高迁移蛋白1

高迁移蛋白1（共7篇）

高迁移蛋白1 篇1

1 简介

高迁移率族蛋白 (high mobility group protein, HMGB) 在1977年被首次报道, 当时发现它主要是因为这种蛋白在凝胶电泳时迁移率很高[1]。而其中的HMGB1是一种含量丰富的真核细胞核内DNA结合蛋白, 主要作用是稳定染色体结构并协助其功能, 参与DNA复制、重组、修复、转录调控、细胞分化等生命活动[2]。此外, HMGB1作为促炎症细胞因子参与晚期炎症进展的作用已得到大量研究证实[3]。

急性肾损伤 (acute kidney injury, AKI) 是一种可由多种基础疾病或因素诱发的临床中常见且症状繁复的综合征, 是危重患者常见的并发症和重要的死亡原因。近年来, 尽管治疗手段有了很大的改善, 但AKI相关的发病率及死亡率仍很高。急性肾损伤 (AKI) 在住院患者中发病率为1~35%, 并与高死亡率相关[4]。普通外科手术后的AKI发病率在1%左右, 而在危重病人中的发病率高达70%, 其中发生多器官功能障碍综合征合并有AKI的患者死亡率可达到50%[5,6]。AKI是一个致死的独立危险因素[7], 幸存患者有更高的风险进展为慢性肾病。究其原因为, 缺乏具有一定的敏感性和特异性的指标来明确诊断AKI的早期损伤、区分病因、判断预后[8]。目前研究证明, HMGB1参与了多种危重疾病的发展, 如:脓毒症、肿瘤、休克、急性重症胰腺炎、急性肝损伤等, HMGB1与疾病的临床表现、严重程度和预后转归均存在良好的相关性, 拮抗HMGB1能够抑制疾病发展, 降低死亡率, 且HMGB1的出现晚于TNF、IL-1, 在治疗相关疾病引起的AKI过程中有更多的缓冲时间, 能够扩大临床治疗的时间窗。

在本文中, 重点对HMGB1在急性肾损伤 (AKI) 发病机制中的作用, 以及拮抗HMGB1的一些方法进行综述。了解这些成果可能揭示新的治疗策略, 以减轻或预防该疾病的发生发展。

2 HMGB1的结构与来源

人类HMGB1基因位于染色体13q12[9], 基因位点上的六个多态性位点最近已被确定[10]。HMGB1是一个含有215个氨基酸残基的单链多肽, 不同的物种之间具有高度进化保守性的3个不同的功能区:两个DNA结合区 (A-box、B-box) 和一个C′端负性调节区[2]。每个HMGB1的A或B盒的长度约为75-80个氨基酸[11], 由两短一长共三个α-螺旋, 折叠后形成L或V型三维结构域[12,13]。从氨基端到羧基端的结构依次为9-79氨基酸残基的A box, 95-163氨基酸残基的B box和186-215仅含谷氨酸和天冬氨酸酸残基的受体结合模体。研究表明, B盒是促使炎症细胞释放炎症因子的功能区域, 而A盒是B盒的拮抗位点, 导致炎性反应抑制HMGB1[2]。A box和B box都能够与DNA结合, 并参与DNA双链的折叠与扭曲。当机体的稳态被打破, 受到信号刺激的核内蛋白HMGB1会被释放到细胞外。Wang W[14]等证实了巨噬细胞主动分泌HMGB1的过程。另外, 损伤坏死的细胞也是细胞外HMGB1的重要来源。

3 HMGB1的受体及信号转导

晚期糖基化终产物受体 (receptor for advanced glycation end-products, RAGE) [15]和部分Toll样受体 (toll-like family of receptors, TLRs) [16]已被明确证实为HMGB1发挥功能的重要受体。RAGE为I型跨膜受体, 通过JAK/STAT信号转导通路调节HMGB1的表达[17]。已有研究表明:RAGE与HMGB1结合后促进趋化作用, 并通过激活NF-κB, 诱导炎症反应[18]。许多炎症性疾病的发生, 如脓毒症、糖尿病、动脉粥样硬化及阿尔茨海默病等均与细胞RAGE的表达增强有着密切联系[19,20]。之后De Marco[21]等证实了TLR2和TLR4也是HMGB1的受体。Tian[22]等证实HMGB1-DNA复合体激活了TLR9信号通路, 通过TLR9促进免疫细胞成熟和细胞分子分泌。此外HMGB1也可以结合IL-1β, TNFα等发挥促炎症因子的作用。

4 HMGB1的病理生理作用

坏死细胞的被动释放和炎症细胞 (如巨噬细胞等) 的主动分泌促使HMGB1从核内转移至细胞外[23], 受HMGB1刺激的单核细胞释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP-1α、Nip-1β。中性粒细胞受HMGB1刺激后, 其TNF, IL-1、IL-8分泌量增加[24]。在多种趋化因子的作用下, 更多的炎症细胞浸润到受损组织, 进一步加重病理损伤, 而多种细胞因子如INF-γ、LPS、IL-1β也能够刺激组织释放HMGB1[24], 两者在晚期炎症反应中不断相互作用, 形成恶性循环, 导致瀑式炎症反应[25]。

5 HMGB1在各种急性肾损伤中的作用

急性肾损伤 (AKI) 可由多种疾病或因素诱发, 如脓毒症、缺血再灌注损伤、休克、肾毒性药物、中毒、手术应激等。本文关注脓毒症和缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的相关机制及干预措施。

5.1 HMGB1与脓毒症所致急性肾损伤

脓毒症 (sepsis) 是指由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) , 其病情凶险, 病死率高。在脓毒症引发的多器官功能衰竭中, 急性肾损伤 (AKI) 是最常见的并发症之一[26], 有资料显示, 脓毒症并发急性肾损伤 (AKI) 的危重患者病死率高达70~80﹪[27]。近年来HMGB1在肾组织中的表达变化以及在脓毒症发病中的机制也逐渐吸引了研究者的目光, 其被证实在脓毒症的发展、转归及预后方面扮演着重要角色。HMGB1是脓毒症致病的关键因子, 并可能成为脓毒症治疗的新靶点[28]。

以往通过针对早期促炎症细胞因子来治疗脓毒症, 其效果不佳。在受到炎症刺激后, 早期促炎症细胞因子 (如TNF, IL-1等) 短时间内即释放且持续时间较短, 很快便恢复基础水平, 这直接导致没有充足的时间来干预早期促炎症细胞因子, 也没有明确的药物来抵抗炎症后期的损害。Wang[29]等通过动物实验发现, HMGB1在注射LPS、IL-1、TNF之后的18小时达到峰值, 并且在之后的24小时内仍可持续保持高水平的血清浓度, 而先前大量研究证实脓毒症导致的死亡常发生在早期促炎症因子己经恢复到基础水平后。这表明HMGB1作为晚期炎症细胞因子对脓毒症进展及致死性的重要影响。

Yang H[30]等对小鼠进行盲肠结扎穿孔术 (CLP) , 发现在术后18h血浆HMGB1升高并可72h保持较高水平。另有研究表明血浆HMGB1升高水平与脓毒症严重程度有关[31]。一项临床研究显示, 脓毒血症病人的血清中HMGB1水平明显高于正常人, 死亡者血浆HMGB1较存活者显著升高 (P均<0.05) [32]。

Asada[31]等用5/6肾脏切除的小鼠 (5/6Nx) 制作CKD模型, 在晚期CKD的时段进行CLP:在5/6 NX的小鼠四周后[33]。综合肾损伤 (BUN和肾小管空泡) , 肝损害 (ALT、AST) 、血清炎症因子 (TNF-αα, IL-6, IL-10) 及脾细胞凋亡程度, 表明CLP术后18h的CKD小鼠比仅进行CLP的小鼠的脓毒症程度更严重。其中血清肌酐 (SCR) 差异无统计学意义, 然而, 解释血清肌酐水平并不简单, 因为脓毒症本身可引起肌酐减少[34]。在CKD后对小鼠进行盲肠结扎穿孔 (CLP) , 术后6h血浆HMGB1即显著增加, 而仅进行CLP的小鼠其血浆HMGB1在术后12h后才出现[29];即使在手术后24小时的正常小鼠组里, HMGB1中和治疗亦改善了死亡率[24]。根据数据可能的解释为:因为HMGB1在CKD的进展过程中水平较高, CKD时肾脏清除HMGB1的能力已经下降, 在脓毒症早期阶段HMGB1的少量增加即可引发自分泌并形成正反馈回路, 从而引发更多的HMGB1释放, 进一步加重炎症反应和组织损伤。由此可知, 脓毒症发生后, HMGB1出现时间的早晚与发生脓毒症前的肾脏基础功能有关。

5.2 HMGB1与肾脏缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤 (IRI) 是一个有助于确定某些疾病高发病率和死亡率的相关因素, 如心肌梗死, 缺血性脑卒中, 急性肾损伤 (AKI) 和创伤。而炎症反应是IRI主要特征之一[35]。在器官移植中, IRI作为大型手术中的挑战, 很大程度上影响临床效果。器官一旦缺血便降低代谢, 引起微血管功能障碍相关的严重缺氧[36,37], 同时释放多种炎症细胞因子和趋化因子, 使中性粒细胞在损伤部位及远处器官趋化、活化、黏附、聚集, 促发更为严重的炎症反应[38]。

大量研究早已证明, HMGB1是一种启动炎症并加重损伤的促炎症因子。肾脏IRI发生后, 大量尿酸释放入血液循环中, 使核内HMGB1乙酰化, 存在于细胞核内的HMGB1显著减少, 而胞浆中HMGB1显著增多 (P均<0.05) , 即HMGB1发生了核浆移位。Rabadi[25]等在体外用尿酸刺激人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) , 证实了尿酸通过钙动员剂和MEK/Erk通路使内皮细胞核内HMBG1乙酰化, 自细胞核中释放后, HMGB1以自分泌和旁分泌的方式促进更多的HMGB1乙酰化和释放, 活化NF-k B并上调血管生成素-2 (ANG-2) 的表达, 引发系统性炎症反应。有研究表明, IRI过程中, 胞浆内HMGB1阳性程度在再灌注3h达到高峰, 随即下降, 但再灌注24h后HMGB1表达仍处于较高水平, 且24h内细胞HMGB1表达总量未见明显变化[39], 这说明, HMGB1的释放源于胞核内的储备而非新合成, 只是表达部位改变但总量不变, 由此可见HMGB1在肾脏IRI启动和进展中发挥了重要作用。

肾缺血再灌注损伤 (IRI) 是肾移植过程中的必然后果, 且会对短期或长期术后存活者肾功能造成不利影响[40]。最初非免疫损伤引起先天免疫反应的激活, 从而引发组织损伤[41]。IRI触发先天免疫, 通过结合TLR内源性配体从而激活Toll样受体 (TLR) 。IRI导致受损组织表达或释放多种内源性TLR配体, 包括热休克蛋白, HMGB1, 透明质酸, 纤连蛋白, 和硫酸乙酰肝素[42]。越来越多的实验证据表明, 通过结合TLRs内源性配体可导致TLR激活, 从而启动并放大免疫反应。在肾脏IRI中, TLR2和TLR4的表达被肾小管上皮细胞上调[43]。TLR4被认为是肾脏IRI所致炎症的一个重要触发剂[44]。IRI的发生是因为TLR4和TLR内源性配体被上调所致, TLR4基因敲除 (TLR4-/-) 小鼠防止了肾功能障碍、肾小管损伤、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润, 以及炎性细胞因子的表达[45]。这表明HMGB1的释放是TLR4依赖的。Chen[46]等发现肾缺血再灌注损伤 (IRI) 后的受损近端小管细胞释放HMGB1, 继而通过结合其受体TLR4引起TLR4 (+/+) 野生型巨噬细胞表达IL-6, 而TLR4基因敲除 (TLR4-/-) 的细胞对HMGB1无反应, 且TLR4 (-/-) 小鼠肾小管损伤较轻, 血清Cr水平也较低。这表明HMGB1/TLR4是肾脏IRI的重要发病信号, HMGB1是通过与受体TLR4结合来介导IRI损伤的。再灌注后将r HMGB1注射入小鼠体内, 肾脏组织的IL-6、TNF及MCP-1 m RNA水平明显增高, 从而加剧了野生型小鼠的肾脏IRI程度。但r HMGB1并未使中性粒细胞和巨噬细胞浸润进一步加重, 也未造成 (TLR4-/-) 小鼠肾功能减退和小管进一步损伤[39]。这表明外源性HMGB1加重肾脏IRI炎症损伤也是通过TLR4介导的。

IRI是肾脏移植手术中常见并发症, 死亡供体从脑死亡即开始血流量下降, 继而引起供体激活补体级联反应与先天免疫系统。移植肾贮存时的冷缺血也导致进一步的缺血性损伤[47], 加之术中肾动脉阻断引起短时间但严重的肾脏缺血, 由于再灌注期间, 血流重建[48]是损伤中最终发生及生物学角度最严重的阶段。因此再灌注时受者体内出现细胞应激和瀑式炎症反应, 造成肾组织损伤是不可避免的。冷缺血再灌注大鼠肾组织HMGB1表达升高, 血清肌酐及炎症因子 (TNF-α、NF-k B) 水平均显著高于假手术组 (P<0.01) , 缺血及再灌注前阻断胞外HMGB1活性, 能够显著降低炎症因子的表达降低血清肌酐水平, 证实了HMGB1在启动冷缺血再灌注损伤后的获得性免疫反应中的重要作用。有研究表明[49], 由活体供肾的移植肾同样经受冷缺血损伤, 但相比较死亡供体肾, 冷缺血时间显著缩短, 其中死亡供肾为 (20±1.3) h, 活体供肾为 (38±3.6) min, 而且在死亡供肾肾的近端小管、远端小管和平滑肌细胞的细胞核和细胞浆中均发现HMGB1表达显著升高, 而活体供肾中未发现任何部位有HMGB1的表达, 故而IRI在活体供肾的肾脏移植中发生率及严重程度远低于死亡供肾[50]。

6 HMGB1的治疗现状

HMGB1作为一种全身炎症反应的晚期介导因子, 扩大了临床干预治疗的时间窗, 已成为药物研究热点。下面概述在AKI中, 针对HMGB1的治疗方法现状。

抗HMGB1中和抗体:Ulloa[51]等在盲肠结扎穿孔术 (CLP) 动物模型研究中观察到, 给予脓毒症小鼠抗HMGB1中和抗体不仅可在一定程度上抑制炎症反应, 其效果优于针对早期促炎症因子 (TNF、IL-1) 的抗体, 并且降低了脓毒症小鼠的死亡率。

丙酮酸乙酯:它是一种食品添加剂, 也可作为制备某些药品的原料。进入机体后解离出的丙酮酸根离子参与细胞代谢, 抑制并清除氧自由基, 从而对机体产生保护作用。一项研究证实丙酮酸乙酯可抑制多种细胞因子的释放, 包括HMGB1、TNF-α等, 有益于提高脓毒症小鼠的存活率[52]。

脾切除:脾细胞凋亡是公认的脓毒症特征之一, 与高死亡率有关, 脾细胞凋亡是血清HMGB1的重要来源[53]。在5/6 NX的小鼠四周后脾切除, 综合肾损伤 (BUN和肾小管空泡) , 肝损害 (ALT、AST) 、血清炎症因子 (TNF-α, IL-6, IL-10) 及脾细胞凋亡程度, 证实CLP术后18h的CKD小鼠比仅进行CLP的小鼠的脓毒症更严重[31]。证明了脾切除能够减少HMGB1释放引发的炎症反应。

此外, Yoshikawa T[54]等的研究表明:高剂量免疫球蛋白能够通过抑制HMGB1的产生来减轻肾脏损伤, 降低脓毒症大鼠的死亡率。血液滤过可以降低脓毒症AKI犬血清及肝、肺、肾组织炎症因子浓度, 保护肝、肺、肾功能。利多卡因能够减少CLP手术大鼠肾组织中HMGB1m RNA水平, 降低血浆Cr, 且呈剂量依赖性。一些中药制剂, 如血必净注射液能够缓解烫伤所致AKI抑制HMGB1的表达。

7 总结

综上所述, HMGB1参与了诸多疾病的发生发展, 且与相应疾病的死亡率有密切的联系。这些拮抗HMGB1的治疗方法在一定程度上改善了疾病预后, 但实验研究和临床经验证明, 单一的治疗方法均不能取得良好的效果且附带不同程度的副作用。目前对HMGB1介导AKI的病理机制的停留在基础研究阶段, HMGB1的表达与各种AKI的临床表现、生化指标和疾病严重程度之间的相关性, 如何合理制定抗HMGB1的治疗方案以及拮抗HMGB1后的预防和保护机制仍需大规模的临床试验证实。关于HMGB1的深入研究将为临床治疗提供一种新的思路。

摘要：高迁移率族蛋白1 (high-mobility group protein 1, HMGB1) 是真核细胞核内蛋白, 其作为晚期炎症介质的作用得到广泛关注。研究表明, HMGB1参与了多种疾病的进展, 如急性肾损伤、恶性肿瘤、脓毒症、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等。在这篇综述中, 笔者专注于HMGB1的生物学及其与各种病因引起的急性肾损伤的关联。

关键词：HMGB1,RAGE,脓毒症,急性肾损伤

高迁移蛋白1 篇2

1 资料与方法

1.1 对象及分组

选择佳大附院心内科2008年4～10月急性心肌梗死患者22例, 男12例 (52%) , 女10例 (48%) ;平均年龄 (62.75±11.04) 岁;经冠状动脉造影证实梗死相关血管狭窄> 95%, 其中11例成功冠脉内支架置入, 另外16例单纯造影列为对照。急性心肌梗死诊断标准:典型的长时间的胸痛, 伴有标准12导联心电图连续变化, 或CK明显升高 (大于正常上限的2倍以上) ;以上病例均排除心肌炎、心肌病、感染性心内膜炎、风湿性心脏病、结缔组织病、严重肝肾功能不全以及近期服用糖皮质激素, 近期有急、慢性感染和手术、外伤史者。所有病例中合并高血压8例, 糖尿病2例, 高脂血症4例, 吸烟6例。

1.2 手术方法

急性心肌梗死患者如不符合急诊PCI术要求者, 则在发病后7～14d行PCI术, 其余患者按常规方法进行PCI术。

1.3 标本采集

经患者及家属同意所有患者分别于支架置入术前1h和术后6h、12h、24h和48h由外周采集静脉血2mL, 2500r/min离心10min后分离出血清, 保存于-20℃冰箱待测。

1.4 测定方法

采用ELISA法, 测定药盒Uscn liee science & Technology company提供;专人专机进行测量, 操作按说明书进行。

1.5 统计学分析

对数转换后HMGB-1数据呈正态分布, 以均数±标准差表示, 结果采用SPSS统计软件 (13.0版本) , 统计学方法采用方差分析, P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 冠脉支架前后血清HMGB-1水平的变化

冠状动脉支架置入术组 (PCI) 术前1h、术后6、12、24、48h HMGB-1的含量进行方差分析 (F=51.46, P<0.05) , 不同时间点血清HMGB-1的差别有显著统计学意义, 见表1。

F=51.46, P<0.01。

2.2 冠脉造影患者造影前后血清HMGB-1水平的变化

单纯造影 (CAG) 的患者, 术前1 、术后6h HMGB-1的含量分别是2.88±0.28、2.91±0.22 (In浓度undefined, 术前与术后比较, 差别无统计学意义 (t=0.34, P>0.05) 。

3 讨论

近年来随着溶栓疗法、经皮冠脉介入疗法 (PCI) 、冠状动脉旁路搭桥术 (CABG) 及心脏移植术等广泛用于临床, 冠心病的治疗进入再灌注时期。如何保证既要尽早恢复缺血组织的血流, 又要减轻或防止再灌注损伤的发生, 将是人们关注的热点。再灌注损伤发生机制十分复杂, 且尚未完全明确。但是, 细胞因子介导的炎症反应在其过程中发挥着重要作用已经得到肯定。本研究中的HMGB-1又称高迁移率族蛋白B-1, 是核蛋白的一种, 与染色体的稳定性有关, 并参与了细胞的转录等生理活动。1999年Wang等[2]报道高迁移率族蛋白-1是一种重要的晚期炎症介质参与了脓毒症的病理生理过程, 并介导了内毒素的致死效应。近年来研究发现HMGB-1除在有菌性炎症中发挥重要作用外, 在无菌性炎症反应中亦是重要的炎症介质。本研究中PCI 组术后各时点HMGB-1水平, 均较同组术前升高 (P<0.05) , 而另外CAG组术前术后差别无统计学意义 (P>0.05) , 提示再灌注导致HMGB-1的大量释放。大量的细胞因子HMGB-1释放后, 与TNF-α、IL-1、IL-6等多种炎症介质发生复杂的相互作用, 引起TNF-α、IL-1等细胞因子的“ 澡布式”释放, 从而介导心肌细胞损害的发生[3]。Scaffidi等研究发现HMGB1是决定某些细胞选择凋亡或坏死的一个关键信号[4], 而大量的心肌细胞的凋亡或坏死可引起心梗后心衰等并发症, 严重影响患者的生存质量。目前已经证实[5]HMGB-1可以影响动脉粥样硬化病变内的细胞如单核一巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能, 促进局部炎症反应、单核一巨噬细胞聚集、趋化性及其细胞骨架的重构, 引起血管内或支架内再狭窄。

综上所述, 本研究结果表明, HMGB-1介导并参与心肌梗死后的再灌注损伤, 可以作为一拮抗靶点, 成功血运重建后迅速采取干预措施, 可能有效改善心梗患者的预后, 减少血管内或支架内再狭窄的发生。

参考文献

[1]孔瑞, 孙备.HMGB-1病理生理作用的研究进展[J].哈尔滨医科大学学报, 2007, 41 (1) :82-84

[2]Wang H, Bloom O, Zhang M, et al.HMGB1 as a late mediator ofendotoxin lethality in mice[J].Science, 1999, 285 (1425) :248-251

[3]Andersson U, Wang H, Palmblad K, et al.High mobility group 1protein (HMGB1) stimulates proinflammatory cytokine synthesisin human monocytes[J].J Exp Med, 2000, 192 (4) :565-570

[4]唐道林, 康睿, 肖献忠.晚期炎症介质HMGB1的病理生理作用[J].中国病理生理杂志, 2005, 21 (7) :1426-1430

高迁移蛋白1 篇3

关键词：持续血液净化,外伤,脓毒症,炎症因子

脓毒症是严重外伤常见并发症类型之一,其病情进展迅速,如不及时控制可导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),严重威胁患者生命安全;流行病学报道显示,腹部外伤继发脓毒症患者死亡率高达35%~40%[1]。而免疫功能失调与异常炎症反应在脓毒症患者MODS发生发展过程中的关键作用已被广泛认可[2,3]。如何有效控制脓毒症患者炎症反应水平,改善预后已成为医学界关注的热点之一。本次研究选取外伤继发性脓毒症90例,分别采用常规对症支持和在此基础上加用持续血液净化疗法,比较两组患者临床疗效,28 d内死亡率,治疗前后A-PACHE II评分和炎症因子水平,探讨持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症临床效果及对高迁移率族蛋白1(high mobility group protein-1,HMG-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和促血管生长素2(angiopoietin-2,Ang-2)的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院2011年7月-2014年5月收治外伤继发性脓毒症90例,采用随机数字表法分为对照组和试验组,每组各45例;对照组患者中男性31例,女性14例,年龄32~71岁,平均(54.80±7.15)岁;试验组患者中男性28例,女性17例,年龄34~72岁,平均(54.93±7.19)岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.1 纳入标准

①经CT检查及腹腔穿刺确诊为闭合性腹部外伤[4];②符合美国胸科医师协会与危重病医学会委员会标准脓毒症诊断标准[5];③研究方案经医院伦理委员会批准;④患者家属签署知情同意书,自愿加入研究。

1.1.2 排除标准

①自身免疫性疾病;②恶性肿瘤;③血液系统疾病。

1.2 治疗方法

对照组患者采用常规对症支持治疗,包括早期液体复苏,乌司他丁静脉滴注、血糖控制及糖皮质激素应用等;试验组患者则在对照组治疗基础上加用持续血液净化疗法,血液净化机器为瑞典金宝公司Prisma CRRT机,透析膜滤过分子量为50 kD,置换液剂量7~8 L/h,9~10 h/次,1次/d,直至机体血流动力学指标恢复正常。

1.3 观察指标

①记录患者28 d内死亡例数,计算死亡率;②病情预后评估采用APACHE(急性生理学及慢性健康状况评分系统)II评分;③炎症因子水平检测指标包括HMG-1、TNF-α及Ang-2;其中HMG-1和TNF-α检测采用酶联免疫吸附法,而Ang-2检测采用免疫电发光法。

1.4 疗效评价标准

①治愈,发热、寒战、心率呼吸加速及尿量减少等临床症状消失,白细胞计数分类、血清C反应蛋白及降钙素原等实验室检查指标恢复正常,且创伤部位愈合;②好转,临床症状消失,但创伤部位尚未愈合;③无效,未达到上述标准。总有效率=[(治愈例数+好转例数)/总例数]×100%[6]。

1.5 统计学处理

本次研究数据录入分析软件分别采用Epidata3.09和SPSS19.0;其中计量资料采用t检验,以均数±标准差(±s)表示;计数资料采用χ2检验,以百分比(%)表示;P<0.05判定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床疗效比较

试验组患者临床疗效显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表1。

2.2 两组患者28 d内死亡率比较

对照组和试验组患者28 d内死亡率分别为31.11%(14/45)和17.78%(8/45);试验组患者28 d内死亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 两组患者治疗前后APACHE II评分比较

两组患者治疗后APACHEII评分显著低于治疗前,且试验组患者治疗后APACHEII评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表2。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05

2.4 两组患者治疗前后炎症因子水平比较

两组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于治疗前,且试验组患者治疗后各项指标水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);见表3。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与治疗前比较,P<0.05

3 讨论

持续血液净化疗法能够有效清除致炎细胞因子,降低炎症介质水平,从而阻断全身炎症瀑布反应;而其对于机体抗炎细胞因子水平降低作用亦有助于保持机体对内毒素血症和菌血症免疫活性[7,8]。同时持续血液净化还可等渗清除溶质,减少细胞外液容量变化,从而有效维持循环系统稳定性[9]。近年来持续血液净化认识已从单纯炎性介质被动清除,转变为主动调节机体免疫系统功能。

本次研究结果中试验组患者临床疗效和28 d内死亡率均显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示持续血液净化疗法治疗外伤继发性脓毒症在改善临床近远期疗效方面具有优势;试验组患者治疗后APACHEII评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明持续血液净化有助于改善外伤继发性脓毒症患者预后;APACHEⅡ评分是目前公认内科危重症疾病病情及预后评估主要指标,已有研究显示,APACHE分值与病死率之间呈正相关关系,即分值越高,病死率亦越高;其病死率预测正确率可达85%~90%[10]。试验组患者治疗后HMG-1、TNF-α及Ang-2等炎症因子水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),则证实通过持续血液净化可有效降低外伤继发性脓毒症患者机体炎症因子水平,调节免疫系统功能;HMG-1是含量最丰富HMG蛋白,每10~15个核小体即可含有1个HMG-1分子,内含219个氨基酸残基,分子质量约为30 k D;其广泛分布于心脑肝肾及淋巴结组织中,并主要定位于胞核。因分子量小于50 k D,HMG-1可经血液净化治疗中对流或吸附机制清除。已有研究显示HMG-1可反映脓毒症晚期炎性反应水平,具有刺激巨噬细胞和单核细胞游离至细胞外,活化细胞核内DNA结合蛋白等促炎作用;而这一作用机制已被证实与TNF-α释放关系密切,即TNF-α作为上游因子调节HMG-2水平[11,12]。TNF-α是一种主要由LPS、IFN-γ、M-CSF及GM-CSF等刺激单核巨噬细胞而分泌的炎性因子;其内含157个氨基酸残基,分子量约为17 k D;因分子量小于50 k D,血液净化治疗中对流或吸附机制均可有效清除TNF-α。TNF-α在机体内可发挥免疫调节、炎症反应刺激等生物学活性,属于炎症早期关键和诱发炎症因子;动物实验显示,TNF-α可在脓毒症发生发展过程中发挥炎性细胞诱导和促进其他细胞因子合成和释放作用[13,14]。Ang-2由496个氨基酸残基组成,分子量为68 k D;其主要分布于卵巢、子宫和胎盘,与Ang-1同源性约为60%。因分子量大于50 k D,Ang-2主要经血液净化治疗中对流机制清除。国外研究显示,脓毒症患者体内Ang-2水平显著升高,与预后具有一定相关性[15]。连续性血液净化能够有效降低早晚期炎性介质水平,多环节拮抗机体级联炎症反应,并保证内环境相对稳定性,这可能是其改善外伤继发性脓毒症患者近远期疗效的主要机制。

高迁移蛋白1 篇4

1资料与方法

1.1 研究对象

筛选出2006年1～7月在重庆医科大学附二院妇产科行全子宫切除的子宫平滑肌瘤患者共50例。纳入标准:年龄为30～50岁,术前6月内未服用激素类药物,无合并其他疾病,术后病理诊断为子宫平滑肌瘤,其中增殖期27例,分泌期23例。

1.2 方法

1.2.1 标本处理

术后立即取子宫平滑肌瘤组织及邻近正常肌组织各一块,约1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm,经4%多聚甲醛(0.1%DEPC)固定4小时,石蜡包埋,连续切片备用。

1.2.2 原位杂交方法

HMGA1探针:针对人HMGA1靶基因的mRNA序列为:5'—AAGTC CAGCC AGCCC TTGGC CTCCA AGCAG—3,;5'—ACAGC GCTGG TAGGG AGTCA GAAGG AGCCC—3,;5'—ATCTC GCAGG AGTCC TCGGA GGAGG AGCAG—3'。HMGA2探针:针对人HMGA2靶基因的mRNA序列为:5'—CAGCC GTCCA CTTTA GCCCA GGGAC AACCT—3';5'—TCCCT CTAAA GCAGC TCAAA AGAAA GCAGA—3';5'—TGGCC ACAAC AAGTT GTTCA GAAGA AGCCT—3'。实验步骤:6 μm厚的组织石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精逐级入水,3%甲醇双氧水阻断内源性过氧化物酶,蒸馏水冲洗。暴露mRNA核酸片段,切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃,20分钟后固定,1%多聚甲醛/0.14M磷酸盐缓冲液(PBS),室温固定10分钟。预杂交,按每张切片20 μl加预杂交液,恒温箱40℃孵育3小时。杂交,按每张切片20 μl加杂交液,恒温箱40℃孵育过夜。杂交后洗涤:37℃水温的2×标准柠檬酸盐缓冲液(SSC)洗涤;37℃水温的0.5×SSC洗涤;37℃水温的0.2×SSC洗涤。滴加封闭液。滴加生物素化鼠抗地高辛、链酶亲和素生物复合物(SABC)、生物素化过氧化物酶、50 μl新鲜配制的辣根过氧化物酶(DAB)显色溶液,显微镜下控制显色3～8分钟。常规复染、透明、封片。

1.2.3 结果判定及记数

阳性染色为棕黄色颗粒,定位于细胞浆中。低倍镜下观察阳性细胞的分布情况,每例切片随机选取10个视野,然后在高倍镜下用测微板计数每个视野中100个网格内的阳性细胞数目(高倍镜下每个网格的面积为0.0025 mm2,100个网格的面积为0.0025×100=0.25 mm2),取其平均数,除以0.25,即为每例 mm2组织切片中的阳性细胞数目(个/ mm2)。

1.2.4 统计学处理

用SPSS 10.0进行统计学处理。采用两样本均数比较的t检验,P<0.05时认为差异有显著性。

2结果

HMGA1 mRNA在子宫平滑肌瘤组织和邻近正常平滑肌组织均不同程度表达,在子宫平滑肌瘤组织中的表达明显强于邻近正常肌组织中。HMGA2 mRNA仅表达于子宫平滑肌组织,而在邻近正常肌组织中无表达(图1～4)。HMGA1和HMGA2 mRNA的阳性表达率和阳性细胞数见表1和表2。

①增生期与分泌期比较,P>0.05

①同一组织不同时期比较,P>0.05

3讨论

近年来,由基因重组导致的高迁移率蛋白的过表达在子宫肌瘤发生、发展中的作用受到了广泛的关注。高迁移率蛋白是一组广泛分布于高等真核生物细胞核中的特殊类型的非组蛋白,具有分子量低(少于30kD)、带电荷氨基酸含量丰富的特点,因在凝胶电泳中高速移动而得名。HMG包括三大家族:HMGB(HMG-box proteins),HMGA(AT-hook proteins),HMGN(NBD-proteins)。其中,HMGA蛋白在细胞增生方面有较独特的作用。HMGA基因作为原癌基因,在细胞内过表达时促进肿瘤的生长和转移,在许多恶性肿瘤中,HMGA蛋白浓度的升高与恶性肿瘤的恶性程度升高一致[2]。HMGA分子内含有3个短的DNA结合结构域(DBD),因能与DNA分子小沟内的A-T丰富区优先结合,又被称为AT-hook,在形成高度立体结构特异的转录因子复合体中,具有构筑因子的作用[3]。HMGA 包括HMGA1和HMGA2。HMGA1最早是从非洲猴肾细胞中提取出来,因在体外能与富含AT的α-微卫星DNA特异结合,而被命名为α-蛋白[4]。许多转录因子、生长因子、生物及环境因素可诱导HMGA1基因的表达,而这些调节HMGA1基因的因子多与肿瘤发生发展及转移有密切的关系。研究发现高表达的HMGA1对细菌[5]和正常甲状腺细胞[6]均具有毒性作用。而抑制HMGA1高表达即可扰乱细胞周期的S期,延迟细胞进入G2-M期,从而诱导细胞凋亡。在肿瘤细胞中,HMGA蛋白持续高水平的表达,且其表达水平随着恶性程度和转移能力的增加而增加[7],从而认为HMGA蛋白水平升高是许多不同种类肿瘤的瘤转化和转移能力升高的诊断指标[8]。本研究发现,HMGA1在子宫肌瘤和正常子宫平滑肌细胞中均有表达,但其在子宫肌瘤组织中的表达明显强于邻近正常平滑肌组织,提示HMGA1在子宫平滑肌瘤细胞的不断分裂增生过程中具有重要的作用。而HMGA1的表达与患者的月经周期没有关系,提示HMGA1的促子宫肌瘤生长的作用与女性内分泌激素没有直接联系,其可能是通过诱导增生相关基因的表达,间接作用于子宫肌瘤细胞,发挥其作用。

在胚胎发育早期,除脑组织外,几乎所有组织都表达HMGA2,这对胚胎细胞的生长是必需的。而在成人组织中几乎测不到其转录产物。动物实验表明,如果小鼠缺乏HMGA2基因,就会导致生长发育迟滞,身材矮小,表现为pygmy症。许多研究发现:HMGA2的异常表达存在于源自脂肪、甲状腺、子宫、肺等组织的许多良恶性肿瘤,提示它在肿瘤细胞转化中起重要作用[9]。本研究发现HMGA2在子宫平滑肌瘤细胞中强表达,而在邻近正常平滑肌细胞中则无表达,但在增生期和分泌期无差异,这与Michael等[10]和Tallini等[11]的研究结果相似,进而推测HMGA2的表达在子宫平滑肌瘤的发生发展中发挥了重要的作用。

HMGA1和HMGA2子宫平滑肌瘤和邻近正常肌组织中的差异表达,提示了其对子宫平滑肌瘤的发生发展具有促进作用。但其发挥作用的具体机制尚需进一步研究。

摘要：目的:探讨高迁移率蛋白A(HMGA)在子宫平滑肌瘤发生、发展中的作用。方法:应用原位杂交方法检测子宫平滑肌瘤和邻近正常肌组织中HMGAm RNA的表达。结果:HMGA1 mRNA在子宫平滑肌瘤和邻近正常肌组织中均有表达,但在子宫平滑肌瘤组织中的表达明显强于邻近正常肌组织(P<0.05);HMGA2 mRNA在子宫平滑肌瘤中强表达,而在邻近正常肌组织中无表达;他们的表达均与月经周期无关。结论:HMGA的高表达对子宫平滑肌瘤的发生、发展具有促进作用。

关键词：高迁移率蛋白,子宫平滑肌瘤,原位杂交

参考文献

[1] Reeves R. Molecular biology of HMGA proteins: hubs of nuclear function[J].Gene, 2001, 277(1-2): 63.

[2] Gianini G, Marcotullio LD, Ristori E, et al. HMGI(Y) and HMGI-C Genes Are Expressed in Neuroblastoma Cell Lines and Tumors and Affect Retinoic Acid Responsiveness[J].Cancer Res, 1999,59(10): 2484-2492.

[3] Piekielko A, Drung A, Rogalla P, et al. Distinct organization of DNA complexes of various HMGI/Y family proteins and their modulation upon mitotic phosphorylation[J].J Biol Chem, 2001,276(3):1984.

[4] Strauss F, Varshavsky A. A protein binds to a satellite DNA repeat at three specific sites that would be brought into mutual proximity by DNA folding in the nucleosome[J].Cell, 1984, 37(3): 889-901.

[5] Reeves R, Nissen MS. Purification and assays for high mobility group HMG-I(Y) protein function[J]. Methods Enzymol,1999,304: 155-187.

[6]Fedele M,Pierantoni GM,Berlingieri MT,et al.Overexpression of pro-tein HMGA1induces cell cycle deregulation and apoptosis in normal rat thyroid cells[J].Cancer Res,2001,61(11):4583-4590.

[7] Tallini G, Dal Cin P. HMGI(Y) and HMGI-C dysregulation: a co mmon occurrence in human tumors[J].Adv Anat Pathol, 1999, 6(5): 237-246.

[8] Giancotti V, Bandiera A, Fusco A, et al. Comparison of multiple forms of high mobility group proteins in rodent and human cells. Identification of the human high mobility group I-C protein[J].Eur J Biochem, 1991, 198(1): 211-216.

[9] Wisniewski JR, Schwanbeck R. High mobility group I/Y: multifunctional chromosomal proteins causally involved in tumor progression and malignant transformation[J]. Int J Mol Med, 2000, 6(4): 409.

[10] Michael K, Annemarie w, Ulrike F. Misexpression of wild-type and truncated isoforms of the high-mobility group I proteins HMGI-C and HMGI(y) in uterine leiomyomas[J]. Am J Patho, 1999, 155(5): 1535.

高迁移蛋白1 篇5

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究采用前瞻对照实验的方法, 在我院收集2014年6-12月进入急诊感染患者的临床资料。采用1992年美国胸科医师协会 (AC-CP) 和美国重症医学会 (SocietyofCriticalCare Medicine, ESICM, SCCM) 联合发布标准: (1) 体温>38℃或<36℃; (2) 心率>90次/min; (3) 呼吸频率>20次/min或PaCO2<32mmHg (1mmHg=0.133kPa) ; (4) 外周血WBC计数>12.0×109/L或<4.0×109/L, 或未成熟粒细胞>10%[4], 并且有明确感染病灶的入选感染组, 共60例。采用2016年SCCM、欧洲危重病医学会 (EuropeanSocietyof IntensiveCareMedicine, ESICM) 制定的脓毒症休克标准[5]进一步对60例感染组患者进行分组。符合该标准进入脓毒症休克组, 尚未达到该标准的称为脓毒症组, 每组30例 (患者一般情况及基础疾病组成结构见表1) 。排除年龄<14岁、泌尿系统感染及入科前接受过人工肾脏替代治疗的患者。另取30例健康自愿者作为无感染组, 纳入标准为:既往无重大疾病史;体格检查无异常发现;血尿常规无异常;生化血尿素氮<7.1mmol/L、尿酸<420μmol/L、肌酐<120μmol/L、空腹血糖<6.1mmol/L;腹部彩超无阳性发现。三组一般资料比较, 差异无统计学意义, 具有可比性, 见表1。

1.2 实验方法

在治疗干预前, 询问病史、详细体格检查, 并进一步行血尿常规、生化、凝血功能、C反应蛋白、降钙素原等化验和相应的CT、B超等检查, 建立患者病情档案。脓毒症组、脓毒症休克组和无感染组三组均取中段尿并将所有标本保存于-80℃低温冰箱中。根据患者不同病情依据指南进行补液初始复苏、抗感染、免疫调理、营养和生命支持等治疗, 并详细记录治疗措施及治疗后患者病情、生命体征及治疗21d后病情转归。用ELISA法对所有尿液标本中HMGB1浓度进行测定, 并记录。以治疗后21d为观察终点, 记录三组患者的生存情况。按照生存情况将感染组分为生存组和死亡组, 并比较其HMGB1情况。

1.3 统计学方法

应用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用独立样本t检验;运用ROC曲线研究HMGB1对预后鉴别能力。采用K-M曲线分析比较普通感染组和脓毒症组的21d死亡率。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 感染组和无感染组HMGB1比较

感染组的HMGB1为 (1072.17±276.37) pg/ml, 明显高于无感染组的 (114.25±6.40) pg/ml, 差异有统计学意义 (t=18.928, P<0.001) 。

2.2 脓毒症组和脓毒症休克组的HMGB1比较

脓毒症组的HMGB1为 (1343.19±56.58) pg/ml, 明显高于脓毒症休克组的 (801.15±14.78) pg/ml, 差异有统计学意义 (t=50.766, P<0.001) 。

2.3 生存组和死亡组的HMGB1比较

生存组的HMGB1为 (1219.90±237.96) pg/ml, 明显高于死亡组的 (891.61±205.13) pg/ml, 差异具有统计学意义 (t=-5.652, P<0.001) 。

2.4 HMGB1指标对预后情况的诊断价值

对HMGB1独立评估预后进行ROC曲线分析, 显示HMGB1指标对预后结局有一定的鉴别能力, 结果见图1。

HMGB1指标独立预测预后结局的AUC为0.893, 标准误为0.042, 95%CI为0.810~0.977, 具有统计学意义 (P=0.000<0.01) 。HMGB1的临界值为814.595pg/ml, 大于该值预后为生存, HMGB1对预后生存与否的敏感性为81.48%、特异性为93.94%和准确性为88.33%。

2.5 脓毒症组和脓毒症休克组的死亡情况分析

采用Kaplan-Meier曲线分析比较脓毒症组和脓毒症休克组的死亡情况, 见图2。采用对数秩检验比较两组生存率, χ2=22.013, P<0.001, 说明脓毒症休克组的死亡率高于脓毒症组。脓毒症休克组的中位生存时间为15.285d, 脓毒症组的中位生存时间为20.362d。

3 讨论

众所周知, 脓毒症 (Sepsis) 是感染引起机体炎症反应失控导致的器官功能障碍以及死亡等严重后果的综合征。脓毒症的病理生理学机制到目前为止尚还未完全阐明。已知脓毒症与机体感染后炎症介质过度释放、免疫功能紊乱;过度激活的炎症反应及抗炎反应有关。多项临床研究和动物模型实验中发现, 早期炎症介质如IL-1、TNF-α等, 多在病因作用后几分钟至2h释放, 半衰期短。晚期炎症介质多在脓毒症开始后16~24h释放, 表达增高晚、持续时间长。本项研究中的HMGB1是近期国内外研究较多的一种晚期炎症介质。HMGB1有着广泛的免疫活性, 包括诱导细胞因子的生成, 细胞的增殖, 趋化作用, 血管再生和细胞的分化[6]。在脓毒症时, HMGB1作为一种重要的危险相关分子模式 (Dangerassociatedmolecularpatterns, DAMPs) 坏死或者受损的细胞会主动从细胞核内释放到细胞外, 而胞外的HMGB1激活单核、巨噬细胞等炎症细胞, 诱导这些活化的炎症细胞生成促炎细胞因子, 而这些促炎细胞因子又进一步促进HMGB1的主动分泌, 形成一个正反馈效应, 从而维持和扩大了炎症反应, 造成机体进一步损伤。国外学者在动物实验中发现, 阻断HMGB1的表达可使机体的炎症反应减轻[7]。可见HMGB1在脓毒症的发生和发展过程中扮演了重要的角色。在本项实验中, 笔者发现由感染导致的全身炎症反应综合征患者, 无论是否合并脏器损伤, 尿中HMGB1水平均较健康自愿者明显升高, 且两组数据的差别有明显的统计学意义。可以推测:一方面当这些由感染引起的全身炎症反应综合征患者血中HMGB1水平升高时会导致肾脏对HMGB1的排泄增加;另一方面, 脓毒症时肾脏局部的炎症反应导致局部组织HMGB1表达增加, 在以上两方面作用下, 尿HMGB1水平明显升高。

在脓毒症合并低血压休克 (Septicshock) 出现脏器损伤时, 肾脏是最易受损的脏器之一, 常导致急性肾功能损伤 (Acutekidneyinjury, AKI) [8]。如今AKI已经成为脓毒症患者死亡的独立危险因素。脓毒症休克时肾脏损伤的发病机理是多因素的。目前认为, 全身炎症反应和肾内炎症反应是脓毒症性AKI最重要的发病机制。脓毒症时, 促炎因子可致肾脏直接或间接损害。例如有国外学者研究就发现, LPS (Lipopolysaccharide) 这种广为人知脓毒症休克主要病因的物质, 可直接或者通过细胞因子间接造成小管细胞的凋亡导致急性肾功能障碍[9]。严重脓毒症可以导致毛细血管渗漏、腹腔内压升高和肾间质水肿, 导致肾小球囊内压升高和有效滤过梯度下降, GFR随之下降, 肾功能受损, 毒素堆积。国外学者在脓毒症休克患者肾脏活检病理检查中已经证实了这点[10]。脓毒症的死亡率高, 如果伴有脓毒症休克或者发展为多器官衰竭, 死亡率则超过70%。在本项实验中, 笔者发现脓毒症休克组的死亡率确实较脓毒症组高, 与世界范围内的流行病学调查结果相符。笔者还发现脓毒症休克组患者尿HMGB1水平较脓毒症组患者略低。笔者对数据进行了统计学分析, 发现二者差距具有统计学意义。提示患者尿HMGB1的水平和脓毒症患者的病情严重程度相关, 对病情的评估有一定的提示作用。根据以上目前大家认同的脓毒症AKI的发病机制, 笔者推测这一现象与脓毒症并发AKI后肾小球滤过率下降, HMGB1的排泄减少有关。总而言之, 经过本实验的初步探索发现, 尿HMGB1水平在健康自愿者、脓毒症和脓毒症休克患者三组之间存在差异, 并且在21d死亡和生存组之间尿HMGB1水平亦存在差异。笔者认为, 可考虑将尿HMGB1作为一项预测感染严重程度的指标, 为临床治疗提供帮助;并可进一步用于感染患者的预后评估。

摘要：目的:探讨测定尿HMGB1水平在严重感染患者病情程度判断和预后评估中的意义。方法:选取2014年6-12月在我院就诊的60例严重感染患者, 留取入院后24h尿测定HMGB1水平。另取30例健康自愿者作为对照组。统计比较两组人群中尿HMGB1水平差异。再将60例严重患者按照是否出现休克表现分为脓毒症组和脓毒症休克组, 统计比较两组之间尿HMGB1水平差异。以21d内患者生存与否分为生存组和死亡组, 对照两组之间尿HMGB1水平差异。结果:严重感染患者尿液HMGB1值明显高于正常健康人群;脓毒症组患者尿HMGB1水平高于脓毒症休克组;生存组患者尿HMGB1水平较死亡组患者高, 统计分析各个对照组之间的差异均具有统计学意义 (P<0.001) 。结论:测定感染患者尿HMGB1水平对病情严重程度的判断和预后转归的预估有一定意义, 可以在临床推广。

关键词：高迁移率族蛋白B1,尿,感染,脓毒症,脓毒症休克,预后

参考文献

[1]Yang H, Wang H, Czura CJ, et al.The cytokine activity of HMGB1〔J〕.J Leukoc Biol, 2005, 78 (1) :1-8.

[2]Abdulahad DA, Westra J, Bijzet J, et al.Urine levels of HMGB1in Systemic Lupus Erythematosus patients with and without renal manifestations〔J〕.Arthritis Res Ther, 2012, 14 (4) :R184.

[3]Chen G, Ward MF, Sama AE, et al.Extracellular HMGB1as a proinflammatorycytokine〔J〕.J Interferon Cytokine Res, 2004, 24 (6) :329-333

[4]Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al.Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis.The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee.American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine〔J〕.Chest, 1992, 101 (6) :1644-1655.

[5]Singer M, Deutschman C, Seymour CW, et al.The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3) 〔J〕.JAMA, 2016, 315 (8) :801-810.

[6]Andersson U, Tracey KJ.HMGB1is a therapeutic target for sterile inflammation and infection〔J〕.Annu Rev Immunol, 2011, 29:139-162.

[7]Harris HE, Andersson U, Pisetsky DS.HMGB1:A multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease〔J〕.Nat Rav Rheumatol, 2012, 8 (4) :195-202.

[8]Zarjou A, Agarwal A.Sepsis and acute kidney injury〔J〕.J Am Soc of Nephrol, 2011, 22 (6) :999-1006.

[9]Duranton C, Rubera I, L’Hoste S, et al.KCNQ1K+channels are involved in lipopolysaccharide-induced apoptosis of distal kidney cells〔J〕.Cell Physiol Biochem, 2010, 25 (4-5) :367-378.

高迁移蛋白1 篇6

关键词：多脏器功能障碍综合征,脾脏,树突状细胞,高迁移率族蛋白B1

体内主要的抗原提呈细胞-树突状细胞(dendritic cells,DC)的功能失调与以失控炎症反应和免疫紊乱为特征的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)发生、发展密切相关[1,2,3],但是引发DC功能紊乱的因素尚未阐明。近年研究发现,以往认为只在细胞中发挥作用的核蛋白-高迁移率族蛋白1(high mobility group protein box 1,HMGB1)在炎症反应时可以释放到细胞外,上调TNF、IL-1、IL-6及其他炎症介质如巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1α、β)的表达、释放[4],从而引发机体免疫功能紊乱,介导内毒素的致死效应[5,6]。胞外的HMGB1是促进树突状细胞成熟的多种信号之一[7,8],也是固有CD4+T细胞增生、存活和极化必不可少的因素[9],阻断HMGB1或者其受体RAGE可抑制T细胞的免疫反应[10]。因此,细胞外环境中的HMGB1可通过作用于DC和相关的免疫细胞影响机体的免疫反应稳态。

本研究采用腹腔注射酵母多糖的方法复制小鼠MODS模型,观察了MODS病程中小鼠脾脏HMGB1表达的规律及其与树突状细胞数量及活性变化的关系,探讨脾脏HMGB1表达水平的变化在机体免疫功能失衡中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组与模型复制

6～8周龄雄性C57/BL6小鼠90只,体重20～25 g,购自军事医学科学院实验动物中心。动物随机分为正常组和伤后3～8 h、24～48 h、5～7 d和10～12 d组,每组10只小鼠。动物适应性喂养1周。实验前12 h禁食,自由饮水。实验组小鼠腹腔无菌注射酵母多糖悬液(2.5 g/100 m L石蜡油,注射剂量1g/kg体重)[11]。

1.2 We s te rn blot检测脾组织中HMGB1蛋白含量

脾组织加入磷酸缓冲液匀浆,冰浴30 min,离心(2 000 g,4℃,30 min),取上清蛋白定量(BCA法,pierce公司,美国)。上清加入等体积2×凝胶上样缓冲液混匀,100℃水浴5 min,离心后上样,12%分离胶电泳;转膜,免疫印迹:一抗为兔抗小鼠HMGB1(BD Pharmingen,美国),二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司),稀释度分别为1∶3 000和1∶2 000。用化学发光法进行检测(pierce公司,美国)。

1.3 脾脏HMGB1 mRNA表达水平的检测

取新鲜脾组织100 mg,加入1 m L Trizol提取组织总RNA;取3μg总RNA逆转录为c DNA(Promega A3500逆转录试剂盒)后,用PCR方法扩增HMGB1。引物序列[5],上游:5'-ATGGGCAAAGG AGATCCT-3'下游:5'-ATTCATCATCATCATCTTCT-3',产物大小为648 bp。PCR条件:95℃,5 min;95℃,55s-53℃,45 s-72℃45 s;34个循环;72℃,10min。取10μL PCR产物电泳,凝胶成像(U-VP-GDS 800,英国),用bandlead 3.0软件分析HMGB1的相对表达量。

1.4 脾脏树突状细胞的电镜观察

新鲜脾组织,常规电镜制片,用JEM-1200EX型透射电镜观察并照相。

1.5 脾脏的免疫组化标记

1.5.1 CD205、CD86的免疫组化标记

小鼠脾组织冷冻切片:大鼠抗小鼠CD205(1∶10,Serotec),间接酶标法;兔抗小鼠CD86(1∶100,Santa Cruz),Power Vision二步法。

1.5.2 HMGB1的免疫组化标记

小鼠脾组织石蜡切片,兔抗小鼠HMGB1(1∶300,BD Pharmingen),S-P法标记。

1.5.3 免疫组化染色阳性细胞的计数

每张切片随机选取10个高倍视野(400倍),计数所有染色阳性细胞及细胞总数,计算细胞阳性染色率。

1.6 统计学处理

实验数据采用Stata 7.0软件分析,行方差分析及均数两两比较,P<0.05,P<0.01时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脾脏HMGB1 mRNA表达和蛋白量的变化

正常组小鼠脾脏只有少量HMGB1表达;伤后3h,HMGB1 m RNA表达开始上调(P<0.05),12 h表达量进一步增加,伤后1d,HMGB1表达量最多,随后减少,伤后5 d时明显减少,但在伤后10～12 d时表达又回升(P<0.05),见图1。脾脏HMGB1蛋白量其m RNA表达变化趋势基本一致,见图1,伤后各时间点升高幅度与正常组比较差异均有显著性,在伤后8 h、伤后2 d和伤后10 d均形成较高的峰值(P<0.01)。

2.2 脾脏HMGB1免疫组织化学标记及计数分析

正常小鼠脾脏有较低水平HMGB1表达,主要位于部分淋巴细胞及血管内皮细胞胞核;伤后3 h组脾脏免疫细胞HMGB1表达即开始增加;伤后8～12 h显著升高,其中核阳性的淋巴细胞数目明显增多;伤后24～48 h胞核、胞浆HMGB1表达均增加;伤后3 d组仍保持高水平表达。伤后5～7 d组HMGB1表达降至接近正常水平,但淋巴细胞胞浆仍呈阳性着色;伤后10～12 d组胞浆HMGB1阳性表达和胞外HMGB1分布较5～7 d组又有所增加。

HMGB1阳性细胞率在对照组小鼠脾脏为6.58%,伤后8 h升至42.55%,12 h～24 h回降(11.8%,8.45%),48 h达高峰(83.64%),伤后5 d降低(12.02%),但伤后10 d又升高(17.21%)。

2.3 脾脏CD205和CD86标记结果

正常组小鼠脾脏边缘区可见少量散在分布的CD+205DC;伤后3～8 h,脾脏白髓与边缘区内CD+205DC数显著增加;伤后24～48 h,CD+205DC略减少,但仍明显多于正常组;伤后5～7 d,CD+205DC数降至正常水平;伤后10～12 d,CD+205DC数再次增加,见图2。

脾脏CD+86DC胞膜呈深棕色阳性反应,病程中其分布及数量变化与CD+205细胞一致。伤后3～8 h,CD+86DC数量显著增加,并可见棕黄色阳性染色的DC胞膜呈树枝状向周围延伸,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。伤后10 d组CD+86DC数量虽然较5 d组略增,但与正常对照组和伤后5 d组相比差异无统计学意义,见图2。

CD86/CD205阳性细胞的比例可以间接反应DC功能成熟的程度。与正常组比较,脾脏CD86/CD205阳性细胞的比例在伤后8 h明显升高,2 d时仍维持较高水平(P<0.05),5 d时接近正常组,10 d时比例最低(P<0.05)。

2.4 脾脏树突状细胞的电镜观察结果

正常脾脏的动脉周围淋巴鞘、边缘区、淋巴滤泡生发中心及脾索可见一些树突状细胞,其体积大、形状不规则,表面形成多个突起伸向周围淋巴细胞的间隙。树突状细胞周围多见淋巴细胞围绕,其中可见细胞凋亡现象,见图3A。伤后3～8 h,树突状细胞数目增加、胞体增大、表面突起增多;周围淋巴细胞增多,表面微绒毛消失,核仁崩解、破碎,有凋亡小体形成,见图3B。伤后12～48 h,树突状细胞仍处于增生、活跃状态,部分细胞呈现空泡变性及溶解性改变,部分细胞表现出凋亡或凋亡早期的改变。树突状细胞周围淋巴细胞大片凋亡,凋亡小体形成,并可见吞噬吞噬凋亡淋巴细胞及凋亡小体的巨噬细胞,见图3C。伤后5～7 d,树突状细胞数目明显减少,胞体较小,同时凋亡的淋巴细胞和凋亡小体也减少。伤后10～12 d,树突状细胞再次增生,但胞体较3 h相对较小、突起也少而短,较多的树突状细胞呈现凋亡及破碎溶解现象,见图3D,周围见大量凋亡的淋巴细胞和凋亡小体。

3 讨论

树突状细胞是体内作用最强、唯一能活化初始型T细胞的抗原呈递细胞,其抗原呈递功能比巨噬细胞强10～100倍,DC通过优先诱导CD4+辅助性T细胞的不同亚群反应而影响T细胞的分化成熟和免疫功能,是T细胞介导的细胞免疫过程中的关键环节[12]。而DC提呈抗原是否促进T细胞分化及如何调节免疫功能的平衡都取决于DC本身的功能状态[13,14]。CD205是成熟树突状细胞的标志物,共刺激分子CD86则反映DC的免疫活性。本研究发现,MODS病程早期(3～8 h),脾脏中CD+86DC与CD+205DC数量明显增加,此时CD86/CD205阳性DC细胞率的比值也明显升高,说明脾脏DC功能活跃;在随后的急性损伤期(24～48 h)CD+86DC与CD+205DC数量减少;在伤后5～7d的平稳期向MODS期(10～12 d)进展时,虽然CD+205DC数目有所恢复,但与其功能相关的共刺激分子CD86的表达并没有伴随增加,CD+86/CD+205DC比值明显下降。电镜观察结果也表明,树突状细胞经历了早期的增生、活跃;病情缓解期的数目减少、功能相对静止;及后期的再次增生、功能衰退的发展过程。这些变化反映了树突状细胞的数量和功能在病程中经历了成熟、活化、增生的功能亢进阶段(伤后3～8 h及24～48 h)及其后的功能低下、衰竭阶段(伤后晚期,10～12 d),与脓毒症发展中的早期免疫亢进(全身性炎症反应综合征,SIRS)及晚期免疫抑制(代偿性抗炎反应综合征,CARS)过程吻合。提示脾脏树突状细胞的功能状态参与调控MODS的病程进展。

新近的研究表明,HMGB1不仅是“晚期炎症介质”,还可诱导DC的迁移,具有趋化和活化DC的双重效应[15,16]。体外细胞培养发现,外源性HMGB1刺激DC后,可使其上调表达CD83、CD54、CD80、CD86、CD40、CD58及MHC-II类分子等与抗原呈递功能直接相关的共刺激分子,同时IL-12、IL-6、IL-11、IL-8及TNF等致炎因子的释放增加[16]。笔者在分析脾脏HMGB1含量与树突状细胞功能相关的标志分子表达变化的关系时发现,伤后8 h和48 h,HMGB1表达量增加时伴有脾脏CD86和CD205阳性细胞数及其比值增加;伤后5～7 d,HMGB1和CD205、CD86同时减少;伤后10～12 d,当HMGB1表达再次增多时,体现DC活性的CD86表达却没有增加,而DC形态也呈现退变和凋亡改变。即:脾脏树突状细胞数量及活性与HMGB1含量在病程前期呈同向变化,但在病程晚期并不伴随HMGB1变化。MODS病程早期,激活的单核巨噬细胞主动分泌HMGB1,具有趋化DC以及促进DC成熟,活化、增生的效应。同时DC自身可以表达、分泌[10,16]HMGB1,通过自分泌环路加强DC的抗原呈递功能,上调表达和分泌促炎因子,产生过度的炎症反应,进一步通过“瀑布效应”发展成失控炎症反应,介导多个器官功能障碍。随着病程的进展,由坏死的组织细胞被动释放的HMGB1增多,但此时DC在周围微环境中众多炎症因子的作用下发生凋亡,参与抗原提呈的功能分子合成减少,细胞功能也从过度活化转入衰退状态,从而在整体上表现为免疫抑制。

高血红蛋白血症颅脑CT表现1例 篇7

患儿女, 15 岁, 出生后5 个月活动后出现胸闷、气喘、呼吸困难、全身发绀并加重, 5 岁时确诊为法洛四联症。3 d前无明显诱因出现头昏、恶心呕吐、心悸、胸闷、呼吸困难。实验室检查:红细胞计数8.0×1012/L, 血红蛋白 (Hb) 226 g/L, 红细胞压积0.70%, 红细胞分布宽度0.166。CT平扫示颅骨结构完整, 脑实质未见异常密度影, 脑室与脑池大小、形态及密度无异常, 脑沟、脑裂清晰, 中线结构无移位;颅内血管系统密度明显增高, 脑血管显像增强 (图1) 。CT诊断:高血红蛋白血症致脑血管密度增高。

图1 CT平扫鞍上池层面见鞍上池边缘可清晰显示Willis动脉环(A);第三脑室下部层面见大脑后动脉(箭)、大脑前动脉垂直段(箭头)及大脑中动脉侧裂段(星号)清晰显示(B);侧脑室上部层面见大脑前动脉胼胝体边缘动脉(箭)、大脑中动脉凸面分支动脉(箭头)及上矢状窦(星号)密度增高显影(C)

2 讨论

血液Hb浓度正常时, 由于脑血管内血液处于流动状态及容积效应与周围间隙现象而常不显影[1], 本例患儿属于右向左分流型心脏病, 由于动脉血氧饱和度减低, 机体严重缺氧, 刺激促红细胞生成素生成, Hb代偿性显著增多。既往研究发现, 血液CT密度与Hb浓度有关, Hb含量每改变10 g/L, 相应的CT值变化1.86 Hu[2]。刘慧等[3]的研究也同样显示, 随着Hb浓度增高, 血液密度不断增加, 当Hb浓度增加到 (242±23) g/L时, CT表现同注入对比剂后的脑血管增强表现, 具有特征性。正常儿童从出生3 个月至15 岁以前, Hb值一般比成人低约10%~20%[4]。本例患儿Hb达226 g/L, 颅底部血管CT值显著升高达55~65 Hu, 明显高于脑实质密度, 与正常人CT增强后的脑血管显像相似。本病主要需与蛛网膜下腔出血相鉴别, 本病所致脑血管及静脉窦密度增高, 按血管解剖走行分布, 其旁仍可见低密度蛛网膜下腔内脑脊液影, 也没有蛛网膜下腔出血的相关临床症状。

参考文献

[1]郭启勇.实用放射学.第3版.北京:人民卫生出版社, 2007:4.

[2]殷薇薇, 许化致, 陈伟建.类似CT增强的高血红蛋白症颅脑CT表现一例.中华放射学杂志, 2008, 42 (12) :1265.

[3]刘慧, 张新堂, 王晋, 等.紫绀型先天性心脏病患者颅内血管密度增高的CT表现及机制分析.中华放射学杂志, 2012, 46 (4) :300-303.