膜片钳技术培训班（共2篇）
膜片钳技术培训班 篇1
膜片钳技术的发展及其应用
膜片钳技术是在电压钳技术的`基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术.它对通过离子通道的离子电流进行记录,目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学、生理学和分子生物学等学科领域.概括了膜片钳技术的基本原理,归纳出该技术的主要操作步骤,并对其发展与应用进行了总结.
作 者：曹建斌 CAO Jian-bin 作者单位：运城学院,生命科学系,山西,运城,044000刊 名：运城学院学报英文刊名：JOURNAL OF YUNCHENG UNIVERSITY年，卷(期)：27(2)分类号：Q424关键词：膜片钳 离子通道 电生理 发展及应用
膜片钳技术培训班 篇2
1 病理生理机制研究
1.1 血管平滑肌离子通道
高血压病血压的升高是由外周血管阻力的增加引起的。血管张力持续升高是血管舒缩活动异常所致。细胞膜离子通道的正常活动是血管平滑肌兴奋舒缩过程的关键。利用膜片钳技术观察培养的或急性分离的单个细胞离子通道变化与细胞生理功能的相互作用, 了解离子通道的开放特性以及某些因素对离子通道动力学特性影响。钾离子通道是血管平滑肌上很重要的效应蛋白, 具有多种作用, 通过调节平滑肌细胞的迁移、增殖和凋亡来重塑血管是钾通道的功能之一[1]。而且钾通道主要是通过提供复极电流来抵消血管收缩的影响, 来维持血管紧张度[2]。血管平滑肌上至少存在着四种钾通道[3,4], 电压依赖性K+通道 (KV) ;Ca2+激活K+通道 (KCa) ;内向整流K+通道 (KIR) ;ATP敏感性K+通道 (KATP) 。
钙激活钾通道是一类电压和钙敏感的通道, 最早由Cardos描述, 后来由Meech证明并报告[5]。在几个钾通道中, 大电导钙激活钾通道对血管张力和神经元的兴奋性影响最明显, 在平滑肌上表达密度最高, 在平滑肌细胞膜电位的维持和肌紧张的调节中起着重要的作用。当平滑肌细胞去极化, BK通道被激活, 钾离子外流, 使血管舒张, 这种负反馈机制在高血压时表现得尤为明显。目前, 包括脑动脉 (100 μm内径) 在内, 不同类别的血管在高血压背景下均有研究, 这些结果均显示了高血压时血管平滑肌大电导钙激防钾通道 (BKCa) 电流增加[6]。12周～16周龄自发性高血压大鼠 (SHR) 冠状动脉平滑肌细胞BK电流密度较WKY大鼠显著增大[7]。且BKCa电流和电流密度随增龄衰减, 血压水平是衰减程度的重要反应;BKCa电流密度与血压水平高度相关[8]。Jesica等[9]用单通道膜片钳法记录人内乳动脉血管平滑肌细胞BKCa通道电流时, 发现细胞内pH值变化对BKCa通道有明显影响。反映出BKCa并不是孤立的发生增龄变化, 它与周围环境的变化也是密切相关的。BK通道的增龄变化与高血压血管重构高度相关[10]。
除了运用膜片钳技术对动物平滑肌细胞的观察以外, 还有许多对人体平滑肌细胞的观察研究。通过研究高血压患者肠系膜血管平滑肌细胞发现, 高血压患者平滑肌细胞 (MASMC) 的BK活性显著高于非高血压患者[11,12], 与动物实验结果基本吻合。且两组对象在内面向外式膜片钳记录下, 随着溶液中[Ca2+]i的增高, BK明显激活, 而高血压组Po随[Ca2+]i增加的幅度明显低于非高血压组。这说明高血压患者的BK对Ca2+敏感性较低。所以高Ca2+而增强的BK活动所致的血管舒张作用不能拮抗因胞外Ca2+内流增多所致的血管收缩作用, 从而导致高血压形成, 而血压状态对BK又有着怎样的影响, 也是众说纷纭。
采用全细胞膜片钳技术记录妊娠期高血压疾病孕妇胎盘血管平滑肌细胞上钾通道电流情况[13], 发现妊娠期高血压疾病胎盘动脉血管平滑肌细胞的静息膜电位增大, 钾电流密度减小, 推测妊娠期高血压疾病发生可能与钾通道功能改变有关。
1.2 神经元的放电活动
AT1受体属于G蛋白耦联受体超级家族。它被激活后是通过何种细胞内信号转导途径, 最终影响细胞的输出效应或功能的, 迄今仍不十分清楚。通过观察全细胞膜片钳以电流钳方式记录原代培养SHR和WKY新生鼠脑干和下丘脑神经元的放电活动, 发现Ang Ⅱ增加SHR和WKY鼠脑神经元放电频率的作用均由AT1受体介导[14]。提示PI3激酶参与SHR鼠脑神经元来自AT1受体的特殊信号转导, 成为研究高血压发生的脑源性机制的重要物质分子, 为高血压的防治提供了又一新的途径。
1.3 心室肌细胞
长期血压增高可致左室心肌产生重构, 左心室肌细胞的电生理特性也可能发生改变。应用膜片钳技术观察SHR左心室肌细胞动作电位及膜离子流, 发现SHR心室肌细胞肥大时, 出现复极障碍, 从而有助于室性心律失常的产生[15]。自发性高血大鼠瞬间外向性钾流密度降低是导致动作电位时程延长的原因之一[16]。ⅠNa仅在心肌明显肥厚时电流密度明显增加, 可能促进肥厚心肌恶性室性心律失常的发生[17]。左室压力负荷所致的肥大细胞的动作电位时程延长与L型钙电流的失活时间延迟有关[18]。
2 抗高血压药物对离子通道的影响
膜片钳技术为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段, 在通道电流记录中, 可分别于不同时间、不同部位 (膜内或膜外) 施加各种浓度的药物, 研究它们对通道功能的可能影响, 了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机制。
钾通道开放药 (potassium channel openers, PCOs) 是近年来发现的一类新型舒张血管平滑肌的药物。PCOs主要通过影响KATP通道的功能而产生相应的作用, 其作用机制主要为激活KATP通道使钾离子的外流增加, 引起平滑肌细胞膜超极化, 降低电压依赖性钙通道活性, 从而使胞浆内钙离子浓度降低导致血管舒张, 已成为抗高血压药物研究的重要方向之一[19]。应用膜片钳技术可以观察钾通道开放药对钾通道电流的影响[20,21,22,23], 借助特定的钾通道阻滞剂, 利用膜片钳技术可以迅速判明药物作用靶点及作用方式等问题, 为开发新药提供药理学依据。
随着中医药现代化, 膜片钳技术已在中医药研究中得到应用, 利用其理论和方法探索中药复方和单体的药效机制, 为中医药防治高血压提供了一条新的途径。丹参复方液具有逆转高血压性肥大心肌L型钙电流的药理作用[24]。钩藤碱 (Rhy) 是中药钩藤的主要有效成分之一, 对大鼠动脉平滑肌细胞实验, 得出Rhy可浓度依赖性地开放BKCa, 低浓度的Rhy即可增加其Po和To[25]。对人体肠系膜动脉平滑肌细胞进行研究, 发现Rhy在细胞贴附式下BKCa无明显作用, 在内面向外模式下则可浓度依赖性地直接激活BKCa, 且激活作用在高血压组效果更为明显。鬼箭羽钩藤复方液在降低心系数的同时具有逆转L型钙电流的作用[26]。
3 膜片钳应用方法
膜片钳主要有四种记录方式:细胞贴附式、膜内面向外模式、膜外面向内模式、全细胞模式。在高血压病的研究中, 大多数用的是全细胞记录模式, 可以记录完整细胞产生的点活动, 并可研究细胞内外液同时变化对细胞的影响。对细胞损伤小, 基本上保持了细胞的生理状态, 因而药物对某类通道的作用可以直接通过细胞的功能表现出来[27]。但是传统的全细胞膜片钳技术存在机械稳定性差, 对细胞的损伤大, 以及胞内液的被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关的第二信使物质的正常运行, 而穿孔膜片钳技术应用用二性霉素B或制霉菌素在细胞膜上形成特定的孔道, 选择性地允许一些离子和大分子物质, 从而使细胞内环境保持相对稳定, 在一定程度上弥补了上述缺陷, 实验成功率也相应提高。血管平滑肌细胞内局部钙浓度的瞬时增加产生钙火花, 可激活邻近细胞膜上由大电导钙激活钾通道开放所介导的自发性瞬时外向电流 (spontaneous transient outward currents, STOCs) , 在研究猪冠脉平滑肌细胞STOCs的实验中发现, 传统的全细胞膜片钳技术很难记录到, 即使有但持续时间较短, 而采用穿孔全细胞膜片钳记录到的概率明显增加, 且可长时间维持[28]。这一现象可能与传统的全细胞模式中细胞内环境受到破坏, 一些影响通道调控的第二信使发生改变有关。
单通道电流记录方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小, 膜内面向外模式是一种高血压病研究中常用的单通道记录方法, 这种构型下能较容易改变细胞内的离子或物质浓度, 也能把酶等直接加于膜的内侧面, 因此适用于研究胞内激素和第二信使物质, 如1, 4, 5-三磷酸肌醇、cAMP、cGMP、Ca2+等对离子通道型受体功能的调节。如在内面向外膜片下, 加入等量的前列腺素1发现钙激活钾通道被激活, 并存在一定的浓度依赖性。可能与特殊位点结合, 诱导通道蛋白发生构象变化增加了对钾的通透性有关[29]。
全自动膜片钳技术是离子通道检测技术的最新进展, 它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。近来在多个方面作出新的突破, 如高的实验通量表现, 较高的自动化程度、良好的封接质量、微量加样等。目前, 该技术在以离子通道为靶标的药物研发、药物毒理测试以及虚拟药筛等方面有广阔的应用前景。
4 用于针灸治疗高血压病研究的探讨
针灸治疗高血压病有确切疗效, 机制研究现在大多局限于对RAAS、血管活性物质、神经肽等方面的研究, 尚未见到对离子通道影响的研究。观察针刺干预因素的影响, 可以采用两种观察模式:①针刺干预起效后, 麻醉取组织, 急性分离细胞, 观察其离子通道的特性和变化;②急性分离或培养的细胞, “针灸血清”作为灌流液作用于细胞或组织切片, 直接观察到针灸处理后的效应。第一种观察模式, 因为是针灸起效后取得部分组织或细胞, 再经过众多处理因素, 不能充分观察针刺起效的即时效应的机制。第二种观察模式, 可以观察“针灸血清”直接作用于离体的细胞或组织切片, 从而能够直接地观察针灸处理后产生的效应。但是“针灸血清”如何制备、如何添加等没有确定的规范化标准, 作用机制也待进一步研究。“针灸血清”是通过血清中一些活性物质而发挥作用, 但是针灸的效应不单单是靠体液因素的影响, 还有神经等其他途径的调节, 所以“针灸血清”的应用也存在一定的局限性。
5 展 望