水溶性蛋白（精选8篇）
水溶性蛋白 篇1
鹿角托盘是雄性梅花鹿在每年的7—8月份,鹿茸被割下以后,自然生长出来的十分坚硬、形状不一,界于鹿茸骨化和未骨化之间的盘状物质[1]。临床应用和医书记载表明,鹿角托盘具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨等功效,用于阳痰遗精、腰脊冷痛、乳痈突起等[2,3,4]。到目前为止,对鹿角托盘的研究主要集中在矿物质、激素及氨基酸等小分子水平,对大分子蛋白质研究文献报道较少。本研究主要对鹿角托盘的水溶性蛋白成分进行提取分离和鉴定,为进一步研究鹿角托盘的药理和生物活性提供参考。
1 材料
鹿角托盘(吉林省东风药业有限公司);中空纤维膜滤柱(购于GE Healthcare);电泳槽DYCZ-24D和电泳仪DYY-8C(北京六一仪器厂);胰蛋白酶(购自Hyclone公司);BCA蛋白试剂盒(购自PIERCE公司);牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(AP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、溴酚蓝、TEMED和考马斯亮兰R250(均购于Sigma公司)。
2 实验方法
2.1 水溶性总蛋白浸提
称取鹿角托盘粉100g,用20mM Tris-HCl pH8.0(含0.1mol NaCl、1mmol EDTA、1 mmol PMSF)缓冲液于4℃浸提24h,10 000 r·min-1离心5min得上清液;沉淀用上述缓冲液反复浸提3次,合并上清液。
2.2 中空纤维膜过滤分离
选择膜孔径0.45μm,滤柱通道长度为60cm,纤维管内径0.75mm,剪切速率8 000~12 000·sec-1,在室温下对鹿角托盘总蛋白浸提液进行过滤澄清。再选择截留分子量为10KD的中空纤维柱在室温下对鹿角托盘总蛋白过滤澄清液进行分离,内液冻干即得鹿角托盘水溶性总蛋白。
2.3 蛋白纯度测定(BCA法)
2.3.1 标准曲线的绘制
按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。完全溶解蛋白标准品,取10μL稀释至100μL,使终浓度为0.5mg·mL-1。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,加用于稀释标准品的溶液补足到20μL。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30min。于562nm处测定吸光度值,绘制标准曲线。
2.3.2 测定蛋白纯度
称鹿角托盘水溶性总蛋白冻干品10mg溶于1mL蒸馏水,取总蛋白溶液20μL,加到96孔板中。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30 min。于562nm处测定吸光度值,根据标准曲线方程,计算出鹿角托盘水溶性蛋白纯度。
2.4 SDS-PAGE电泳[5]
采用分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,分离胶电压为70V,浓缩胶电压为140V。采用考马斯亮蓝R-250进行染色,最后用脱色液(甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1)脱色,至背景清楚。
2.5 胶内酶解
将电泳分离的主要蛋白带分别从脱色清晰的凝胶上切下,置于含50%乙腈、50mmol·L-1碳酸氢铵溶液100μL中浸泡20min,移去溶液,重复操作两次。再向其中加入100%乙腈100μL处理10min,移去乙腈,将其置于37℃烘箱中5~10min以确保完全干胶。向干胶中加入5~10μL浓度为12.5ng·μL-1的trypsin酶溶液,4℃冰箱中酶解约30min,取出后在37℃烘箱中酶解过夜。向酶液中加入50%乙腈、0.1%TFA 60μL作用30~40min,将溶液转移到新的96孔板内,重复2~3次得肽段溶液。将肽段溶液在N2流下吹干浓缩,完全干燥的肽段重新溶解于0.7μL0.5g·L-1CHCA溶液(0.1%TFA+50%ACN)中,并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上,室温下自然干燥,用于MAL-DI-TOF-MS鉴定。
2.6 MALDI-TOF-MS鉴定
样品用4700串联飞行时间质谱仪[4700 Proteomics Analyzer(TOF/TOFTM)(Applied Biosystems,USA)]进行质谱分析,激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器,加速电压为20kV,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。PMF质量扫描范围为700~3 500 Da,对强度最大的5个峰进行串级质谱分析,谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正,所得结果进行数据库检索。
3 结果
3.1 鹿角托盘水溶性总蛋白的收率
100g鹿角托盘粉末经中性缓冲液浸提和中空纤维膜过滤分离,得蛋白粗品8g,水溶性总蛋白收率为8%。
3.2 鹿角托盘水溶性蛋白纯度
使用PIERCE公司生产的BCA蛋白试剂盒测定纯度,测得蛋白纯度为86%。
3.3 SDS-PAGE电泳分析
如图1所示。
注:从左至右分别是:标准Marker(分子量从上而下依次为:97.4KD,66.2KD,43KD,31KD,20.1D,14.4KD);鹿角托盘水溶性总蛋白(a,b.c d.e为被鉴定出的蛋白带)。
从电泳结果可知,鹿角托盘中水溶性蛋白分子量主要分布在10~110 KD之间,主要包括蛋白分子量约为110KD、66KD、51KD、30KD、17KD、16KD、14KD、10KD蛋白带。从带上看,含量最高的是分子量为66KD的蛋白,其次是分子量为51KD、30KD、17KD的蛋白。
3.4 MALDI-TOF质谱分析
处理后样品经MALDI-TOF质谱分析和NCBI数据库检索,同时结合SDS-PAGE电泳中相应蛋白质的表观分子量和等电点等进行综合分析和鉴定,鉴定出5种蛋白质,分别为:β-3亚型血红蛋白;抗菌肽1;肽聚糖识别蛋白;β-c亚型血红蛋白;Pre-pro血清白蛋白。如表1所示。
4 讨论
已有研究表明鹿角托盘中除含有无机成分外,还含有大量蛋白质类有机物,因此建立一条快速、简单、高效的鹿角托盘水溶性总蛋白提取工艺显得尤为重要,本研究采用的提取分离工艺可获得较高的蛋白收率和纯度,这为鹿角托盘水溶性蛋白更深入的研究与开发奠定了基础。在鉴定出的5种蛋白中,β-3亚型血红蛋白、β-c亚型血红蛋白、Pre-pro血清白蛋白为动物血液中的主要蛋白,来源于鹿角托盘残存血液。另外两种蛋白:抗菌肽是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽,除了主要的抗菌活性外,它还具有抑制组织损伤,促进创伤修复,结合内毒素,诱导血管生成等多种生物学功能[6]。肽聚糖识别蛋白是一类可识别肽聚糖和含肽聚糖细菌的模式识别受体,机体通过有限的模式识别受体迅速识别大量不同的病原微生物,进行及时有效的初步防御[7],在天然免疫应答中发挥着重要的识别和调节功能。
抗菌肽1和肽聚糖识别蛋白在机体中的含量通常很低,而本研究表明它们在鹿角托盘中的含量很高,这可能与旧鹿角脱落,角基上大面积的骨组织暴露在外,机体为防御炎性感染,快速愈合伤口而大量表达有关,对它们进行更深入的研究可望开发具有抗炎、促组织愈合等功能的创新药物。
参考文献
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水溶性蛋白 篇2
低温打破龙牙百合休眠过程中可溶性蛋白的变化
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了龙牙百合低温解除休眠过程中所发生的可溶性蛋白表达的变化.结果表明:在低温贮藏的60 d里龙牙百合鳞茎盘中可溶性蛋白电泳所得的.条带无明显变化,而当休眠解除初期,鳞茎盘出现一条新带,一条带明显表达增强,另有一条带表达则有所减弱;鳞叶中的可溶性蛋白电泳出现相同的趋势,只是鳞叶蛋白电泳条带数比鳞茎盘中的少,低温贮藏期没有变化,萌发初期两条带表达增强,另外一条带则有所减弱.
作 者：管毕财 龚熹 郭琼 GUAN Bi-cai GONG Xi GUO Qiong 作者单位：南昌大学,生命科学学院,江西,南昌,330031 刊 名：南昌大学学报（理科版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NANCHANG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)：2006 30(5) 分类号：Q949.71 关键词：低温 龙牙百合 休眠 蛋白质水溶性蛋白 篇3
豆渣含有大量的营养物质, 碳源、氮源和矿物质含量丰富, 可作为微生物生长的基质[5]。Y.P.Zhu等人[6]用枯草芽孢杆菌B2发酵豆渣, 并对其抗氧化活性及肽含量进行测定分析, 发现发酵后的豆渣可作为功能性食品的原料用于食品工业中。黄晓东等人[7]采用米曲霉对豆渣进行固态发酵, 研究发现发酵豆渣提取物的抗氧化效果要比未发酵豆渣好。余永红等人[8]对面包串珠霉发酵豆渣的营养成分变化进行研究, 结果表明:通过发酵可以提高豆渣的营养和功能性成分, 改善加工特性。但这些研究集中在抗氧化活性、功能性成分的分析及膳食纤维的改性等, 还没有通过发酵法来提高豆渣水溶性蛋白含量, 进而提高其加工适用性的研究。
本研究以豆渣为原料, 通过接种本试验室诱变后的高活力、遗传稳定性强的米曲霉进行固态发酵, 对发酵豆渣中的水溶性蛋白进行初步研究, 旨在为豆渣的进一步加工利用提供一些理论帮助。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
豆渣, 国家大豆产业技术研发中心加工研究室。
米曲霉沪酿3.042, 吉林农业大学食品生物反应器与功能性食品研究室。
Mg SO4、KH2PO4、 (NH4) 2SO4、琼脂、Fe SO4·7H2O、Na Cl、Zn Cl2、Ca Cl2和K2HPO4等均为分析纯, 天津市化学试剂三厂;琼脂 (RT) , 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2 试验仪器和设备
SW-CJ-1F超净工作台, 苏州安泰空气技术有限公司;DHP120恒温培养箱, 上海试验仪器厂有限公司;LDZX-50KBS立式电热压力蒸气锅、BL-20B-Ⅱ离心机, 上海安亭科学仪器厂;78HW-1磁力搅拌器, 杭州仪表电机有限公司;infinitie M200酶标仪Nano Quant等。
1.3 培养基
豆汁培养基:豆汁1 000m L, 硫酸镁0.5g, 可溶性淀粉20g, 磷酸二氢钾1g, 硫酸铵0.5g, 琼脂20~25g (视季节而定) , p H值6左右, 高压蒸汽灭菌 (121℃, 20min) 。
发酵培养基:粉碎后过60目的干豆渣加入适量的水, 取10g装入100m L三角瓶中, 高压蒸汽灭菌 (121℃, 20min) 。
1.4 豆渣发酵工艺流程
原料豆渣→前处理→灭菌 (121℃, 20min) →冷却至室温→接种→拌匀→发酵→灭菌 (121℃, 20min) →冷却→烘干→粉碎→成品
1.5 指标测定
1.5.1 水溶性蛋白质含量测定
采用双缩脲法[9]。
水溶性蛋白质提取工艺:将1g样品中加入50m L的磷酸盐缓冲液 (p H值7.0, 0.05 mol/L) , 25℃、150r/min下恒温振荡1h, 在转速为3 000r/min下, 将悬浮液离心20min, 取上清液, 测定水溶性蛋白质含量。
1.6 豆渣发酵条件的单因素试验
以水溶性蛋白质含量为指标, 研究豆渣水分含量分别为45%、55%、65%、75%和85%;接种量分别为2%、4%、6%、8%和10%;温度分别为26、28、30、32、34、36、38和40℃;发酵时间分别为12、16、20、24、28和32h的条件下, 米曲霉发酵对豆渣水溶性蛋白质含量的影响。
1.7 豆渣发酵最佳条件的确定
通过单因素试验得到豆渣的水分含量、接种量、温度和时间对豆渣发酵效果的影响, 为进一步优化发酵条件, 拟通过L9 (34) 正交试验来确定最佳发酵条件, 以水溶性蛋白质含量为指标, 确定豆渣最佳发酵工艺参数。
2 结果与分析
2.1 单因素对豆渣水溶性蛋白含量的影响
2.1.1 豆渣初始含水量对发酵豆渣水溶性蛋白含量的影响
水分是影响发酵的主要因素, 底物含水量的变化对微生物的生长及代谢能力会产生重要的影响[10~11]。由图1可知:水溶性蛋白含量随豆渣水分含量的变化而变化, 当豆渣含水量等于75%时, 豆渣的水溶性蛋白含量达到最高值, 可达7.59%;当豆渣含水量超过75%时, 水溶性蛋白含量呈下降趋势。可能原因是由于水分含量过大影响了蛋白酶的活力。
2.1.2 不同接种量对发酵豆渣水溶性蛋白含量的影响
由图2可知:随着米曲霉接种量的增加, 发酵豆渣的水溶性蛋白含量逐步增加, 当接种量为6%左右时, 发酵豆渣的水溶性蛋白含量达到13.22%, 接种量超过6%时, 豆渣的水溶性蛋白含量呈下降趋势。产生这种现象的原因可能是由于过大的接种量使米曲霉生长速度加快而消耗大量的营养物质。因此, 豆渣中的水溶性蛋白含量呈现下降趋势。
2.1.3 不同温度对发酵豆渣水溶性蛋白含量的影响
微生物生长需要适宜的温度, 它关系到菌体对营养物质的吸收利用, 对细胞内酶的生成和活性产生直接影响[12]。由图3可知:随着温度的增加, 水溶性蛋白含量也不断增加, 当温度为30℃时, 水溶性蛋白含量达到最大值16.11%, 继续增加温度, 水溶性蛋白含量反而减少。
2.1.4 发酵时间对发酵豆渣水溶性蛋白含量的影响
由图4可知:随发酵时间的增加, 豆渣的水溶性蛋白的含量不断增加, 但是由于发酵22h之后, 豆渣有不愉快的气味, 颜色呈棕褐色;而且随着发酵时间的延长, 菌体会发生自溶现象。综合考虑, 发酵时间确定为22h。
2.2 豆渣发酵条件优化
为进一步优化发酵条件, 拟通过L9 (34) 正交试验来确定最佳作用条件, 以水溶性蛋白含量为指标, 确定豆渣最佳发酵工艺参数, 结果见表1。
采用直观分析, 对各因素的K值和R值 (极差) 的大小进行分析, 根据正交试验结果的分析, 可以得出如下结果:
极差值越大, 反映该因素对指标值的影响越大, 由极差分析可得影响发酵效果的主次关系为:A>B>C>D, 说明在米曲霉发酵豆渣过程中, 影响水溶性蛋白含量的主要因素是水分, 其他因素影响顺序依次是接种量、温度和时间。根据表中各因素的K值大小可以确定各因素的较优水平组合是A2B3C1D2, 正交试验中有该方案, 即米曲霉发酵豆渣最佳的工艺参数:水分为75%、接种量为7%、温度为28℃和时间为20h, 其水溶性蛋白含量为17.876%。
2.3 发酵前后豆渣感官评价
豆渣经发酵后, 其色泽、气味和组织状态均发生一定变化, 对优化发酵条件后的豆渣与未发酵豆渣进行烘干、粉碎, 进行感官评价。结果如表2、图5和图6所示。
3 讨论
米曲霉因其蛋白酶活力高、生长快、适应性强、安全无毒等优点, 广泛用于酿造业。通过对米曲霉发酵提高豆渣水溶性蛋白含量的工艺优化可知, 在发酵的过程中, 豆渣水分含量是影响其水溶性蛋白含量的重要因素, 所以我们应严格控制豆渣的水分含量, 这样才能保证米曲霉的蛋白酶活力。同时, 还应准确掌握米曲霉的接种量和发酵时间。
豆渣在米曲霉所分泌的蛋白酶作用下, 部分水溶性蛋白转变成水溶性蛋白, 同时发酵豆渣中菌体蛋白的增加, 可总体提高豆渣中的水溶性蛋白含量, 有效解决了豆渣蛋白溶出率与利用率低的问题。同时, 米曲霉发酵豆渣后, 感官特征得到明显改善, 具有特殊香气、口感细腻。这些为促进豆渣的深加工与综合利用, 实现产业化提供了理论支持。
参考文献
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水溶性蛋白 篇4
食品废水中回收蛋白质的方法一般有絮凝法、等电点沉淀法[2]、膜分离法[3]及电阻加热法[4]。絮凝法分为无机类和有机类2大类,无机类的氯化铝和氯化铁系列,虽然蛋白质的回收率高,但因为铝(Al)和铁(Fe)等元素的存在,使得回收蛋白的再利用很难实现;有机类中如聚丙烯胺系列由于合成聚合物中的残留单体有毒,限制了合成高分子絮凝剂在回收蛋白再利用方面的应用[5]。而天然有机高分子絮凝剂具有原料来源广泛、价格低廉、无毒无害、无二次污染及易于生物降解等特点[6]。用此类絮凝剂处理蛋白废水不会引入有毒物质,絮凝物富含蛋白质,无毒无害,经进一步处理可作为动物饲料或食品添加剂。近年来国内外陆续报道了用壳聚糖作为高效絮凝剂在处理粉丝废水[7]、回收大豆蛋白[8]、渔业废水[9]、味精废水[10]、活性污泥絮凝沉降[11]、鱼糜漂洗水[12,13]及甲壳质生产废水[14]中的显著效果。因此,该试验用壳聚糖絮凝法对鱼糜漂洗水中的水溶性蛋白质进行回收研究。
1 材料与方法
1.1 材料
鱼肉由深沪富鸿水产有限公司提供。鱼糜漂洗水是用鱼肉5倍的、经冷却至8～10 ℃的自来水循环漂洗3次,于200目滤布过滤,滤液置于冰箱,冷冻保藏备用,其漂洗工艺流程如下:
1.2 试剂
盐酸和氢氧化钠均配成10 mol·L-1的溶液备用。壳聚糖的脱乙酰度达88%,黏度为0.5 Pa·s。用1%的乙酸配成1%的溶液备用。
1.3 仪器
磁力搅拌器(金坛市恒丰仪器厂出品),恒温电热水浴锅(国华电器有限公司出品),离心机(飞鸽牌,4 000 r·min-1),pH-510型酸度计(Eutech Instruments)以及漩涡振荡器(Jim-X Scientific Instruments)。
1.4 测定方法
1.4.1 pH 用pH-510型酸度计测定体系中的pH。
1.4.2 蛋白质质量浓度 采用双缩脲法用UV-2100型分光光度计在540 nm处比色测定[15]。
1.4.3 蛋白质回收率
1.4.4 COD的测定 按照重铬酸钾法[16]测定COD。
1.4.5 COD去除率
COD去除率undefined
1.4.6 透光率 透光率用UV-2100型分光光度计在600 nm处测定,用去离子水作为对照[17]。
1.5 试验方法
1.5.1 蛋白质回收工艺
取40 mL已知质量浓度(9.0 mg·mL-1)的漂洗水于100 mL烧杯中,在一定温度下用10 mol·L-1的盐酸或氢氧化钠调pH至定值,加入定量的1%壳聚糖絮凝剂,在磁力搅拌器上搅拌5 min后再静置30 min。置于离心管中,在4 000 r·min-1离心5 min。测定上清液中的蛋白质质量浓度、透光率和COD。计算蛋白质回收率和COD去除率。
1.5.2 蛋白质标准曲线的绘制
将牛血清白蛋白配制成10 mg·mL-1的标准溶液。分别取蛋白质标准溶液(10 mg·mL -1)0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于试管中,不足1 mL则用蒸馏水补齐至1.0 mL,然后各试管均加入4.0 mL双缩脲试剂,在漩涡震荡器上混匀,室温下反应30 min。以空白管调零,用UV-2100型分光光度计在540 nm波长,杯径1.0 cm条件下测定吸光值(OD)。以蛋白质质量浓度为横坐标,以OD为纵坐标作标准曲线[15]。
1.5.3 壳聚糖絮凝条件的优化
1)体系的pH对回收效果的影响。设6组试验,pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。每组均添加壳聚糖絮凝剂1.0 mL,温度均设为20 ℃。按1.5.1的回收工艺进行。2)壳聚糖絮凝剂的加入量对回收效果的影响。设6组试验,每组分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL壳聚糖絮凝剂,pH调至8.0,温度均设20 ℃。按1.5.1的回收工艺进行。3)体系的温度对回收效果的影响。设5组试验,温度分别设10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃,pH调至8.0,每组均加入1.0 mL壳聚糖絮凝剂。按1.5.1的回收工艺进行。4)壳聚糖絮凝剂的正交试验。设pH、温度和壳聚糖添加量3个因素,以蛋白质回收率、透光率和COD去除率为指标,选用正交表L9(34)(表1)。
2 结果与分析
2.1 蛋白质标准曲线
蛋白质的标准曲线见图1,回归方程为y=0.047 3x+0.000 8,R2=0.999 8,表明蛋白质质量浓度在0～10 mg·mL-1范围内与吸收浓度线性关系良好,后续试验中检测蛋白质质量浓度根据此标准曲线计算。
2.2 鱼糜漂洗水指标分析
蛋白质回收前鱼糜漂洗水溶液的pH为 6.5,ρ(COD)为10 368.56 mg·L-1,ρ(水溶性蛋白质)为9.0 mg·mL-1。
2.3 壳聚糖絮凝条件的优化
2.3.1 pH对回收效果的影响
随着pH的上升,回收率逐渐增加,当体系的pH为8.0左右时,回收率达到最大(69.42%)。此后,随着pH的继续上升回收率反而减小(图2)。同时,COD去除率最大(43.33%)。pH继续上升时COD去除率变小,选择pH 7.0～9.0作为正交试验的因素水平。由上述分析可知,壳聚糖回收蛋白质宜在弱碱性条件下进行,这是由于在弱碱性条件下其絮凝沉淀的速度缓慢,可大量吸附漂洗水中的水溶性蛋白质;而当碱性过强时壳聚糖絮凝速度过快,来不及大量吸附漂洗水中的水溶性蛋白质就沉淀,故回收率偏低。
2.3.2 壳聚糖的添加量对回收效果的影响
随着壳聚糖添加量的逐渐增加,蛋白质回收率也随之增加(图3)。壳聚糖添加量为1.5 mL左右时蛋白质回收率达到最大(70.82%),继续添加则回收率逐渐减小。这是因为过量的壳聚糖阻碍了壳聚糖与蛋白质之间的絮凝。同时,壳聚糖添加量在1.5 mL左右时COD去除率最大(45.55%)。故选择壳聚糖添加量0.5～1.5 mL作为正交试验的因素水平。
2.3.3 温度对回收效果的影响
温度从20 ℃升高到30 ℃的过程中蛋白质回收率的增幅较大,继续升温时蛋白质回收率的增幅变小(图4)。从高回收率和节约能源两方面考虑,选择温度25～35 ℃作为正交试验的因素水平。温度从20 ℃升高到40 ℃的过程中COD去除率的增幅较大,温度超过40 ℃以后COD去除率的增幅变小。
2.3.4 壳聚糖正交试验结果
壳聚糖絮凝剂回收鱼糜漂洗水中蛋白质的正交试验方案及结果见表2。由蛋白质回收率的极差分析可以看出,影响蛋白质回收率的各因素主次顺序为A(pH)>C(壳聚糖添加量)>B(温度)。方差分析可知,pH对蛋白质回收率的影响极显著;壳聚糖添加量对回收率的影响显著;温度对回收率的影响不显著(表3)。根据表2中回收率的K分析得到的优化组合为A2B3C3,即pH 8.0,温度35 ℃,壳聚糖的添加量1.5 mL。
注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00,后表同此
Note:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00,the same case in the following tables.
从透光率的极差分析(表4)中可以看出,影响透光率的各因素主次顺序为A(pH)>C(壳聚糖添加量)>B(温度)。从方差分析可知,pH和壳聚糖添加量对透光率的影响显著;温度对透光率的影响不显著。根据表2中透光率的K分析得到的优化组合为A2B3C3,即pH 8.0,温度35 ℃,壳聚糖的添加量1.5 mL。
由COD去除率的极差分析(表5)可以看出,影响COD去除率的各因素主次顺序为A(pH)>C(壳聚糖添加量)>B(温度)。从方差分析可知,pH对COD去除率的影响显著;壳聚糖的添加量和温度对COD去除率的影响均不显著。根据表2中COD去除率的K分析得到的优化组合为A2B3C3,即pH 8.0,回收温度35 ℃,壳聚糖的添加量1.5 mL。
综合以上分析,壳聚糖从鱼糜漂洗水中回收水溶性蛋白质的最佳工艺条件为pH 8.0,温度35 ℃,壳聚糖絮凝剂的添加量1.5 mL。在该工艺条件下
进行验证试验,得出蛋白质回收率73.17%,透光率87.50%,COD去除率47.20%的结果。
3 小结
壳聚糖由甲壳质脱乙酰基而得到。壳聚糖分子中含有高浓度的游离氨基酸和羟基基团,而这些基团可以参与其他物质的化学反应,如蛋白质及氨基酸等[18]。这是由于在水溶液中壳聚糖的游离氨基酸发生质子化反应,使得整个壳聚糖分子带有正电荷,因此,很容易与其他带电荷物质通过离子交换作用和疏水作用发生相互作用,从而使溶液中的离子凝聚成大的凝聚体而沉降[19]。该试验正是利用了壳聚糖的这种性质来回收鱼糜漂洗水中的水溶性蛋白质,为寻找新的蛋白质饲料资源、缓解蛋白质资源短缺提供一条有效途径。
水溶性蛋白 篇5
水溶小麦蛋白是酒精生产企业开发深加工产品新产品，它是以湿面筋(图1)为原料，经过预处理、酶水解和干燥得到粉末产品(图2)。水溶小麦蛋白具有良好的水溶性、乳化性和分散性等特性，与大豆蛋白相比有着价格低、无豆腥味且有天然谷物香味等优点，是理想的蛋白添加剂，广泛用于面制品、肉制品及乳制品等领域，经济价值高，是新兴的蛋白添加剂。
在用湿面筋生产水解小麦蛋白时，需要用碱液将湿面筋进行预处理，然后与酶反应而制成。工艺流程如图3.
小麦面筋蛋白具有较好的黏性和弹性，成胶状，不易与碱液均匀混合，面筋蛋白水解度低，达不到水解蛋白标准要求。
为了能够达到混匀目的，需要利用胶体磨对面筋进行高速破碎，在破碎的过程中加入碱液，使其均匀混合。但该方法使用起来存在较多弊端，一方面胶体磨阻力太大，运行不平稳，容易超负荷运行，造成设备损坏，为了使其平稳运行，需要人工去控制进料量，且处理量非常有限，混合效果也不理想。
前期的解决方案是根据湿面筋的特性，让湿面筋和碱液以一定的比例先通过一个多孔板，然后再通过一个弯曲的时而交汇时而分开的管道进行混合，混合后的物料再经过一个间隙较大的均质装置进行搅拌均质。该方案解决了仅利用均质机的种种弊端，混合效果较好，处理量明显增加，能耗下降，但有时还会遇到一些细小的无法搅拌均匀的湿面筋颗粒，降低了湿面筋水解率，影响终产品的水解度。为了达到较好的混合效果，需要加大碱液的添加量，但这又造成终产品的灰分超标，见下页图4。
问题分析
造成混合效果不理想的主要原因有物理和化学两个方面，化学方面是湿面筋在碱性水溶液中的溶解度较小，无法通过化学方法实现均匀混合;物理方面是两种物质的物理状态差异较大，湿面筋是一种胶状的物质，具有较强的黏性和弹性，难以通过简单的方法将其破碎或搅拌开，即使将面筋团分开，当两块相遇后，还会黏连为一块，碱液是均匀的溶液，面筋与碱液混匀就比较困难。
原有的技术方案已经注意到了这个问题，但解决问题不彻底，故而存在混合效果不理想和灰分超标的问题。
运用TRIZ理论进行分析
TRIZ是“发明问题解决理论”的俄文简称，它是前苏联G.S.Ahshuller及其同事们在分析研究了世界上近250万件高水平发明专利，综合多个学科领域原理、法则的基础上提出的创新方法理论体系。
G.S.Ahshuller通过对上百万件发明专利的分析研究，抽出了40个发明创造所遵循的原理，它们成为TRIZ解决技术矛盾的关键。这些原理是分割、组合、嵌套、部分改变、动作预置、自助机能等。这40个原理本身较为抽象，作为解决具体技术和矛盾对立的指导方针，还需要进一步转化为具体的解决对策。同时还抽象出了产生系统矛盾对立的典型技术特性39项，这些典型技术特性是速度、形状、强度、温度、可靠性、制造性等。他们还发现虽然技术系统和发明创造问题涉及方方面面，但典型的系统矛盾对立只有大约1 250个左右，而且这些典型的系统对立均可用40个发明创造原理中的方法来解决。
根据本问题的特点，运用TRIZ理论中的发明原理来解决上述问题，发明原理的运用程序是：分析问题，提取技术参数，运用技术矛盾矩阵表查找发明原理，再根据发明原理提出技术方案。
第一步：问题分析和技术参数的提取
面筋和碱水的互溶问题, 我们希望的理想结果是混合得越均匀越好, 混合得越均匀, 就意味着单个面筋的体积越小, 则面筋的表面积越大, 我们的目标是希望面筋的表面积变大, 根据TRIZ技术参数的规定, 我们希望改善的参数是静止物体的面积。
但是如果通过一些办法将面筋的表面积变得很大，我们需要用一定的力量多次对面筋施加作用，那么恶化的技术参数就是力。结果如下：
改善参数：静止物体的面积
恶化参数：力
第二步：发明问题确定
改善参数(6、静止物体的面积)和恶化参数(10、力)之间构成了一对技术冲突，查找冲突矩阵找出创新原理，创新原理有：(18)振动，(35)参数变化，(36)状态变化。
原理18、35、36不适用，确定利用(1)分割原理。
第三步：初步解决方案
分割原理是指这样一种过程, 其以虚拟方式或实物方式将一个系统分成若干部分, 以便抽取或合并一种有益的或有害的系统属性。在多数情况下, 可对各部分进行重组 (合并) , 以执行某些新的功能, 并 (或) 消除某一问题。它包括几个方面 (1) 将一个物体分成相互独立的部分; (2) 使物体分成容易组装及拆卸的部分; (3) 增加物体相互独立部分的程度。
在本案中考虑使用第(3)增加物体相互独立部分的程度。即降低添加碱液的用量，使初次混合后的物料通过一个更细的多孔板进行分割，使面筋颗粒再进一步缩小，使其与碱液的接触面尽可能变大见图5。
第四步最终问题解决方案
利用多道混合作用，最终达到混合目的，既控制了碱液的用量，又使产品的水解度达到了要求，且灰分不超标。
即让湿面筋和碱液以一定的比例先通过一个多孔板，然后再通过一个弯曲的时而交汇时而分开的管道进行混合，混合后的物料再经过一个孔径更细的多孔板，然后再通过一个时而交汇时而分开的管道进行混合，使面筋颗粒再进一步缩小，最后利用机械力的搅拌作用，让其通过一个间隙较小均质机进行充分均质混合，见图6。
结论
水溶性蛋白 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
供试西瓜品种为黑美人和黄小玉, 选取若干饱满及形态相同的西瓜种子, 用0.2%的K2MnO4灭菌10~15min, 然后用蒸馏水冲洗干净, 放入温水中浸种8h, 28℃催芽至露白期。选取露白一致的种子播于水培盆中, 人工气候室内35℃左右Hoagland营养液中培养, 定期补充Hoagland营养液和水分, 待长至三叶一心期进行试验处理。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
从所栽培的西瓜幼苗中选出长势相似的9盘样本苗, 随机分成3组, 每组3盘, 均置于Hoagland培养液中 (35℃, 光照3 000lx, 12h·d-1) , 其间定期补充Hoagland营养液和水分。试验设A (对照) 、B (单一盐胁迫处理) 、C (交叉胁迫处理) 3个处理, 即先往C组的西瓜幼苗培养液中加入PEG6000溶液进行模拟干旱处理, 保持培养条件保持不变, 培养3d。将干旱处理后的C组幼苗置于初始条件下, 恢复培养3d。将B和经过恢复处理的C组西瓜幼苗同时置于0.1mol·L-1 NaCl溶液中进行模拟盐胁迫处理, 培养3d后取样, 测定样本苗叶中的相关指标。将A组幼苗始终置于初始条件下, 将测定样本苗叶片中的相关指标。
1.2.2 测定指标及方法
可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[5], 可溶性糖含量用蒽酮乙酸乙酯法测定[6], 数据分析用WPS2000软件。
2 结果与分析
2.1 可溶性蛋白质的变化
通过标准曲线可得两种西瓜幼苗在单一胁迫及交叉胁迫适应中可溶性蛋白的变化 (见图1) 。
从图2中可以看出, 2个品种的西瓜幼苗在受到单一盐胁迫时, 与正常生长的对照苗相比, 可溶性蛋白质含量均呈下降趋势。其中黑美人西瓜幼苗可溶性蛋白质含量下降23.30%, 黄小玉西瓜苗可溶性蛋白质含量下降18.23%。这种变化表明在单一盐胁迫下, 抗盐性强的西瓜品种具有较高的可溶性蛋白质含量;另外在交叉胁迫下, 两种西瓜幼苗的可溶性蛋白质含量也均下降, 其中黑美人下降18.00%, 黄小玉下降15.54%。在两种胁迫下, 两种西瓜幼苗都受到不同程度的伤害。从图4中还可以看出, 经干旱预处理的水稻幼苗可溶性蛋白质含量下降幅度有所降低, 因此, 可初步表明经过干-盐交叉逆境胁迫的水稻幼苗比经过单一盐胁迫的幼苗的耐盐性强。
2.2 可溶性糖的变化
通过标准曲线可得2种西瓜幼苗在单一胁迫及交叉胁迫适应中可溶性糖的变化 (见图3) 。
从图4可以看出, 不同品种的西瓜幼苗经单一盐胁迫处理后, 可溶性糖含量均有一定程度的上升, 其中黑美人上升了50.36%, 黄小玉上升了38.11%;经过干旱-盐交叉逆境处理后, 两种西瓜幼苗的可溶性糖含量也有所上升, 其中黑美人上升了82.01%, 黄小玉上升了46.79%。由此可见, 干旱预处理增强了两种西瓜幼苗的耐盐性。
3 结论与讨论
在单一盐处理条件下, 2种西瓜幼苗蛋白质含量均显著减少, 可溶性糖含量显著增加;而经过干旱-盐处理的西瓜幼苗蛋白质含量减少量降低, 可溶性糖含量增加量升高, 因此, 干旱处理提高了西瓜幼苗的耐盐性。而且耐盐性强的黑美人比黄小玉的变化趋势更明显。
目前现有的资料表明蛋白磷酸化和去磷酸化显著影响细胞的基因表达和生理代谢, 在真核细胞中, 促分裂原激活蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases, MAPKs) 级联参与细胞分化、增殖、伸长、死亡及对各种逆境的响应等几乎所有的细胞活动过程。植物对各种生物逆境或非生物逆境的响应也离不开MAPK级联反应。交叉胁迫在不同时间, 以不同方式抑制了植物的正常生长发育, 因此, 体内蛋白质含量较正常植株明显下降。国内外的研究表明, 由于植物长期处在变化的自然环境中, 常常会遭受干旱、高温、低温、土壤盐碱化和矿质元素过多或过少等各种逆境, 任何一种逆境都会影响或干扰植物的正常生理过程[7]。而且植物在受到各种逆境对自身的危害时往往体现出关联性, 同时, 植物响应各种逆境的过程也是相互联系的。因此, 植物在先后遭受到几种胁迫时都能表现出抗逆性与植物的交叉适应相关[8]。当植物受到逆境胁迫后, 自身会合成一系列的功能蛋白来减轻对其造成的伤害, 表明逆境条件使植物基因表达发生了改变, 一些正常表达的基因被关闭, 而一些与适应性有关的基因被启动, 这说明在适宜的条件下, 植物细胞自身具有调节逆境适应性表达的能力, 而这些适应性表达同时能提高植物对逆境的抵抗能力[9]。如对小麦[10]进行冷锻炼后, 其耐热性有明显提高。干旱预处理也可增强玉米[11]幼苗的耐冷性和海滨锦葵[12]叶片的耐盐性。因此人们认为植物体内可能存在着一种相同的生理机制, 而植物正是由于这种共同的机理, 使得植物能对各种不同的逆境适应。西瓜可能也存在一种对不同胁迫 (甚至明显不相关) 抗性的发展的共同机制。
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水溶性蛋白 篇7
为了能够进行后续的结构功能研究,所获得的重组蛋白则必须满足可溶性,稳定性,正确的折叠,以及生物活性等要求。然而,在实际的研究中,这些往往成为获得一个理想重组蛋白的障碍。当一个重组蛋白被宿主表达出来以后,其可溶性就成为首要解决的问题。因此,许多的融合标签被引入。目前,对促溶标签应用进行系统总结的相关综述还很少,中文文献更是少见。本文对一些常用的促溶标签的特点和应用中的进展和问题进行综述,以期对我们研究应用实践中遇到的重组蛋白溶解性问题有所帮助。
1 常用促溶标签应用特点
1.1 麦芽糖结合蛋白
1.1.1 来源
麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)是大肠杆菌K12品系中的一个自有蛋白,由malE基因编码,分子量为42 kDa,属于大肠杆菌吸收和分解麦芽糖通路中的一员。
1.1.2 应用特点
MBP标签最出色的特点是它强大的促溶能力。主要表现在两方面:促溶范围广,促溶效率高。
(i)在对不同目的蛋白促溶表达时,MBP标签能够有促溶作用的个数要多于其它参比标签。例如,在大肠杆菌系统重组表达95个哺乳动物蛋白的研究中,MBP标签能对其中的63个产生促溶效果[1]。
(ii)MBP标签的促溶效率也很好,即可溶的重组蛋白占总重组蛋白百分率高。如在重组表达人源蛋白flotillin-2 (reggie-1)时,融合MBP标签后,可溶性组分达到93.7%[2]。
MBP标签得到广泛应用的另一重要原因在于,能够通过该标签与直链淀粉特异性结合并在10mmol/L麦芽糖非变性条件下洗脱,从而实现单级纯化。此外,将MBP融合在N端或者C端都具有促溶解作用。目前,已经有商业化的MBP融合标签载体(pMAL series, New England Biolabs; pIVEX, Roche)来适应研究需要。
1.2 谷胱甘肽巯基转移酶
1.2.1 来源
谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST),最初发现于日本血吸虫(Schistosoma japonicum)蛋白大小为26 kDa,是一个常用的可溶性亲和纯化标签。
1.2.2 应用特点
GST最突出的优点是它能够与固定的谷胱甘肽产生亲和力,在含10mmol/L还原型谷胱甘肽的非变性条件下洗脱,最终达到亲和纯化的目的。GST作为促溶标签,有一定的促溶效果,并且可以通过优化诱导条件以及裂解纯化溶液体系来提高其溶解度[3]。GST标签对重组蛋白还具有另一个有利作用,即减少在宿主细胞内的降解,增加蛋白稳定性[4]。目前,GE Healthcare已经有pGEX系列GST表达载体面市。有报导指出,GST的促溶效果并不十分明显[2,5]。
1.3 硫氧还蛋白A
1.3.1 来源
硫氧还蛋白(Thioredoxins)是一系列广泛存在于生物体中的氧化还原酶,它能通过置换硫代二硫化物来减少二硫键的结合。常用作融合表达标签的硫氧还蛋白A(Thioredoxin A,TrxA)分子量大小为11.6 kDa,来源于大肠杆菌。
1.3.2 应用特点
TrxA标签最独特的优点是它的热稳定性。TrxA本身不作为亲和标签来进行重组蛋白纯化,而是通过在高温条件下将杂蛋白变性去除而重组蛋白得以保存这一方法,进行简单快速的纯化[6,7]。
TrxA也具有极好的促溶效率,用作促溶标签融合表达时可将重组蛋白的可溶性组分比例从12.1%提高至95.3%[2]。Trx在与人源重组蛋白融合表达时,目的蛋白也能有很好的生物活性[8,9]。
1.4 小泛素样修饰蛋白
1.4.1 来源
小泛素样蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)在真核生物中极为普遍地存在,而原核生物中未曾发现;在不同物种中编码的基因有所差异[10,11]但有着相同的蛋白三维结构[12]。常用作融合标签的SUMO来源于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Smt3),分子量为11.5kDa。
1.4.2 应用特点
SUMO标签最大的特点是能够被SUMO蛋白酶特异地识别并高效地降解,使得后续标签移除过程准确高效[13,14,15]。SUMO标签在细菌中进行融合表达有比较成功的应用,不仅能加强重组的蛋白的可溶性,也能提高其表达量[16,17,18]。
由于真核细胞存在内源性的SUMO蛋白酶,所以野生型的SUMO标签不能在真核表达体系中应用。LifeSensors公司已经开发了工程改造过的SUMO标签及其配套的特异性蛋白酶,使得SUMO标签可以适用于酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等真核表达体系。
1.5 NusA标签
1.5.1 来源
NusA蛋白(N-utilization substance A)是大肠杆菌中一类转录延长的抗终止因子,分子量大小为55kDa。
1.5.2 应用特点
由于NusA有着促进DNA转录和减缓翻译的生物活性,这使表达出来的蛋白有更多的时间进行折叠。它能够让重组蛋白得到稳定和有活性的表达[19],即使不移除NusA标签,融合蛋白依旧能够存在活性[20,21]。所以,在同其它促溶标签比较时,NusA也是有自己的优势[22,23]。目前Merck Millipore的pET NusA Fusion System已经在市场上得到应用。
1.6 其它促溶标签
有很多促溶标签因其自身特有的性质,常被用于有某种特定性质的目的蛋白融合表达。例如,来源于大肠杆菌的Ⅰ型蛋白质二硫键异构酶DsbA具有高度的亲水性,能够促进蛋白的可溶性表达。而且由于DsbA可以利用它具有的信号肽从细胞质向细胞周质间隙运输,所以可以利用这一标签来进行分泌表达[24]。砷酸盐氧化还原酶(arsenate reductase,ArsC)可以促进有聚集倾向的外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达[25]。
2 促溶标签新的研究进展和应用
2.1 串联标签的使用
2.1.1 便于亲和纯化
TrxA、SUMO、NusA等这些促溶标签本身不能用来进行亲和纯化,所以需要添加其它的亲和标签来对融合蛋白进行纯化。最常见的亲和标签为多聚组氨酸标签(His-tag),如常用的pET32系列载体(Merck Millipore)即是将Trx标签和His联用。而MBP标签虽然本身可以亲和纯化,但当它同目的蛋白融合表达时会导致与直链淀粉结合率降低,最后使得纯化效率下降。因此可以将MBP标签与His标签联用[26]。
2.1.2 便于标签蛋白的去除
当得到高纯度的重组蛋白后,需要将融合的标签蛋白去除,最终获得目的蛋白进行后续的结构和功能研究。常见的做法是在在标签蛋白与目的蛋白之间加入一些特定序列的多肽来作为标签移除蛋白酶的识别位点。如肠激酶(enterokinase)、Xa因子(factor Xa)、烟草蚀刻病毒酶(tobacco etch virus,TEV)以及凝血酶(thrombin)等。这些切除酶将表情蛋白切除后,会在目的蛋白与标签蛋白连接端留下氨基酸残基,对目的蛋白存在影响。而SUMO标签的蛋白酶能够特异地识别SUMO的三级结构并在SUMO的C端Gly-Gly序列后进行切除。通过这一方法,就能获得具有天然N端的目的蛋白。有研究者[27]将Trx和SUMO联用,从培养的每升大肠杆菌中纯化出2.4mg具有天然N端的人源抗菌多肽LL-37。
2.1.3 其它种类标签联用
不同的标签之间组合联用能够产生不同的效果,这需要根据研究的需求和目的蛋白的特性来进行灵活组合。有研究者利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光特性,将荧光标签GFP和促溶标签MBP以及亲和纯化标签His三级串联,用于表达肝素酶Ⅰ(heparinase Ⅰ,HepA)[28]。该方法不仅能够获得高纯度的可溶性HepA,而且可以对目的蛋白生产过程中的生物活性实时监控。
2.2 促进膜蛋白可溶性表达
膜蛋白因其存在于脂质的生物膜上,具有疏水性的特点。而且重组表达时容易出现低表达和错误折叠等情况。所以膜蛋白的重组表达也有许多困难。目前重组表达膜蛋白的方法有体外表达的试剂盒(MembraneMax Protein Expression Kits,invitrogen)和新的表达宿主[29]等。这些方法可能存在费用高,技术不成熟等缺点,不如经典的表达系统简单实用。因此,我们可以利用已有体系,在需要表达的膜蛋白上融合促溶标签,以得到可溶的重组蛋白。有研究人员为了评估MBP标签对膜蛋白可溶性表达的促进作用,给42个在大肠杆菌中低表达或者不表达的膜蛋白加上MBP标签,其中29个得到可溶性的过表达,其中尤其是小分子的(10～20kDa)全部成功[30]。MBP对膜蛋白表达的促进作用可能与它能够增加表达量和加强重组蛋白膜定位有关。如Trx[31]和SUMO[16]等其它标签,通过增加溶解性和表达量,也能够用于膜蛋白的表达。
2.3 新促溶标签的产生
2.3.1 常用促溶标签的新衍生物
为了使常见的促溶标签能够满足更多的应用需求,可以对现有标签蛋白进行改造,或者寻找该蛋白在其它物种所表达的形式。为了解决GST融合蛋白寡聚后导致的纯化洗脱困难,有研究建议,用硫-甲基化谷胱甘肽(S-butylglutathione)替代谷胱甘肽,洗脱效果较好[32]。来源于热球菌属(Pyrococcus furiosus)的MBP可以作为耐热标签表达热稳定的重组蛋白[33]。有研究将人源的SUMO2内含肽开发成融合标签,利用其在改变至特定pH值时自身移除的特性,使融合标签的移除更便捷,并省去相应的纯化步骤[18]。
2.3.2 发现新的促溶标签
随着生物技术的发展,一些新兴的促溶标签正在不断被发现和应用。如IF2(initiation factor 2 domain I),因为其较小的分子量(20kDa)并且融合上目的蛋白后目的蛋白具有生物活性,从而代替GST和MBP作为某些蛋白的促溶标签[34,35],某些在嗜盐细菌中应用的促溶蛋白也正被研究,并有希望成为独特的新型促溶标签[36]。通过人工改造合成的多肽片段也可以作为促溶标签使用[37]。随着研究的深入及扩展,更多促溶标签将会不断地出现。
3 问题和措施
3.1 促溶机制不清楚
目前对促溶标签能够促进目的蛋白溶解的原因没有一个全面的认识。有三种可能的解释。
(i) 在融合蛋白的溶解微粒中,亲水性的促溶标签在微粒外围包裹住疏水性的目的蛋白,最终整个融合蛋白成为可溶的。
(ii) 带上促溶标签以后,融合蛋白之间存在静电排斥作用,使的融合蛋白不能发生相互聚集。
(iii) 促溶标签具有类分子伴侣作用,能够促进目的蛋白的重折叠,使它具有天然的立体结构,提高溶解性[38]。
这些机制只是在具体的标签上适用,不能解释所有标签的促溶机制,这给我们选择合适的促溶标签造成了困惑,在融合了某种促溶标签后,还是得不到可溶性表达。
3.2 影响目的蛋白的结构和功能
促溶标签与目的蛋白融合表达时,二者会存在蛋白与蛋白的相互作用,标签蛋白可能会阻碍目的蛋白的活性结构域暴露,使其失去相关的生物学功能。切除促溶标签以后,目的蛋白的末端还残留有多余的氨基酸序列,影响到其天然结构和功能。
3.3 解决方案
在选择促溶标签的时候,应该充分考虑各种因素,如该标签是否可以用来亲和纯化,是否对目的蛋白的空间结构和生物活性有影响,以及成本和技术路线简单快捷。在充分考察了各标签的特点和自身实践需要的基础上,做出合适的选择。为了快速的选择合适目的蛋白的促溶标签,目前比较可行的一个方法是在构建融合表达时,平行构建多个不同标签的促溶表达载体,根据表达纯化结果,进行随后的重组蛋白生产[2,5]。表1总结了常用促溶标签的优缺点,在选择时可作参考。
4 展望
随着生物技术的快速发展,蛋白质的研究逐渐深入和拓宽,对重组蛋白的表达、纯化有了更多的需求。促溶标签在获得可溶性重组蛋白的新方法中将占据重要的位置。例如在同时对很多个蛋白进行表达时,促溶标签可作为一个高通量筛选工具以快速获得大量可溶性重组蛋白。有研究者尝试用MBP标签分别与代表16个生物群体的95种蛋白进行融合表达,其中68个蛋白获得表达,59个为可溶性[39]。虽然一个标签并不能够使所有的蛋白获得可溶性表达,但更多的促溶标签必将加入到高通量的表达筛选中来。
因为促溶标签的促溶机制并不十分清楚,它们各自所适用的范围也不明确,所以在将目的蛋白融合上某个促溶标签后无法准确预测是否能够得到可溶性表达。今后的研究必将对各标签的促溶机制进一步研究,为快速准确选择合适的标签提供依据。
摘要：重组蛋白表达在现代生物学技术发展中起着重要的推动作用。通过利用宿主实现外源性蛋白表达,为一些重要蛋白尤其是人源蛋白的结构和功能研究的提供了强有力的工具。促溶标签的应用可以有效地解决重组蛋白表达时常遇到的溶解性问题,并且这些标签还能够对重组蛋白产量、结构和纯化等有一定影响。该综述介绍了几种常见的促溶标签的特性,对其各自的应用特点进行总结,归纳促溶标签最新研究进展。根据文献报导就应用时存在的一些问题和进行探讨,最后展望了促溶标签研究可能产生突破的方面,以便研究者在实验中选择合适的标签。
水溶性蛋白 篇8
关键词：LED,不同光质,洋桔梗,可溶性蛋白,影响
LED(Light Emitting Diode)又称发光二极管,具有节能环保、安全可靠、使用寿命长、响应时间短、体积小、重量轻、发热量少、易于分散和组合控制等许多不同于其他电光源的重要特点[1]。传统植物设施栽培中使用的光源一般是荧光灯、金属卤化物灯、高压钠灯和白炽灯。这些光源是依据人眼对光的适应性所选择的,其光谱有很多不必要的波长,对植物生长的促进作用少[2]。而LED具有较窄的波谱,波谱半宽范围从几纳米到几十纳米,在±20 nm左右,波长正好与植物光合成和光形态形成的光谱范围相吻合[3,4],且LED作为冷光源,可以近距离地照射植物,将大大提高空间的利用效率。
洋桔梗(Eustoma grandiflorum(Raf.)Shinners)又名草原龙胆,台湾亦称“土耳其桔梗”,为龙胆科(Gentianaceae)草原龙胆属(Eustoma russellianum)植物,原产美国、墨西哥。洋桔梗为多年生草本植物,常作一年生植物栽培,根据花瓣一般可分为单瓣花和重瓣花品种。
洋桔梗原本是一种普通的野花,随着育种领域的进步,特别是最近10年间,洋桔梗的育种与生产有了迅速的发展,尤以日本为盛,且有“无刺的玫瑰”之称,已育有紫色、粉色、白色、蓝色、淡紫色、白花带粉边或白花带紫边等多种花色以及钟型花冠、漏斗型花冠等多种花型的品种,目前日本市场上有300多个品种。洋桔梗花姿高雅秀丽,妩媚动人,异常新异,且插花效果好,花条寿命可达2~3周,是国际上流行的切花品种,已成为荷兰鲜花拍卖市场十大切花之一[5]。
近年来,洋桔梗盆花已在欧洲、日本兴起,有非常大的发展前景。而洋桔梗的种子十分细小(19 000粒/g),播种技术难度大,种子萌发缓慢,发芽及幼苗生长受多种环境因子影响,发芽率较低,给洋桔梗在我国的生产带来了一定的困难[6]。在这种情况的前提下,利用组织培养技术繁殖洋桔梗来解决这个问题已十分必要。利用组织培养技术不但可以节约生产成本,而且可以使洋桔梗种苗的生长、发育避免受到外界环境的影响,对满足切花市场对洋桔梗优质种苗的需求具重要现实意义。
植物的生长发育被许多环境因子所刺激,其中包括光、温度和地球的引力。在这些刺激中,光具有特殊重要的地位。因为它不仅影响着植物几乎所有的发育阶段,还可以为植物进行光合作用提供能量[7]。对植物而言,光生物学主要关心的是波长200~800 nm的辐射波,其中可见光光谱在380~760 nm,这种波长被植物机体分子吸收后,能够引起化学变化[8]。
近年来,国内外对光质的研究已成为热点,但是目前,人工得到的所谓单色光质一般并不是单一波长光质,往往还掺杂有少量其他波长的不同色光,这种光质不同的现象,人眼通常不能觉察,因而给不同作者关于相同光质试验结果的报道的相互比较带来很大困难[9]。国内外已有学者尝试用LED光源对植物照射补光,LED在植物工厂中的应用,LED不同光质配比组合对菊花组培苗形态学和生理学的研究报道。然而采用LED不同光质配比组合对洋桔梗组培苗生理学的研究未见报道。本试验采用LED光源,能得到单一波长光质,解决了光质不纯的问题,增加了试验结果的可靠性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为云南农业大学花卉研究所提供的洋桔梗701品种的组培苗,苗高1.5 cm,具4叶1心;生根培养基配方为:MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂。
1.2 试验方法
1.2.1 光质控制系统。LEDs光质控制系统的设计如表1所示。
注:1RB为红蓝复合光,2RB为红蓝配光。
1.2.2 可溶性蛋白含量的测定。
洋桔梗在各光质下生长30 d后选完全展开的第3~4片叶,称取新鲜叶片0.1 g,加少量石英砂用蒸馏水研磨成匀浆,定容至100 m L,置于10 000 g离心机20 min提取上清液,即可溶性蛋白待测液。每组样品重复3次。取待测液1 m L和考马斯亮蓝G-250溶液5 m L,摇匀后于595 nm下比色(以标准曲线的空白调零),读取吸光度。
2 结果与分析
从表2可以看出,光质对洋桔梗组培苗可溶性蛋白含量影响显著。红蓝复合光处理的组培苗可溶蛋白含量最高,为14.314 3 mg/g;红蓝绿光处理的组培苗可溶性蛋白含量最低,为8.106 3 mg/g;红蓝复合光的处理结果与红蓝绿光处理结果差异显著(P<0.05);单色蓝光处理的组培苗可溶性蛋白含量为14.272 7 mg/g,单色红光处理的组培苗可溶性蛋白含量为11.439 7 mg/g,单色蓝光的处理结果明显高于单色红光的处理结果,但两者差异不显著(P<0.05);与对照组荧光灯的处理结果13.856 3 mg/g相比,高于荧光灯处理结果的有:红蓝复合光14.314 3 mg/g、单色蓝光14.272 7 mg/g、红蓝配光14.189 7 mg/g,低于荧光灯处理的有:单色白光12.627 0 mg/g、单色红光11.439 7 mg/g、红蓝白光9.835 7 mg/g、红蓝绿光8.106 3 mg/g。可溶性蛋白含量变化规律:红蓝复合光>单色蓝光>红蓝配光>荧光灯>单色白光>单色红光>红蓝白光>红蓝绿光。
3 结论与讨论
本试验研究了LED不同光质对洋桔梗组培苗可溶性蛋白含量的影响,结果表明:红蓝复合光处理的组培苗可溶蛋白含量最高,红蓝绿处理的组培苗可溶性蛋白含量最低。可溶性蛋白含量变化规律:红蓝复合光>单色蓝光>红蓝配光>荧光灯>单色白光>单色红光>红蓝白光>红蓝绿光。因此,红蓝复合光最有利于洋桔梗组培苗可溶性蛋白质的合成。
植物体内的新陈代谢都是在液体环境中进行的,形成可溶性蛋白标志植物体要进行更旺盛的生命活动。植物体内的可溶性蛋白是植物体内多种重要的酶的组成成分,直接关系到植物体的呼吸作用分解糖类供能、构成细胞、催化各种化学反应等[7]。因此,可溶性蛋白在植物体内起着极其重要的生理作用。可溶蛋白作为机体的重要成分、生物体的主要物体基础,其形成受到不同波长的光的影响。作用光谱显示促进可溶性蛋白含量增加的最有效波长为460 nm和370 nm附近[8],这为通过测定不同光质处理下的植物体内可溶性蛋白含量来选择能够促进植物生长的光质提供了理论依据,在植物组织培养过程中光质的选用发挥重要作用。
诸多报道认为:蓝光有利于蛋白质含量的提高。如:张微慧等[9]研究发现,不同光质下蓝光促进果树蛋白质含量积累;倪德祥[10]研究表明,蓝光能促进锦葵愈伤组织蛋白质含量提高;倪德祥[11]研究表明,蓝光有利于康乃馨中蛋白质含量的提高。究其原因主要有:一是蓝光促进了蛋白质的合成[12],二是蓝光阻止了蛋白质的丧失[13]。