C-myc基因

C-myc基因（精选4篇）

C-myc基因 篇1

摘要：目的 检测c-myc基因在急性髓性白血病(AML)不同临床阶段的表达情况,探讨c-myc基因与AML的关系。方法 20例初诊AML患者作为初诊AML组,16例复发AML患者作为复发AML组,10例外周血造血干细胞移植治疗的AML患者作为对照组。检测三组骨髓单个核细胞中c-myc基因的表达水平,分析c-myc基因与AML不同临床阶段之间的关系。结果 初诊AML组与复发AML组治疗前骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于对照组(0.27±0.08)(P<0.05);治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.38±0.24)、(0.49±0.12)较治疗前下降(P<0.05);治疗后未达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于对照组(P<0.05);复发AML组再诱导治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.49±0.12)高于初诊AML组诱导治疗后达CR患者(0.38±0.24)和对照组(0.27±0.08)(P<0.05)。结论 c-myc基因高表达可能是AML发生与复发的机制之一,其表达水平在AML患者病程监测与预后判断中具有重要意义。

关键词：c-myc基因,急性髓性白血病,逆转录-聚合酶链反应,预后

急性白血病是因造血干细胞异常克隆性增生为表现的一类恶性肿瘤性疾病,其主要病因在于各种因素导致造血干细胞失去往成熟血细胞分化的能力而停滞在细胞发育的某个阶段不断增殖。现阶段多项研究已证实特定的分子生物学异常对AML具有临床意义。c-myc基因是1982年Neel等[1]发现的一种癌基因,具有刺激细胞增殖和凋亡的双向调节作用。近年来研究表明在多种肿瘤细胞中,c-myc基因存在异常表达[2,3]。本研究应用RT-PCR技术检测不同阶段的AML骨髓单个核细胞的c-myc基因表达水平,探讨c-myc基因作为细胞生长周期的主要调控基因与AML的关系,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月~2014年10月江西省人民医院血液内科住院的初诊AML患者20例作为初诊AML组。根据FAB分型,M1型5例、M2型8例、M4型5例、M5型2例。男11例,女9例,平均年龄(37.4±5.6)岁。选取2012年4月~2014年11月该院复发AML患者16例作为复发AML组。根据FAB分型,M1型5例、M2型2例、M4型5例、M5型4例。男7例,女9例,平均年龄(32.2±7.6)岁。选取2010年1月~2014年5月该院外周血造血干细胞移植治疗的AML患者10例作为对照组。男3例,女7例,平均年龄(27.8±8.3)岁。研究对象均为染色体核型分析正常者,诊断符合《血液病诊断及疗效标准》[4]。三组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 实验仪器与试剂

总RNA提取试剂为北京康为世纪生物科技有限公司生产;Taq DNA合成酶与美国Proega公司产品;M-MLV逆转录酶与缓冲液为美国Promega公司产品;c-myc基因与actin引物的PCR扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;PCR仪、紫外分光光度仪、低温离心机为美国BIO-RAD公司生产;-80℃冰箱为Forma Scientific公司生产;水平电泳仪为英国Amersham Pharmarcia Biotech公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 标本提取

所有研究对象在无菌条件下抽取骨髓2 ml注入EDTA抗凝试管中,用Hypague-Ficoll液密度梯度离心分离去除血清后计数,获得的骨髓单个核细胞。取(1~2)×106个骨髓单个核细胞,PBS洗涤两遍后加1 ml Trizol液,-80℃保存。

1.3.2 m RNA制备

按照TRIZOL试剂盒说明书提取细胞总RNA,应用微量核酸蛋白测定仪测定从各标本中提取RNA的OD260/OD280值,并计算RNA溶液的浓度,比值在1.8~2.0之间的标本进行逆转录反应。取RNA 2μg采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行c DNA合成及反转录产品扩增,并用β-actin作为参照,引物序列为:c-myc基因:上游序列:5’-ACAGCAAACCTCCTCACAG-3’,下游序列:5’-CGCAACAAGTCCTCTTCAG-3’,扩增条带为403bp;β-actin:上游引物:5’-ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3’;下游引物:5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’;扩增条带为379bp。反应条件:95℃孵育10 min后;以95℃孵育30 s,退火至58℃孵育30 s,72℃延伸30 s为1个循环,c-myc反应35个循环,β-actin反应25个循环,扩增后72℃延伸10 min。反应产物4℃保存。

1.3.3 PCR产物分析

制备2%浓度的含溴化乙锭琼脂糖凝胶,并取10μl实验所得PCR产物和DNA MarkerІ上样至琼脂糖凝胶中,120 V稳压电泳40 min后用拍照并应用Image J软件进行灰度值测定。结果判断以同时扩增的内参actin的表达强度为基准,c-myc的表达强度=c-myc基因灰度值/内参actin灰度值。

2 结果

初诊AML组与复发AML组治疗前骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于对照组(0.27±0.08),差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.38±0.24)、(0.49±0.12)较治疗前下降,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后未达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);复发AML组再诱导治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.49±0.12)高于初诊AML组诱导治疗后达CR患者的(0.38±0.24)和对照组的(0.27±0.08),差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1,2。

3 讨论

AML是一类造血干细胞异常克隆性增生为表现的恶性疾病,可发生于各个年龄阶段,是青少年与儿童最常见的恶性肿瘤之一。急性白血病是因造血干细胞异常克隆性增生为表现的一类恶性肿瘤性疾病,其主要病因在于各种因素导致造血干细胞失去往成熟血细胞分化的能力而停滞在细胞发育的某个阶段不断增殖。目前的资料显示急性白血病约占肿瘤总发病率的3%左右。近年来得益于化疗方案与支持治疗的改进和干细胞移植技术的进展,AML的预后明显得到改善,CR率明显提高[5]。目前证实AML特定的分子生物学异常具有临床意义,对于预后不良的分子生物学异常,采取特定的靶向治疗,是AML治疗进一步取得突破的一个重要方向。

c-myc基因是近年来医疗工作者研究最广泛的癌基因之一,其定位于人染色体8q24,由3个外显子组成,属核内蛋白。c-myc基因通过其编码的c-Myc蛋白,广泛作用于细胞生长、增殖、分化和凋亡等各个阶段[6,7],是细胞生长周期重要的调控基因之一,其异常表达与多种恶性肿瘤的发生有关[8,9,10]。Guo等[11]研究发现经过c-myc基因敲除的小鼠出现明显的造血异常,其有核细胞如中性粒细胞、单核细胞与淋巴细胞明显减少,并伴有严重贫血和血小板增多,证实了c-myc基因在髓系造血细胞分化中的作用。Delgado[12]等研究证实c-myc基因异常表达在白血病的发病和疾病进程中起着重要作用。

Rice等[13]运用染色体免疫沉淀启动基因阵列和基因表达谱分析相结合,发现PLZF-RARa可促使小鼠造血干细胞的生长,并抑制Dusp6和Cdkn2d,同时诱导c-myc表达,解释了c-myc基因在AML中表达增高的机制。陈萍等[14]发现AML与急性淋巴细胞白血病(ALL)的初诊患者,c-myc基因表达均明显高于健康对照,且在AML初诊患者中,c-myc基因的表达与FAB分型无相关性,而与初诊是外周血细胞数和骨髓中原始细胞比例呈正相关,在诱导化疗后未达CR的患者明显高于CR组。

在本次研究使用RT-PCR半定量的实验方法,结果显示,初诊AML组与复发AML组治疗前骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于对照组(0.27±0.08),差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.38±0.24)、(0.49±0.12)较治疗前下降,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后未达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);复发AML组再诱导治疗后达CR患者骨髓中单个核细胞的c-myc基因表达(0.49±0.12)高于初诊AML组诱导治疗后达CR患者(0.38±0.24)和对照组(0.27±0.08),差异具有统计学意义(P<0.05)。c-myc基因在急性髓性白血病初次诊断时和复发时的表达明显升高,提示c-myc基因高表达可能是急性髓性白血病的发生与复发的机制之一。治疗后完全缓解者c-myc基因表达水平下降,复发患者c-myc基因表达水平再次升高,且复发患者经治疗缓解后其c-myc基因表达水平虽有所下降但仍高于对照组和初治患者缓解后c-myc基因表达水平,提示c-myc基因表达水平在急性髓性白血病患者病程监测与预后判断中具有重要意义。

Lin等[15]研究发现,c-myc基因抑制剂在临床研究中显现出良好的抗肿瘤效果。Roderick等[16]报道,抑制c-myc基因能够阻止白血病的发生,并改善常规治疗失败的急性T淋巴细胞白血病患者的预后。

综上所述,随着医学研究的进一步开展,采用针对抑制c-myc基因的治疗策略,并动态监测AML患者的c-myc基因水平,有可能改善AML患者的预后,进一步提高AML患者的缓解率与治愈率。

C-myc基因 篇2

关键词：pu27,Mut Pu27,c-myc,结肠癌

G-四链体 (G-quadruplex) 由富含鸟嘌呤核酸序列旋聚而成 (图1) , 结合和稳定G-四链体的药物抑制端粒酶活性和癌基因表达发挥抗肿瘤作用[1]。癌基因c-myc转录的85%~90%由启动子区核酸超敏元件Ⅲ1 (NHEⅢ1) 控制, 也叫Pu27 (图2) , 富含鸟嘌呤可形成G-四链体沉默基因表达[2,3]。

1材料与方法

1.1细胞培养:结肠癌SW480细胞和正常结直肠黏膜FHC细胞, 分别用培养基RPMI 1640和DMEM:F12加10%FBS, 37℃、5%CO2条件下培养, 实验取用对数生长期细胞。

1.2富鸟氨酸寡核苷酸序列的制备:Pu27 5'-TGGGGAGGGTGGGGA GGGTGGGGAAGG-3'和Mut Pu27 5'-TGAGTAGCGTGAGCAGAGTGCG TAACG-3'序列, 上海生工生物工程有限公司合成, 无RNAse/DNAse双蒸水溶解至终浓度200μmol/L, 95℃处理5 min备用。

1.3 FITC标记Pu27和Mut Pu27观察摄取情况:8μmol/L浓度处理SW480细胞, DAPI核染色后观察。

1.4 MTT法检测Pu27对细胞的生长抑制作用:1~10μmol/L浓度梯度处理细胞 (1×105cells/well) , 5%CO2、37℃孵育 (24、48、72、144 h) , MTT法测490 nm各孔吸光度 (OD) 值。

1.5 RT-PCR检测c-myc基因转录活性:8μmol/L浓度处理细胞6、24、48、72 h, 提取总RNA, RT-PCR反应体系参数:95℃5 min, 95℃30 s、54℃30 s、72℃30 s, 40个循环, 72℃5 min, 得出各组CT值。引物序列见表1。

1.6 We s t e r n B o l t检测c-m y c基因蛋白表达:8μm o l/L P u 2 7和Mut Pu27, 处理SW480细胞6、24、48、72 h提取蛋白, Western Blot测蛋白表达, 计算目的与内参蛋白条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理24、72 h收集细胞, 流式细胞仪分析。

1.8统计学分析:数值用均值±SEM表示, SPSS16.0统计学软件分析, 单因素ANOVA分析MTT法测得数据, LSD法两两比较;独立样本t检验进行不同细胞株间的比较;秩和检验分析FCM数据, P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 Pu27和Mut Pu27细胞摄取情况:FITC-Pu27处理细胞24h荧光表达最强达87%, 72 h后摄取率未见较大降低;FITC-Mut Pu27细胞摄取率24 h为22%。见图3。

2.2 Pu27抑制结肠癌SW480细胞增殖:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理细胞48 h, 生长抑制率分别为 (0.50±0.03) ×100%、 (0.11±0.004) ×100%。8μmol/L Pu27处理FHC和HCT116细胞48 h, 生长抑制率分别为 (0.08±0.003) ×100%、 (0.26±0.06) ×100%。不同细胞株对Pu27敏感性不同, SW480细胞组高, FHC细胞组低。见图4。

2.3 Pu27抑制c-myc基因表达:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理细胞48 h, c-myc m RNA相对表达值分别为 (0.48±0.12) ×100%、 (0.85±0.08) ×100%, 蛋白相对表达值为 (0.42±0.09) ×100%、 (0.77±0.07) ×100%。Pu27抑制c-myc基因表达。见图5。

2.4 P u 2 7诱导S W 4 8 0细胞凋亡:P u 2 7处理细胞4 8 h, 凋亡率为41.34%, Mut Pu27组、未处理组48 h凋亡率分别为16.34%、6.82%, P<0.05。见图6。

3讨论

多种稳定c-myc基因启动子区四链体结构的药物可以下调c-myc基因表达, 表明G-四链体结构作为负调节因子在基因转录中的作用[2,3,4,5]。抑制c-myc基因表达的反义寡核苷酸序列, 易被核酸酶降解, 细胞摄取率低, 对正常细胞有毒性[6]。Pu27抑制c-myc基因表达的同时克服了以上局限, 不需转染易被细胞摄取并稳定存在[7,8,9]。

本文研究的外源性Pu27抑制SW480细胞增殖诱导凋亡, 对正常细胞毒性小, 摄取实验表明Pu27通过非转染进入细胞, 摄取率和稳定性高。MutPu27对比试验证明, Pu27的生物学作用与连续重复鸟嘌吟序列密切相关。Pu27下调c-myc基因mRNA和蛋白水平。这项研究通过基因组DNA序列选择性杀死癌细胞, 对正常细胞毒性小, 作用方式简单, 无需额外辅助, 是很有前途的肿瘤治疗方案。

参考文献

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C-myc基因 篇3

1 临床资料

质粒和细胞:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC-FU Vector、慢病毒结构质粒p Helper 1.0、慢病毒包膜蛋白质粒p Helper2.0、Oct4基因表达质粒、Sox2基因表达质粒、c-Myc基因表达质粒、Klf4基因表达质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司;293T细胞购自Invitrogen公司;试剂:质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;Lipofectamine200购自Invitrogen公司;胎牛血清、胰酶和DMEM培养基为Gibco公司的产品, M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司, OligodT购自上海生工, Marker购自Fermentas公司;AgeI酶购自NEB公司。

2 方法

2.1 引物设计及合成

根据pGC-FU Vector要求在引物中加入AgeI酶切位点。

M:Marker 5 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp

ACCGGT于PCR扩增Oct4基因F5-CGGGTACCGGTCGCCA CCATGGCGGGACACCTGGC-3R5-CCGGAATTCTCACTTGT CATCGTCATCCTTGTAGTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3, PCR产物大小:1134bp;同理以下是其余3个基因扩增引物Sox2基因F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGTACAACATGATG GAGACGG-3R5-CCGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCC TTGTAGTCCATGTGTGAGAGGGGCAG-3, PCR产物大小:1005bp;c-Myc, F5-CGGGTACCGGTCGCCACCATGGATTTTTTT CGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCTCCCGCGACGA-3R5-C CGGAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCGCAC AAGAGTTCCGTAGC-3, PCR产物大小:1416bp;Klf4 F 5-CG GGTACCGGTCGCCACCATGGCTGTCAGCGACGC-3R5-CCG GAATTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAAAATGC CTCTTCATGTGTAA-3, PCR产物大小:1464bp。PCR鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落, 其中Oct4 F5-CCTGGTGCCG TGAAGCTG-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PC R产物大小798bp;Sox2 F5-GAGCGCCCTGCAGTACAAC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小467Bp;c-Myc, F5-CCACACATCAGCACAACTACG-3R5-AGCGTA AAAGGAGCAACATAG-3, PCR产物大小531bp;Klf4 F5-CA ATTACCCATCCTTCCTGC-3R5-AGCGTAAAAGGAGCAAC ATAG-3, PCR产物大小521bp。上述引物设计与合成均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

2.2 重组慢病毒载体质粒的构建

采用PCR技术分别从4个含目的基因表达质粒中扩增目的基因, 用AgeI酶分别酶切载体pGC—FU Vector和上述PCR产物, 琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体DNA、酶切回收的PCR产物、In-Fusion交换酶及buffer与ddH20加入反应体系, 于23℃反应15min, 再于42℃反应15min制备克隆交换液, 转化DH5a。PCR鉴定细菌阳性克隆, 分别命名为p GC-FU-Oct4、p GC-FU-Sox2、pGC-FU-c-myc、pGC-FU-Klf4送往上海吉凯基因化学技术公司测序。

2.3 慢病毒包装

制备的各DNA溶液 (pGC-FU-Oct4 20μg, pHelper 1.0载体15μg, pHelper 2.0载体10μg) , 与相应体积的Opti-MEM混合。取100μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4mL Opti-MEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合以形成pGC-FU-Oct4 DNA-Lipofectamine 2000复合物。同样按照上述方法制备pGC-FU-Sox2的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-c-Myc的DNA-Lipofectamine 2000复合物、pGC-FU-Klf4的DNA-Lipofectamine 2000复合物。DNA-Lipofectamine 2000混合, 室温下温育20min, 混合液转移至293T细胞的培养液中, 于37℃, 5%CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基, 加入含10%血清的细胞培养基25mL, 于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48h。收集293T细胞上清液, 4℃, 4000×g离心10min, 以0.45μm滤器过上清液于40m L超速离心管中。于4℃, 25 000r/min, 离心20min, 冰PBS液重旋病毒沉淀, 于4℃溶解过夜。以10μL每管分装病毒液置于-80℃冰箱中保存。

2.4 慢病毒滴度测定

慢病毒液按10倍梯度稀释为5个浓度后, 分别感染293T细胞, 细胞培养于含有5ug/mL稻瘟菌素 (Blastieidin, BSD) 的DMEM培养液, 约2周左右去除培养液, PBS漂洗后, 结晶紫溶液进行染色, 最后在倒置显微镜下计数细胞克隆数。

3 结果

3.1 4个目的基因克隆PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 (图1) , 与设计的克隆片断大小一致。

3.2 慢病毒转移质粒的构建及鉴定结果

pGC-FU-Oct4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2A) , PCR片段大小为7 9 8 Bp, 测序结果与Ge n eb a n k中正常NM_002701.4序列一致;pGC-FU-Sox2重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2B) , PCR片段大小为467Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_003106.2序列一致;pGC-FU-c-Myc重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2C) , PCR片段大小为531Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_002467.3序列一致;pGC-FU-Klf4重组质粒阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳图 (2D) , PCR片段大小为521Bp, 测序结果与Genebank中正常NM_004235.4序列一致。

3.3 重组慢病毒的包装及滴度测定

将获得的病毒液梯度稀释后接种于293T, 经Blastieidin筛选, 约2周左右各转染组均已长出大小不等的细胞克隆, 而对照组则无克隆形成。在倒置显微镜下计数细胞克隆, 并计算出所获重组慢病毒的最终滴度。Oct4基因重组慢病毒、Sox2基因重组慢病毒、c-Myc基因重组慢病毒的滴度均为1×109TU/mL, Klf4基因重组慢病毒的滴度为1.9×109TU/mL。

4 讨论

胚胎干细胞被誉为“万能细胞”, 但一直以来, 获取人体胚胎干细胞必须摧毁胚胎, 这一点颇受非议。iPSC不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与胚胎干细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与胚胎干细胞几乎完全相同。iPSC的研究, 回避了长期以来围绕人类胚胎使用问题的政治和伦理争论, 并为新药筛选, 药物毒理研究和再生医学等领域提供了广阔的研究和应用前景。

这4个基因, 按其功能不同分为胚胎干细胞特异转录因子Oct4、Sox2, 肿瘤上调基因c-Myc、Klf4。Yamanaka等[1]认为Oct4、Sox2是维持细胞多能性必需的转录因子, c-Myc可以激活下游基因, Klf4则通过抑制P53表达来激活NANOG和其它胚胎干细胞特异性因子表达, 从而提高转化率。Takahashi研究小组[2]去除c-Myc转录因子, 利用慢病毒载体分别携带Oct4、Sox2、Klf4 3个转录因子转染小鼠胚胎成纤维细胞, 同样也获得iPSC, 但此方法的诱导效率约低于4个转录因子共同作用10倍;Huangfu等[3]借助助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小2种转录因子转染人成纤维细胞, 也成功获得ips, 诱导率明显低于3个因子共同作用;Vittorio等[4]用反转录病毒载体只携带Oct4转录因子转染小鼠神经干细胞获得iPSC, 诱导成功率为0.014%, 明显低于2个因子转染效率, 由此可见这个4个基因对于iPSC的最终形成都起着重要的作用。

本研究所采用的慢病毒载体是近年来出现的一种新的基因转移工具, 在多项研究中表现出具有转染分裂期和非分裂期细胞、容载外源目的基因片断大、能够将目的基因整合至靶细胞的染色体在体内长期表达、免疫反应小等独特优点[5]。此外, 研究人员还采用了腺病毒载体法、质粒载体法等方法进行iPSC诱导。Stadffeld等[6]使用腺病毒为载体通过反复转染小鼠肝实质细胞, 诱导产生小鼠iPSC, 对其进行PCR和Southern杂交检测, 没有发现腺病毒的整合。但是这种方法重编程的效率却比逆转录病毒转染要低得多。对于这种低效率, 一种可能的解释是使用腺病毒载体本身使用寿命较短, 不能维系一定的感染力, 转染细胞只能维持3～8d外源基因的表达, 在小鼠成纤维细胞中, 转基因的表达至少需要8d才能产生iPSCs。Okita等[7]建立包含Oct4、Sox2、Klf4的多顺子质粒载体 (polycistroni vector) 和包含c-Myc的质粒载体将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为iPSC, 但其诱导率却更低, 说明病毒基因的整合对iPSC克隆形成率有影响。

由于慢病毒载体源于Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV-1) 为保证其作为载体的安全性, 我们采用三质粒包装系统, 包括转移质粒、包装质粒及壳蛋白质粒。慢病毒三质粒系统各质粒单独存在时既不能形成病毒颗粒, 也不具备转导能力[8]。转移质粒将HIV3ˊ端LTR中的U3部分切短, 使之丧失启动病毒复制的功能, 同时插入CMV启动子, 成为复制缺陷型病毒载体;包装质粒去除了HIV包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列;壳蛋白质粒用单纯疱疹病毒来源的VSVG基因提供病毒包装所需要的衣壳蛋白, 大大提高了其安全性, 同时包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围, 而且增加了载体的稳定性, 允许通过高速离心对载体进行浓缩, 提高了滴度。病毒的滴度是进行后续实验研究的重要条件, 为了提高慢病毒滴度, 本实验采用共转染包装法, 这种方法[9]与传统方法 (即先将293FT细胞种植于培养板上, 再用DNA一脂质体复合物转染) 相比, 可提高病毒产量3～4倍, 与传统的脂质体2000转染方法的主要区别是:首先制备DNA-脂质体2000复合物, 然后将其加入含生长培养基的板上, 最后加入293FT细胞, 让细胞转染复合物与充分接触, 孵育过夜。结果显示提取含目的基因病毒滴度都较高, 可以达到满足后续实验的要求。本研究旨在构建慢病毒载体转载4个目的基因, 通过运用基因重组、3质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒共转293T细胞包装出高滴度的LV-Oct4、LV-Sox2、LV-c-Myc、LV-Klf4为下一步实验奠定了基础。

参考文献

[1]Takahashi K, Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell, 2006, 126 (4) :663～676.

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[3]Huangfu D, O safune K, Maehr R, et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4and Sox2[J].Nat Biotechnol, 2008, 26 (11) :1269～1275.

[4]Kim JB, Vittorio S, Wu G, et al.Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells[J].Cell, 2009 (136) :411～419.

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[6]Stadffeld M, Nagaya M, Utikal J, et a1.Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Intergation[J].Science, 2008, 322 (5903) :945～499.

[7]Okita K, Nakagawa M, Yamnaaka S, et a1.Generation of Mouse In-duced Pluripotent Stem Cells without Viral Vectors[J].Science, 2008, 322 (5903) :949～953.

[8]Bartosch B, Cosset FL.Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J].Curr Gene Ther, 2004, 4 (4) :427～443.

C-myc基因 篇4

1 C-myc与肿瘤的关系

1.1 C-myc促进肿瘤发生

正常细胞一般不表达或低表达C-myc。当染色体转位、基因重排或扩增引起DNA损伤时,原癌基因C-myc被激活,其编码的蛋白过表达,引起细胞转化和肿瘤形成[2]。Felsher等[3]发现,在小鼠造血细胞中构建C-myc转基因的模型,转基因的表达会导致恶性淋巴瘤和髓系肿瘤发生。C-myc还能与cyclin D1基因配合共同加速肿瘤形成,推动肿瘤发展[4]。此外,20%的人类恶性肿瘤都与C-myc的异常表达有关[2],包括乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、髓性白血病、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性胶质瘤、小细胞肺癌以及成神经管细胞瘤[2,5,6]。

1.2 C-myc促进肿瘤细胞增殖

肿瘤细胞有别于正常细胞的一个特性是具有永生化,使细胞周期出现紊乱达到细胞无限增殖的目的。而细胞周期的不断运行有赖于细胞周期蛋白依赖性激酶与周期蛋白的结合。C-myc与cyclin D1是调节Wnt信号通路重要的原癌基因,二者在刺激细胞增殖中发挥功能[4]。C-myc在调节细胞周期G1/S过渡中起关键作用,激活C-myc能加速细胞增殖。C-myc表达升高还能间接拮抗细胞周期抑制剂P21和P27的活性[7],激活细胞周期[8]。在体外敲除癌症细胞中的C-myc能阻碍细胞增殖,使细胞周期停滞[2,9]。C-myc癌蛋白还能控制粒线体的生物合成借以维持转化细胞高增殖的需求[10]。

1.3 C-myc抑制干细胞分化

细胞分化的实质是基因选择性表达的结果,癌症诊断和治疗中一个重要的参考数据就是肿瘤细胞的分化程度。近年来发现,C-myc能干扰干细胞分化,维持它们的全能型造血干细胞[11,12]和胚胎干细胞[13]。C-myc调节干细胞表达及其功能的能力与其致癌活性密不可分。一般情况下在分化瞬间,C-myc的表达几乎总是下降[13]。

1.4 C-myc促进肿瘤血管生成

新生血管是肿瘤赖以生存的重要营养保障,肿瘤通常通过这个过程来实现生长、增殖和转移[14]。研究发现,在低氧条件下低氧诱导因子-1α((hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)可促进肿瘤血管生成[15]。而C-myc能诱导HIF-1α表达,因而促进血管生成。下调C-myc和HIF-1α最终会抑制血管内皮生长因子和血管形成[16]。

1.5 C-myc促进肿瘤转移

肿瘤细胞的特性与基因组不稳定性密切相关,其不仅能无限分裂增殖,还能引发肿瘤细胞一系列形态和功能上的改变,比如上皮细胞-间充质转化和易于转移。肝癌细胞转移是通过C-myc的多种信号通路介导的[17]。研究[18]发现,在C-myc表达升高的骨肉瘤中,通过下调C-myc的表达能抑制癌细胞的迁移和入侵。

1.6 C-myc干扰肿瘤细胞凋亡

凋亡是存在于细胞内的自毁机制,具有免疫监视作用。在正常细胞中,C-myc能诱导细胞凋亡。一方面C-myc通过激活P53,继而激活促凋亡基因诱导细胞凋亡[19,20];另一方面,C-myc还能抑制抗凋亡蛋白如bcl-2的表达促进凋亡。而肿瘤细胞过表达的C-myc通常已经发生突变而无法启动凋亡程序[21]。在某种情况下体外敲除肿瘤细胞中的C-myc能诱导细胞凋亡[9]。

2 C-myc过表达与肿瘤预后

肿瘤预后与肿瘤治疗和肿瘤所处阶段息息相关,研究发现:在膀胱恶性肿瘤中myc癌基因的异常扩增和表达与预后不良有关[22];以C-myc扩增为特征的成神经管细胞瘤临床治疗结果差[6]。在C-myc表达升高的子宫癌肉瘤中,即使是早期癌症患者其复发率也达30%~50%。

3 C-myc在肿瘤治疗中的应用

C-myc参与正常细胞和肿瘤细胞的细胞周期、分化、蛋白合成和凋亡,已成为当前癌症治疗的一个靶点。为此,研制新型的专门抑制C-myc功能的小分子复合物来减轻癌症患者的痛苦很值得期待[2],包括抑制C-myc的表达、开发Myc-Max抑制剂、干扰与C-myc相关的靶点[9]。至今只有一种小分子化合物CX-3543进入神经内分泌癌的二期临床试验。分化诱导因子-1能诱导C-myc的降解,抑制肿瘤细胞的增殖[23]。miRNA-33b通过下调C-myc的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[18]。JQ1是一种能选择性地针对和抑制溴结构域包含蛋白活性的新型小分子,在恶性胶质瘤及其他恶性肿瘤的预临床模型中取得了成功,JQ1主要通过下调C-myc抑制肿瘤[24,25]。

4 结语

通过对C-myc异常表达的致癌属性的逐步认识,C-myc已成为与之相关的众多恶性肿瘤的治疗靶标。目前大量研究显示,低分子量的化合物将会发展成为继小分子化合物后潜在的抗癌个性化治疗药物。尽管当前在药物研发领域取得了较大成功,对肿瘤细胞中C-myc过表达的机制认识有了提高,但获取高特异性和高活性抗癌药物仍面临着困难。相信通过对各类干扰C-myc表达的小分子化合物的识别,有希望研制出新型的、有效的抗癌制剂[2]。

摘要：C-myc是原癌基因myc编码的一种转录调节因子,在促进肿瘤发生、维持肿瘤细胞生长增殖与分化及血管形成和凋亡中有重要作用。在大多数的恶性肿瘤中都发现C-myc的异常表达。鉴于C-myc在促癌和维持肿瘤细胞生长中具有重要作用,越来越多的学者将C-myc作为研究的靶点。作者对C-myc在肿瘤中的作用及将C-myc预应用于临床的研究作一综述。