信号途径（精选7篇）
信号途径 篇1
1 雌激素受体 (ER) 的基本结构
1.1 A/B区 (1-149氨基酸) 位于N端, 为高度可变区
在A/B区氨基末端存在一个非配体依赖性转录激活功能区, 称AF1区, 该区有高度变异性, 其转录活性依赖于特定的启动子, 是激素非依赖性的, 还含有一个能与转录因子交互作用的反式激活区。其长度和氨基酸序列可变性较大, 通过对专一性和非专一性DNA序列的识别来进行, 可减少非专一性DNA的结合, 选择正确的雌激素应答元件 (ERE) , 达到激活调控靶基因的目的, 可参与调节配体与雌激素受体结合, 调节雌激素应答基因的转录。
1.2 C区 (180-263氨基酸) 为DNA结合区 (DBD)
DNA结合区位于受体的中部, 是核受体家族中富含碱性氨基酸和半胱氨酸的最保守的一个区域, 氨基酸序列为180-263, 该区9个位置的Cys相对固定, 形成双“锌指”结构, 每个“锌指”结构由4个Cys与中心部的锌离子络合组成α螺旋, 直接参与DNA的结合, 达到转录靶基因的目的。外显子2和3编码该区域。
1.3 D区 (263-302) 为多变的铰链区
D区的保守性只有30%, 具有在E区的帮助下结合DNA的作用, 有时还会影响受体蛋白的DNA结合位点的结构。ER构型的改变受D区结构变化的影响, 以保证受体以最佳的构型与配体结合。D区可与热休克蛋白结合, 帮助ER进行适当折叠, 以保护疏水的配基结合区并使之处于非活性状态。D区还含有核定位信号, 并具有稳定DBD与DNA结合的功能。D区包括核的定位信号, 即所谓的“桥接区”, 它并不依赖于配体结合, 具有核转位功能。
1.4 E/F区 (302-553氨基酸) 为ER高度保守的区域
E/F区称为激素结合区位于受体的C端, 是第二保守区, 该区包括外显子4到8和装配配体结合的一个疏水区。E区是ER五种基因序列最大最长的功能区, 所以E区被赋予了最多的任务。E区包含有另外一个激素依赖的转录激活区, 该区域由螺旋3、4、5和12的氨基酸组成, AF2功能区的螺旋12在识别配体的雌激素激动或拮抗作用中发挥着重要的作用。当ER结合不同的配体时, AF2会呈现出不同的构像变化, 并决定转录靶基因所需要结合的共激活因子和共抑制因子, 形成ER-配体复合物, 而后与靶基因上的雌激素反应元件结合, 通过辅助因子与蛋白相互作用启动转录, 从而影响细胞增殖和分化。AF-2的核心成分是H12, 是转录激活的必须成分, 但其不直接与配体结合。当ER与配体结合, 可使H12发生明显的构象变化, 从而使AF-2活化。
2 ER受体的分型与分布
2.1 两种亚型 (ERα和ERβ) 定位
人类ER具有不同的基因编码, 含有不同的蛋白质分子结构和c DNA, 发挥不同的生物学功能。ERα基因定位于染色体6q25-1, 基因由140 kb以上的碱基对组成, 编码由595个氨基酸残基组成的蛋白质, 有8个外显子, 分子量约为67kb, -103位置和-27位置处有类似CAAT和TATA的转录元件顺序;ERβ基因远小于ERα基因, 主要因内含子长度不同所致, ERβ基因定位于14q22-24, 由40kb碱基构成, 编码由530个氨基酸残基组成的蛋白质, 分子量为59.2kb, 在结构上, 其氨基酸序列在DBD区及LBD区与ERα的同源性分别达95%和55%, 而在N端的AF1功能区, ERα和ERβ只有30%的同源性。ERβ和ERα与17B-雌二醇结合的解离常数分别为0.4mol/L和0.1mol/L, 都能与ERE结合。
2.2 雌激素的分子功能
卵巢是合成雌激素的主要场所, 分泌入血液后与性激素可逆性结合球蛋白及白蛋白。在血液中游离的雌激素扩散到靶组织而发挥其特殊的生理生化作用。雌激素对女性的卵巢、输卵管、子宫及阴道等内外生殖器官的分化、成熟和发育, 对女性乳腺的生长发育起着关键作用。男性精子的产生、睾丸等其他附属性器官的功能同样依赖雌激素。
雌激素对非生殖系统有调节作用。雌激素对心血管系统和下丘脑-垂体轴等中枢神经系统具有保护作用;可调节“骨”这个靶器官, 促进青春期骨骼的生长和骨骺的闭合, ERα和ERβ皆存在于成骨细胞、破骨细胞、间叶干细胞以及骨细胞中, 直接对这些骨发挥作用;对维持骨矿物质含量也具有重要意义;老年痴呆症、帕金森氏病、认知、记忆以及疼痛敏感性的病因也可能与之有关。
3 雌激素作用的信号转导途径
3.1 基因组作用途径
配体依赖途径。当雌激素与核受体结合后, 形成雌激素-受体复合物, 而使受体的构象发生改变, 形成同源二聚体, 暴露出DNA结合区, 这种复合物以二聚体的形式穿过核孔进入核内。在核内, 雌激素-受体复合物作为反式作用因子与靶基因上游的DNA特异基因的雌激素反应元件ERE结合, 同时通过募集而来的辅助因子, 直接或间接的与辅激活物和转录元件作用, 启动基因的转录。
配体非依赖途径。EGF (表皮生长因子) 、IGF-1 (胰岛素样生长因子-1) 、8-溴-c AMP等多肽类激素也可以激活雌激素受体, 使靶基因得到表达。文献报道, 该过程的关键因素可能是由细胞中的激酶磷酸化雌激素受体而导致的。ERα和ERβ均可被MAPK磷酸化, 只是二者磷酸化的部位不同。ERαAF-1区的第118位丝氨酸在接受EGF后可被MAPK (有丝分裂原激活的蛋白激酶) 磷酸化, 从而导致p68 RNA螺旋酶即ERα特异性辅激活物与受体结合, 使靶基因活化。同理, MAPK也可以磷酸化ERβN末端的活化区, 使受体与p160辅激活物SRC-1结合, 且这种结合是以配体非依赖的形式结合的最后再与ERE相互作用, 削弱ERα的转录活性。
3.2 非基因途径
此为雌激素的快速效应, 由雌激素与膜受体直作用影响蛋白质的磷酸化或去磷酸化所致。MAPK信号转导通路为:
丝裂原激活的蛋白激酶家族是细胞内信号转导的重要系统, 普遍存在于多种生物, 包括酵母和哺乳动物细胞, 参与了细胞分化、增殖、凋亡以及细胞间的功能同步等生理过程, 属于一组以级联方式依次活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成, 由多种同工酶组成, 以此将细胞外信号逐级放大并传导到细胞内乃至细胞核, 把膜受体结合的胞外刺激物与细胞质和细胞核中的效应分子连接起来。它可被多种刺激所活化。
MAPK家族的信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号。3种激酶按激活顺序依次为丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶, 丝裂原激活的蛋白激酶激酶及丝裂原激活的蛋白激酶, 构成一个连续的激活途径, 其中的ERK途径最为重要, 通过生长因子、细胞因子激活相应的受体酪氨酸激酶;多肽物质通过G蛋白偶联受体激活。
结束语
随着对ER蛋白分子机制认识的不断提高, 有待于深入研究ER与其他转录因子的相互作用, 以及对靶基因转录激活的机制及激素配体的作用, 同时仔细探讨雌激素的MAPK通路与其具体的生物学效应之间的关系, 将有重大的研究价值和应用前景。
信号途径 篇2
一氧化氮通过依赖和不依赖活性氧的信号途径介导桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉悬浮细胞中紫杉醇生物合成
一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)是植物体内两种常见的信号分子,在植物抗逆反应等过程中起重要作用.NO合成和氧化迸发(oxidative burst)以及ROS积累是红豆杉悬浮细胞在桔青霉细胞壁诱导子处理下出现的两个早期反应.为了探讨NO和ROS在桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞紫杉醇合成过程中的作用及其相互关系,分别以NO专一性淬灭剂cPITO,一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU,质膜NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI以及超氧离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)淬灭剂超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)处理红豆杉细胞.结果表明,cPITO和DPI不仅可以分别抑制红豆杉细胞的NO合成和ROS积累,同时还可以阻断诱导子对紫杉醇合成的促进作用,说明NO和ROS是参与桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞中紫杉醇合成调控的信号分子.cPITO和PBITU同时还可以部分抑制诱导子对红豆杉细胞氧化迸发的诱发作用.外源NO单独处理可以促进红豆杉细胞中紫杉醇合成,DPI可以抑制NO对紫杉醇合成促进作用.然而,即使在红豆杉细胞中ROS积累被完全抑制的情况下,NO和桔青霉细胞壁诱导子对细胞中紫杉醇的.合成仍然具有一定的促进作用.上述结果表明,NO可以通过依赖和不依赖ROS的两类不同信号途径介导真菌诱导子诱发红豆杉细胞中紫杉醇的生物合成.实验结果同时也表明,NO和桔青霉细胞壁诱导子对红豆杉细胞中紫杉醇合成的促进作用可以被CAT抑制,但不受SOD的影响,说明氧化迸发产生的H2O2可能是介导NO和桔青霉细胞壁诱导子诱发紫杉醇合成的信号分子.
作 者：徐茂军 董菊芳 作者单位：浙江工商大学生物工程系,杭州,310035刊 名：科学通报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE SCIENCE BULLETIN年，卷(期)：200651(14)分类号：Q94关键词：一氧化氮 氧化迸发 信号转导 红豆杉细胞 紫杉醇生物合成 真菌诱导子
信号途径 篇3
1 MAPK信号途径
MAPKs为促分裂原活化蛋白激酶, 属于丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶, 广泛地存在于哺乳动物细胞内, MAPK信号途径可受不同信号刺激而激活, 参与调解细胞多种生理功能。MAPKs家族成员主要有四个:细胞外信号调控的蛋白激酶 (ERK) 、c-Jun N端激酶 (JNK) /应激激活的蛋白激酶 (SAPK) 、ERK5/BMK1以及P38MAPK途径。大量证据表明氧化压力和ROS可以激活MAPKs。JNK (也被称为SAPK) 和p38MAPK信号转导途径在几种细胞中 (包括B-cells) 可被氧化压力激活。
2 JNK信号途径
JNK蛋白家族包括三个广泛表达的成员, 分别为JNK1、JNK2和JNK3, 可被多种因子激活, 如细胞因子、特定的G蛋白偶联受体 (GPCR) 和细胞压力。JNK信号级联的组成与MAPK家族其他成员一样, JNK激活域的Thr-Pro-Tyr位点被MKK (MAPK kinase) 双重磷酸化而激活, 而MKK (MAPK kinase) 的激活是由上游激酶对Ser/Thr残基的磷酸化。JNK有两个激活子:MKK4和MKK7, MKK7是JNK的特异性激活子, 而MKK4也可以使p38 MAPK磷酸化。被激活后, JNK转位到核内, 在细胞核内磷酸化并上调几个转录因子, 包括c-Jun、ATF-2、STAT3和HSF-1。
芹黄素可通过抑制p38、JNK及Akt的磷酸化, 来抑制多巴胺诱导的黑素细胞中ROS的生成, 降低氧化应激引起的人黑素细胞凋亡, 发挥对白癜风的治疗作用[1]。
3 p38 MAPK信号途径
p38 MAPK途径通常在炎症因子的响应中被激活, 也包括其他刺激如激素、G蛋白配体偶联受体、热激及渗透压力等。研究表明对p38 MAPK信号途径的调节是细胞响应氧化压力刺激的关键通路之一。p38激酶家族有四个成员, 分别为α、β、γ和δ。细胞因子P38、激素、G蛋白耦合受体和细胞压力 (如热激) 可以激活这些酶。p38/MAPK可以被MEK3 (或MKK3) 和MEK6 (或MKK6) 磷酸化, 而MEK3和MEK6本身是几个MAPKKK的底物, 包括ASK1、MLKs、TAK1。MAP3Ks的多样性可适应宽范围刺激的调控能力, 并与其他信号途径和p38 MAPK一同激活, MAP3Ks触发p38 MAPK的同时也激活了JNK信号途径。有证据表明几个与炎症相关基因的启动子例如IL-6、IL-8、IL-12p40、MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) , 都表现出p38MAPK依赖的组蛋白H3 Ser 10磷酸化的增强, 这一磷酸化作用增强了与隐藏的NF-κB-结合位点的结合能力。
藏红花素具有抗氧化的作用, 可以下调p-p38 MAPK、p53、及caspase-3蛋白表达, 提高SOD, GSH-px及CAT及抗氧化酶活性, 减少丙二醛 (MDA) 生成和还原型谷胱甘肽 (GSH) 的消耗, 进而减轻了顺铂对小鼠肝肾的氧化损伤[2]。飞燕草素可通过ROS/p38MAPK/NF-κB信号通路介导抗氧化作用, 其能明显抑制ox LDL诱导的ROS的产生、NADPH氧化酶亚基Nox2和p22phox的表达、p38 MAPK的磷酸化和核转录因子NF-κB p65的活性及表达, 因而对内皮细胞氧化应激损伤具有明显的抑制作用[3]。
4结论
MAPK信号途径于体内存在广泛, 调节的生理功能较为复杂, 生物色素通过调节JNK、p38MAPK途径不仅能起到抗氧化、抗炎作用, 还可以调节免疫、保肝护肝。随着人们对健康与保健等问题的逐渐关注, 生物色素的药理作用越来越受到重视, 阐明色素的药理作用机制, 将有利于生物色素的进一步开发和利用。生物色素对细胞信号途径影响机制的揭示, 为色素作用机制的研究和今后的开发利用奠定了理论基础, 但是对于色素分子与信号途径分子间的识别、结合和相互作用的机制目前还不清楚, 仍需进一步研究。
摘要：生物色素是从生物中提取得到的天然色素产物, 近年来对生物色素的药理作用研究表明:生物色素可以通过调节细胞内信号途径发挥抗氧化、抗炎等药理作用。本文总结了生物色素通过MAPK信号途径调节, 发挥抗氧化、抗炎、调节免疫等药理作用。
关键词：色素,药理作用,MPAK信号途径
参考文献
[1]林茂.芹黄素对氧化应激引起的人黑素细胞凋亡的影响[D].大连:大连医科大学, 2011.
[2]孙妍.藏红花素对顺铂致小鼠急性肝、肾损伤的保护作用及其机制研究[D].青岛:青岛大学, 2014.
信号途径 篇4
APC基因全名为大肠腺瘤样息肉 (adenomatous polyosis coli, APC) 基因, 位于染色体5q21~22上[1]。开放读码区8535bp, 由15个外显子和14个内含子组成, 其中第15外显子最大, 长度为6571bp, 是人类已知最大的外显子[2]。APC基因编码的蛋白为胞浆蛋白, 由2843个氨基酸组成。蛋白结构包含有β-链蛋白、APC和E-钙黏附蛋白的结合位点[3]。APC蛋白是一个多功能蛋白, 是Wnt信号转导途径的一个重要组成部分, 其主要作用是与β-catenin和E-钙黏附蛋白相互作用而影响细胞黏附及细胞间信号传递[4], 并参与了一系列细胞进程, 包括细胞周期调节、凋亡、细胞黏附、Wnt信号转导和微管集合等[5]。
2 APC基因失活对Wnt信号转导途径的影响
2.1 APC在Wnt信号转导途径中的作用
在Wnt途径中, APC与Axin、Gs K-3β共同形成一种蛋白质络合物, 从而控制β-catenin在细胞内的含量[6]。APC蛋白1342-2075残基间包含七个20个氨基酸重复序列, 这些重复序列是β-catenin蛋白的结合及降解所必须的[7]。当β-catenin蛋白与APC蛋白结合后, 其NH2末端上的丝氨酸、苏氨酸位点被GSK-3β磷酸化[8], 磷酸化β-catenin成为蛋白酶体的靶蛋白而被降解。因此, 蛋白酶体介导的β-catenin的降解有赖于APC蛋白与β-catenin的直接相互作用。即APC蛋白作为构架蛋白通过促进β-catenin的降解而发挥肿瘤抑制作用[9]。
2.2 APC基因MCR区突变
APC基因突变类型主要有点突变和框架移码突变, 前者包括无义突变、错位突变和拼接错误, 后者包括缺失和插入[10]。密码子1286~1513之间是APC基因的突变密集区 (MCR) , 位于15外显子内。部分MCR区域靠近APC基因的β-catenin结合位点, 该部位突变可使下游形成提前的终止密码子, 编码产物为截短蛋白。基因突变后产生的截短蛋白缺失几乎所有的20个氨基酸重复序列, 导致APC蛋白虽能与β-catenin结合, 但却不能降解β-catenin[11]。过量的β-catenin在细胞浆内聚集并进入核内, 结合到T细胞因子 (TCF) /淋巴增强因子 (LEF) 转录因子家族[12], 从而激活相关靶癌基因c-myc、Cyclin D1和c-jun等的转录、过表达, 导致癌症的发生[13]。
2.3 APC基因启动子甲基化
APC基因是抑癌基因中的一种, 在很多组织中都有表达, 是结肠癌的"看门基因"[14]。近年来发现在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、T淋巴细胞瘤等肿瘤中均有APC基因超甲基化[15]。DNA甲基化是突变失活及缺失失活之外基因失活的第三种机制。DNA甲基化即通过DNA甲基转移酶 (DNA Methyltransterase, DNMT) 的催化作用, 利用S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 提供甲基, 在Cp G二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的5号碳原子上加上甲基的共价修饰过程[16]。APC启动子区CCAAT盒附近Cp G岛的异常高甲基化, 可以抑制APC基因的表达, 主要是通过改变染色质的构象和干扰转录因子CBF结合到CCAAT盒上来实现的[17]。抑癌基因启动子的异常甲基化可以激活异常的Wnt信号转导通路及对一些重要的细胞生理功能产生影响[18]。
近年来研究表明, Wnt信号转导通路异常在细胞的癌变过程中起着重要的作用。其异常激活与肿瘤的发生密切相关。肿瘤抑制基因APC失活突变可促使该通路异常激活, 启动下游c-myc、Cyclin D1和c-jun等靶基因, 导致细胞恶化。因此, 我们应深入研究与了解APC与Wnt信号转导通路之间的相互作用与机制, 更好地认识APC基因失活突变与肿瘤的形成和发展之间的关系。
摘要：APC是Wnt信号转导通路的重要组成分子。APC蛋白可控制β-catenin在细胞内的含量, 在Wnt信号转导通路中起负向调节作用。APC基因突变或蛋白异常可使Wnt信号转导通路异常激活, 多种原癌基因持续转录而导致肿瘤发生。本文主要探讨APC基因失活的机制和对Wnt信号转导通路的影响。
信号途径 篇5
关键词：Hsp70,TLR信号途径,肿瘤细胞
Toll样受体家族(Toll-like recepters, TLRs)和果蝇Toll蛋白都具有同源性,表达在细胞膜上和免疫系统识别微生物相关[1]。在TLR3识别病毒感染的过程中所产生的双链RNA,从而诱导炎症反应、激活信号转导途径、促进抗原呈现细胞活化,导致天然免疫反应来对微生物感染进行抵抗[2]。Hsp70和肿瘤的发展、发生有着密切的联系。HSP是TLR信号转导途径当中的内源性配体,通过TLR介导的免疫应答来参与肿瘤、炎症、自身免疫疾病发病机制[3]。本文主要研究Hsp70在TLR信号途径中对肿瘤细胞增殖的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
H22肝癌细胞株:购自北京伯乐生命科学发展有限公司;谷氨酰胺,HEPES,小牛血清,RPMI 1640培养基,购自Sigma公司;Hsp70为本实验室纯化获得;逆转录引物oligo(dT),TaqDNA聚合酶,逆转录酶抑制剂,dNTP,DNA分子量标准,M-MLV逆转录酶,TRizol试剂均购自上海研拓生物科技有限公司;30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液,5mol/L Tris-HCl(PH=6.8和8.8),细胞裂解液。
1.2 方法
将体外培养的H22细胞分成两组:A组为对照组;B组加入终浓度为10μg/mL的Hsp70。两组细胞培养在37℃、5%CO2培养箱中。按实验要求,各组细胞的培养时间不同。分别收集处理8h的A组和B组的H22细胞,然后对两组细胞TLR2和TLR4的mRNA表达水平进行检测。分别收集处理24h H22细胞,对β-catenin水平进行检测。设计基因表达所用的引物:TLR2:上游引物:5'-GTCTTTCACCTCTATTCCCTC-3',下游引物:5'-GTCTCTACATTTCCTATCCTG-3',扩增片段长度为362bp;TLR4:上游引物:5'-GAAACTCAGCAAAGTCCCTG-3',下游引物:5'-GAAAGGCTTGGTCTTGAATG-3',扩增片段长度为524bp;β-actin:上游引物:5'-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATG-3',下游引物:5'-ATCTCCTGCTCGA AGTCTAGAG-3',扩增片段长度为536bp。PCR 扩增体系:10×PCR buffer 6μL,MgCl2 4μL,dNTP(2.5 mmol/L) 3μL,5'端引物 2μL,3'端引物2μL,cDNA 3 μL,TdH2O 28μL,TaqDNA聚合酶1.5μL,总体积50μL。PCR的反应条件:预变性95℃ 5min循环30次95℃1min、52 ℃55sec、72℃50sec、延伸72℃5min。然后对扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后回收,用于下一步试验。
2 结果
2.1 TLR2、TLR4mRNA的表达
Hsp70分别处理H22细胞8h后,RT-PCR检测H22细胞内的基因TLR2、TLR4 mRNA 的表达均明显上调(图1)。
2.2 β-catenin的表达
体外加入Hsp70培养H22细胞24h后, Western blot检 H2 细胞中β-catenin的表达,与对照组相比, Hsp70促进H22细胞中β-catenin上调表达(图2)。
2.3 H22细胞培养10天后计数
分别收集A 组和B 组的H22细胞,接入6孔板内,每组3孔,每孔细胞数为1.5×105。刺激3天后,换液,细胞计数,此后每隔 2 天以同样的细胞量(1.5×105)传代培养,连续培养12天。Hsp70 处理组的细胞增殖倍数高于对照组。结果显示:当细胞处于正常增殖状态时,Hsp70会促进H22细胞的增殖(图3)。
3 讨论
TLRs 在肿瘤免疫当中的作用越来越引起人们的兴趣,包括通过介导免疫佐剂作用来对机体免疫力进行增强,以及识别了肿瘤细胞所产生的“危险信号”起就针对肿瘤的免疫反应[4]。TLR主要是激活于2条信号通路:其中一条是通过了激活转录因子 NF-кB,调控编码免疫与炎症相关的蛋白基因的转录;另外一条是激活MAPK与JNK[5]。TLRs与配体结合之后产生了信号转导的级联反应,并激活转录因子 NF-кB、p38、C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),从而对免疫相关蛋白进行调控,这些有可能和肿瘤的形成与生长有关。肿瘤细胞是通过TLR信号通路的介导肿瘤自身所保护的机制,产生了免疫逃逸[6]。Hsp70信号能够通过TLR4传导,从而对核转录因子NF-κB进行激活,通过了基因转录所诱发出一系列病理生理的改变。肿瘤细胞在不断地增殖并需要大量的 HSP 成为“分子伴侣”来稳定与调节这一异常的增殖过程[7]。近些年来研究发现了 HSPs可以通过和 c-myc、c-fos与P53等抑癌基因或原癌基因以及它的产物相互作用参与细胞的最基本活动,调节了细胞增殖。Wnt信号通路将通过激活β-catenin入核和核内转录因子(TCF/LEF,又称为了T细胞因子淋巴增强因子)相结合,来对靶基因的表达水平进行调节,从而影响细胞的凋亡与增殖。β-catenin是Wnt信号传导通道的最关键环节,调控 cyclin-D1以及c-myc等原癌基因的表达。通过研究,本文发现,Hsp70会促进H22细胞内的基因TLR2、TLR4 mRNA的上调表达,同时也会促进H22细胞中β-catenin上调表达,通过细胞计数得知,Hsp70会促进H22细胞的增殖。
综上所述,Hsp70会促进TLR信号途径中某些基因的上调表达,在TLR信号途径中肿瘤细胞的增殖具有促进作用。
参考文献
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信号途径 篇6
关键词：脑梗死,电针,神经功能,维甲酸,大鼠
缺血性脑损伤时, 产生兴奋毒性, 引发脑损伤级联反应, 导致神经元细胞损伤甚至死亡[1]。治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复[2]。重组组织型纤溶酶原激活剂 (rt-PA) 是唯一经循证医学证实能有效治疗急性缺血性脑卒中的药物。rt-PA治疗可发生严重的致命性颅内出血的并发症, 限制了rt-PA的应用[3]。
近年来研究证实[4], 人及动物成年脑内有多处部位存在着自我更新和分化潜能的静息态神经干细胞 (NSC) , 可参与修复缺损的神经功能。在成年啮齿类动物和成人脑中有3个NSC群[2], 1个是位于脑室区和脑室下区 (ventricular zone and subventricular zone, VZ and SVZ) , 另1个在连接侧脑室和嗅球的区域 (在成人尚未证实) , 第3个是在海马齿状回 (dentate gyrus, DG) 。NSC的增殖分化受多种生长因子和细胞信使分子的调控[5]。维甲酸是影响细胞增殖分化的信号之一, 在脊椎动物中枢神经系统的正常发育中起关键作用[6]。研究表明RA能够激发脑室区、脑室下区和海马齿状回的神经再生, 显著提高多种干细胞分化为神经元[7,8,9,10]。利用维甲酸处理短尾猴胚胎干细胞成功地获得运动神经元 (表达NFM和IsletⅠ+) 后植入偏瘫模型小鼠, 小鼠的运动功能明显改善[11]。
针灸治疗缺血性脑卒中临床疗效确切, 电针足三里、曲池亦可刺激脑室区、脑室下区和海马齿状回的神经增殖、分化, 促进脑缺血恢复期神经功能的恢复[12,13,14,15,16]。开展此项研究, 以期为针灸的临床应用提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂
Raldh1、Raldh2和β-actin引物 (上海生工生物工程有限公司) , BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒 (北京碧云天生物技术研究所) , Prestained Protein marker (立陶宛MBI公司) , PVDF膜 (美国Millipore公司) , 羊抗Raldh1、羊抗Raldh2 (美国Santa Cruz Biotechnoligy公司) , 鼠抗β-actin、HRP标记抗小鼠二抗 (北京中杉金桥生物技术有限公司) 。
1.1.2 仪器
Homecage仪器 (美国clever system公司制造) , 全自动酶标仪 (BioTek) , PE-9600 PCR仪 (PE公司, 美国) , Nicon ECLIPSETE2000-U倒置生物显微镜, Cool4500数码相机, 电泳仪、微型凝胶电泳装置、凝胶成像系统、半干电转移槽、化学发光成像仪 (美国Bio-Rad公司) 等。
1.2 实验动物与分组
清洁级健康雄性SD大鼠, 体重250g±30g, 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供, 合格证号:2007000509570。大鼠144只, 随机分为假手术组、模型组、针刺组, 各48只。
1.3 实验方法
1.3.1 模型制备
参照Zea-Longa线拴法[17]复制大脑中动脉缺血模型。颈部正中切口, 钝性分离左侧颈总动脉 (CCA) 、颈外动脉 (ECA) 和颈内动脉 (ICA) 。
1.3.2 模型筛选
参照Longa和Bederon的5分制评分方法[17,18]评分。1分~3分入选。
1.3.3 实验动物处理
假手术组:仅分离CCA、ECA及ICA, 不结扎、插线。模型组:于缺血再灌后1d、7d、14d、28d各取6只, 先进行Homecage Scan行为学检测, 之后取梗死侧脑组织用于Western blot检测, 另取6只梗死侧脑组织用于PCR检测。针刺组:穴位取患侧曲池、足三里 (大鼠穴位定位参考《实验针灸学》[19]) 。应用华佗牌SDZ-Ⅱ型电针治疗仪, 电压峰值为6V, 以肢体轻轻抖动为度, 疏密波, 频率 (4~20) Hz, 每次电针20min, 1次/日。于缺血再灌1d、7d、14d、28d各取6只, 先进行Homecage Scan行为学检测, 之后取梗死侧脑组织用于Western blot检测;另取6只梗死侧脑组织用于PCR检测。
1.3.4 观察指标
Homecage Scan行为学检测:在术后1d、7d、14d、28d, 将各组大鼠放入Home cage仪器中进行观测24h。每一段影像由HomecageScan软件来分析, 选取行走、进食、后肢站立、舔毛四个行为进行分析。蛋白免疫印迹法 (Western blot) :按BCA蛋白定量试剂盒说明制作标准曲线并测定蛋白含量, 计算出灰度值。RT-PCR检测:利用RT-PCR两步法试剂盒 (TaKaRa公司) 说明将mRNA逆转录成cDNA。
1.4 统计学处理
使用SPSS13.0处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组计量资料采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) , 方差齐者用LSD法, 方差不齐则用Tamhane’s T2法。
2 结果
2.1 大鼠神经功能评定结果
假手术组大鼠各项Homecage Scan行为学检测均正常;造模各组大鼠均出现明显的瘫痪, 且随时间的推移逐渐恢复, 具体表现为花费在行走、后肢站立、舔毛三种行为的时间逐渐增加, 而耗费在进食上的时间却减少;针刺组在术后7d、14d各项行为学评定与模型组比较有统计学意义 (P<0.05) 。详见图1。
2.2 Raldh1mRNA、Raldh2mRNA表达及电针对其表达的影响
模型组及针刺组Raldh1mRNA、Raldh2 mRNA的表达在术后第7天升高, 第14天达到高峰, 之后表达减少, 至第28天趋于正常。针刺组、模型组第7天、第14天Raldh1mRNA、Raldh2mRNA的表达同假手术组比较有统计学意义 (P<0.05) , 针刺组7d、14d的Raldh1mRNA、Raldh2mRNA的表达同模型组比较有统计学意义 (P<0.05) 。详见图2。
注:与模型组比较, *P<0.05。
2.3 Raldh1、Raldh2蛋白的表达及电针对其表达的影响
Raldh1蛋白为一个55KD的条带, Raldh2蛋白为一个55KD的双条带。研究发现, Raldh1、Raldh2蛋白的表达模式与各自mRNA的表达模式相一致, 模型组、针刺组第7天、第14天Raldh1、Raldh2蛋白的表达同假手术组比较有统计学意义 (P<0.05) 。详见图3。
注:与模型组比较, *P<0.05。
3 讨论
脑缺血损伤能激活脑内“静息”的NSC, 并促进其增殖、迁移和分化, 分化的神经元能部分地替代和修复损伤的神经元, 从而在一定程度上改善缺损的神经功能[4]。
维生素A及其有生物活性的衍生物, 特别是维甲酸, 在脊椎动物发育、细胞分化和维持体内平衡中发挥广泛的效应[20]。体内类维生素A代谢后可产生RA, RA进入细胞后, 首先与细胞质中维甲酸结合蛋白形成复合物, 该复合物进入核内与受体结合, 调控一系列基因的表达, 诱导海马及脑室下区等部位的NSC增殖、分化为神经元[6,7,8,9,10]。RA的生物效应主要是由维甲酸受体 (RARs和RXRs) 介导, 通过与RARs和RXRs作用, RA上调了转录因子NeuroD, 使P21表达增加, 同时增加了酪氨酸激酶 (tyrosine kinase, Trk) 受体TrkA、TrkB、TrkC和P75神经营养因子受体的表达, 使NSC向神经元分化[21]。RA还同其他核受体发生作用, 通过与甲状腺素受体、维生素D3受体结合, 激活1, 25 (OH) 2D3及甲状腺激素的释放, 起到神经保护作用[22,23]。此外, RA能够诱导中期因子的表达, 对缺血性脑损伤起到保护作用[24]。
维生素A要通过两次氧化才能转变为RA, 首先氧化为视黄醛, 然后经视黄醛氧化脱氢酶 (Raldhs) 催化形成RA。Raldhs有三种:Raldh1, Raldh2和Raldh3。Raldh3仅在眼睛、面部及腹侧视网膜和端脑神经节隆起有表达, 胚胎发育成熟后, 这种酶在肝脏及皮肤也可被检测到, Raldh1主要存在于背侧视网膜、腹侧中脑及中脑到纹状体的投射纤维, 而Raldh2主要存在于脑膜中[25]。
本实验发现, 模型组及针刺组Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA的表达在术后第7天升高, 第14天达到高峰, 至第28天趋于正常, 针刺组第7、1 4天的Raldh 1、2各亚型蛋白及mRNA的表达同模型组比较有统计学意义, 电针可调控Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA的表达。
为了定量分析神经功能缺损, 将缺血性脑卒中大鼠置于HomecageScan系统测试笼中。国外已将该测试系统运用到Huntington病、Prion病和脑出血大鼠模型中[26,27], 相比传统的行为学检测而言, Homecage Scan系统检测具有以下的优势[28,29,30]。首先, 节约了大量的人力。其次, 能够全天候地观测大鼠的行为活动。第三, 能够实时反映出动物的行为动作, 避免了传统的评测方法中试验人员的人为干扰因素, 以及对实验动物的抓取和环境改变等因素对治疗效果的影响。
Homecage Scan行为学检测的数据显示, MCAO术后, 大鼠舔毛、行走、后肢站立这三种行为所耗费的时间呈现递增的趋势, 进食方面花费的时间在第7天突然出现增长, 而后逐渐递减。查看相关录像资料后发现:MCAO术后第1天, 处于创伤期的大鼠很少有进食行为;此后数天, 偏瘫大鼠在进食时需要耗费比平时多数倍的时间才能抓取到食物, 在第28天, 针刺组、模型组与假手术组的各项实验结果无明显差异, 造成这一结果的原因可能与脑损伤后大鼠的自我修复有关, 自我修复主要通过脑水肿的减轻, 发芽, 突触调整, 远隔功能抑制等机制实现[31]。本研究选用鼠龄 (8~12) 周SD大鼠作为MCAO模型, 这与缺血性脑卒中患者多为中老年人的事实不符, 有可能影响到实验结果的准确性。尽管如此, 研究结果显示:针刺组在术后7d、14d各项行为学评分与模型组比较有统计学意义, 这种神经功能方面的改善与Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA的表达上调是一致的, 间接地说明了通过调控RA蛋白及其mRNA的表达, 电针可以改善脑梗死大鼠的神经功能表现。
信号途径 篇7
核因子KB(NF-KB)参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡与增殖、肿瘤等病理过程[3]。在致炎症因子表达时无处不在,几乎影响细胞生理各个方面,近年来有学者[4]认为NF-KB是AS发生的始动机制之一。
牛磺酸对抗AS有潜在的保护作用,但牛磺酸是否通过C-反应蛋白(CRP)激活NF-KB信号传导途径而影响血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达,目前尚不清楚。本实验通过复制兔AS模型,以NF-KB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)为阳性对照,实验组给予牛磺酸,研究牛磺酸如何影响NF-KB调控系统来干预AS早期形成的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
健康雄性日本大耳白兔32只,体质量2.0~2.5kg,5~6个月龄,由辽宁医学院实验动物中心提供,合格证号SCXK(辽)2009-0004;牛磺酸购自北京嘉康源科技发展有限公司;PDTC购自Sigma公司;胆固醇购自安徽科宝生物工程有限公司;IKBα、NF-KBp65抗体购自上海越研生物科技有限公司;VCAM-1抗体、CRP试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;Coridis公司球囊扩张压力泵;日本Sanyo公司低温冰箱;美国BIO-RAD公司酶标分析仪、电泳槽。
1.2 方法
1.2.1 复制动物模型及分组
32只白兔单笼、恒温、恒湿度饲养,自由饮水,适应性饲养1周后,随机分为4组(每组8只),分别为正常对照组、AS模型组、牛磺酸治疗组、PDTC治疗组,后3组施行球囊内膜损伤术[5],术后正常对照组给予普通饲料,其余3组给予高脂饮食(按1%胆固醇、15%蛋黄粉、8%熟猪油喂饲),牛磺酸治疗组同时给予300 mg/(kg·d)牛磺酸灌服,PDTC治疗组同时给予20 mg/(kg·d)PDTC灌服,共喂饲8周。
球囊内皮损伤术方法:术前12 h禁食,从兔耳缘静脉注射1~2 m L利多卡因,麻醉成功后,仰卧位固定,分离暴露股动脉,直视下穿刺股动脉成功后送入导丝,沿导丝放置鞘管,然后拔出导丝,留置鞘管,逆行放入球囊导管15~20 cm至兔腹主动脉,球囊直径超过血管直径10%左右,利用压力泵充盈球囊,加压过程中轻拉球囊导管以增加内皮损伤,重复该过程5次,拔出球囊导管与鞘管,结扎,缝合。术后注射抗生素3 d防止感染。
1.2.2 标本采集和光镜观察主动脉形态学变化
实验结束后,于兔耳中央动脉抽血10 m L,-20℃冰箱保存,用于检测血清hs-CRP。剖开腹部,逐层分离,取兔腹主动脉全长,截取1 cm长度用10%甲醛固定,用于石蜡包埋、切片、HE染色,观察主动脉病理形态学变化。
1.2.3 Western blotting法检测IKBα、NF-KBp65蛋白表达
将兔主动脉组织剪碎,超声波碎裂细胞取上清液测定蛋白浓度,进行SDS-PAGE电泳,上样,转膜,TBST洗膜,加入抗体摇床轻摇,显色,进行条带扫描,采用凝胶成像系统分析电泳图的平均光密度,以β-action条带为参照。
1.2.4 免疫组织化学染色法检测VCAM-1表达
烤片机60℃烤片2 h备用,脱蜡,高压修复1.5 h,冷却加A液,孵育30 h加一抗(1︰200),4℃冰箱过夜,次日加B、C液,DAB显色,复染、脱水,树胶封片,镜下观察,细胞质棕黄色颗粒为VCAM-1阳性表达。每组取3张兔主动脉切片,每张切片于200倍镜下随机选取5个视野计算阳性细胞比例,每组取其平均值。
1.2.5 ELISA法检测血清hs-CRP水平
包被液稀释抗原,各取0.3 m L加入酶标板孔中,4℃过夜,次日移去包被液,每孔加被检血清0.2 m L,37℃孵育1h,每孔加酶标检测抗体0.2 m L,37℃孵育1 h,每孔再加入0.2 m L ABC液,加终止液,酶标仪在450 nm测定OD值,应用Curve-Expert 1.3软件转换成浓度水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行实验数据分析,计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 模型判定与腹主动脉病理形态学变化
肉眼观察可见正常对照组主动脉内膜光滑,无斑块形成,AS模型组内膜显著增厚,散在不规则灰黄色隆起斑块,牛磺酸治疗组与PDTC治疗组明显减轻。HE染色镜下观察正常对照组内膜光滑而完整,内皮细胞连接紧密,AS模型组局部内膜明显增厚,斑块突向管腔,内膜下有大量泡沫细胞聚集和脂质沉积,中层弹力纤维破坏、排列紊乱,并有炎症细胞浸润,在心肌纤维之间产生大量结缔组织,由此判定AS模型复制成功。而牛磺酸治疗组与PDTC治疗组有少量泡沫细胞,内膜增厚明显减低,未见典型斑块。见图1。
(×100)
2.2 IKBα、NF-KBp65蛋白表达
AS模型组、牛磺酸治疗组与PDTC治疗组NF-KBp65蛋白表达较正常对照组明显增加,牛磺酸治疗组与PDTC治疗组NF-KBp65蛋白表达较AS模型组显著降低(P<0.01),但PDTC治疗组较牛磺酸治疗组下降明显(P<0.05)。IKBα蛋白表达趋势与NF-KBp65相反,AS模型组、牛磺酸治疗组与PDTC治疗组IKBα蛋白表达较正常对照组明显减少,牛磺酸治疗组与PDTC治疗组IKBα蛋白表达较AS模型组显著增加(P<0.01),但PDTC治疗组较牛磺酸治疗组增加明显(P<0.05)。Western blotting法分析结果表明牛磺酸可以抑制IKB磷酸化及NF-KB活化。见图2及表1。
A:正常对照组;B:AS模型组;C:牛磺酸治疗组;D:PDTC治疗组
注:1)与正常对照组比较,P<0.01;2)与正常对照组比较,P<0.05;3)与AS模型组比较,P<0.01;4)与PDTC治疗组比较,P<0.05
2.3 VCAM-1表达情况
AS模型组、牛磺酸治疗组与PDTC治疗组表达明显增强,阳性细胞数明显增多,胞质中可见大量棕黄色阳性颗粒,较正常对照组差异有统计学意义(P<0.01),但牛磺酸治疗组与PDTC治疗组较AS模型组有明显降低(P<0.01),且牛磺酸治疗组与PDTC治疗组无明显差异。见图3及表2。
(×200)
注:1)与正常对照组比较,P<0.01;2)与AS模型组比较,P<0.01
2.4 血清hs-CRP水平
AS模型组、牛磺酸治疗组与PDTC治疗组hsCRP水平较正常对照组均显著提高(P<0.01),药物干预后牛磺酸治疗组与PDTC治疗组较AS模型组明显下降,且牛磺酸治疗组与PDTC治疗组差异无统计学意义。见表3。
注:1)与正常对照组比较,P<0.01;2)与AS模型组比较,P<0.01
3 讨论
目前心血管疾病是致人类死亡的主要疾病之一,在我国心血管疾病发生率和死亡率呈逐年上升趋势,而AS则是它的首要病理基础,因此抗AS治疗显得尤为关键。而由氧化应激和氧自由基导致的慢性血管炎症在AS发生发展的复杂过程中起到核心作用[6],并且炎症还可以促进动脉血栓形成。本研究AS模型组与正常对照组比较,血清炎症因子hsCRP水平明显提高,提示AS处于炎症状态。众多前瞻性研究[7]结果显示,高水平的CRP可预测心血管疾病的发生。CRP可增加活性氧(ROS)、组织因子、细胞因子、基质金属蛋白酶(MMP)和氧化型低密度脂蛋白表达。一些专家认为CRP也许通过增强炎症反应、氧化应激和促凝血活物而在AS中发挥重要作用[8]。在AS的早期形成过程中主要是单核细胞向内皮细胞黏附并向血管平滑肌细胞趋化,形成泡沫细胞。此过程依赖黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)和趋化因子(MCP-1)。SHAH[9]研究发现,VCAM-1诱导的炎症细胞可以作用于粥样硬化斑块中其他细胞及间质成分,使斑块趋向不稳定而易于破裂。本实验结果表明AS模型组较其他3组CRP、VCAM-1表达明显增多,与最近国外文献报道[10]的CRP可诱导人主动脉内皮细胞ICAM和VCAM表达并刺激单核细胞向内皮黏附基本一致。VERMA等人[11]证明ICAM和VCAM随着CRP浓度水平提高而表达增强。
NF-KB是一种由Rel相关蛋白同源或异源二聚体组成的一种关键转录因子,参与炎症介质表达,包括细胞因子、趋化因子、黏附分子等,并在它们之间的交互作用中有重大影响,导致AS斑块形成、发展和最终破裂,因此NF-KB在炎症和AS中发挥重要作用。在静息状态下,NF-KB存在于细胞质中与抑制蛋白IKB构成蛋白复合体,当受到外界刺激时,如病毒、细菌、感染、氧化应激和一些细胞因子等,炎症信号会聚并激活IKB激酶(IKK复合体),活化的IKK复合体使IKBα两个保守N-末端丝氨酸磷酸化,通过蛋白酶体作用引起IKBα泛素化并降解。于是被解放的NF-KB进入细胞核,各种炎症介质启动子上拥有NF-KB结合位点,从而引起炎症介质大量释放[12]。本实验AS模型组NF-KBp65、VCAM-1表达明显增多,IKBα表达明显下降,说明AS可能通过激活NF-KB信号转导途径引起VCAM-1大量表达。VERMA等人[13]实验表明CRP可诱导大隐静脉内皮细胞NF-KB,CRP明显升高,可导致NF-KB激活,而NF-KB激活后又导致炎症反应放大,从而形成恶性循环。
有动物和在体实验研究[14]显示牛磺酸可改善血脂、降低血压,作为一种抗氧化剂和抗炎药发挥作用,并提示牛磺酸在改善心血管危险因素状况和减少心血管疾病发生有非常大的潜力。CARDIAC研究也显示经常摄取牛磺酸可降低患心血管疾病的风险并有益长寿[15]。
本实验结果表明牛磺酸可能通过hs-CRP抑制NF-KB信号传导途径,减少细胞黏附分子(VCAM-1)表达,抑制单核细胞与巨噬细胞功能,阻止血管平滑肌增殖与迁移,一定程度上抵抗AS发展。另外,有毒理学证据评估牛磺酸唯一不良反应是胃肠道失调[16],并有报道[17]提出PDTC具有神经毒性。这些都表明牛磺酸可为治疗AS提供新的前景。
摘要：目的 观察牛磺酸对动脉粥样硬化(AS)兔IKBα、NF-KBp65、VCAM-1、hs-CRP表达的影响,探讨牛磺酸防治动脉粥样硬化的可能机制。方法 将32只日本大耳白兔随机分为4组:正常对照组、AS模型组、牛磺酸治疗组、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)治疗组,每组8只。8周后光学显微镜下观察主动脉病理形态学变化,Western blotting法检测IKBα、NF-KBp65蛋白表达,免疫组织化学染色SABC法检测VCAM-1表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测hs-CRP水平。结果 ①与正常对照组比较,AS模型组、牛磺酸治疗组、PDTC治疗组内膜厚度、泡沫细胞及斑块面积显著增加,尤以AS模型组最明显。②与AS模型组比较,牛磺酸治疗组与PDTC治疗组NF-KBp65、VCAM-1、hs-CRP显著下降(P<0.01),IKBα显著增加(P<0.01),牛磺酸治疗组与PDTC治疗组VCAM-1、hs-CRP比较差异无统计学意义,而IKBα与NF-KBp65的表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 牛磺酸可能通过抑制NF-KB信号转导途径而下调炎症因子表达,从而抑制AS早期形成过程。