α1微球蛋白（共7篇）
α1微球蛋白 篇1
糖尿病肾病 (DN) 是糖尿病常见的微血管并发症, 是肾衰竭的最常见原因。D N早期常规尿检难以发现阳性结果, 如出现了蛋白尿 (肾脏出现不可逆转的病变) , 再用药物治疗, 难以治愈。因此, 早期发现DN对于糖尿病早期治疗、改善预后有重要作用。本文通过免疫散射浊度法, 对尿常规检测蛋白阴性的糖尿病患者进行随意尿微量白蛋白 (M A I b) 和α1-微球蛋白 (α1-M G) 的检测, 以探讨糖尿病患者尿M A I b和α1-M G在糖尿病肾病早期诊断中的临床意义。
1 对象及方法
1.1 对象
选择到我院就诊的糖尿病患者53例, 所有病例均符合1 9 9 9年W H O提出的糖尿病诊断标准。无急性感染和代谢并发症, 除外其他肾脏、内分泌疾病及肾脏毒性药物应用史。其中男24例, 女29例;年龄24~71岁, 平均48.6岁;病程2个月到10年;尿常规蛋白检查均为阴性。
1.2 方法
受试者留取常规随意尿液, 所用仪器是美国D A D E-B E H R I N G公司提供的B N P型特种蛋白分析仪, 采用免疫散射浊度法进行尿M A I b、α1-M G检测。
2 结果
53例糖尿病患者随意尿检测中M A I b高于正常20例 (3 7.7%) , 随意尿α1-MG高于正常15例 (28.3%) , 二者中至少一项高于正常22例 (4 1.5%) 。
3 讨论
D N又名糖尿病肾小球硬化症, 是糖尿病常见的微血管并发症, 糖尿病肾病起病隐匿, 血糖增高所致的肾小球滤过率增高及基底膜滤过屏障的变化是糖尿病肾病的早期重要因素。常规肾功能检测和采用自动尿液分析仪及相应干化学试纸测定的尿常规, 由于敏感性低, 常不能发现糖尿病早期肾损害。正常情况下, 肾小球滤过率膜存在电荷选择性屏障, M A I b带负电荷, 不能通过滤过膜。糖尿病患者由于长期高血糖引起肾小球基底膜蛋白质糖化, 导致肾小球毛细血管通透性改变[1], 使尿M A I b滤过率增高, 引起白蛋白尿, 持续性微量白蛋白尿是临床糖尿病引起肾小球损伤的重要标志。尿α1-M G为小分子量蛋白, 能自由通过肾小球滤过膜, 但极大部分被近曲小管重吸收并分解代谢。在正常情况下, 尿中α1-M G含量甚微, 当肾小管受损时, 尿α1-MG排泌量增加[2], 故尿α1-MG升高是反映肾小管受损的重要指标。DN不仅有肾小球病变, 也有肾小管病变, 且可能早于肾小球病变, 共同参与D N的进展[3]。通过检测MAI b和α1-MG两种蛋白在尿液中的含量, 可以判断肾脏功能的受损程度, 对肾小球和肾小管受损的定位诊断有一定的意义。
本组53例糖尿病患者尿常规蛋白检测均呈阴性, 但M A I b和/或α1-M G的异常率占4 1.5%。检测结果说明, 糖尿病患者虽然尿常规蛋白检测呈阴性, 但是并不能排除隐匿的肾小球损伤和肾小管重吸收功能障碍。笔者认为, 对血肌酐尿素氮处于正常而肾功能已受损者, 随意尿M A I b和α1-M G的异常检出, 对糖尿病肾病的早期诊断具有重要意义。故糖尿病患者在治疗过程中, 除定期查血糖、尿糖外, 随意尿M A I b和α1-M G检测也可作为常规性的检查, 从而达到早期诊断和治疗的目的。
参考文献
[1]陈伟, 邓光贵, 李天星.糖尿病肾病早期诊断指标的探讨[J].第三军医大学学报, 1998, 20 (3) :277-288.
[2]陈燕.尿微量白蛋白检查对糖尿病早期肾损伤的诊断价值[J].中华检验医学杂志, 2003, 26 (9) :33-34.
[3]童南伟, 梁荩忠.糖尿病性肾小管病变[J].国外医学·内科学分册, 2001, 28 (1) :25-28.
α1微球蛋白 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
福建省立医院内分泌科收治的符合1999年WHO诊断标准的2型糖尿病住院病人37例, 年龄18~67岁, 男18例、女19例, 其24 h尿白蛋白排泄率 (UAER) 在30~100 mg/d。所有患者均排除原发性高血压, 急性代谢综合征、急性感染、肿瘤和严重的心、肺、肝疾病, 及其他原因引起的肾脏疾病。对照组为该院健康体检者32例, 其中男21例, 女11例, 年龄17~77岁, 与观察组性别、年龄分布差异无统计学意义。排除高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病等心脑血管及内分泌疾病, 肝肾功能正常。
1.2 方法
以Siemens BNII特殊蛋白分析仪测定观察组及对照组人员尿液α1-MG (速率散射比浊法) , 以Olympus Au5800生化分析仪检测尿24 h Alb及U-m Alb/Cr (免疫比浊法、Jaffe法) , 同步抽血并分离血清, 1 h内测定Cys-C (免疫比浊法) , 比较两组尿α1-MG、U-m Alb/Cr, Cys-C浓度差异。
1.3 统计方法
所收集数据采用SPSS11.5软件进行统计, 计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 用t检验, 计数资料用χ2检验。
2 结果
观察组U-m Alb/Cr、Cys-C、α1-MG、m-Alb水平均明显高于对照组 (P<0.05) , 见表1。
注:*与对照组相比P<0.05。
观察组中UAER在30~100 mg/d的样本共22例 (尿蛋白微量组) , 统计其各项目的阳性率, 结果U-m Alb/Cr>α1-MG>CysC, 见表2。
注:以上各指标超出参考值为阳性, *、#与对照组相比P<0.05;*与#相比, ▲与对照组相比, P>0.05;▲与#相比χ2=4.65, P<0.05;*与#相比χ2=7.5, P<0.05。
3 讨论
肾损伤后尿中最早出现的蛋白质是白蛋白, 正常情况下肾小球滤过的白蛋白几乎完全被近端肾小管重吸收。当肾小球滤过膜受损时, 其表面的电荷屏障受损, 致使白蛋白的滤过量大于近端小管的重吸收量, 从而致使尿白蛋白增加, 所以检测尿白蛋白对糖尿病性肾损害早期诊断具有重要意义。现普遍采用抗原-抗体凝集反应免疫比浊法测尿白蛋白, 利用Benedict-Behre肌酐比色法测肌酐浓度。因为标本为单次随机尿, 简便易行, 避免了收集24 h尿液带来的不便及误差, 从而提高了准确性。研究表明, 随机尿样m-Alb/Cr与尿白蛋白排泄率 (呈高度相关 (r=0.903, P<0.05) [2]。该研究所得结果与该研究结论相符。此外, 由于尿m Alb存在一定的变异性, 有学者认为在半年内连续检测尿m Alb/Cr比值次中有2次超过正常范围提示有肾损伤的存在[3]。
α1-微球蛋白 (α1-MG) 属Lipocalin家族成员[4], 为相对分子量30×103~33×103的小分子糖蛋白, 含糖量约为20%, 等电点 (p I) 为4.3~4.8。机体内游离型的α1-MG可以自由透过肾小球滤过基膜, 并在肾近曲小管处被完全重吸收及代谢分解。当肾小球滤过功能受损或肾小管重吸收和代谢能力降低时, α1-MG被更多地由血液释放到尿液中, 尿液α1-MG因此增高。由于尿液α1-MG不受尿液p H值的影响, 因此较尿液中其他微球蛋白的测定更为精确、稳定。动态观察发现肾小管受损时尿α1-MG升高, 较β2-MG升高明显[5]。
该研究以UAER在30~300 mg/d范围的样本为研究对象, 结果观察组的U-m Alb/Cr、Cys-C、α1-MG三项指标均高于对照组, 表明在早期肾损害发生时, 此三项指标均异常升高, 且从操作的简便性和结果准确度来看, 这三项指标明显优于尿白蛋白排泄率。由于三者功能不同, U-m Alb/Cr侧重敏感性、Cys-C能准确反映GFR、尿α1-MG可有效用于判断肾小管的损伤, 故可认为U-m Alb/Cr、Cys-C、α1-MG联合检测有助于糖尿病肾损害的早期诊断, 同时有助于对疾病进展作出更加准确、全面的评估。该次实验计算了UAER在30~100 mg/d范围样本的U-m Alb/Cr、Cys-C、α1-MG的阳性率, 结果表明对UAER低水平增高的敏感性U-m Alb/Cr>尿α1-MG>Cys-C, 该结果与罗敏琪等[7]和徐红菊等[8]的研究相符, 提示U-m Alb/Cr可代替UAER成为DN早期诊断中最敏感而不可或缺的检测指标。由于样本例数较少、各浓度标本分布不均的关系, U-m Alb/Cr、Cys-C、尿α1-MG三者之间的相关性有待于进一步探讨。
摘要：目的 探讨尿微量白蛋白/肌酐比值 (U-mAlb/Cr) 、血清胱抑素C (c) ys-C) 和尿α1-微球蛋白 (α1-MG) 在糖尿病肾病 (DN) 早期诊断中的价值。方法 观察组包含福建省立医院内分泌科2012年1月—2013年7月收治的2型糖尿病住院病人, 其尿白蛋白排泄率在30300 mg/d;对照组为该院健康体检者, 收集二者血清及尿液标本, 检测U-mAlb/Cr、Cys-C和尿α1-MG浓度进行比较。结果 观察组U-mAlb/Cr、Cys-C和尿α1-MG检测结果与对照组比较均增高 (P<0.05) , 而在UAER低水平增高时 (UAER在30100 mg/d) , m-Alb/Cr (77.2%) 和尿α1-MG (36.3%) 阳性率与对照组相比均增高 (P<0.05) , Cys-C (9.09%) 阳性率无显著性增高, 将三者间阳性率作两两比较, 差异有统计学意义。由此可推断, 对UAER低水平增高的敏感性U-mAlb/Cr>尿α1-MG>Cys-C。结论 U-mAlb/Cr、Cys-C、尿α1-MG联合检测有助于糖尿病早期肾损害的诊断。
关键词：尿微量白蛋白/肌酐比值,胱抑素C,α1-微球蛋白,糖尿病肾病,早期诊断
参考文献
[1]徐红菊, 李冬, 万海英.血清胱抑素与尿α1-微球蛋白对糖尿病肾病的早期诊断价值[J].检验医学与临床, 2013, 10 (1) :57-59.
[2]刘明开, 李达.随机尿样微量白蛋白/肌酐比值与24 h尿白蛋白定量结果的对比研究[J].实用诊断与治疗杂志, 2007, 21 (3) :171-173.
[3]李小明, 陈丽达, 胡汉林, 等.尿微量白蛋白与尿肌酐比值对糖尿病性肾病的诊断价值[J].湖北预防医学杂志, 2001, 12 (3) :10-11.
[4]傅美华, 陈军.胱抑素C与糖尿病肾病的相关研究进展[J].中国全科医学, 2013, 16 (1) :229-231.
α1微球蛋白 篇3
1 实验方法
1.1 仪器与试剂
LC-10A型高效液相色谱仪, SPD-10A型紫外可见检测器等。
1.2 溶液的制备
1.2.1 尼莫地平溶液的制备:
精密称取尼莫地平 (消旋体) 约8.0mg, 以乙醇溶解并稀释制成每1 m L中约含400μg的贮备液, 低温避光保存。使用时用流动相稀释制成浓度约为8μg·m L-1的溶液, 经0.45m滤膜过滤, 即得。
1.2.2 非洛地平溶液的制备:
精密称取非洛地平 (消旋体) 约8.0mg, 以乙醇溶解并稀释制成每1 m L中约含400μg的贮备液, 低温避光保存。使用时用流动相稀释制成浓度约为8μg·m L-1的溶液, 经0.45m滤膜过滤, 即得。
1.2.3 氨氯地平溶液的制备:
精密称取氨氯地平 (消旋体) 约8.0mg, 以乙醇溶解并稀释制成每1 m L中约含400μg的贮备液, 低温避光保存。使用时用流动相稀释制成浓度约为8μg·m L-1的溶液, 经0.45m滤膜过滤, 即得。
1.3 液相色谱条件
色谱柱:Chiral-AGP柱 (4.0 mm×100 mm, 5μm, 瑞典Chrom Tech公司) ;Chiral-AGP保护柱 (4.0 mm×10 mm, 5μm, 瑞典Chrom Tech公司) 。流动相:随化合物不同而不同, 在使用前经0.45μm滤膜滤过并脱气;流速:0.6 m L·min-1;检测波长:236 nm进样量:10μL;柱温:25℃。
2 讨论
2.1 有机改性剂种类和浓度对对映体分离的影响
Chiral-AGP首选的有机改性剂是异丙醇, 若用异丙醇不能实现拆分, 可以使用乙腈、乙醇、甲醇或四氢呋喃。本文分别以不同比例的甲醇-醋酸钠缓冲液、乙腈-醋酸钠缓冲液、异丙醇-醋酸钠缓冲液作为流动相, 考察了有机改性剂种类对三种二氢吡啶类钙通道阻滞剂类药物对映体拆分的影响。结果表明, 甲醇、乙腈为有机改性剂时, 三种对映体均不能被拆分。而以异丙醇作为有机改性剂时能使三种药物对映体达到完全分离。有机改性剂加入量也是影响分离的因素之一。
2.2 缓冲液种类及浓度对对映体分离的影响
在室温和流动相流速为0.6 m L·min-1条件下, 分别考察了磷酸二氢钠缓冲液 (调节p H至7.0) 和醋酸铵缓冲液, 结果表明磷酸二氢钠缓冲液对对映异构体的拆分能力明显弱于醋酸铵缓冲液。实验中分别尝试了不同浓度的磷酸二氢钠缓冲液, 虽然随着缓冲盐浓度的增加分离度逐渐改善, 但始终没有达到基线分离, 且因为磷酸盐难以挥发, 使其在某些仪器上的使用受到限制, 因此我们选用醋酸铵缓冲液并考察缓冲盐浓度的变化对保留因子 (k) , 选择性因子 (α) 及分离度 (R) 的影响。
可见, 改善分离度可以通过增加缓冲盐浓度实现, 随着缓冲盐浓度增加, 容量因子, 分离因子及分离度逐渐变大。对于氨氯地平当缓冲盐浓度大于等于20 mmol·L-1时, 可以达到基线分离;尼莫地平在缓冲盐浓度大于30 mmol·L-1时, 达到基线分离;非洛地平在缓冲盐浓度大于60 mmol·L-1时, 达到基线分离。继续增加缓冲盐浓度, 分离度变化不显著。这个结果提示, 在一定范围内离子强度对对映异构体的分离和保留有一定影响。一般情况下, Chiral-AGP柱所使用的缓冲盐浓度是0~100 mmol·L-1, 在达到分离要求的情况下尽量选择低浓度缓冲盐, 故本实验最终选择了30 mmol·L-1的醋酸铵缓冲液作为氨氯地平和尼莫地平的流动相, 选择60 mmol·L-1的醋酸铵缓冲液作为非洛地平的流动相。
2.3 醋酸盐缓冲液p H值对对映体分离的影响
流动相的p H值对Chiral-AGP手性拆分选择性的影响显著。AGP应用的p H值范围为4~7, 虽然有些药物其最佳的分离p H值大于7, 但当其使用p H值大于7时, 柱的稳定性下降, 会缩短柱子使用寿命[3]。AGP等电点为2.7, 因此在其应用的p H值范围内蛋白分子结构中的氨基酸呈离子型状态, 该离子结构提供了手性作用位点, 利用手性药物对映体与这些作用位点间产生不同的氢键结合效应、疏水效应、静电作用等而达到拆分。本文根据所研究的三种药物对映体的结构差异, 考察了在不同p H值条件下各药物对映体的分离情况。结果表明提高p H值, 三种药物对映体的保留时间、分离度均有增大。
2.4 柱温变化对分离的影响
柱温也是手性分离中的一个重要参数, 柱温升高, 使溶质在固定相和流动相中传质变快的同时, 最终改变了溶质同固定相间的手性作用力, 保留因子变小, 分离度下降[4]。
2.5 流速对对映体分离的影响
用异丙醇-30 mmol·L-1醋酸铵缓冲液 (p H 5.0) (1.5:98.5, v/v) 作为氨氯地平的流动相;异丙醇-30 mmol·L-1醋酸铵缓冲液 (p H 7.0) (8:92, v/v) 作为尼莫地平的流动相;异丙醇-60 mmol·L-1醋酸铵缓冲液 (p H 7.0) (8:92, v/v) 作为非洛地平的流动相;考察不同流速对对映体分离的影响。随着流速降低, 柱效增加, 分离度随之增大, 而对手性选择性并无明显改善, 与文献报道一致。说明蛋白质对溶质的识别是一个相对较慢的动力学过程, 在低流速时, 溶质与固定相作用更充分, 而使柱效增加, 分离改善。综合考虑确定流速为0.6 ml·min-1。
摘要：采用α1-酸性糖蛋白手性固定相, 建立了HPLC法拆分氨氯地平、尼莫地平、非洛地平和西替利嗪四种药物对映体。考察了流动相中有机改性剂种类和浓度、缓冲盐浓度和pH值、柱温以及流速等因素对对映体分离的影响, 优化了色谱条件, 并对分离机理进行了探讨。
关键词：HPLC法,手性拆分
参考文献
[1]尤启冬, 林国强.手性药物研究与应用.北京:化学工业出版社, 2003.
[2]郭鹏程, 黄红林.二氢吡啶类钙通道阻滞剂及其药物手性研究.现代生物医学进展, 2009, 9 (1) :181-185
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α1微球蛋白 篇4
关键词：胃肿瘤,富含半胱氨酸61,低氧诱导因子-1α,免疫组织化学,蛋白免疫印迹法
胃癌是常见的消化道肿瘤,其发病率仅次于肺癌,居第2位,大约65%的患者确诊时已经出现局部或远处转移[1]。因此对于侵袭与转移机制的研究一直是胃癌研究的重要课题。目前认为肿瘤的侵袭转移过程涉及多分子作用机制和信号传导通路。近年来研究发现,富含半胱氨酸61(cysteine rich61,Cyr61)可通过PI3K/mTOR和MAPK依赖的信号通路促进低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducing factor-1α,HIF-1α)蛋白合成增加,而且可诱导HIF-1α的HRE(hypoxia response element,低氧反应元件)依赖的转录活性,使HIF-1α调控的侵袭相关基因纤溶酶原激活因子抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)表达上调,从而促进胃癌细胞的侵袭性[2],但目前国内外有关Cyr 61和HIF-1α与胃癌的研究鲜见报道。本研究应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同胃癌组织中Cyr 61和HIF-1α蛋白的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,旨在进一步明确两者与胃癌侵袭的关系,为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 标本来源
取自青岛市市立医院普外科2008年10月~2009年12月手术切除的标本共49例,标本均经病理科两位以上的资深医师证实,术前均未接受任何化疗或放疗,且均进行了局部淋巴结的清扫。
49例标本分为3组,分别为原发性胃癌组,配对癌旁组(距离边缘2 cm)及配对的手术切缘正常组(距离边缘5 cm以上),将胃癌手术切除标本均分为两部分,一部分立刻固定10%的甲醛溶液中,包埋在石蜡中,以备病理检查用;一部分手术切除的标本立即放于-70℃冰箱中冻存用于Western blot检测。
1.2 主要试剂和仪器
RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),Cyr61和HIF-1α兔多克隆抗体(武汉博士德公司)、β-actin兔多克隆抗体(武汉博士德公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)为第2抗体。
第2抗体试剂:EnVision试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benzidine,DAB)购于福州迈新。
1.3 实验方法和主要步骤
1.3.1 免疫组织化学检测胃癌组织中Cyr61和HIF-1α的表达
采用EnVision两步法。主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡水化后,浸于0.01 mol/L枸橼酸溶液(pH为6.0),微波中火4 min进行抗原修复。操作严格按说明书进行,取已知阳性切片作为阳性对照,用PBS液代替第一抗体试剂作为阴性对照。
1.3.2 Western blot法检测Cyr61和HIF-1α蛋白的表达
用RIPA裂解液裂解组织(400μl RI-PA+4μl PMSF)提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜,封闭液封闭(4℃过夜),分别用Cyr 61和HIF-1α兔多克隆抗体(1∶200)和β-actin兔多克隆抗体(1∶1 000)孵育,室温轻摇180 min后,再用TBS洗涤3次(10min/次)后,再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育120 min,TBS洗涤3次(15 min/次)后,最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。
1.4 结果判断
1.4.1 免疫组织化学结果判断
CRY61阳性判断标准:以胞质呈棕黄色为阳性。免疫标志的阳性标准:无阳性细胞为阴性;阳性细胞<10%为弱阳性;阳性细胞10%~50%为阳性;阳性细胞≥50%为强阳性。HIF-1α参照ZHONG等[3]的方法,以细胞核或细胞质内呈棕黄色为阳性,高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个细胞,共计1 000个。0分:无着色;1分:<1%的细胞核着色;2分:1%~10%的细胞核着色和(或)胞质弱着色;3分:10%~50%的细胞核着色和(或)胞质明显着色;4分:>50%的细胞核着色和(或)胞质强着色。评分结果:0~1分定为阴性,2~4分定为阳性。
1.4.2 Western blot结果分析
应用BIO-RAD图像分析软件对Western blot杂交条带进行密度扫描,以Cyr61及HIF-1α条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示各组织中Cyr61及HIF-1α表达水平(灰度值为条带密度值及面积值的乘积,设空白对照相对密度值为0)。
1.5 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件,Cyr61蛋白及HIF-1α蛋白的表达以均数±标准差(x±s)表示。组间计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验。Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中表达的相关性用Spearman进行相关性检验分析。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 免疫组织化学方法检测Cyr61和HIF-1α的表达
2.1.1 Cyr61在各组中表达水平的比较
Cyr 61在各组中的表达情况见图1及表1。图1显示Cyr 61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达。由表1可见,Cyr61在胃癌中表达的阳性率(91.8%),高于癌旁组(75.5%)和正常组(49%),差异有显著性(χ2=4.780,P<0.05;χ2=21.598,P<0.01);癌旁组与正常组比较差异有显著性(χ2=7.338,P<0.01)。
注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与正常组比较,P<0.01;3)与癌旁组比较,P<0.05
2.1.2 HIF-1α在各组中表达水平的比较
HIF-1α在各组中的表达情况见图2及表1。图2显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,由表1可见,HIF-1α在胃癌中表达的阳性率(83.17%),高于癌旁组(38.8%)和正常组(0%),差异有显著性(χ2=6.186,P<0.05;χ2=70.491,P<0.01),癌旁组的表达高于正常组(χ2=23.57,P<0.01)。
注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与癌旁组比较,P<0.01
2.2 Western blot检测各组Cyr61和HIF-1α蛋白的表达
2.2.1 Cyr61蛋白在各组表达的比较
Cyr61蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2767±0.02200)、(0.2145±0.02209)和(0.1055±0.02082)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=785.8,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=14.618;t=38.957,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=23.962,P<0.01)(图3和表2)。
2.2.2 HIF-1α蛋白表达的比较
HIF-1α蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2663±0.02682)、(0.2120±0.04087)和(0.1008±0.03867)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=269.3,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=7.772;t=24.619,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=13.837,P<0.01)(图3和表2)。
2.3 胃癌中Cyr61和HIF-1α的表达及其与胃癌临床病理参数的关系
对49例胃癌患者按照性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期进行分组,观察Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达情况(表3)。由表3可见,Cyr61和HIF-1α蛋白的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关,差异具有显著性(均P<0.05),与胃癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无关,差异无显著性(P>0.05)。
2.4 胃癌组织中Cyr61和HIF-1α表达的相关性
Spearman相关性检验结果表明,在胃癌组织中,Cyr61蛋白表达与HIF-1α蛋白表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。
3 讨论
Cyr61是CCN(Cyr61/CTGF/NOV)蛋白家族成员之一。人类Cyr61基因定位于染色体Ip22.3,含有5个外显子和4个内含子,编码381个氨基酸的蛋白,其中38个为保守的半胱氨酸,Cyr61的相对分子量为42 kD。Cyr61由信号肽(signal peptide,SP)及4个保守结构域组成。Cyr61可调控内皮细胞和成纤维细胞的黏附、迁移与增殖,分泌细胞外基质、诱导血管生成,参与多种重要的生理、病理过程。在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着不同作用。研究发现,在不同的组织细胞及肿瘤中,Cyr61的表达水平不同,其功能也不同。如Cyr61在神经胶质瘤、骨肉瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织血管形成[4,5]。而Cyr61在子宫内膜癌、子宫平滑肌瘤、前列腺癌中、非小细胞肺癌中低表达,起到类似抑癌基因的作用[4,5,6,7]。
目前有关Cyr61与胃癌的研究国内外罕见报道,均采用免疫组织化学方法检测,LIN等[7]用免疫组织化学方法对81例胃癌石蜡切片研究发现,Cyr61表达与胃癌肿瘤分期、淋巴结转移及组织学分型相关。在此基础上本研究联合Western blot技术检测了49例胃癌手术患者,发现Cyr61蛋白在胃癌组织中呈高表达,明显高于配对癌旁组织及配对的正常组织,差异有显著性。同时分析Cyr61与临床病理参数的关系发现,Cyr61蛋白的表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。提示Cyr61可用于胃癌的检测及作为胃癌侵袭转移的判断指标。
低氧诱导因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亚单位构成的异二聚体[8]。HIF-1α是其活性调节亚单位;HIF-1β在常氧和缺氧条件下均可表达,而HIF-1α在氧浓度正常时,其表达量维持在较低水平。在常氧条件下,88%的正常人体组织中不表达HIF-1α,而53%的恶性肿瘤组织中表达HIF-1α,在相应的良性肿瘤中没有检测到HIF-1α[9]。当周围环境的氧浓度下降时HIF-1α的转录、翻译水平呈指数增加,但主要是蛋白水平的表达改变[10]。ZHONG等[9]利用HIF-1α单克隆抗体检测了HIF-1α在多种肿瘤组织中的表达,发现90%的结肠癌、肺癌及前列腺癌组织中HIF-1α表达升高,而在肿瘤附近正常组织中则不表达。关于HIF-1α在胃癌组织中表达的研究报道甚少:TAKAHASHI等[11]研究发现HIF-1α与胃癌肿瘤大小及肝转移密切相关;CHEN等[12]研究发现HIF-1α的高表达与胃癌的复发及远处转移密切相关。
本研究采用免疫组织化学和Western blot技术检测了HIF-1α蛋白水平的表达,发现HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达高于配对癌旁组织及配对的正常组织,癌旁组织高于正常组织,差异均有显著性。同时分析HIF-1α与临床病理参数的关系发现,HIF-1α蛋白的表达与胃癌TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移、细胞分化程度显著相关,而与患者年龄、性别、原发肿瘤大小无关。韩冰等[13]对96例胃癌患者研究发现,HIF-1α表达阳性的患者总生存率明显低于表达阴性的患者,提示HIF-1α在胃癌患者的预后中起着重要作用。本研究显示HIF-1α的表达与胃癌的进展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关。HIF-1α可作为评估胃癌发展、转移及预后的参考指标。
α1微球蛋白 篇5
关键词：缺氧诱导因子-1α,细胞骨架蛋白(Fascin蛋白),食管鳞癌
缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是上世纪90年代初被发现的,其由缺氧诱导产生,且能与促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)基因上的缺氧反应元件结合,从而促进EPO转录的新的转录因子[1]。HIF-1α在肿瘤中表达水平与其生长,转移等密切相关[2,3,4]。Fascin蛋白是一种细胞骨架蛋白,其与F-肌动蛋白结合,在细胞迁移、黏附及细胞间信息传递等过程中发挥重要作用[3]。笔者采用免疫组织化学方法检测了HIF-1α蛋白及Fascin蛋白在食管鳞癌中的表达,并分析此两者在食管鳞癌发生、发展中的作用及相互的关系。进一步了解食管鳞癌的发生、发展及侵袭转移的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年1-12月在本院胸外科行手术切除的食管鳞癌患者80例。其中男54例,女26例;年龄38~76岁,平均59.5岁;其中≥60岁48例,<60岁32例;组织学分级:高分化18例,中分化36例,低分化26例;TNM分期:Ⅰ期12例、Ⅱ期38例、Ⅲ期30例;其中淋巴结转移阳性30例,阴性50例。80例癌旁食管组织(取自距癌组织边缘≥5 cm处)作为对照,病理学检查排除肿瘤累及。手术前所有病例均未行放化疗,所有标本均经病理确诊为食管鳞癌。所有标本均经10%福尔马林液固定;常规石蜡包埋、切片(厚度4μm);并进行HE染色和免疫组织化学检测。
1.2 免疫组化染色
试验用小鼠抗人Fascin单克隆抗体及SP即用型试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗人HIF-1α多克隆抗体购自Boster公司。应用免疫组织化学SP方法,检测HIF-1α及Fascin蛋白在食管鳞癌中的表达。严格按试剂盒上要求的步骤操作,用已确诊的食管癌组织切片作阳性对照,用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.3 染色结果及判断标准
1.3.1 HIF-1α蛋白染色判定
阳性表达为肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒。HIF-1α定位于细胞核或细胞浆内;据阳性肿瘤细胞数占肿瘤细胞总数的比例分为:HIF-1α阳性细胞数<1%定义为阴性(-),在1%~10%之间定义为弱阳性(+),在11%~50%之间定义为中度阳性(++),>50%定义为强阳性(+++),其中(+~+++)均视为阳性表达。
1.3.2 Fascin蛋白染色判定
依据胞膜和胞浆中显示弥漫性棕黄色颗粒为阳性染色,每张切片随机计数10个高倍视野,每个视野计数100个细胞。据阳性细胞百分率来判定:(1)未见棕黄色颗粒为阴性;(2)<25%为弱阳性(+);(3)在25%~75%之间为阳性(++);(4)>75%为强阳性(+++),其中(+~+++)视为阳性表达。
1.4 统计学处理
应用SPSS 22.0软件处理数据,计数资料的比较采用字2检验,相关性分析采用Pearson相关分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HIF-1α和Fascin蛋白在食管鳞癌和癌旁正常组织中的表达
HIF-1α和Fascin蛋白在食管鳞癌组织的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织中的阳性表达率,差异均有统计学意义(P<0.01),见表1。
2.2 HIF-1α和Fascin的表达与食管鳞癌临床病理因素的关系
HIF-1α及Fascin的表达均与食管鳞癌患者的性别、年龄无明显相关性(P>0.05);HIF-1α及Fascin的表达均与食管鳞癌患者的组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05),见表2。
2.3 HIF-1α、Fascin在食管鳞癌中表达的相关性分析
食管鳞癌组织中HIF-1α、Fascin均为阳性表达者50例,均为阴性表达者8例,分析显示两者的表达呈正相关(r=0.252,P<0.05),见表3。
3 讨论
3.1 缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和Fascin蛋白表达与食管鳞癌生物学行为的关系
相对缺氧趋势是实质性肿瘤微环境的重要改变,但肿瘤对微环境缺氧存在自我调节与适应,其主要受HIF-1α介导的缺氧反应通路的调节,主要功能涉及微血管生成、细胞生存、糖代谢、细胞侵袭转移等多个方面[4]。孙巧妹等[5]应用免疫组织化学方法检测HIF-1α在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、唾液腺腺样囊性癌中表达时发现三者阳性表达率依次递增,且组间比较差异有统计学意义,提示HIF-1α可以作为判断唾液腺腺样囊性癌诊断、侵袭、转移及预后的重要指标。Semenza等[6]报道提示在实体肿瘤组织中HIF-1α表达上调,且其表达程度与肿瘤的病理学分级、血供存在相关性。Dales等[7]研究发现HIF-1α在乳腺癌中的表达与其转移有关,且HIF-1α高表达患者有生存率较低。Jean等[8]报道提示HIF-1α表达的高低与乳腺癌的分期、进展程度以及患者的预后相关。周红艳等[9]通过原位杂交技术检测102例宫颈鳞癌组织、66例CIN组织和40例正常宫颈组织中HIF-2αm RNA的表达时发现HIF-2αm RNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率均显著高于正常宫颈组织和CIN组织,且HIF-2αm RNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达与淋巴结转移和临床分期相关。提示HIF-2αm RNA在宫颈鳞癌组织中表达上调,可能与宫颈鳞癌的发生和演进有关。Matsuyama等[10]研究发现在215例食管鳞癌组织中HIF-1α阳性表达率达为95%,进一步研究发现HIF-1α与食管鳞癌血管生成和淋巴结转移相关;本研究提示80例食管鳞癌组织中HIF-1α的阳性表达率高于癌旁正常食管组织(P<0.05);进一步研究发现食管鳞癌中HIF-1α表达与食管癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05);提示HIF-1α可作为反映食管癌恶性程度及分期的指标。本研究与Munipalle等[11]的研究结论一致。
Fascin是20世纪70年代由Bryan等[12]从海胆卵母细胞胞质中发现的。人类Fascin基因定位于染色体7q22,分子质量为55 ku,为一种细胞骨架蛋白。其主要作为细胞与细胞、细胞与细胞外基质黏附受体以及影响上皮细胞的转移能力[13];在细胞迁移、黏附以及细胞间信息传递等过程中发挥重要作用[14]。徐光[15]研究发现鼻咽癌组织中Fascin阳性表达率为92.05%显著高于癌旁正常组织9.09%;姜英等[16]用免疫组化方法检测乳腺增生、乳腺原位癌及乳腺浸润性导管癌中Fascin蛋白表达,结果显示:Fascin蛋白在高度乳腺导管原位癌中阳性表达率为11.1%(2/18),在乳腺浸润性导管癌组中阳性表达率为15%(18/120)。提示在乳腺增生到乳腺癌的发生、发展过程中,Fascin蛋白表达可能是一个迟发事件,主要在癌组织中表达,有可能成为乳腺癌治疗的一个新的生物学标志物。李晟等[17]采用免疫组织化学法检测108例胃癌组织中Fascin表达,结果Fascin表达率为25.00%,进一步研究提示:Fascin的表达在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),远处转移组高于无远处转移组,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),提示Fascin蛋白阳性表达与肿瘤的转移有关。Tsai等[18]采用免疫组化的方法统计了100例肾癌手术标本,发现Fasein与肿瘤分期呈正相关,且在肿瘤的侵袭、转移和复发过程中发挥作用。安锦丹[19]等研究发现:卵巢恶性上皮性肿瘤组织中Fascin的阳性表达率高于卵巢交界性上皮性肿瘤组织和卵巢良性上皮性肿瘤组织的表达,比较差异有统计学意义(P<0.01)。进一步分析发现Fascin的阳性表达与卵巢恶性上皮性肿瘤患者临床分期、淋巴结转移、腹水显著相关(P<0.05),提示卵巢恶性上皮性肿瘤组织中Fascin阳性表达升高;其阳性表达可能与卵巢恶性上皮性肿瘤的浸润、转移有关。本研究显示80例食管鳞癌组织中Fascin的阳性表达率达72.5%,明显高于癌旁正常食管组织的表达(P<0.05);进一步分析发现食管鳞癌中Fascin表达与食管癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05),结合文献及本研究结果推测,Fascin与F-肌动蛋白结合,使细胞膜表面突起增多,从而改变细胞骨架、细胞与细胞、细胞与细胞外基质的黏附等因素而促进食管鳞癌细胞转移。
3.2 HIF-1α和Fascin蛋白表达的关系
α1微球蛋白 篇6
本研究旨在构建COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,转染CHO细胞进行表达,并检测其与鼠成纤维细胞表面Endo180是否能够相互作用,为深入研究COL1A1基因的生物学功能提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
p APtag-4质粒、prcol1α1质粒、E.coli GH2感受态、中国仓鼠卵巢细胞(二氢叶酸缺陷型,dhfr-/-)、鼠胚胎成纤维细胞(Rat-1)由Gene Hunter公司提供。
1.1.2 试剂
DL5000 DNA marker、限制性内切酶、r Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;引物合成和DNA测序由TSINGKE公司完成;Fu GENE 6购自Roche公司;兔抗人AP多克隆抗体购自Gene Hunter公司;HRP标记的羊抗兔Ig G二抗购自Southern Biotch公司;Reagent A(含氯化镁、二乙醇胺、BSA和对硝基苯磷酸酯)购自Gene Hunter公司;Reagent S(氯化硝基四氮唑兰)购自Sigma公司;胎牛血清购自Bovogen公司。其他试剂和耗材均购自国内生物公司。
1.1.3 仪器
PCR仪(Bio-Rad);电泳仪(北京JUNYI电泳仪公司);冷冻离心机(Eppendorf公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司);CO2恒温培养箱(Thermo Fisher公司)。
1.1.4 培养基
胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM高糖培养基和IMDM培养基均购自Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的获取
根据NCBI数据库中鼠COL1A1的c DNA序列设计一对用于扩增COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的引物,上游引物P1:5'-GTAGATCTGGACGTGAGGGG-3',下划线为BglⅡ酶切位点,下游引物P2:5'-GGTCTAGATTT-GAAGCTGAAGTCG-3',下划线为XbaⅠ酶切位点。以含有COL1A1的c DNA全长的质粒prcol1α1为模板,以P1、P2为上下游引物,用r Taq DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为:94℃、5 min;94℃、30 s,58℃、1 min,72℃、1 min,循环数30;72℃、5 min。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。
1.2.2 真核表达质粒p AP-Gly的构建和鉴定
用BglⅡ和XbaⅠ双酶切甘氨酸重复序列基因和真核表达载体p AP-tag4,将酶切后的p AP-tag4和甘氨酸重复序列分别进行割胶回收。将纯化的p AP-tag4和甘氨酸重复序列基因(1∶10)经T4DNA连接酶16℃连接过夜,并转化E.coli GH2感受态,使用含有氨苄和四环素双抗的固体LB培养板挑取单菌落培养,提取质粒,然后进行PCR鉴定、双酶切鉴定以及送到TSINGKE公司基因测序鉴定,得到测序完全正确的p AP-Gly重组质粒(图1)。
1.2.3 重组质粒转染CHO细胞
将生长状态良好的CHO(dhfr-/-)细胞经胰酶消化后用血球计数板计数,以每孔5×104细胞密度铺到六孔板中,培养时加入1×次黄嘌呤与胸腺嘧啶(HT)至IMDM培养基中,放入5%CO2孵箱中37℃培养24 h。当CHO(dhfr-/-)细胞长到50%~70%汇合度时,按照Roche公司提供的Fu GENE 6操作说明书进行转染,阴性对照为转染空质粒p AP-tag4的CHO(dhfr-/-)细胞,空白对照为无转染的CHO(dhfr-/-)细胞。转染72 h后进行蛋白水平鉴定。
1.2.4 AP活性测定检测AP-Gly蛋白在细胞中的表达
转染72 h后,收集六孔板中细胞培养基,5 000r/min离心5 min,取上清检测培养基中的AP活性。具体AP活性测定方法如下:取50μL含有AP-Gly蛋白的细胞培养基(以50μL IMDM培养基作为负对照),然后加入等体积AP反应底物2×Reagent A,立即放入37℃水浴锅并计时,待溶液变成黄色后,用100μL 0.5 mol/L Na OH终止反应,然后加入800μL双蒸水,利用酶标仪读取溶液OD405。根据公式54×OD405/(T·V)计算AP活性,其中T为水浴时间(min),V为样品体积(μL),AP活性单位是U/m L。
1.2.5 Western Blot鉴定AP-Gly蛋白的表达
将上述检测到有AP活性的AP或AP-Gly细胞培养基用PBS均调至相同AP活性,分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜。使用5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入兔抗人AP多克隆抗体(1∶2 000)室温孵育2 h或4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入羊抗兔Ig G二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜3次。加入ECL显影液,在凝胶成像仪(Bio-Rad)上拍照。
1.2.6 Rat-1细胞原位染色
取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA(5 mmol/L KCl,0.44mmol/L KH2PO4,0.49 mmol/L Mg Cl2·6H2O,136mmol/L Na Cl,0.4 mmol/L Na H2PO4,5%BSA)清洗细胞1次,每孔中分别加入1U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90min,弃掉上述细胞培养基,用1 m L HBHA溶液在10 min内清洗细胞至少5次,每孔加入500μL固定液(60%acetone,3%formaldehyde,20 mmol/L HEPES p H7.5),固定细胞30 s,迅速弃掉固定液,加入1 m L HS溶液(1.6 mmol/L Na Cl,20 mmol/L HEPES p H 7.5)清洗细胞2次,加入1 m L HS溶液,将培养皿放在65℃水浴锅20 min(去除内源AP),然后弃掉HS溶液,每孔加入500μL AP显色底物Reagent S,于37℃孵箱显色2 h,直到在显微镜下观察到实验组细胞染成蓝紫色,而负对照组没有出现染色情况。
1.2.7 Rat-1细胞定量染色
取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA清洗细胞1次,然后每孔中分别加入1 U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90 min,弃掉上述细胞培养基,加入200μL细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl p H8.0,1%Triton×100)放置5 min后,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,于4℃离心机最大转速离心2 min,收集上清,BCA法测定上清中Rat-1细胞全蛋白浓度,与此同时,将剩余上清于65℃孵育20 min(去除内源AP),最后按照上述AP活性测定方法测定各实验组上清中AP活性。
1.2.8 Rat-1细胞全蛋白的提取
取出Rat-1细胞培养皿并且弃掉培养基,用5m L预冷的PBS清洗细胞1次,再加入1 m L预冷PBS,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,用4℃离心机2 000 r/min离心2 min,弃上清,然后在离心管中加入200μL预冷的细胞裂解液(10mmol/L HEPES,p H 8.0,10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L EGTA,1 mmol/L PMSF,1mmol/L DTT,0.3%NP40),于4℃裂解细胞30min,4℃离心机最大转速离心10 min,收集上清。用BCA方法测定全蛋白浓度。
1.2.9 AP-Gly与Rat-1全蛋白的配体受体亲和印迹实验
将Rat-1全蛋白分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇的两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,上述蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜后,用5%脱脂奶粉封闭1 h后,TBST洗膜3次,分别用等AP活性的AP、AP-Gly、AP-Coll细胞培养基孵育,室温孵育2 h或者4℃摇过夜,TBST洗膜3次,往膜上滴加入AP反应底物Reagent S,直到出现蓝紫色目的条带,用双蒸水反复冲洗PVDF膜终止反应,在凝胶成像仪上拍照。
1.2.1 0 统计学分析
每次实验均独立重复3次,数据以平均数±标准误差(mean±SEM)表示,使用Graph Pad Prism5.0统计学软件进行单因素方差分析,组间两两比较采用t检验分析并作图,当P<0.05时具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01。
2 结果与分析
2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的PCR扩增
利用合成的引物以含COL1A1 c DNA全长的prcol1α1质粒为模板进行PCR扩增C端甘氨酸重复序列全长,利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物在500 bp~750 bp之间可见约570 bp的特异性单一条带,基因大小与预期相符合(图2)。
Note:M:DNA marker DL5000;1:C-terminal glycine repeats gene.
2.2 重组质粒p AP-Gly的PCR鉴定
将C端甘氨酸重复序列基因扩增产物与p AP-tag4载体连接,转化E.coli GH2感受态,进行菌液PCR鉴定。2%琼脂糖凝胶电泳结果可见约500 bp~750 bp处存在C端甘氨酸重复序列的的基因片段,说明重组质粒中含有C端甘氨酸重复序列基因(图3)。
Note:M:DNA marker DL5000;1-16:Electrophoretic profile of PCRproduct of p AP-Gly.
2.3 重组质粒p AP-Gly的双酶切鉴定
重组质粒用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳分析,结果可见约5 500 bp的空质粒p AP-tag4片段和约570 bp的C端甘氨酸重复序列基因的目的片段,显示重组质粒构建成功(图4)。对上述鉴定正确的质粒进行测序并且在NCBI上进行BLAST比对,编码框完全正确,将测序正确的克隆命名为p AP-Gly。
Note:M:DNA marker;1:p AP-Gly with endonuclease.
2.4 Western Blot检测融合蛋白的表达
转染p AP-Gly重组质粒于CHO(dhfr-/-)细胞中,收集细胞培养基进行Western Blot检测。Western Blot结果中,重组质粒组可检测到约77k Da大小条带(可能是由于存在表达提前终止现象,故还有一条略小条带),空质粒组检测到67k Da条带(图5)。
注:1:AP(加巯基乙醇);2:AP(不加巯基乙醇);3:AP-Gly(加巯基乙醇);4:AP-Gly(不加巯基乙醇)。Note:1:AP(+β-Me);2:AP(-β-Me);3:AP-Gly(+β-Me);4:AP-Gly(-β-Me).
2.5 细胞原位染色检测AP-Gly与Rat-1细胞表面的相互作用
为了检测AP-Gly融合蛋白是否能够和Rat-1细胞表面结合,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基),最后加入AP反应底物Reagent S于37℃孵箱显色。细胞原位染色分析表明:AP-Gly与Rat-1细胞表面能够发生结合,催化AP底物Reagrnt S发生颜色反应,而负对照却没有颜色变化(图6)。
2.6 细胞定量染色分析AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的相互作用
为了进一步证实AP-Gly融合蛋白能够与Rat-1细胞相互作用,我们进行细胞定量染色分析,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基)。细胞定量染色结果表明:实验组在Rat-1全蛋白量基本一致的情况下(图7A),AP-Gly融合蛋白能够和Rat-1全蛋白结合,催化AP底物Reagent A发生颜色变化,因而在波长为405 nm下具有很强的吸光值,而AP蛋白不能够与Rat-1全蛋白结合,所以在405nm下基本没有吸光值(表1)。AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的结合和AP对照组具有极显著差异(*P<0.05,**P<0.01)(图7B)。
2.7 配体受体亲和印迹实验
之前我们实验室用AP标签亲和标记了COL1A1的C端区域(氨基酸1 000~1 453),融合蛋白命名为AP-Coll,且证实了AP-Coll能够和Rat-1细胞表面的Endo180结合[10]。通过配体受体亲和印迹实验,我们进一步探究AP-Gly融合蛋白是否同样和Rat-1细胞表面的Endo180结合。
注:A:两组Rat-1细胞全蛋白量基本相同;B:AP-Gly能够与Rat-1全蛋白结合,与AP组有极显著差异。Note:A:Normalization of whole cell extract of Rat-1 cells;B:Bound AP activity.
将加巯基乙醇和不加巯基乙醇处理过的Rat-1全蛋白经8%SDS-PAGE分离并转PVDF膜后,5%脱脂牛奶封闭过后,分别用含有等活性的AP、AP-Gly、AP-Coll蛋白的细胞培养基室温孵育2h或4℃过夜孵育后,TBST清洗3次,用AP底物Reagent S滴加在PVDF膜上显色。结果表明:AP-Gly实验组并没有出现蓝紫色条带,而AP-Coll实验组能够在150 k Da~250 k Da之间出现蓝紫色条带(Endo180大小为180 k Da),AP负对照组也没有出现蓝紫色条带(图8)。我们推测AP-Gly融合蛋白应该是和Rat-1细胞表面2种或2种以上的蛋白组成的复合物结合。
Note:M:protein marker;1:whole cell extract(+β-Me);2:whole cell extract(-β-Me).
3 讨论
细胞外基质的重塑对发育、稳态以及出生后组织重塑都有很重要的作用,同样与肿瘤发生、许多细胞增生疾病紧密相关。Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质成分中的重要一员,一直备受科学家的关注。Ⅰ型胶原蛋白是由(α1)2α2组成的异源三聚体。前体Ⅰ型胶原蛋白是由N端肽、中间的(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列、C端肽三部分组成的三股螺旋结构。在前体Ⅰ型胶原蛋白分泌到细胞外后,特定的蛋白酶分别将N端肽和C端肽剪切,形成只有(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列的成熟Ⅰ型胶原蛋白。最近的研究表明,Ⅰ型胶原蛋白的N端肽能够作为诊断肺癌骨转移过程中的一个代谢指标,患者尿液中的N端肽比正常人高[11]。COL1A1C端肽中一个氨基酸的替换将会导致致死性的成骨生成缺陷以及许多骨骼疾病[12]。COL1A1基因中第2 317个碱基由G替换为T的新生错义突变,第773个氨基酸由Gly转换为Cys,导致了非常严重的并且威胁终生的成骨生成缺陷[13]。COL1A1基因不仅与成骨生成密切相关,并且在乳腺癌细胞和内皮细胞的定向迁移过程中也起着很重要的作用[14]。
Endo180是Ⅰ型胶原蛋白的一个极其重要的受体,它与Ⅰ型胶原蛋白的相互作用与胶原蛋白的内吞、降解以及细胞粘附、肿瘤迁移等均有密切的联系。Endo180的表达常见于成纤维细胞和内皮细胞中。前期研究中,笔者课题组证实了COL1A1基因C端区域(氨基酸1 000~1 453)能够和鼠胚胎成纤维细胞表面的Endo180受体结合,并且它们的结合与细胞粘附紧密相关。但是,仅仅COL1A1C端甘氨酸重复序列是否参与细胞粘附还有待进一步研究。
本实验成功获得了COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189),构建了C端甘氨酸重复序列基因的真核表达质粒p AP-Gly,并在CHO细胞中成功表达,Western Blot分析转染重组质粒的细胞培养基可以检测到与预期一致的77 k Da蛋白。细胞原位染色表明AP-Gly能够与鼠成纤维细胞结合。细胞定量染色实验表明,AP-Gly与鼠成纤维细胞表面结合能力很强,相对于AP有极显著差异(**P<0.01)。配体受体亲和印迹实验表明,AP-Gly并不是和成纤维细胞表面的Endo180结合,也不能和成纤维细胞全蛋白中的任何一种单一蛋白结合,我们推测与其结合的受体蛋白很有可能是2种或2种以上的蛋白组成的复合物。
α1微球蛋白 篇7
牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)属于小整合素结合配体N端联接糖蛋白家族(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein family,SIBLING)[4]。最早在牙本质和骨组织中被发现,近期发现DMP1表达广泛,在颌下腺组织和肿瘤组织中均有表达[5,6]。近期研究发现,DMP1可以通过激活其伴侣基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)降解基底膜的Ⅳ型胶原和黏着连接的组成成分血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin),该过程可能会导致通透性的增高。而近期有研究显示TNF-α可以促进MMP9的表达[7],因而推测TNF-α和DMP1可能在HFRS患者通透性增高过程中发挥联合作用。
本研究的目的是,通过免疫细胞化学技术检测DMP1在HTNV感染的脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的表达情况,以及TNF-α对其表达量的影响。并通过Transwell单层细胞模型系统检测DMP1及TNF-α对HTNV感染的HUVEC通透性的影响。为阐明HFRS发病过程中通透性增高的机制提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒
原代HUVEC购自上海澳赛尔斯公司,采用该公司的内皮细胞完全培养基培养,内含内皮基础培养液,10%的胎牛血清和2%的生长因子添加剂(含表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、环磷酸腺苷、肝素、醋酸氢化可的松、青霉素、链霉素、两性霉素B溶液等)。细胞培养瓶提前用0.25%的明胶(美国Sigma公司)包被以保证细胞能均匀生长。所有实验均保证细胞控制在p3到p5代内使用。非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell,VERO)和汉滩病毒国际标准株HTNV 76-118由第四军医大学唐都医院感染科王平忠教授惠赠。采用免疫荧光化学方法鉴定病毒在细胞的复制情况,并采用Reed-Muench法测定病毒滴度。
1.2 间接免疫荧光检测病毒感染情况
VERO细胞在24孔板培养,待细胞融合至50%~60%时弃去培养基,加入HTNV悬液37℃培养2 h后弃去病毒悬液加入新鲜培养基继续培养,病毒感染3 d后采用间接免疫荧光方法进行检测。首先,用4%的多聚甲醛4℃固定20 min,然后采用0.5%的Triton X-100室温通透10 min,5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭30 min,然后加入鼠抗人HTNV 1A8抗体(第四军医大学唐都医院感染科王平忠教授惠赠,1∶1 000稀释)4℃过夜。然后加入羊抗鼠异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,Ig G)(中国北京中杉金桥生物公司)37℃孵育1 h。每一步结束后均用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗3次,每次5 min。最后在荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)上观察。
1.3 免疫细胞化学法检测DMP1在HUVEC的表达
将HUVEC爬片后用HTNV(感染复数=1)感染,3 d后加入TNF-α刺激30 min,PBS冲洗后加入4%的多聚甲醛4℃固定20 min,加入0.5%的Triton X-100室温通透10 min,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加50μl内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10 min,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加入50μl二抗动物非免疫血清,室温下孵育15 min;甩干玻片上的血清,每张盖玻片上滴加鼠抗人DMP1一抗(美国Santa Cruz公司,1∶100稀释)4℃过夜,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加50μl生物素标记的羊抗鼠二抗(福州迈新生物技术开发有限公司),37℃放置1 h,PBS冲洗3×5 min;除去PBS,每张玻片滴加50μl链霉素抗生物素过氧化物酶溶液,室温下孵育10 min,PBS冲洗3×5 min;除去PBS,每张玻片滴加一滴新鲜配制的二氨基联苯胺显色液,室温下显色2~10 min,在显微镜下控制染色时间;将染色液冲洗干净,干燥后中性树胶封片,将样品置于显微镜下观察。阴性对照组用PBS代替一抗进行反应。图像半定量分析:显微镜观察,每组随机取15个视野,Image-Pro Plus 6.0分析各视野下平均光密度值(average optical density,AOD)。AOD为阳性目标光密度和阳性面积比(IOD/area),代表待测抗原的量。
1.4 Transwell单层细胞模型系统检测HUVEC的通透性变化
HUVEC接种于基质胶(10μg/ml)包被的Costar Transwell单层细胞模型系统(孔径3μm),HUVEC生长在内皮细胞完全培养基,细胞密度是3×104个;HTNV感染transwell系统中的HUVEC 3 d后,细胞密度接近100%,长成均匀致密单层,HUVEC在内皮基础培养基中饥饿过夜;FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran,0.5 mg/ml)加入Transwell的上室,在相应组加入TNF-α(10 ng/ml),DMP1(100 nmol/L),一式3份。反应30 min后,从每个transwell的下室吸取100μl样品,样品中葡聚糖的含量在荧光酶标仪(490 nm处激发,530 nm处发射)中检测,以检测样本中的相对荧光强度来反映TNF-α,DMP1与HTNV对HUVEC通透性的影响。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism 5.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,免疫组织化学AOD值及transwell的相对荧光强度分别用单因素方差分析(one way-ANOVA),两两比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VERO细胞及原代脐静脉内皮细胞生长状态良好
(见图1)
2.2 HTNV感染的VERO和HUVEC鉴定及病毒滴度测定
HTNV感染72 h后几乎所有的VERO细胞均被感染,HUVEC在HTNV感染72 h后也被感染,阴性对照组均无荧光。Reed-Muench法测定病毒的TCID 50为6.31×106/ml。
2.3 DMP1在HUVEC的表达情况
免疫细胞化学检测显示DMP1可以表达在HUVEC;HTNV感染可以导致其表达的轻微上升;感染细胞加入TNF-α后DMP1的表达量显著升高(P=0.009);单独TNF-α刺激对DMP1的表达量无显著性影响,见图2和表1。
2.4 DMP1、TNF-α对HTNV感染的HUVEC的通透性影响
DMP1和TNF-α均可显著提高HTNV感染的HUVEC的通透性(见图3A,3B),且两者联合作用后,感染HUVEC的通透性进一步增加,与单独作用比较差异有统计学意义(见图3C,3D)。而DMP1,TNF-α单独作用对于通透性的影响明显低于HT-NV感染组(见图3A,3B)。如表2所示,HTNV单独作用并不能提高HUVEC的通透性。
A:生长良好的VERO细胞;B:原代脐静脉内皮细胞;C、D分别是其放大图
确定DMP1可以表达在HTNV感染的HUVEC后,笔者进一步检测DMP1和TNF-α对HTNV感染的HUVEC通透性的影响。结果显示,DMP1和TNF-α均可显著提高HTNV感染的HUVEC的通透性(P=0.000),且两者联合作用后感染HUVEC的通透性进一步增加,与单独作用比较差异有统计学意义(与HTNV+TNF-α组比较,P=0.002,与HT-NV+DMP1组比较,P=0.000)。而DMP1,TNF-α单独作用对于通透性的影响远远低于HTNV感染组分别为(P=0.033和0.000)。HTNV单独作用并不能提高HUVEC的通透性。见图3和表2。
A、B:1)与2)比较,差异无统计学意义;1)与3)比较,通透性显著增加,P<0.05;1)与4)比较;2)与4)比较;3)与4)比较,通透性显著增加,P<0.01;C、D:1)与2)比较,差异无统计学意义;1)与3)比较;1)与4)比较;2)与3)比较;2)与4)比较,均为通透性显著增加,P<0.01;3)与4)比较,通透性显著增加,P<0.01
3 讨论
HTNV的主要靶细胞是血管内皮细胞和单核巨噬细胞,在病毒侵入人体后不久,机体产生细胞和体液免疫应答,参与HFRS的发病过程。TNF-α是主要由单核巨噬细胞和血管内皮细胞等产生的一种调节机体免疫和代谢过程的多功能细胞因子,是机体免疫防御、炎症损伤和休克等发生的重要介质。TNF-α在体内维持一定浓度对机体发挥生理功能有重要作用,但血中浓度过高,则可能会对机体造成损害,已有研究证实,HFRS患者中的TNF-α的水平增高且与疾病进程密切相关[3]。HFRS基本的病理生理改变为全身微血管损伤,通透性增加,而TNF-α又可进一步增加血管的通透性。然而TNF-α引起通透性增高的具体机制鲜有报道。
DMP1是一种非胶原蛋白,近年来发现其表达十分广泛,在肾、脑、肿瘤组织等均有表达[8]。有研究证实,DMP1能通过激活其伴侣MMP9降解基底膜的IV胶原等成分,基底膜是一种特化的细胞外基质,是细胞间物质转移的物理屏障[9]。本文证实,DMP1可以表达在HTNV感染的血管内皮细胞,这说明DMP1可能在HFRS的发病中扮演一定角色。HTNV单独作用于HUVEC并不能引起通透性增高,病毒感染细胞加入TNF-α之后,DMP1的表达量显著增加。DMP1可以活化重组人基质金属蛋白酶前体-9并增强MMP-9酶解活性,通过破坏局部组织结构降解基底膜屏障,改建细胞外基质,使通透性增加[9]。故笔者推测在HFRS的发病过程中,TNF-α通过促进DMP1表达增加促使通透性增高。
进一步的实验证实,DMP1和TNF-α均可使体外HTNV感染的单层血管内皮细胞的通透性增加,且两者联合作用对通透性的增高作用明显高于各自独立作用,差异有统计学意义。TNF-α可以促进血管内皮钙黏蛋白VE-cadherin的磷酸化、内化,并可以促进血管内皮生长因子VEGF和MMP-9的表达[10]。血管内皮钙黏蛋白是内皮细胞间黏着连接的主要成分[11],钙黏蛋白的内化会导致黏着连接的解体,细胞间隙增大,这可能是TNF-α引起通透性增高的一方面原因。另一方面,TNF-α可以促进MMP-9的表达[10],而DMP1可以激活MMP-9,两者可能联合参与了降解基底膜的过程从而使通透性大大增加,实验结果中DMP1和TNF-α的共同作用使HTNV感染的HUVEC通透性增加明显,显著高于单独作用组,也支持这一推断。
综上所述,本文通过免疫细胞化学技术实验证明DMP1可以表达在HTNV感染的HUVEC,且进一步实验证明TNF-α和DMP1在可以促进HTNV感染的血管内皮细胞通透性增加,且两者存在联合作用,该结果为阐明TNF-α引起通透性增高的机制提供实验数据支持,MMP-9在HFRS中的直接作用将在接下来的实验中进行研究。
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