAStar等生物软件对所测定的长白猪IL-2基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析。
1.2.7 真核表达载体的构建
对于BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定正确的条带用胶回收试剂盒回收;与BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的pcDNA3.1 (+) 进行连接;转化Top 10感受态细胞, 取450 μL 均匀铺于Amp (70 μg/mL) 的2×YT琼脂平皿, 37 ℃恒温箱中培养12～16 h;挑取10个白色菌落接种于含Amp (70 μg/mL) 的2×YT琼脂平皿, 同时做菌落PCR;37 ℃培养 5～6 h, 取出, 封口, 4 ℃保存。将PCR鉴定含有目的条带的菌落接种于含Amp (70 μg/mL) 的2×YT培养基, 37 ℃振荡培养12 h, 提取质粒。再进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定, 鉴定正确的菌种送Invitrogen生物公司进行序列测定。
2 结果
2.1 长白猪的IL-2基因的RT-PCR扩增
对ConA刺激24 h的淋巴细胞提取总RNA, 经RT-PCR扩增后通过1%琼脂糖凝胶电泳得到1条542 bp的片段, 见图1。加A后电泳检测得到目的条带, 见图2。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.RT-PCR扩增产物。
M.DL-2 000 Marker;1.加A产物。
2.2 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定
将重组质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定, 菌株3, 4, 6, 7得到了与目的基因大小一致的片段, 初步证明所克隆的目的基因成功插入pMD19-T载体, 见图3、图4。
M.DL-2 000 Marker;1～10.菌落PCR产物。
M1.DL-15 000 Marker; 1, 3, 5, 7.质粒双酶切产物;2, 4, 6, 8. 对照; M2.DL-2 000 Marker。
2.3 序列分析
经Invitrogen生物公司测序, 得到了完整的长白猪IL-2基因的cDNA序列。长白猪的IL-2 cDNA 序列为 ctcacagtaa cctcaactcc tgccacaatg tataagatgc agctcttgtg ttgcattgca ctaacccttg cactcatggc aaacggtgca cctacttcaa gctctacaaa gaacacaaag aaacaactgg agccattgct gctggattta cagttgcttt tgaaggaagt taagaattac gagaatgctg atctctccag gatgctcaca tttaaatttt acatgcccaa gcaggctaca gaattgaaac accttcagtg tttagtagaa gaactcaaag ctctggaggg agtgctaaat ttaggtcaaa gcaaaaactc tgactcagca aatatcaagg aatcaatgaa caatatcaac gtaacagttt tggaactaaa gggatctgaa acaagtttca aatgtgaata tgatgatgag acagtaactg ctgttgaatt tctgaacaaa tggattacct tttgtcaaag catctactca acactgactt gataattaag tgcctctcat gttaaatgta tcaggc。
用DNAStar进行分析确定IL-2 cDNA 全长为526 bp, ORF全长为465 bp, 编码154个氨基酸, 所占比例:疏水氨基酸34.4%、亲水氨基酸34.4%、碱性氨基酸10.4%、酸性氨基酸11.7%。IL-2序列与GenBank公布的猪IL-2序列 (X58428) 比对, 同源性为100%。
2.4 真核表达载体构建
将重组质粒进行菌落PCR鉴定, 菌株除6, 8号外均得到了与目的基因大小一致的片段, 选择3, 5, 7, 9号菌株扩增、抽提质粒、双酶切鉴定, 初步证明所克隆的目的基因成功地插入pcDNA3.1 (+) 载体, 见图5、图6。
M.DL-2 000 Marker;1～10.菌落PCR产物。
M1.DL-15 000 Marker;1, 3, 5, 7.质粒双酶切产物; 2, 4, 6, 8.对照; M2.DL-2 000 Marker。
2.5 真核表达载体测序结果
将符合酶切鉴定要求的重组质粒pcDNA3.1 (+) -IL-2的菌种送Invitrogen生物公司进行测序鉴定, 测序结果序列与GenBank上公布的猪IL-2序列 (X58428) 比对, 同源性为100%, 表明猪IL-2基因的核表达载体pcDNA3.1 (+) -IL-2构建成功。
3 讨论
试验应用RT-PCR技术, 在体外成功地从ConA刺激24 h的长白猪淋巴细胞总RNA中分别扩增出了特异cDNA条带, 并将其克隆到pMD19-T载体及真核表达载体pcDNA3.1 (+) 上, 经测序证明克隆成功。试验采用pfu E和Taq E同时扩增, 结果显示2种酶扩增的片段经比对同源性为100%, 并且pfuE为高保真酶, 所以只列出了pfu E扩增的结果, 该结果提示在扩增片段不是很长时Taq E的准确性还是很高的。
养猪业在我国养殖业中占重要地位, 但是一些烈性传染病严重威胁着养猪业的发展。预防是控制传染的最佳手段, 但传统免疫预防手段存在一些问题, 如弱毒苗潜在的安全问题;灭活疫苗虽然安全有效, 但免疫效力较差, 尤其是细胞免疫作用受限制;基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗虽然具有应用潜力, 但也需提高其免疫效力, 尤其是细胞免疫效果。
近年来, 随着对IL-2的免疫学应用研究逐步深入, 发现其既可预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病以提高机体免疫机能, 也可作为增强基因疫苗免疫应答水平和免疫保护率的有效佐剂。在兽医方面, 因其能提高疫苗的免疫效果, 尤其是提高基因工程亚单位疫苗的免疫效果而倍受重视, 展现出了广阔的应用前景。Nunberg J H 等以IL-2和狂犬病灭活苗一起免疫小鼠, 结果表明, 疫苗对试验鼠的保护作用提高了25倍。Reddy P G等研究了单次和多次注射IL-2对重组牛的免疫增强作用, 结果表明:单次和多次注射IL-2均可增强BHV Ⅰ和副流感病毒二联苗及牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗的免疫效果, 但多次注射效果更好, 且无不良反应。希尼尼根等[4]的试验证明, pcDNA-IL-2 能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5 基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答, 可作为PRRSV 基因疫苗的良好佐剂。细胞因子基因不是外源基因, 其表达产物对机体无毒副作用。Ishii K J等[5]对IL-4、IL-12、IFN- γ等几种细胞因子质粒的安全性进行了探索。研究表明:它们的佐剂效应可维持数周或数月, 并不是永久性的, 也不会因反复免疫而无限放大, 因此在体内持续表达不会具有潜在的危险性。
研究克隆了长白猪IL-2基因的cDNA, 并构建了真核表达载体, 为IL-2作为免疫增强剂及其生物活性的研究奠定基础。
摘要：为了对长白猪白细胞介素-2 (IL-2) 基因的生物学作用进行研究, 试验将长白猪外周血淋巴细胞在刀豆素A (ConA) 的刺激下培养24 h后, 提取总RNA, 应用RT-PCR技术扩增IL-2 cD-NA, 克隆到pMD19-T载体并测序。对构建好的T载体双酶切并回收目的片段, 将回收片段与pcD-NA3.1 (+) 载体连接并转化到Top 10中构建真核表达载体。结果表明:克隆的IL-2 cDNA全长为526 bp, ORF全长为465 bp, 编码154个氨基酸, 与GenBank公布的猪IL-2比对同源性为100%, 进而证明成功地克隆了长白猪IL-2 cDNA;并且真核表达载体双酶切及测序表明成功构建了长白猪IL-2真核表达载体。
关键词：长白猪,IL-2基因,真核表达载体,构建
参考文献
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IL-2基因 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物
供体健康雄性Wistar大鼠(300～500g),受体健康雄性SD大鼠(300～350g),购自中科院上海实验动物中心。
1.2 主要试剂及器械
腺病毒介导人白介素-10基因(Adenovec-hIL-10)(美国Invivogen公司);hIL-10、IL-2、TNF-α单克隆抗体, SABC免疫组化染色试剂盒,DAB酶底物显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);hIL-10 ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司);hIL-10 PCR试剂(美国MBI Fermentas公司);PM10SP 显微荧光图像自动摄像系统(日本OLYMPUS公司);Emager2200型凝胶图像分析仪(美国Alpha公司);DU-64 型紫外分光光度计(美国Beckman公司)。
1.3 实验分组
29只供体Wistar大鼠和受体SD大鼠配对,随机分为3组:Ⅰ组(空白对照组,n=9)离体供血管置入10℃含肝素生理盐水中浸泡30min;Ⅱ组(空载体对照组,n=10)离体供血管置入10℃含空腺病毒载体的转染液中浸泡30min;Ⅲ组(重组基因组,n=10)离体供血管置入10℃携带5.0×109PFU/ml hIL-10的重组腺病毒的转染液中浸泡30min。
1.4 动物模型
建立大鼠同种异体移植血管急性排斥反应动物模型[3]。
1.5 基因转染
离体供血管获取后,置入10℃携带5.0×109PFU/ml hIL-10的重组腺病毒载体含肝素生理盐水中浸泡,30min后植入受鼠颈部。
1.6 观察指标及测定方法
移植术后5d,SD大鼠沿原切口游离显露颈总动脉,腹腔注射肝素液(200U/g)3min后,吻合口内侧端切取移植动脉长约1cm,生理盐水轻轻漂洗后备行下列处理。
1.6.1 取部分移植血管组织固定、包埋、切片,行HE染色,光镜下观察移植血管内膜、中层和外膜的改变,血管腔的变化和单核/巨噬细胞浸润情况;并按器官移植排异反应的国际诊断标准分级[4],共分为0～Ⅳ级。
1.6.2 PT-PCR法检测移植血管hIL-10mRNA的转录强度。(1)TRIZ01 试剂提取组织总RNA:取1g移植血管组织以液氮速冻后,严格按照TRIZ01试剂提取组织总RNA操作步骤进行,紫外线分光光度计准确定量总RNA的OD值确定RNA浓度及纯度,要求OD256nm/OD280nm结果在1.8以上,且2.0%琼脂糖凝胶电泳显示清晰的18S和28S条带,说明RNA提取完整。(2)二步法RT-PCR检测组织中hIL-10m RNA的转录强度:以Two-tube RT-PCR system进行二步法逆转录和多聚酶链反应扩增,cDNA的合成严格按Promega RT-PCR试剂盒说明书进行。50μlPCR反应体系如括号中所示[10×buffer:5.00μl;dH2O2(RMNase-free):34.00μl;Taq DNA polymerase:1.00μl;cDNA sample:4.00μl;25mM MgCl2:3.00μl;final volme:50.00μl;10mM dNTP: 1.00μl;downstream primer:1.00μl;upstream primer:1.00μl],引物设计见表1。hIL-10的PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,57℃退火40s,72℃延伸50s,循环30次,72℃延伸10min,4℃退火。β-αctin的PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸75s,循环25次,72℃延伸10min,4℃退火。(3)凝胶图像分析仪分析:取5μl的PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理,计算hIL-10/β-actin灰度的比值。
1.6.3 酶联免疫吸附法(ELISA法)测定移植血管hIL-10的表达水平:取50mg组织,加入2ml提取液(275mmol/L 氯化钠,5mmol/L氯化钾,10mmol/L EDTA, 100mmol/L L-精氨酸,2.5g/L吐温-80,冰醋酸调pH至4.0),匀浆器制作组织匀浆,置冰上平衡1h。13 000r/min离心匀浆物3min,上清液分装后以液氮快速冷冻,储存于-70℃待用。采用ELISA检测试剂盒测定各组hIL-10的表达量。
1.6.4 免疫组化染色检测移植血管hIL-10、IL-2、TNF-α:标本首先进行微波抗原修复,然后应用SABC法进行免疫组化染色检测,细胞核呈棕黄色为阳性细胞,400倍光镜下计数5个视野内的细胞总数,表达指数用百分比表示。
1.7 统计学处理方法
所有数据采用均值±标准差
2 结果
2.1 移植血管病理形态学变化
移植术后5d,Ⅰ组血管内皮细胞明显肿胀,内皮受损明显、大片脱落,外膜大量单核细胞/巨噬细胞浸润;Ⅱ组病理改变与Ⅰ组相似;Ⅲ组移植血管内皮受损减轻,外膜单核细胞/巨噬细胞浸润不明显,排斥反应级别较Ⅰ、Ⅱ组明显下降。各组的免疫排斥病理分级见表2。
2.2 移植血管hIL-10基因的转染及表达情况
2.2.1 hIL-10mRNA的转录强度:
仅Ⅲ组出现hIL-10 DNA特异性扩增带(181bp);Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组出现SD大鼠特异性β-actin DNA扩增带(491bp),见图1。
注:与Ⅰ、Ⅱ组比较,P< 0.01。
2.2.2 hIL-10蛋白表达情况:
ELISA法检测Ⅰ组未检出hIL-10表达,Ⅱ组hIL-10表达量轻度上升[(0.19±0.11)pg/100μg]。与Ⅰ组、Ⅱ组比较,Ⅲ组hIL-10表达量明显上升[(0.84±0.38)pg/100μg],差异有统计学意义(P< 0.01)。
2.3 免疫组化染色检测各组hIL-10、IL-2、TNF-α的表达情况
见表3。hIL-10、IL-2、TNF-α的免疫组化阳性表达位置主要位于细胞浆,呈棕褐色。且主要分布于内膜的内皮细胞和浸润炎性细胞。Ⅰ组、Ⅱ组IL-2、TNF-α表达明显增多;Ⅲ组IL-2、TNF-α的表达较Ⅰ组、Ⅱ组明显减少。
注:与Ⅰ组、Ⅱ组比较,★P<0.01;▲P<0.05。
3 讨论
研究表明,建立特异性移植耐受是解决移植排斥反应难题的最佳途径,其中转基因诱导由TH1向TH2转化的免疫偏离是实现免疫耐受的重要策略之一[5]。目前对诱导免疫耐受的研究均是建立在对T细胞的调控上,一般认为TH1型细胞因子(主要为IL-2、TNF-α)参与介导急性排斥反应的发生;而TH2型细胞因子(如IL-10)可拮抗TH1细胞并抑制CTL的功能,TH2型细胞的活化可导致移植耐受的形成[6]。
IL-10兼有抑制移植免疫排斥反应和增强移植物自我保护功能,对免疫应答具有负性调节作用,主要由TH2细胞产生,抑制TH1类细胞因子,并通过多种途径间接抑制TH1细胞的分化及其介导的免疫应答。用免疫抑制性细胞因子——IL-10基因转染移植器官,让其在局部有效稳定地表达基因产物以建立移植物长期生存的微环境已渐受到人们的关注,并取得了令人鼓舞的结果[7]。
针对血管移植而言,直接浸泡基因转染法是最简便、安全和最具高效率的基因转移方法。采用此种基因转染方法既可避免移植血管过长的冷缺血-再灌注损伤和动脉内灌注所致内皮灌注伤而影响实验结果的精确,又可使转基因载体与靶细胞充分接触;移植前用生理盐水冲洗移植血管床,可洗脱掉残留在移植血管内的腺病毒载体,减少其对移植物的毒性、免疫原性和载体的全身性转导和表达的几率。
IL-2、TNF-α在器官移植急性排斥反应中发挥十分重要的作用。IL-2是调节T细胞增殖分化的关键介质。IL-2能够诱导T淋巴细胞和NK细胞发挥细胞毒作用,诱导靶细胞凋亡。TNF-α在排斥反应早期上调了移植器官抗原的表达,还可促使免疫细胞和炎性细胞在移植物局部的浸润,而两者正是急性排斥反应发生的关键因素[8]。本研究结果显示,对照组IL-2、TNF-α均明显上调,移植血管组织免疫排斥损害明显。
本研究结果表明,从转录、翻译两个水平证明,离体供血管移植后5d局部成功地转染并表达外源性hIL-10基因,而对照组则检测不到相应的基因产物,由此说明该转染方法是有效可行的。免疫组化染色检测发现转基因组较对照组IL-2、TNF-α的表达明显减少;病理结果也显示转基因组与空载体组、空白对照组相比,移植血管组织免疫排斥减轻,内皮损害不明显,中性粒细胞浸润减少。由此说明,移植血管局部表达的免疫抑制性细胞因子——hIL-10可抑制TH1类细胞因子IL-2、TNF-α的产生,从而抑制T细胞活化和增殖,下调单核细胞及巨噬细胞的活性,达到减轻同种异体移植血管急性排斥反应的治疗目的。
本实验结果表明,移植血管局部的hIL-10基因修饰,只是诱导移植血管局部的免疫抑制状态,还未能达到完全的免疫耐受,这可能由于基因产物表达的有限性及血管表达水平相对较低等限制了其免疫抑制效果,所以仅通过单一细胞因子的转基因治疗来控制错综复杂的细胞因子网络很可能远远不够,多基因联合治疗应该是器官移植免疫耐受诱导研究的一个重要策略,有待于以后进一步扩大研究。
摘要：目的:观察腺病毒介导人白介素-10(hIL-10)转基因对大鼠同种异体移植血管IL-2、TNF-α的影响及其可能的作用机制。方法:以Wistar大鼠为供体,SD为受体,采用颈动脉显微外科原位吻合技术,将经直接浸泡法转染腺病毒介导hIL-10的离体供血管植入受体血管。随机分为3组:I组(空白对照组,n=9),II组(空载体组,n=10),III组(基因转染组,n=10)。移植后5d,观察移植物病理组织学变化及免疫排斥级别;RT-PCR、ELISA、免疫组化染色检测移植血管hIL-10基因产物;免疫组化染色检测IL-2、TNF-α。结果:基因转染组移植血管有效地表达特异性hIL-10基因产物。与对照组比较,急性排斥级别降低(P<0.01);IL-2、TNF-α的表达量明显下降(P<0.01)。结论:腺病毒介导人白介素-10转基因能有效地下调IL-2、TNF-α表达,诱导移植血管局部免疫抑制状态,抑制同种异体移植血管的急性排斥反应。
关键词：人白介素-10,转基因治疗,IL-2,TNF-α,同种异体血管,大鼠
参考文献
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IL-2基因 篇3
1资料与方法
1.1 研究对象
选择2008年12月至2009年10月在我院妇科门诊确诊的BV患者38例。选择同期正常体检妇女40例作对照组。为避免月经周期性激素水平波动对细胞免疫的影响,所有研究对象选择在月经干净后1周内取样。所有研究对象1年内有正常的宫颈防癌检查结果。排除标准:妊娠及哺乳期,服用性激素妇女;阴道其他病变,阴道流血,1周内阴道用药,3天内性生活史;长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者;2周内全身使用抗生素。标本的采集均经研究对象的知情同意。
1.2 方法
1.2.1 详细记录各组妇女年龄、月经史、生育史、性伴侣数目、性生活频度以及阴道炎史。
1.2.2 按Amsel法确诊BV患者,判断标准如下:①阴道分泌物稀薄奶样;②阴道pH>4.5;③胺试验阳性;④线索细胞阳性。以上4项有3项者。
1.2.3 阴道细胞因子的检测,用0.9%氯化钠溶液5 ml冲洗阴道上1/3及后穹隆,取阴道灌洗液置于试管中,-20℃保存。所有标本复融后一次检测,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定阴道灌洗液中细胞因子IL-2、IL-10水平。IL-2、IL-10试剂盒均为森威医疗设备有限公司生产。
1.3 统计学处理
用SPSS 13.0软件进行统计分析,结果以undefined或中位数表示。组间差异的比较采用方差分析和t检验。
2结果
2.1 两组一般情况的比较
BV组平均年龄31.26±5.54岁,对照组平均年龄32.68±6.36岁,两组比较差异无统计学意义。两组妇女在孕产次、性伴侣数目、性生活频度,以及患阴道炎种类、次数相比较,差异均无统计学意义。
2.2 两组IL-2和IL-10水平比较
①IL-2水平:BV组IL-2水平较对照组明显降低,两组比较,差异有高度统计学意义( P=0.007)。②IL-10水平:BV组IL-10水平较对照组明显增高,两组比较,差异有高度统计学意义( P<0.001)。③IL-2/IL-10比值:BV组阴道灌洗液IL-2/IL-10较对照组明显降低,两组比较,差异有高度统计学意义( P<0.001)。见表1。
3讨论
3.1 应用阴道灌洗液测定细胞因子的可能性
Fratti等[2]报道,在正常妇女及复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)患者阴道灌洗液中可测到干扰素(IFN);刘朝晖等[3]报道,在正常妇女及VVC患者阴道灌洗液中可测到IFN、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)及免疫球蛋白G(IgG )。本研究所有的标本均检测到了IL-2、IL-10。与孙玉凤等[4]报道在BV患者阴道局部可测到IL-2、IL-8、IL-13的结果有一致性。
3.2 BV患者阴道灌洗液中细胞因子IL-2的变化
本研究所有的标本均检测到了IL-2;BV患者阴道灌洗液中IL-2水平较正常组明显下降( P=0.007),与孙玉凤等[4]报道在BV患者阴道局部IL-2浓度低于对照组的结果有一致性。IL-2主要由T细胞产生,主要生物学功能为活化T细胞,促进细胞因子产生,刺激自然杀伤细胞(NK)增殖,增强NK杀伤活性,促进B细胞增殖和分泌抗体。因此,BV时阴道灌洗液IL-2下降,提示阴道局部活化T细胞及产生细胞因子的能力减弱,宿主的细胞免疫功能低下。
3.3 BV患者阴道灌洗液中细胞因子IL-10的变化
本研究所有的标本均检测到了IL-10,BV组妇女IL-10水平较正常组显著增高,差异有高度统计学意义( P<0.001)。IL-10主要由Th2细胞和单核巨噬细胞产生,主要功能是抑制前炎症细胞因子产生,抑制MHC-II类分子和B-7分子的表达,抑制T细胞合成IL-2、IFN-γ等细胞因子。推测在BV时,阴道灌洗液IL-10升高,提示阴道局部抑制前炎症细胞因子产生以及抑制T细胞合成细胞因子,具有抗炎效应;IL-10的大量产生使阴道局部炎症反应及T细胞合成受到抑制,符合临床BV时无阴道黏膜炎表现。
3.4 BV患者Thl/Th2免疫平衡变化
本研究中BV患者阴道局部IL-2/IL-10比值较对照组显著下降,与孙玉凤等[4]报道相似。推测BV患者阴道局部可能Th1类细胞因子表达受抑制,Th2细胞因子表达相对增强,出现了Thl/Th2细胞的免疫功能失衡。机体在对抗自身及外来抗原入侵的过程中以Th1介导的细胞免疫为主,一旦由Th1向Th2偏移,则机体处于免疫抑制状态。王国富等[5]对尖锐湿疣患者免疫状态
参考文献
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IL-2基因 篇4
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 一般资料
2006年10月至2007年3月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院急诊 (ICU) 病房SIRS43例患者。其中男性21例, 女性22例;年龄65~88岁, 平均76岁。脑血管意外33例, 肺部感染5例, 糖尿病休克3例, 上消化道出血2例。43例患者随机分组:中药组20例, 对照组23例。两组病例在性别、年龄、SIRS评分比较均无显著差异 (P>0.05) , 具有可比性。
1.1.2 诊断标准
符合1991年美国胸科医生学会和危重医学学会 (ACCP/SCCM) 提出的全身炎症反应综合征的诊断标准, 即符合以下2项或2项以上的临床表现:①体温>38℃或<36℃;②心率>90/min;③呼吸>20/min或Pa CO2<4.3kPa;④白细胞总数>12×109/L或<4×109/L, 或中性杆状核细胞>0.10,
1.1.3 排除标准
①入院前两周内有感染病史者;②既往存在心、肝、肾等脏器慢性功能不全病史;③入院前半年内或入院后常规治疗中曾使用糖皮质激素或免疫抑制剂的患者;④发病后7d之内死亡的病例。
1.2 研究方法
对照组予单纯西医综合治疗, 中药组在西医综合治疗的基础上予内服升降散, 组方:僵蚕6g、蝉蜕3g、片姜黄1g、大黄12g, 用法:每日1剂。水煎200m L, 早晚各100m L, 连续服用7d。
1.3 检测项目
两组患者在用药前, 用药后第7天分别于晨起空腹抽取静脉血3m L, 血样离心后取上清液, -20℃冰箱冻存待用。采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清IL-2、IL-4、IL-6水平。试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。操作过程严格说明书进行。仪器采用国产FJ630G/12型微机多探头γ计数器。
1.4 统计学分析
数据处理应用SPSS13.0软件进行分析, 计量资料以±s表示, 采用重复测量资料的方差分析 (One way ANOVA方法) , 以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
中药组与对照组血清IL-2、IL-4、IL-6水平在用药前均无统计学差异 (P>0.05) , 且两组均明显高于正常值。治疗后第7天血清IL-2、IL-4、IL-6水平比较, 对照组治疗后与治疗前比较均不存在统计学差异 (P>0.05) , 中药组治疗后与治疗前比较均存在显著统计学差异 (P<0.05) , 治疗后中药组与对照组比较均存在显著统计学差异 (P<0.05) 。
3 讨论
目前大量研究表明认为在机体炎症反应过程中始终存在促炎和抗炎两个方面的相互作用并相互重叠, 炎性介质及其抑制因子之间的失平衡可能是导致MODS的重要原因。SIRS中炎性介质种类繁多, 相互之间作用复杂, 具有“网络性”特点, 但总的分为促炎介质和抗炎介质。本研究发现升降散能同时降低SIRS患者血清IL-2、IL-4、IL-6水平, 提示升降散可能对全身炎症反应促炎和抗炎两方面均有调控作用。
升降散, 又名太极丸, 陪赈散, 最早见于明代医家张鹤腾编著的《伤暑全书》[6], 由僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄组成, 是中医温病学名方, 清代杨栗山在《伤寒温疫条辨》中对此方推崇倍至“按温病总计十五方…而升降散, 其总方也, 轻重皆可酌用”, 其疗效也甚为显著, 可用来治疗各种温热证候。针对升降散中所含单药现代中药药理学研究亦表明, 僵蚕有良好抗凝、抗血栓、促纤溶等作用[7], 可能对SIRS所产生的凝血机制的紊乱起到调节作用, 阻止SIRS的进一步发展恶化;蝉蜕和姜黄都有诱生干扰素的作用, 并且有一定的抑菌效用, 可以降低各细胞因子的释放, 起到良好的预防MODS的功效[7];大黄有多种药理作用, 能抑制IL-6等细胞因子的作用[8~9], 并对机体的免疫反应可能具有双向调节作用[10]。因此提示我们对于SIRS患者, 在常规治疗的基础上加用升降散对影响其预后的炎性介质及机体免疫调节功能可能存在一定作用。而本研究发现, 加用升降散的中药组与对照组治疗后第7天IL-2、IL-4、IL-6水平值与治疗前比较, 两组均有差异 (P>0.05) , 因此表明升降散与常规治疗相比显然能更有效降低SIRS患者血浆IL-2、IL-4、IL-6水平, 提示依据温病学说理论运用中药对SIRS患者进行干预可能具有重要临床意义。
参考文献
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IL-2基因 篇5
Wistar大鼠40只, 雄性, 体重180～200g, 1.5月龄, 黑龙江中医药大学实验动物中心提供。弗氏完全佐剂:美国Sigma;血清白细胞介素-2 (IL-2) 和白细胞介素-10 (IL-10) ELISA试剂盒:美国ADL公司。KWD-808Ⅱ型电针仪:常州长城;Anthos 2010型全自动定量酶标仪:奥地利;AB204-N电子分析天平:梅特勒托利多集团;TCL-16B高速台式离心机:上海安宁科学仪器厂。
2 方法
2.1 动物分组及造模方法
大鼠随机分为4组, 见表1。除正常组外, 其余各组参照文献[1]方法造模。
2.2 针刺干预及指标检测方法
电针组、普通毫针组于造模后第1天, 每日早8:00开始给予针刺治疗。电针组:将大鼠置于固定器内, 两后肢暴露于外, 待大鼠安静20分钟后, 以0.25mm×13mm毫针垂直刺入大鼠左侧足三里和三阴交穴约5mm, 采用KWD-808Ⅱ型脉冲电针仪, 正极连接足三里, 负极连接三阴交穴, 规律脉冲电波, 给予“疏密波” (60Hz/1.05s与2Hz/2.85秒交替) , 强度1mA, 持续25分钟。普通毫针组:针刺方法同电针组, 但不接电针仪。上述治疗每日1次, 共治疗28天, 于末次治疗2小时后, 处死大鼠, 摘除眼球取血, 室温放置15分钟, 3000r/min离心15分, 离心后取上层血清, 按ELISA试剂盒说明书操作, 测定血清IL-2和IL-10水平。
2.3 统计学处理
采取SPSS17.0统计软件做单因素方差分析, 数据以undefined表示, 两组间比较采用q检验。
3 结果
见表1。
与正常组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05;与毫针组比较#P<0.05
4 讨论
类风湿性关节炎 (RA) 属中医学“痹证”范畴, 其形成与免疫系统调节功能紊乱密切相关。足三里和三阴交是针刺发挥免疫调节作用的重要穴位。针刺通过刺激穴区的神经、血管及淋巴管等具有复合结构的感受器, 神经冲动通过外周躯体或植物神经的传入系统, 针感反射性作用于神经-内分泌-免疫网络的各级水平, 使神经肽和细胞因子相互作用、加工和整合, 产生对“细胞因子网络”完整而精密的调节。
尽管RA病因和病理机制还不十分明确, 但越来越多的证据表明, 细胞因子在RA的病理过程中发挥着重要作用[2,3]。IL-2由Th1细胞分泌, 可以增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖和活化, 增强NK细胞的活性, 诱导TNF-α和IFN-γ的产生。IL-10主要由Th2细胞产生, 是一种具有很强免疫抑制及免疫调控作用的细胞因子, IL-10可以阻止抗原特异性T细胞增殖, 抑制抗原递呈细胞的递呈能力, 可以抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、THF-α、GM、CSF等促炎症细胞因子和趋化因子的产生[4]。
在本实验中, 通过测定动物血清细胞因子含量的变化发现:RA大鼠血清中IL-2和IL-10水平较正常组显著升高。经针刺治疗后, RA大鼠血清中IL-2的含量显著下调, IL-10水平均显著升高, 电针组与普通毫针组无显著差异。表明针刺治疗可能通过从整体上调整平衡Th1/Th2细胞网络, 从而达到调节RA大鼠机体免疫功能, 改善关节滑膜炎性病变的作用。
参考文献
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IL-2基因 篇6
1 材料与方法
1.1 动物分组和模型制作
取健康、未生产、12～14周龄的雌性wistar大鼠,适应性饲养1周后,于晚6时雄雌1∶2合笼,次日晨8时行阴道涂片,见到精子较多者定为孕第1天。将30只孕鼠按随机数字表分组法分为3组:正常孕组、注射溴隐亭组、注射溴隐亭+IFN-γ抗体组,每组10只,均存活12天。正常孕组:正常孕12天;注射溴隐亭组:于孕5～7天每天腹腔注射溴隐亭0.3mg/kg,连续3天;注射溴隐亭+IFN-γ抗体组:于孕5～7天每天腹腔注射溴隐亭0.3mg/kg,连续3天,孕8～10天肌内注射IFN-γ抗体1μg/kg,连续3天。以流产率判定模型的建立(流产率=流产鼠胚胎只数/妊娠鼠胚胎只数×100%),其中,正常孕组胚胎数为108只,均为活胎,流产率为0;注射溴隐亭组胚胎数为115只,流产鼠胚胎数为104只,流产率达90%;注射溴隐亭+IFN-γ抗体组的胚胎数为112只,流产鼠胚胎数为67只,流产率为60%,后两组与正常孕组流产率相比差异有统计学意义,视为模型建立成功。
1.2 取材
大鼠存活至12天时,2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉,打开胸、腹腔,从腹主动脉取血后自然凝固静止30分钟,离心取血清,置于-20℃冰箱备用;然后行4%多聚甲醛灌注固定,取卵巢,置于4%多聚甲醛中固定12小时,常规进行石蜡包埋、切片,片厚6μm。
1.3 酶联免疫吸附法(ELISA)测定
血清中TGF-β1、IL-2、IL-4的水平双抗体夹心法:(1)包被:用0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(2)加样:加待检样品0.1ml于上述已包被的反应孔中,置37℃孵育1小时,然后洗涤。(3)加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml,37℃孵育0.5～1小时,洗涤。(4)加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液0.1ml,37℃10～30分钟。(5)终止反应:于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05ml。(6)结果判定:ISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
1.4 SP免疫组化检测
将组织块常规石蜡包埋、切片,片厚6μm,取石蜡切片,脱蜡、入水后,用IL-2(1∶200)、IL-4(1∶400)、TGF-β1(1∶200)行免疫组织化学SP法染色(以上试剂均购自北京博奥森生物工程公司)。1.5统计学分析用SPSS 10.0对血清所测的TGF-β1、IL-2、IL-4OD值及黄体的免疫阳性细胞OD值行单因素方差分析及t检验,P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ELISA测定结果
注射溴隐亭组血清IL-2水平较正常孕组升高,TGF-β1、IL-4水平较正常孕组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。注射溴隐亭+IFN-γ抗体组血清IL-2水平较注射溴隐亭组有所降低,而TGF-β1、IL-4水平有所升高(P<0.05),基本达正常水平。见表1。
(1)注射溴隐亭组与正常孕组比较,P<0.05;(2)注射溴隐亭+IFN-γ抗体组与注射溴隐亭组比较,P<0.05
2.2 黄体阳性细胞OD值
TGF-β1、IL-2、IL-4在各组大鼠卵巢黄体颗粒黄体细胞和膜黄体细胞均有表达,阳性产物主要分布于胞质,未见胞核着色。表达趋势与血清水平基本一致。见表2。
(1)与正常孕组比较,P<0.05;(2)与注射溴隐亭组比较,P<0.05
3 讨论
生殖免疫学认为,妊娠过程是成功的半同种移植过程,母体对胎儿的免疫耐受与其免疫状态的调节有关[4,5]。母体免疫系统对胚胎组织是否发生排斥反应,到底以何种类型免疫应答占优势,人们进行了很多研究。经研究发现,细胞型免疫应答主要由Th1型细胞因子介导,包括IFN-γ、IL-2等,产生细胞毒作用,排斥胚胎组织,导致流产;体液型免疫应答则由IL-4、IL-5、IL-10等Th2型细胞因子介导,形成免疫耐受,对胚胎起保护作用。正常妊娠过程Th1/Th2因子处于动态平衡状态,且Th2因子占优势,保护胚胎组织,如果该细胞因子的平衡状态被破坏,则对妊娠不利[6]。同时,该平衡状态又受到其他细胞因子的调节,其中TGF-β1就是非常重要的调节因子。
研究表明,TGF-β1是参与负向调节的细胞因子,它对T细胞、B细胞、巨噬细胞等发挥多种抑制效应,在其他黏附分子的共同作用下,使一些免疫豁免部位和重要器官维持在免疫耐受状态[7],妊娠期血清中高水平的TGF-β1可能是保护胎儿免受母体排斥的重要机制之一。妊娠期敲除小鼠TGF-β基因后,近50%的胎鼠死于宫腔内。应用经典的自然流产小鼠模型CBA/JxDBA/2,采用斑点杂交及图像分析技术发现,自然流产小鼠蜕膜中TGF-βmRNA表达明显低于正常妊娠小鼠模型CBA/JxBALB/C,认为蜕膜TGF-βmR-NA表达异常在自然流产发病中起重要作用,可见TGF-β对妊娠影响重大。若TGF-β及其受体含量下降,可能引起早孕妇女体内局部免疫抑制状态发生改变,导致TGF-α、IL-2及自然杀伤细胞等活性相应增加,即Th1型细胞因子功能增强,而Th1型细胞因子可以直接或间接激活多种毒性细胞危害妊娠[8]。同时,研究证明,正常妊娠过程中TGF-β表达水平较妊娠前显著升高,这种上调作用是由孕期高水平的孕激素所引发[9]。
本实验中注射溴隐亭可使TGF-β的表达水平减低,免疫耐受作用减弱,上调了具有细胞毒性作用的Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ等),而下调了具有胚胎保护作用的Th2类因子(IL-4等),导致流产的发生。而注射IFN-γ抗体后,TGF-β1水平基本没发生变化,推测单独阻断某一Th1类的细胞因子,并不能对TGF-β1起到反馈调节作用,但是IL-2水平有所降低,而IL-4水平有所升高,说明在流产的发生过程中,IFN-γ可能与IL-2、IL-4具有协同或抑制作用,而不是单一因素的作用。文献报道,细胞因子IFN-γ除了单独具有多种生物学活性外,与其他细胞因子之间还可在诱导或抑制、受体调节及生物学效应的发挥3个方面相互作用[10]。
本研究初步阐明流产模型在注射IFN-γ抗体后,上调黄体TGF-β1的表达、而TGF-β1表达升高又间接下调了IL-2、上调了IL-4的表达,起到了对流产的保护作用,本研究提示临床上在治疗流产时,可考虑应用IFN-γ抗体,至于其中的机制和疗效,有待进一步研究和验证。
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IL-2基因 篇7
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集我院2013年3月-2014年3月滴虫性阴道炎患者300例, 随机分为A、B、C组各100例。A组年龄19~54 (31.2±1.7) 岁;B组年龄19~55 (31.5±1.8) 岁;C组年龄20~53 (31.3±1.6) 岁。所有患者均无其他严重内外科疾病。3组患者一般资料差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
在常规治疗的基础上分别给予A组患者甲硝唑500mg口服, 每天2次;B组患者替硝唑500mg口服, 每天2次;C组患者奥硝唑400mg口服, 每天3次。
1.3 观测指标
3组患者治疗7d后评价疗效。分别于治疗前后检测局部细胞因子IL-2、IL-8、IL-13水平, 用5ml生理盐水对阴道壁上1/3进行灌洗, 收集灌洗液以3000r/min离心5min后取上清液进行酶联免疫法检测[2]。
1.4 疗效评价标准
治疗7d后患者根据如下标准进行评价: (1) 痊愈:泡沫样或脓性白带等症状消失, 外阴及阴道不充血, 镜检未发现滴虫; (2) 有效:白带减少, 尿频、尿痛、外阴瘙痒等症状消失或改善明显, 镜检有滴虫但数量少缺乏活力; (3) 无效:上述症状未改善甚至加重[3]。总有效率= (痊愈+有效) /总例数×100%。
1.5 统计学方法
计量资料以±s表示, 多组间两两比较采±s表示, 多组间两两比较采用q检验;计数资料以率 (%) 表示, 多组间两两比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗效果
治疗后A组的总有效率98%和B组的总有效率92%均高于C组的72%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;A、B 2组总有效率差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。
[例 (%) ]
注:与A组比较, *P<0.05
2.2 细胞因子水平变化
3组患者治疗前局部细胞因子IL-2、IL-8、IL-13水平相近, 差异均无统计学意义 (P>0.5) 。3组患者治疗后IL-2、IL-8和IL-13水平均有不同程度下降, C组下降幅度最大, B组次之, A组最小, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
(±s, pg/ml)
注:与治疗前比较, *P<0.05;与A组比较, #P<0.05;与B组比较, △P<0.05
3 讨论
奥硝唑与替硝唑两者均为新型硝基咪唑类药物, 本结果证明两者疗效较传统代表药物甲硝唑有显著治疗效果。虽然奥硝唑治疗总有效率略高于替硝唑, 但差异不显著。有文献报道奥硝唑的抗革兰阳性厌氧菌作用较替硝唑强, 具有短时间改善症状、见效快的优点, 故部分文献报道倾向于首选奥硝唑治疗, 但依然有不少临床医师首选替硝唑。此外奥硝唑和替硝唑虽然疗效显著, 但依然有白带异常、阴道充血、外阴瘙痒等不良反应给患者带来痛苦, 为此应更加重视两者的不良反应[4]。
有研究发现滴虫性阴道炎患者IL-2、IL-8及IL-13的水平均有升高趋势, 有报道认为白带减少、尿频、尿痛、外阴瘙痒等症状由上述细胞因子升高所致。硝基咪唑类药物通过减少上述炎性因子的表达干预炎性反应, 阻止高敏炎性反应发生, 改善机体和阴道内环境, 缓解临床症状, 最终实现患者的康复。鉴于硝基咪唑类药物不可避免的耐药性, 能否通过减少上述细胞因子水平干预炎性反应治愈滴虫性阴道炎, 进而取代硝基咪唑类药物的治疗, 值得临床研究[5]。
综上所述, 治疗滴虫性阴道炎的临床效果由强到弱依次为奥硝唑、替硝唑和甲硝唑, 三者均可降低局部细胞因子IL-2、IL-8和IL-13的水平, 但奥硝唑降幅远大于替硝唑和甲硝唑。
参考文献
[1] 乐莲辉.替硝唑和奥硝唑在滴虫性阴道炎治疗中的临床价值观察[J].中国医药指南, 2013, 11 (23) :562-563.
[2] 卢俪潼.奥硝唑、甲硝唑用于滴虫性阴道炎的疗效分析[J].中国医药指南, 2013, 11 (27) :476-477.
[3] 张婵娟.三种硝基咪唑类药物治疗滴虫性阴道炎的疗效比较[J].中国医药指南, 2013, 11 (32) :388-389.
[4] 金春香.奥硝唑与替硝唑、甲硝唑治疗滴虫性阴道炎的疗效比较[J].中国社区医师 (综合版) , 2006, 8 (13) :45.