D-半乳糖衰老模型

D-半乳糖衰老模型（共6篇）

D-半乳糖衰老模型 篇1

银耳多糖(Tremella Polysaccharide,TP)是银耳中主要的活性作用成分,将其从银耳中提取分离后进行研究,发现它具有很多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗辐射以及抗衰老等。衰老的自由基学说认为,自由基和脂质过氧化物引起的细胞衰老是导致衰老的重要原因[1]。而机体抗氧化酶活性提高,清除自由基的能力增强,其抗衰老能力也得到增强。本实验建立了衰老小鼠模型,并用TP干预,以观察TP对衰老小鼠抗氧化功能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级ICR纯系小鼠,雌雄各半,体质量(19±2)g,由上海西普尔-必凯公司提供。D-半乳糖为Sigma公司产品;SOD、MDA、GSH-Px检测试剂盒购自南京建成公司;银耳多糖(TP)由北京九和药业提供,为精品干粉,经气相色谱法鉴定,此精品含糖质量分数达80%左右,其中糖醛酸质量分数为13.38%。将此TP精品用生理盐水分别稀释成所需质量浓度(10和20 g·L-1),贮存于4℃备用,其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

将100只小鼠按体重随机分为5组,分别为正常对照组、衰老模型组、低剂量TP组、中剂量TP组、高剂量TP组,每组20只,雌雄各半。

1.2.2 衰老模型建立及实验干预

除正常对照组外的其余各组每日腹腔注射D-半乳糖120 mg·kg-1,连续8周;正常对照组每日腹腔注射生理盐水。同时,低、中、高TP剂量组每日分别灌胃TP 100、200和400 mg·kg-1,连续8周,正常对照组和衰老模型组每日灌胃生理盐水,自由进食、饮水,室温为20℃左右。末次给药后,称体质量,摘眼球取血,处死小鼠。离心取血清,将心、脑准确称重,按1:9体积加入冰生理盐水,4℃匀浆,离心后取上清,按试剂盒说明测定心组织匀浆中SOD活力及MDA含量,脑组织匀浆中GSH-Px活力及脂褐质含量。

1.2.3 统计学处理

数据以均数±标准差表示,采用SPSS 11.5统计学软件进行方差分析,P值小于0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 一般状况

实验期间各组小鼠均自由饮食。生长状况良好,未发生意外损伤和死亡。实验开始和结束时,各组小鼠体重无显著性差异(P>0.05)。

2.2 抗氧化指标测定

表1中,衰老模型组小鼠心组织匀浆SOD活力、脑组织匀浆GSH-Px活力低于正常对照组(P<0.05),心MDA含量较正常对照组显著增加(P<0.05)。说明已成功应用D-半乳糖腹腔注射的方法建立衰老模型小鼠。

表2中,与衰老模型组小鼠相比,TP各剂量组心组织匀浆SOD活力、脑组织匀浆GSH-Px活力显著升高(P<0.05),中、高剂量TP组心脏MDA含量显著降低(P<0.05)。与低剂量TP组相比,高剂量组心脏SOD活力显著升高(P<0.05),中、高剂量组脑GSH-Px活力显著升高(P<0.05),高剂量组心MDA含量显著降低(P<0.05)。与中剂量TP组相比,高剂量TP组脑组织GSH-Px活力显著升高(P<0.05),心MDA含量显著降低(P<0.05)。

3 讨论

衰老是机体代谢性障碍的结果。糖代谢在生热营养素代谢中具有很重要的意义,糖代谢紊乱必然会引起心、肝、肾、脑等重要器官代谢异常,最终出现衰老。因此,在一定时间内,连续给动物注射大剂量的D-半乳糖,使机体细胞内半乳糖浓度增高,在醛糖还原酶的催化下,还原成半乳糖醇,这种物质不能被细胞进一步代谢,而堆积在细胞内,影响正常渗透压,导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱,最终导致衰老的发生[2]。D-半乳糖腹腔注射成功制备的亚急性动物衰老模型所观察的指标与自然衰老的动物相似[2,3]。文献报道应用于造模的动物有家蝇、小鼠、大鼠、豚鼠以及家兔。给药方式有眼球后注射、(颈背) 皮下注射及腹腔注射等,但在众多给药方式中以腹腔注射为优[5]。

SOD、GSH-Px活力降低、脂褐质含量增多等都是衰老的标志[4,6]。自由基对机体的损伤可表现为脂质过氧化与生物膜的损伤。机体衰老时,自由基引起不饱和脂肪酸的脂质过氧化作用,使膜的液态性和流动性发生改变,通透性异常增加,甚至膜的完整性被破坏。脂质过氧化反应一旦被触发,常呈链式反应,可产生多种活泼的脂质自由基。在诸多凋亡的诱因中, 体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡[7]。此外脂质过氧化反应中产生的醛类化合物对细胞有毒性作用,如丙二醛可与免疫细胞膜上的受体发生交联,对免疫细胞产生封闭效应,从而抑制机体的免疫功能。

本实验中,通过D-半乳糖注射建立的亚急性衰老小鼠模型,使用银耳多糖灌胃,结果发现,与造模组相比,不同剂量银耳多糖干预组小鼠心组织SOD活力和脑组织GSH-Px活力有不同程度的升高。这一结果提示银耳多糖能够提高机体SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活力,从而促进机体内自由基的清除,减轻脂质过氧化发生,保护生物膜,起到一定的抗衰老的作用。另外,自由基减少还能够通过抑制细胞凋亡的机制延缓衰老。

摘要：研究了银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力影响。将ICR小鼠腹腔注射D-半乳糖建立衰老模型,同时给予不同剂量的银耳多糖(TP),8周后获取小鼠心、脑,测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量的差异。结果:TP各剂量组SOD和GSH-Px活力高于对照组(P<0.05),且高剂量组SOD、GSH-Px活力均高于低剂量和中剂量组(P<0.05);中、高剂量TP组MDA含量低于对照组(P<0.05)且高剂量组MDA含量低于低剂量组(P<0.05)。结论:银耳多糖对于衰老模型小鼠抗氧化能力具有一定正性调节作用。

关键词：银耳多糖,衰老,抗氧化,小鼠

参考文献

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D-半乳糖衰老模型 篇2

关键词：D-半乳糖,大鼠,衰老模型

我国正快速进入老龄化社会,据第六次全国人口普查显示,我国60岁及以上人口已达1.78亿,占总人口的13.26%。预计到21世纪中叶,我国60岁以上老年人将达到4.8亿,占总人口的34%。随着老龄人口的增加,各种老年疾病也随之而来,如何延缓衰老已成为世界各国学者研究的热点。因此,研究衰老机制、建立衰老动物模型显得尤为重要。近年来,我国老年学研究中广泛将拟自然衰老动物模型应用于衰老机制、衰老过程和抗衰老的研究上,取得了许多研究成果,促进了老年生物学和老年医学的发展。目前用于衰老研究的动物模型有D-半乳糖衰老模型、自然衰老模型、臭氧损伤衰老模型和去胸腺衰老模型等[1]。在衰老研究上以自然衰老动物模型最为理想,但由于饲养周期长、价格昂贵、动物来源不统一、个体间差异大,从而影响实验结果的准确性[2]。虽然D-半乳糖在衰老研究方面应用广泛,但是具体机制还有待进一步证实[3,4]。本实验对皮下注射和腹腔注射D-半乳糖在动物体内导致的自由基代谢、免疫指标及病理变化进行比较,观察其拟衰老效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠30只,体重250~300 g,购自军事医学科学院实验动物中心,合格证为SCXK-(军)2007-001。动物饲养在屏障系统内,许可证为SYXK-(军)2007-008。动物适应性饲养1周后,开始正式实验。

1.2 仪器及试剂

紫外/可见分光光度计,美国Beckman公司;高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;电子天平,上海电子天平仪器厂。D-半乳糖购自上海第一制药厂;氯化钠注射液购自北京双鹤药业股份有限公司;D-半乳糖与氯化钠注射液配成5%D-半乳糖-氯化钠注射液,使用前配制,常规灭菌后使用;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;甲醛溶液购自北京市旭东化工厂。

1.3 实验动物分组

30只大鼠随机分成对照组、模型1组和模型2组,每组各10只。参照王亚利等[5]、崔美芝等[6]方法进行D-半乳糖衰老模型的建立。模型1组每天颈部皮下注射D-半乳糖50 mg/(kg·d);模型2组每天腹腔注射D-半乳糖500 mg/(kg·d);对照组每天颈部皮下注射等量(50 mg/kg)生理盐水。各组大鼠均每天上午给药,连续给药6周。

1.4 体重、胸腺指数和脾指数测定

每周称重1次。动物处死后迅速取出胸腺及脾,吸去血液,修去脂肪、系膜。用电子天平称取胸腺、脾湿重,根据体重计算胸腺指数、脾指数。

1.5 胸腺和脾病理组织变化

胸腺和脾分别称取湿重后,置于10%中性福尔马林固定液中固定,行常规脱水,石蜡包埋,组织切片,苏木精-伊红(HE)染色,在光镜下进行组织形态学观察。

1.6 血常规、SOD活性和MDA含量测定

动物处死前眼球采血,测定血常规;分离血清,采用化学比色法测定SOD活性和MDA含量,方法按试剂盒说明书要求进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计分析,数据用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义,以P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 D-半乳糖对大鼠体重、胸腺指数和脾指数的影响

如表1所示,与对照组比较,模型1组和模型2组大鼠体重增加比例降低,胸腺明显萎缩,胸腺指数明显减少(P<0.01),而脾指数增高,但差异无统计学意义(P>0.05);模型1组和模型2组间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。

注:与对照组比较,*P<0.01

2.2 D-半乳糖对胸腺和脾病理组织形态的影响

病理组织观察显示,对照组胸腺淋巴细胞结构清晰,细胞密集,染色较深;脾细胞结构正常。模型1组胸腺皮质明显变薄、萎缩,细胞排列稀疏,间隙增大,髓质缩小;脾白髓缩小,细胞减少,红髓扩大并充血。模型2组胸腺和脾病理变化同模型1组。说明衰老模型大鼠的胸腺萎缩,脾轻度病理改变。

2.3 D-半乳糖对血常规的影响

如表2所示,D-半乳糖对血常规无明显影响,三组血常规各指标差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 D-半乳糖对血清SOD活性和MDA含量的影响

如表3所示,与对照组比较,模型1组和模型2组血清SOD活性显著下降(P<0.01),说明自由基代谢出现异常;血清MDA含量显著升高(P<0.01),说明D-半乳糖促进机体过氧化产物形成,使动物产生拟衰老效应。

注:与对照组比较,*P<0.01;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛

3 讨论

建立不同的衰老动物模型是常用的揭示衰老机制和抗衰老研究的实验工具。衰老的机制十分复杂,至今尚未能被充分阐明,而只有研究出生命衰老的机制,才能采取有效的延衰措施,真正延长人类的寿命。当前有关衰老机制的学说多达300多种,其中公认的有免疫学说、自由基学说等[7]。本实验旨在为免疫衰老和自由基衰老研究方面提供更加完善的实验依据。随年龄增长免疫功能出现逐步减退的过程称为免疫衰老。胸腺作为中枢免疫器官,其功能和状态直接影响机体的免疫功能,胸腺的增龄性退化是免疫衰老的直接原因[8]。D-半乳糖衰老模型在机体免疫器官的研究中主要涉及胸腺、脾、淋巴结。本实验结果显示,衰老大鼠胸腺明显萎缩,胸腺指数明显低于对照组,脾指数增高,这与王少康等[9]报道的结果一致。同时病理组织观察胸腺皮质明显变薄、萎缩,细胞排列稀疏,间隙增大,髓质缩小,提示D-半乳糖诱导大鼠免疫器官的衰老是引起机体衰老的重要因素。自由基又称游离基,是具有一个以上的未配对电子的原子或原子团、分子或离子。正常情况下体内自由基的产生和清除保持相对平衡状态。细胞内自由基的清除主要是抗氧化作用,如SOD可以清除氧自由基,并有随增龄而减低的趋势;自由基的产生可使细胞中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,脂质过氧化产生的MDA能与蛋白质结合,使之发生交联而丧失功能,并形成脂褐素,可以引起机体的衰老与死亡[10]。本实验结果显示,D-半乳糖致大鼠的血清SOD活性下降,MDA水平升高,说明D-半乳糖进入体内引起的氧自由基代谢失衡是诱发衰老的主要原因。

选用D-半乳糖来建立衰老动物模型常用大鼠和小鼠,由于雄性动物的反应较雌性动物反应敏感,大多选择雄性动物,以Wistar大鼠、SD大鼠、昆明小鼠和ICR小鼠最常见,没有种属、月龄和体重的区别。一般采用颈背部皮下注射和腹腔注射两种方法,此外,还有口服给药途径。李春海等[11]给大、小鼠口服D-半乳糖700 mg/(kg·d)连续6周,可造成较好衰老的效应,与皮下注射70 mg/(kg·d)连续6周造成的衰老效应相似,但某些生化指标检测不及皮下注射给药途径显著。有关D-半乳糖诱导剂量和造模时间目前尚无统一规定。根据文献报道,剂量范围在50~500 mg/(kg·d)连续6~8周给药比较合适[12]。本实验采用D-半乳糖50 mg/(kg·d)颈背部皮下注射和500 mg/(kg·d)腹腔注射连续6周,试验效果良好,两者比较差异无统计学意义(P<0.05)。同时在造模过程中应注意给药时间应准时,D-半乳糖溶液需密封保存,防止发生变质,并根据动物体重变化调整D-半乳糖注射剂量,注射时采取无菌操作,避免引起大鼠因感染而死亡。

D-半乳糖衰老模型 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种健康小鼠 (85±3d龄) 24只, 体重20～25g, 雌雄各半, 购于佳木斯大学实验动物中心。

1.2 材料与试剂

藏灵菇菌种为佳木斯大学生命学院微生物实验室低温保存菌种。藏灵菇制备:每天定时无菌称取藏灵菇2g, 用冷开水洗净, 接入200mL伊利纯牛奶中, 在恒温箱中 (20±1) ℃培养20h后, 取发酵乳备用。

D-gal (恒信化学试剂有限公司生产) , 考马斯亮兰蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 和丙二醛 (MDA) 测定试剂盒 (均为南京建成生物工程研究所产品, 批号20101206-15) 。

1.3 仪器

722PC分光光度计 (上海棱光技术有限公司) , 组织匀浆机, 高灵敏度pH计 (上海精密科学仪器公司) , 离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司) , 电子天平等 (北京赛多利斯天平有限公司, d=0.1mg) 。

1.4 动物分组与给药

将雌雄各12只小鼠分别随机分成3 组:青年对照组、衰老模型组和藏灵菇发酵乳组, 分笼饲养, 每组8只, 每笼4只, 给予标准饲料喂养。室内温度18～20 ℃, 相对湿度50%～60%,

青年组每日上午灌服温开水0.5mL/只, 腹腔注射生理盐水0.65mL/只;衰老组每日上午灌服温开水0.5mL/只, 注射D-gal (剂量100mg/kg体重/只) , 同时;藏灵菇发酵乳组每天注射同样剂量D-gal, 同时灌服藏灵菇发酵乳0.5mL/只。连续处理30d。

1.5 10%脑组织匀浆的制备

末次给药24h后, 断颈处死小鼠, 迅速在冰板上取脑组织, 用滤纸吸干残血后, 称质量, 计算脑器官指数。按试剂盒说明书的要求进行测试。在冰板上称取2 g, 用预冷的0.86%生理盐水, 在冰水中用组织匀浆机制备脑组织匀浆。测定蛋白质含量, MDA含量, SOD、GSH-Px活力等脑组织氧化水平。

1.6 生化指标的检测

按测试盒说明书所示方法、步骤进行蛋白质含量测定 (考马斯亮蓝法) , SOD活性测定 (黄嘌呤氧化酶法) 和MDA含量 (TBA反应比色法) 测定。

1.7 统计学方法

实验数据用SPSS11.5统计软件处理, 进行方差分析和 LSD-t检验, 以均数±标准差undefined表示, 组间均数比较采用t检验。

2 结果

藏灵菇发酵乳对小鼠脑组织SOD、GSH - Px活力和MDA含量的影响, 见表1。

与衰老模型组比较:1) P<0.01, 2) P<0.05。

由表1可见, 与青年对照组相比, D-gal 诱导的衰老模型组小鼠的脑组织SOD、GSH-Px 活力极显著降低 (P<0.01) , MDA含量极显著增加 (P<0.01) ;藏灵菇发酵乳灌胃组脑组织SOD活力极显著增加 (P<0.01) , GSH-Px活力显著增加 (P<0.05) , MDA含量极显著降低 (P<0.01) 。

3 讨论

衰老是机体内各种生理生化反应的综合过程。自由基学说是目前最有说服力的衰老学说之一。自由基能诱发细胞膜或细胞器膜中不饱和脂肪酸发生过氧化作用, 进而损伤细胞引发机体衰老。因此, 如能减少自由基生成和增强机体抗自由基能力、有效维持二者之间的动态平衡, 必定会有延缓衰老、促进健康的作用。超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 是机体内重要的天然抗氧化酶, 其作用是清除自由基堆积, 抑制生物膜脂质过氧化, 防止自由基对细胞结构的破坏。机体脂质过氧化产物MDA对细胞有毒性, 其含量可间接反映组织细胞的损伤程度。脑是机体最重要的中枢神经器官, 脑组织也是耗氧量最高、代谢最旺盛的组织, 因而是最容易受氧化损伤的组织。脑的器官指数及其组织中自由基代谢变化可以反应机体衰老程度。

本实验表明, D-gal所致衰老模型小鼠脑组织抗氧化酶活力降低, 抗氧化能力降低, 脂质过氧化物MDA产生增多, 脑组织氧化损伤严重。长期饲喂藏灵菇发酵乳有显著提高衰老小鼠的脑组织中SOD、GSH-Px活性, 明显降低衰老小鼠的脑组织中MDA含量的作用。因此藏灵菇发酵乳有一定的提高脑组织抗氧化酶的活性, 减少脂质过氧化物的产生, 提高对自由基的清除能力, 能够抑制和修复由D-半乳糖代谢产生的自由基和有毒物质造成的脑组织细胞的氧化损伤, 减缓脑的衰老提高记忆和反应能力。

摘要：目的:通过对小鼠腹腔注射D-gal制造衰老模型小鼠。方法:用藏灵菇发酵乳对小鼠进行灌胃处理, 采用黄嘌呤氧化酶法, TBA反应比色法, 测定小鼠脑组织中总超氧化物歧化酶 (T-SOD) , 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性, 丙二醛 (MDA) 的含量变化, 进一步研究藏灵菇发酵乳的抗氧化抗衰老作用及其机理。结果:发现藏灵菇发酵乳能极显著提高D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织T-SOD活性, 显著提高GSH-Px活性, 极显著降低MDA的含量。结论:证明藏灵菇发酵乳具有显著清除衰老小鼠脑组织氧自由基能力, 提高抗氧化酶活性, 抑制小鼠脑自由基从而发挥抗衰老作用。

关键词：藏灵菇,脑,抗衰老机制,小鼠

参考文献

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D-半乳糖衰老模型 篇4

巴戟天最早是作为一种壮阳中药应用于一些基础研究和临床的,后来研究发现其具有补肾壮阳、增强性欲、抗肿瘤、缓解抑郁症状以及抗衰老等多种作用,作为提取自巴戟天的巴戟天醇提物也具有类似的作用[2,3]。以往的研究证实,巴戟天醇提物通过抗氧化以及抗凋亡而发挥其抗衰老作用的[4],而关于其对衰老大鼠免疫功能的影响尚未有报道。因此,作者旨在通过将巴戟天醇提物应用于D-半乳糖致衰老大鼠模型来探讨其对衰老大鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

巴戟天醇提物提取自巴戟天(一等品,广东省德庆县药材公司,河南省食品药品检验所鉴定);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、刀豆素(canavalin,Con A)(批号:20120203、201200123,美国Sigma公司);大鼠白介素-2(IL-2),定量酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号:20120417,美国RD公司);PE-兔抗大鼠CD28单抗(批号:12-0280-81,美国e Bioscience公司);考马斯亮兰试剂盒(批号:20120509,南京建成生物工程研究所)。

1.2 仪器

CASTEAX2100型全自动酶联免疫分析仪(美国Beckman公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dicknson公司)。

1.3 实验动物

健康雄性Wistar大鼠,4月龄,体重200~245 g,平均(223±12)g,由河南省实验动物中心提供。

1.4 分组及处理

50只大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、维生素E组、巴戟天高剂量组、巴戟天低剂量组,每组各10只,各组大鼠常规分笼饲养。模型对照组及巴戟天高、低剂量组大鼠均每天皮下注射质量分数5%D-半乳糖1 m L/kg;空白对照组大鼠均每天皮下注射质量分数0.85%氯化钠溶液1 m L/kg;维生素E组大鼠每天在给予D-半乳糖的同时,给予维生素E 50 mg/(kg·d)灌胃;巴戟天高、低剂量组大鼠在每天给予D-半乳糖的同时,分别给予巴戟天醇提物2.1、0.7 g/(kg·d)灌胃。所有大鼠均连续给药8周,之后进行免疫功能相关指标的检测。

1.5 大鼠脏器指数的检测

首先对每只大鼠进行称重,并记录,然后常规解剖,无菌条件下取出脾脏、胸腺进行称重,计算脏器指数,公式如下:脾脏指数或胸腺指数=(脾脏重量或胸腺重量/大鼠体重)×100%。

1.6 淋巴细胞转化试验

末次给药后次日,将取出的部分脾脏制成脾细胞悬液,调节细胞浓度至1×107/mL,然后加入96孔培养板,每孔200μL,再加入20μg/mL ConA(用于T淋巴细胞转化试验)或LPS(用于B淋巴细胞转化试验),并设对照孔以及Con A刺激孔或LPS刺激孔。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育72 h,并采用MTT法测定570 nm处OD值,根据OD值计算T、B淋巴细胞刺激指数,计算公式如下:刺激指数(SI)=(刺激孔OD值/对照孔OD值)×100%。所有实验重复3次,每次设3个复孔。

1.7 IL-2表达检测

末次给药后次日,将取出的部分脾脏与0.85%氯化钠溶液制成10%脾脏组织匀浆,采用双抗夹心ELISA法定量检测IL-2,具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.8 CD28表达检测

末次给药后次日,从取出的脾脏中取1 mm3脾脏组织剪碎,制成脾细胞悬液,取脾细胞悬液100μL用红细胞裂解液裂解红细胞直至液体变成无色透明,然后3 000 r/min离心3 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,调脾细胞浓度至2×106/m L,取其中40μL加入试管,同时往试管中加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD28单抗10μL,震荡混匀,并于4℃冰箱中孵育30 min,PBS洗涤,3 000 r/min离心3 min,然后细胞定容至0.5 m L到专用试管,上流式细胞仪进行CD28阳性淋巴细胞检测。

1.9 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巴戟天醇提物对大鼠脏器指数的影响

模型对照组胸腺指数、脾脏指数明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组胸腺指数、脾脏指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

2.2 巴戟天醇提物对大鼠淋巴细胞的影响

模型对照组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

2.3 巴戟天醇提物对大鼠IL-2及CD28的影响

模型对照组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

3 讨论

衰老的发生机制众多,诸如自由基过剩导致衰老理论、衰老的细胞凋亡学说、衰老的免疫功能障碍学说等,随着衰老相关机制的研究进展,衰老的免疫学说的地位越来越高。越来越多的研究表明,免疫功能下降是机体出现衰老的征兆和重要因素[5,6],随着增龄化的进展,机体免疫器官老化,免疫细胞、免疫相关因子的数量和功能发生明显变化,从而导致了感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的发病率上升。D-半乳糖是一种常用的致衰老药物,其制作的模型已经被广泛应用于实验研究。研究表明,D-半乳糖致衰老模型其各种免疫功能相关指标的变化与自然衰老一致[7],例如免疫器官老化、淋巴细胞转化能力减弱、机体IL-2水平降低、胸腺指数及脾脏指数降低等。因此,本研究选择D-半乳糖致衰老模型代替自然衰老模型是切实可行的。本研究结果也提示,D-半乳糖能够降低大鼠胸腺指数、脾脏指数,T、B淋巴细胞SI,IL-2水平,以及体内CD28阳性淋巴细胞数量,进一步验证了机体免疫功能的衰退是导致衰老发生的重要因素。

胸腺是免疫调节的中枢器官,主要用于为T淋巴细胞的分化、成熟提供场所,对于机体的细胞免疫功能以及免疫反应的发生具有重要作用。而脾脏是最大的外周免疫器官,其为各种成熟的淋巴细胞提供定居场所以及发生免疫应答。胸腺和脾脏均会随着机体的增龄化进程,质量变轻,功能下降[8]。本研究结果提示,高、低剂量的巴戟天醇提物与阳性对照药物维生素E相似,均具有提高衰老大鼠脏器指数的作用,且两种剂量的巴戟天醇提物的作用不同,低剂量者作用较弱(P<0.05)。

T、B淋巴细胞在机体发生特异性免疫应答中发挥重要作用。其中T淋巴细胞主要介导细胞免疫,其杀伤作用及分泌免疫相关因子能力的下降导致机体自身免疫性疾病、恶性肿瘤等发生,随着年龄的增大,T淋巴细胞的数量和功能均会下降[9]。B淋巴细胞主要参与机体的体液免疫,通常通过分泌细胞因子进行免疫调节,且这种分泌作用于年龄的增长呈负相关[9,10]。本组实验结果提示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够有效提高衰老大鼠降低的T、B淋巴细胞转化能力,从而促进这些细胞的增殖,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

IL-2主要由活化的T淋巴细胞分泌,特别是辅助性T淋巴细胞分泌能力更强。IL-2具有较强的免疫调节作用,能够促进T淋巴细胞的增殖、分化,增强T淋巴细胞及NK细胞的活性,同时还可以通过促进干扰素合成而增强细胞杀伤力。IL-2随年龄增加分泌减少被认为是衰老的免疫学说的主要分子机制[11]。本实验结果显示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠IL-2表达水平,从而促进T淋巴细胞及NK细胞的的增殖及杀伤作用等,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

CD28分子是广泛表达于T淋巴细胞表面的共刺激分子,为T淋巴细胞的活化提供第二信使,从而发挥重要作用[12]。另外,CD28还参与免疫维持及下调免疫功能,在免疫功能平衡与稳定过程中发挥重要作用。随着机体的老化,CD28分子信号转到能力下降,进而导致T淋巴细胞的增殖活化受阻,同时IL-2等细胞因子分泌减少,以致机体的细胞免疫和体液免疫均呈现衰退和紊乱,这也导致了机体的衰老[13]。本组结果显示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠CD28阳性淋巴细胞数量,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

D-半乳糖衰老模型 篇5

关键词：大鼠,D-氨基半乳糖,肝衰竭

祖国医学认为肝脏和眼睛有较深的联系, “肝开窍于目”, “肝主目”都是前人总结的经典论点。对于这些理论, 有些学者通过对肝经瘀滞的眼底病患者进行肝、肺血流图描记, 得出肝与眼在血流动力学方面存在内在联系的结论[1]。

现代西医的研究也有类似发现, 肝炎、肝硬化以及肝癌往往伴随有视物模糊, 眼内干涩和视网膜动脉扩张等眼部病患。为证实并探究肝脏和眼睛的内部联系, 笔者通过D-氨基半乳糖诱导的肝衰竭模型大鼠的视力变化的研究。

1 材料与方法

1.1 材料:

健康雄性SD大鼠 (购自郑州大学实验动物中心) 14只 (随机分为数量相同的2组, 实验组:7只, D-氨基半乳糖诱导肝衰竭;对照组:7只, 注射等量0.9%氯化钠溶液) 。D-氨基半乳糖 (sigma) 。可调节光亮度手电筒 (市售) , 0.9%氯化钠溶液 (河北福乐尔动物保健品有限公司) , 自动脱水包埋一体机, 苏木素染液、伊红染液。

1.2 动物模型建立:

14只SD大鼠随机分为2组, 每组7只。实验组动物腹腔注射1.4g/kg的D-氨基半乳糖[2];对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.3 实验动物测试:

分别于注射D-氨基半乳糖6小时、12小时、24小时、48小时、72小时用手电筒用弱光、中光、强光检测SD大鼠对光线反应能力。

1.4 实验动物组织学取材及观察:

72小时候, 分别取实验组及对照组3只SD大鼠肝脏及研究标本, 4%多聚甲醛固定, 脱水透明, 石蜡包埋, 常规切片后HE染色, 在具摄像功能的显微镜下观察组织变化并拍照。

2 结果

2.1 SD大鼠视力 (表1) 。

2.2 组织学观察:

对照组大鼠肝细胞所围绕中央静脉放射状排列, 未出现肝细胞坏死, 实验组肝细胞分布没有规律, 散在分布, 并有多量肝细胞坏死。与对照组相比, 实验组出现视网膜增厚, 血管充血, 结缔组织水肿等现象。肝脏组织学变化与眼球组织学变化有相关性。

3 讨论

3.1 大鼠肝衰竭模型主要用肝毒性药物建模, 主要使用的药物有D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺、对乙酰氨基酚、四氯化碳等, 而D-氨基半乳糖是尿嘧啶干扰剂, 可造成肝细胞索弥漫性坏死及炎症, 该模型研究较多, 已经接近成熟[3], 所以在模型的选择上, 由于主要目的不是建模, 而是建立肝脏和眼球的组织学关系, 所以笔者选择更为成熟的D-氨基半乳糖诱导的肝衰竭模型。

3.2 眼睛疾病的中医认为其主要病机有感风热胜、肝肾亏虚等与肝脏相关的论述[4], 其理论基础就是足厥阴肝经有一分支从目系分出, 另一分支从肝分出[1], 所以两者在经络上是相通的, 他们之间就有一定的从属关系。诚然, 近年来对于中医经络的本质, 有不同步观点, 具体其通过一种什么力量发挥作用, 至今还没有定论。

3.3 基于以上讨论, 保护肝脏, 对保护眼睛有一定的作用, 不同学者发现黄芩苷[5]和脂氧素A[6]对D-氨基半乳糖诱导的肝衰竭模型大鼠的肝脏组织有不同程度的修复作用, 但是其对眼睛的保护作用及保护程度还不得而知。而反过来, 如果眼睛损伤之后, 对肝脏的影响也未可知, 有学者研究复合肥对大鼠眼睛损伤, 但是为涉及到肝脏的损伤[7], 希望未来在这方面有更广阔的研究。

基于笔者知识, 在肝脏的肝血窦和窦周隙存在一种储脂细胞, 有储存脂肪和维生素A作用, 而维生素A及其产物视黄醛在视力的维持中发挥着重要的作用。肝脏储存维生素A的功能与眼睛对维生素A的需要之间又有什么关联呢?希望在以后的研究和探索中, 笔者或者广大学者能对这个问题作出正面的回答。

参考文献

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[6]黄乐, 田德英.脂氧素A4在大鼠急性肝衰竭中的作用[J].中国医药科学, 2013, 3 (7) :38-40.

D-半乳糖衰老模型 篇6

关键词：葡萄内酯,D-半乳糖模型,学习记忆能力,乙酰胆碱酯酶(Ach E)

人体衰老存在学习记忆减退和认知障碍。动物试验研究结果表明,衰老与认知功能障碍密切相关。注射D - 半乳糖建立D - 半乳糖衰老动物模型是我国学者最先报道的,是较有代表性的痴呆动物模型。D - 半乳糖诱导的衰老动物模型,表现为学习记忆下降,在生理、生化指标各个方面类似于自然衰老,广泛应用于筛选药物以及评价具有延缓衰老功能的保健品方面。

葡萄内酯又名橙皮油素,是一种香豆类化合物,普遍存在于芸香科植物中,具有广泛的生物活性。本试验所用的葡萄内酯为枳壳醇提脂溶性部位分离纯化的化学成分,前期的试验证明枳壳的醇提脂溶性部位能够抑制乙酰胆碱酯酶( Ach E) ,提高乙酰胆碱( Ach) 递质水平,达到增强胃肠动力的作用,从而发挥枳壳的中医临床治疗效果。有人还报道了葡萄内酯是一种Ach E抑制剂[1,2],对神经细胞具有保护作用,同时还具有抗癌、抗炎及免疫调节作用[3,4,5,6,7]。但关于葡萄内酯对D - 半乳糖致亚急性衰老小鼠模型学习记忆改善作用方面的研究尚未见报道。本研究选用2月龄的清洁级雌性昆明小鼠,以D - 半乳糖120 mg / kg的剂量每日颈背部皮肤注射,连续造模并给药60 d后,采用Morris水迷宫试验观察葡萄内酯对D - 半乳糖模型小鼠学习记忆的改善作用,并结合试剂盒检测 其生化指 标[包括超氧 化物歧化 酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、Ach E、谷氨酸( Glu) ]的变化,为葡萄内酯在抗老年痴呆方面提供试验依据。

1 材料

1. 1 试剂

食用豆油,市购; D - 半乳糖( 25 g /瓶) ,国外进口分装; 考马斯亮蓝试剂盒( 批号为20101021) 、SOD试剂盒 ( 批号为20101027) 、Ach E试剂盒 ( 批号为20101028) 、MDA试剂盒( 批号为20101006) 、谷氨酸试剂盒( 批号为20101029) ,购自南京建成生物工程研究所; 水为双蒸水; 其他试剂均为分析纯。

1. 2 药物

葡萄内酯( 批号为20090310) ,由江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室制备,经光谱确定结构,HPLC峰面积归一化计算纯度 > 99% ; 安理申( 批号为091222A) ,卫材中国药业有限公司制造。

1. 3 试验动物

2月龄清洁级雌性昆明小鼠90只[生产许可证号为SCXK( 赣) 2011 - 0001],体重为( 25±2) g,江西中医药大学实验动物科技中心提供。

1. 4 仪器

电子秤( HZT - 6000) ,购自福建华志科学仪器有限公司; Morris水迷宫硬件与视频分析系统Xe Ye( V.3. 2) ,购自北京天鸣宏远科技发展有限公司; 手术器械及分析天平 ( Sartorius,BT224S) 、Eppendorf移液枪、岛津2550型紫外分光光度计、德国Sigma3 - 18k高速冷冻离心机、Milibo超纯水装置、DW - 86L386海尔超低保存箱、IKAT18B匀浆机,江西中医药大学实验动物科技中心提供。

2 方法

2. 1 动物造模、分组及给药

将90只昆明小鼠于屏障试验环境内饲养,自由摄食和饮水,在预饲养1周后随机分别设为空白对照组、模型对照组、安理申阳性药组和葡萄内酯高、中、低剂量组。其中模型对照组及试药各组动物每日颈背部皮下注射D - 半乳糖120 mg /kg,空白对照组皮下注射等量生理盐水,连续60 d造模。葡萄内酯给药组造模时同时给予不同剂量的药物,按人( 以60 kg体重为标准) 每天的给药剂量2. 5,5,10 mg进行换算,以小鼠标准体重20 g计算,灌胃剂量分别为葡萄内酯低剂量组0. 514 mg /kg,葡萄内酯 中剂量组1. 028 mg / kg,葡萄内酯高剂量组2. 055 mg / kg; 安理申阳性药组给予安理申1. 028 mg /kg,模型对照组和空白对照组给予等量食用油。连续灌胃60 d。

2. 2 动物行为学测试

造模给药60 d后,采用Morris水迷宫试验方法测试小鼠的学习记忆能力[8]。水迷宫试验共7 d,分为两部分。

2. 2. 1定位航行试验定位航行试验时间为1 ~6 d,即每天1次,历时6 d,跟踪记录小鼠的游泳轨迹。将小鼠面向池壁,选取离平台最远象限作为入水点,记录小鼠在2 min内寻找到平台的时间( 称逃避潜伏期) ,如果超过2 min未找到平台,潜伏期记为120 s,计时结束试验者可以帮助小鼠找到平台,并停留10 s。试验结束后将小鼠放回鼠笼中。小鼠的逃避潜伏期作为评价小鼠学习记忆能力的指标。

2. 2. 2空间探索试验定位航行6 d后,即第7天撤掉迷宫平台,其他同定位航行试验,记录其穿越平台次数及经过平台所在象限的停留时间,考察小鼠对平台空间位置记忆的保持能力。

2. 3 生化指标的检测

水迷宫试验结束后,将各组小鼠断头处死,迅速取脑组织,置于4℃预冷的生理盐水中,拭干血水,称重,将剪细的组织倒入玻璃匀浆管中,加入9倍体积的生理盐水,用冷冻离心机3 500 r/min离心10 ~15 min,弃去沉淀,即得10% 脑组织匀浆上清液。取上清液置 - 20℃冰箱保存,待测。严格按试剂盒说明进行SOD、MDA、Ach E、Glu的测定。

2. 4 数据的统计学处理

所测数据均以“±s”表示,采用SPSS13. 0统计软件进行两样本的t检验,P < 0. 05表示有显著差异,P < 0. 01表示有极显著差异。

3 结果

3. 1 葡萄内酯对学习与记忆行为考察结果

3. 1. 1定位航行试验试验观察到,一般训练到第3天后,小鼠水迷宫的成绩基本趋于稳定,遂以第4,5,6天3 d的平均成绩为试验数据进行分析,结果见表1。

注: 与模型对照组比较,数据肩标* 表示差异显著( P < 0. 05) 。

从表1可以看出,与模型对照组比较,安理申阳性药组、葡萄内酯低剂量组( 0. 514 mg /kg) 、葡萄内酯中剂量组 ( 1. 028 mg /kg) 和葡萄内酯高剂量组( 2. 055 mg /kg) 的逃避潜伏期明显缩短,具有显著性差异( P < 0. 05) ,但与空白对照组无显著差异。结果表明: 葡萄内酯有增强D - 半乳糖模型小鼠学习记忆能力的作用。

3. 1. 2空间探索试验结果见表2。

注: 组间数据无统计学意义。

撤除平台后,与模型对照组比较,空白对照组、安理申阳性药组、葡萄内酯低( 0. 514 mg /kg) 和中剂量组( 1. 028 mg /kg) 在Morris水迷宫经过平台所在象限的停留时间延长,穿越平台次数有增多的趋势,但不具有统计学意义。结果表明: 葡萄内酯有改善D - 半乳糖模型小鼠对空间位置记忆能力作用的趋势。

3. 2 葡萄内酯对脑组织生化指标的影响( 见表 3)

注: 与模型对照组比较,数据肩标* 表示差异显著( P < 0. 05) ,无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。

从表3可以看出: 各给药组与模型对照组比较,Glu含量之间无显著性差异( P > 0. 05 ) ,但各给药组小鼠脑组织中Glu含量与空白对照组接近; 对于SOD,安理申阳性药组和葡萄内酯低、中、高剂量组与模型对照组比较,SOD活性明显升高,且安理申阳性药组和葡萄内酯中、高剂量组与模型对照组比较具有显著性差异( P < 0. 05) ; 对于MDA,给药各组与模型对照组比较,MDA含量均有下降,且葡萄内酯中剂量组( 1. 028 mg /kg) 与模型对照组比较有显著性差异( P < 0. 05) ,表明葡萄内酯在中剂量( 1. 028 mg /kg)可以降低D - 半乳糖模型小鼠脑组织中MDA含量,起到对神经细胞的保护作用; 对于Ach E,各给药组与模型对照组比较,Ach E的活性均有所降低,且葡萄内酯中 剂量组 ( 1. 028 mg /kg ) 和高剂量 组( 2. 055 mg /kg) 与模型对照组之间比较有显著性差异( P < 0. 05) 。

4 讨论

D - 半乳糖诱导氧化损伤模型是以代谢紊乱学说为理论依据而制作的,是较理想的动物衰老模型[9]。这是由于在一定时间内连续给动物注射D -半乳糖,使机体细胞内半乳糖的浓度增高,在醛糖还原酶催化下还原为半乳糖醇和H2O2,半乳糖醇破坏机体抗氧化防御系统,使自由基积聚,引起组织、细胞的氧化损伤,还可引起蛋白质交联; 另外,半乳糖醇由于不能被细胞进一步代谢而堆积,从而影响正常渗透压,导致细胞肿胀和功能障碍,代谢紊乱,最终导致衰老的发生。本试验用D - 半乳糖造模的动物脑中,SOD活性明显下降,而MDA及Ach E的含量明显偏高,逃避潜伏期的时间明显增加,进一步说明用D -半乳糖复制衰老模型是成功的。

本次试验中,葡萄内酯各剂量组与模型对照组比较,Glu含量无显著差异( P > 0. 05) ,但各给药组小鼠脑组织中Glu含量与空白对照组接近,初步表明D -半乳糖模型小鼠脑组织Glu含量不会因使用D - 半乳糖造模而升高,但还有待试验再次加以验证。

另外,葡萄内酯各剂量组均能提高D - 半乳糖模型小鼠脑中SOD活性,以对抗自由基的细胞毒害和脂质的过氧化作用,防止机体受损; 能降低D - 半乳糖模型小鼠脑中的MDA含量,起到对神经细胞的保护作用; 葡萄内酯各剂量组均显示出了抑制Ach E的活性,且葡萄内酯中、高剂量组与模型对照组比较均有显著差异( P < 0. 05) ,也进一步说明了葡萄内酯可能是一种Ach E的抑制剂,预示葡萄内酯可以通过对Ach E的抑制达到增加Ach在脑中的含量,从而促进中枢神经系统中乙酰胆碱的传输,达到改善D - 半乳糖模型小鼠学习记忆的作用。

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