A群轮状病毒（精选3篇）
A群轮状病毒 篇1
轮状病毒属呼肠病毒科, 为双链RNA病毒, 对理化因子具有一定抵抗力, 在自然界广泛存在, 且存活能力较强。轮状病毒常引起小儿胃肠道急性感染, A群轮状病毒是引起婴幼儿病毒性肠炎的主要病原体。轮状病毒的主要通过粪-口途径传播, 也可以通过气溶胶形式传播, 因此皮肤接触及呼吸道传播是其主要传播方式[1]。儿童神经康复科主要收治中枢性协调障碍、脑瘫、精神运动发育迟滞、脑损伤等患儿, 对其进行各种神经康复治疗和训练。该病患儿一般免疫力相对较低, 住院时间较长 (平均95d) , 且每名患儿都有家属陪护进行康复训练, 在轮状病毒高发季节容易被感染。轮状病毒感染的发生直接影响患儿康复训练的正常进行, 在影响治疗效果的同时增加了患儿的痛苦和其家庭的经济负担。本研究对2011年1月至2011年12月青岛市某儿童医院神经康复科332例住院患儿轮状病毒检测结果进行回顾性分析, 以期对其防控做出针对性指导, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿为调查对象, 对其大便进行A群轮状病毒抗原检测。
1.2 试剂
北京万泰生物技术公司A群轮状病毒检查试剂盒
1.3 方法
对2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿均进行A群轮状病毒抗原检测, 查看其是否发生轮状病毒感染。检测方法按照试剂说明书进行。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0软件进行统计学分析, 采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿322人, 其中住院期间发生腹泻患儿25人, 轮状病毒检测阳性20例, 以秋冬春季为主, 其中冬季12例 (60%) , 秋季6例 (30%) , 春季2例 (10%) , 夏季0例, 发生轮状病毒感染者均为6个月-2岁患儿, 其中年龄<7个月2例 (10%) , 7个月～1岁9例 (45%) , 1～2岁8例 (40%) , >2岁1例 (5%)
3 讨论
轮状病毒是导致秋冬季节儿童腹泻的重要病原体[2]。小儿脑性瘫痪 (PC) 简称脑瘫, 是一种严重危害儿童健康的疾患, 主要表现为种属性运动障碍和姿势异常, 同时伴有智力、语音、视觉、听觉障碍。脑瘫患儿在住院康复过程中发生轮状病毒感染, 不仅延迟了患儿的康复, 而且也增加了家长的经济负担。
有关脑瘫儿童住院期间发生轮状病毒感染的情况未见报道, 本研究发现, 我院神经康复科脑瘫患儿发生轮状病毒的感染率为6.21%, 发生季节以秋冬季为主, 发病年龄主要为<2岁患儿, 与赵丹洋等[3]报道基本一致。我院发生轮状病毒感染均为散发, 且发病患儿或家长有明显的离开病区或接触轮状病毒感染者经历。因我院对医务人员的手卫生等制度要求严格, 为发现可疑医务人员导致的感染[3]。
调查显示, 儿童神经康复科患儿因住院时间较长, 对院内环境相对较为熟悉, 因此患儿或家长经常到本病区以外的地方走动的或活动, 加之脑瘫患儿本身免疫力相对较低, 是造成患儿发生轮状病毒感染的主要原因。
综上所述, 为降低脑瘫患儿轮状病毒感染的发生。在轮状病毒易感季节, 需限制患儿或家属到本病区以外的地方活动;患儿或家属外出归来或进入病区建议执行严格的手卫生消毒制度;适当情况下可以考虑对处于高发年龄阶段的神经康复科患儿应用增强免疫力的药物。
参考文献
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[3]赵丹洋, 华亮, 赵明奇.广州地区患儿医院感染轮状病毒腹泻病的分子流行病学研究[J].中华医院感染学杂志, 2011, 21 (20) :4248-4250.
A群轮状病毒 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2013年12月—2015年12月在长春市儿童医院检验科进行A群轮状病毒检测患儿298例, 其中女145例, 男153例;年龄0~5岁, 平均年龄 (3.1±1.2) 岁。所有患儿均符合小儿急性腹泻的诊断标准[5]。所有患儿的各种资料均经患儿家属的同意, 并通过伦理委员会的批准。
1.2 方法
1.2.1 试剂
选用A群轮状病毒抗原检测试剂盒 (胶体金法) , (国食药监械 (准) 字:2012第3400941号) 。检测原理, 采用的是免疫层析双抗体夹心法, 在硝酸纤维素膜上的检测区包被A群轮状病毒抗体, A群轮状病毒单克隆抗体用胶体金标记, 当样本中含有A群轮状病毒时可形成胶体金-抗体免疫复合物, 并在检测区出现一条红色线为阳性, 没有出现一条红色线为阴性。
1.2.2 方法
从粪便中取约100 mg的检测样本, 放入样本稀释液的试管中, 震荡均匀, 后将测试卡平放于操作台上, 垂直滴入2~3滴, 5~10 min判断结果。出现2条红色线为阳性, 出现1条红色线为阴性。
2 结果
2.1 各个年龄段A群轮状病毒阳性率
298例急性腹泻患儿中A群轮状病毒阳性率为32.2%, 6个月~2岁患儿的阳性率为47.8%, 与0~6个月 (21.7%) , 2~5岁 (15.9%) 相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 0~6个月和2~5岁阳性率相比差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。
2.2 A群轮状病毒性别阳性率
298例急性腹泻患儿中, A群轮状病毒男孩患儿为48/153例, 阳性率为31.4%, A群轮状病毒女孩患儿为43/145例, 阳性率为29.7%, 性别相比差异无统计学意义 (P>0.05, χ2=1.633) 。
3 讨论
小儿急性腹泻是多种病原引起的消化道综合征, 好发于夏秋季节, 是我国小儿的常见病和多发病, 在小儿疾病死亡中位居第二[6]。研究显示[7], 全世界5岁以下患儿每年约有12 500万例, 而发展中国家每年死亡人数为60万~87万, 约为腹泻总人数的20%~25%。急性腹泻根据临床表现可以分为轻型腹泻和重型腹泻两种[8], 轻型腹泻1岁内多发, 大便次数可多至十余次, 量小, 多呈水样便, 为黄色或黄绿色, 可伴有白色奶瓣、泡沫, 患儿全身症状较轻。重型腹泻0~2岁多发, 大便次数可达数十次, 量多, 呈蛋花汤样便, 为黄绿色或黄色, 患儿全身症状较重, 可出现精神萎靡、烦躁、高热, 严重时出现昏迷、休克等, 危及患儿生命。急性腹泻的发病与小儿消化系统发育不完善、机体免疫力较低、细菌、病毒感染关系密切, 小儿胃酸分泌较少, 消化酶的活性较低, 而小儿生长发育较快, 需要的营养相对较多, 两者的关系失衡, 容易出现消化功能紊乱;同时小儿胃酸指数偏低, 杀菌能力较弱, 肠壁较薄, 通透性高, 进入体内的细菌、病毒易被吸收。因此, 早发现, 早检测A群轮状病毒并给予积极有效的治疗对患儿恢复健康具有重要作用。
轮状病毒是双链核糖核酸病毒, 最早是由澳洲微生物学家Ruth Bishop发现的[9], 其中A群轮状病毒是婴幼儿腹泻的首要病原, 其直接侵袭小肠上部上皮细胞、肠绒毛, 使水和电解质吸收减少而引起腹泻, 同时可以降低肠道黏膜细胞的双糖酶活性, 出现吸收障碍, 进而加重腹泻, 病程多在2~3周之内。从医院的研究发现, 298例急性腹泻患儿中A群轮状病毒阳性率为32.2%, 6个月~2岁患儿的阳性率为47.8%, 与0~6个月 (21.7%) , 2~5岁 (15.9%) 相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 0~6个月和2~5岁阳性率相比差异无统计学意义 (P>0.05) , 男孩患儿阳性率为31.4%, 女孩患儿阳性率为29.7%, 相比差异无统计学意义 (P>0.05) , 与李晶伟[10]报道的急性腹泻婴幼儿患者粪便轮状病毒检测阳性率为28.4%, 0~5个月大的婴幼儿感染率为17.9%, 6个月~2岁婴儿阳性率为26.8%, 2~5岁感染率为16.3%, 不同年龄阶段检测轮状病毒阳性检出率比较差异具有统计学意义 (P<0.05) 结果相似。可见, 及早对急性腹泻婴幼儿进行轮状病毒检测, 可利于减少感染, 提高治疗效果。
综上所述, 粪便中A群轮状病毒检测在小儿急性腹泻的诊断中意义重大, 值得在临床上大力推广应用。
参考文献
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A群轮状病毒 篇3
由于PEDV、TGEV及RV有相似的临床表现和剖检变化,其鉴别诊断通常需要借助实验室诊断技术[4],如免疫荧光试验、病毒分离、PCR技术等[5]。传统的诊断技术,如免疫荧光试验、病毒分离等费力费时,不适合用于临床的快速诊断,也不适合用于大规模的流行病学调查;PCR技术具有很强的特异性,很高的敏感度;而多重PCR技术能够在一个扩增反应中同时检测多种病原体,在实验室诊断中具有较突出的优势。
本研究旨在建立一种能够快速检测PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR体系,并用于临床样本的检测,现将结果报道如下。
1 材料
1.1 疫苗、病毒
猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联弱毒疫苗,购自哈尔滨维科生物技术开发公司;猪瘟病毒(CSFV),购自广东永顺生物制药有限公司;猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、沙门氏菌、大肠杆菌,由天津市畜牧兽医研究所实验室提供;牛病毒性腹泻病毒(BVDV),由美国明尼苏达大学赠送;TGEV、PEDV、RV阳性质粒p MD-S、p MD-M和p MD-VP7,由天津市畜牧兽医研究所实验室制备;疑似病毒性腹泻粪样,采自天津、河北等地区发病猪场。
1.2 主要试剂
TRIzol试剂、反转录酶、RNA酶抑制剂、r Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA Marker、DL-2 000Marker,购自Ta KaRa公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 引物的设计与合成
根据Gen Bank登录的TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,多重RT-PCR引物设计见表1。
2 方法
2.1 病料处理
用p H值为7.4的PBS缓冲液将猪腹泻粪便样品稀释成浓度为100 g/L的悬液,4℃、3 000 r/min离心30 min;取上清液,于-70℃保存,备用。
2.2 RNA提取
采用TRIzol法提取RNA。取200μL待检样品分别加入TRIzol Reagent 600μL,振荡混匀,室温作用5 min;加入200μL氯仿,振荡混匀,室温作用5 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;取上清液至新的1.5 m L离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置15 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清液,用500μL 75%乙醇洗涤;4℃、12 000 r/min离心10 min;自然干燥,用20μL DEPC水溶解。
2.3 c DNA合成
反转录体系(总体积为20μL):50 pmol/μL RNA模板10μL,5×RT Buffer 4μL,随机引物1μL,d NTP Mix 2μL,Mg Cl22μL,40 U/μL RNA酶抑制剂0.5μL,5 U/μL反转录酶0.5μL。
反应程序:30℃10 min;42℃60 min,99℃5 min,4℃5 min;c DNA合成结束后,进行PCR扩增或-20℃保存,备用。
2.4 单项PCR最佳退火温度的确定
以PEDV、TGEV、RV的c DNA为模板,分别应用表1中的3对引物进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs2μL,Mg Cl21μL,上、下游引物各1μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板5μL,用去离子水补至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃30 s,退火温度分别为54℃、56℃、58℃、60℃、64℃,72℃45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
2.5 多重PCR引物浓度的优化
在单对引物扩增成功的基础上,将表1中的3对引物同时加到扩增体系中,建立多重PCR扩增反应体系,对多重PCR反应体系的引物浓度进行优化。PCR结束后,取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2.6 多重PCR特异性试验
以CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、JEV、BVDV、大肠杆菌、沙门氏菌等病原体的核酸为模板,同时以TGEV、PEDV、RV为阳性对照,进行同等条件下的多重PCR扩增,反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.7 多重PCR敏感性试验
将p MD-S、p MD-M和p MD-VP7阳性质粒稀释为1×101~1×105拷贝/μL,每种标准品取1.0μL,加到同一多重PCR反应体系中,验证所建立方法的敏感性。反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.8 多重PCR的临床检测
采集天津、河北等地区的疑似病料样品78份,用已建立的多重PCR方法检测,并分析检测结果。
3 结果与分析
3.1 单项PCR最佳退火温度的确定
采用不同退火温度对PEDV、TGEV、RV进行PCR扩增,退火温度范围为54~64℃,结果5个温度都有目的条带,其中PEDV的最佳退火温度为60℃和64℃,5个退火温度均能扩增TGEV和RV,见图1~3,为防止非特异性扩增,本试验选定64℃作为退火温度。
M.DL-2 000 Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
3.2 多重PCR引物浓度的确定
通过对引物浓度的摸索,结果表明:PEDV的上、下游引物浓度各为0.7μL,TGEV的上、下游引物浓度各为0.75μL,RV的上、下游引物浓度各为0.6μL,该条件下扩增效率最优,见图4。最终PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs 2μL,Mg Cl21μL,3对引物(各单条引物终浓度均为10μmol/L)分别为PEDV引物0.7μL、TGEV引物0.75μL、RV引物0.6μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板2μL,用dd H2O补充至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
M.DL-2 000 Marker;RV、PEDV和TGEV引物量分别为:1.1μL、1μL、1μL;2.0.6μL、0.7μL、0.75μL;3.0.5μL、0.6μL、0.6μL;4.0.3μL、0.4μL、0.3μL。
3.3 多重PCR特异性试验
对PEDV、TGEV和RV进行多重PCR扩增,同时对猪常见的病毒病病原进行PCR扩增,结果显示,多重PCR仅扩增出PEDV、TGEV和RV的目的条带,而未曾扩增出其他病毒,说明本试验建立的多重PCR具有很好的特异性,见图5。
M.100 bp DNA Marker;1.CSFV;2.PRRSV;3.PRV;4.PCV-2;5.PPV;6.JEV;7.BVDV;8.大肠杆菌;9.沙门氏菌;10.PEDV阳性对照;11.TGEV阳性对照;12.RV阳性对照;13.PEDV+TGEV+RV阳性对照;14.空白对照。
3.4 多重PCR敏感性试验
以已测得的含目的片段的阳性质粒作为模板,稀释成1×101~1×105拷贝/μL的5个不同浓度,进行PCR扩增反应,结果见图6。
由图6可知,最低检测浓度为1×102拷贝/μL。
3.5 多重PCR的临床检测
应用建立的多重PCR方法对天津和河北等地区的78份疑似腹泻粪样进行检测,结果在78份样品中检测到PEDV阳性37份,阳性率为47.44%;TGEV阳性10份,阳性率为12.82%;RV阳性4份,阳性率为5.13%;PEDV、TGEV和RV均为阳性2份,阳性率为2.56%。该试验结果表明,阳性样品的PCR检测结果出现3条特异性片段,可用于临床病例的检测与诊断。
M.DL-2 000 Marker;1.空白对照;2.1×105拷贝/μL;3.1×104拷贝/μL;4.1×103拷贝/μL;5.1×102拷贝/μL;6.1×101拷贝/μL。
4 讨论
1)本试验针对TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因保守序列设计引物,建立了检测3种病毒的多重PCR方法,扩增得到的特异性片段长度分别为299 bp、437 bp和639 bp,目的片段之间具有明显的长度差异,便于鉴别,而且单对引物的扩增特异性强,扩增效率高。
2)在多重PCR方法建立过程中,引物是最关键的因素。在引物设计时,除了考虑每对引物的特异性及扩增效率之外,还应尽量减少不同引物之间形成二聚体和交叉配错的可能。此外,还需要对各对引物浓度配比及退火温度等条件进行优化,以便确定最佳反应体系和最佳反应温度。
3)本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR方法具有较高的敏感性,能检测出1×102拷贝/μL浓度的阳性质粒模板。该方法和传统PCR方法检测单一病原体相比具有较大优势,能同时检测3种病原,且具有方便、灵敏、快捷等优点,适于动物疫病的流行病学调查和临床病例的快速检测。
4)应用本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR对78份疑似腹泻粪样进行检测,结果表明,多重PCR方法不仅省时、省力,而且具有敏感性高、特异性强等优点,具有较高的实用价值。
参考文献
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