病原菌鉴定

病原菌鉴定（通用12篇）

病原菌鉴定 篇1

柿子 (Diospyros Kaki L.f) 为柿树科 (Ebenaceae) 柿树属 (Diospyros) 多年生落叶大乔木植物, 又名朱果, 猴枣, 原产东亚, 我国有3000多年的栽培历史[1]。柿子不仅营养丰富, 含有大量的糖类及多种维生素, 而且具有很高的药用价值和经济价值。甜柿, 作为柿子的一个品种, 广泛引种栽培于滇中-川南地域及汉江中上游区域, 尤以云南省保山市, 湖北省恩施州较为出名。危害柿树的生长的病虫害有:草履蚧、龟蜡蚧、长绵蚧、日本双棘长蠧、柿炭疽病、柿圆斑病、柿子角斑病等[2]。自从2012年以来, 在云南省保山市隆阳区蒲缥镇甜柿种植区, 个别甜柿单株发病, 出现零星死亡的现象;随后该病害就从中心病株扩展到附近单株, 发展形成发病中心;果园30%的甜柿植株受害, 在甜柿嫁接口附近产生黑色的病疤, 造成大量的落果现象, 多数果农已经开始连根挖除田间死亡的病树;2012年隆阳区农业局、果蔬站组织对蒲缥镇以外的其它甜柿种植区进行调查, 发病面积有逐渐上升的趋势, 严重的柿园已全部发病, 达到全园毁灭的程度, 造成重大经济损失, 该病已成为一种毁灭性病害。

为此对病害的发生情况进行了调查, 对病原菌进行了分离鉴定, 为病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离

1.1.1 样品采集

病株样品从云南省保山市隆阳区蒲缥镇甜柿种植区采集, 并在实验室进行分离培养实验及病原菌鉴定。该镇地理位置为E98 43~99 26, N24 46~25 38′, 海拔3655.9m, 年均气温14.9~17℃, 土壤p H为在6.0~7.0之间, 呈微酸性, 肥力中等。

1.1.2 分离培养方法

将病株洗净, 在嫁接口位置的病健交界处剪取6mm×6mm组织。用灭菌水清洗表面3~5次, 然后依次在75%酒精和0.1%升汞中进行表面消毒, 后用灭菌水清洗组织, 随后移入PDA培养基平板上。培养皿放入25℃的恒温培养箱内培养, 菌落形成后, 挑取边缘纯化菌丝转接PDA斜面保存。

1.2 形态学鉴定

观察培养分离物的生长情况, 描述其菌落形态。在显微镜下镜检菌丝、分生孢子器和产孢细胞以及分生孢子的形态特征, 测量其大小等, 参照有关资料进行鉴定。

1.3 致病性测定

选择健康的甜柿嫁接苗, 将分离纯化培养好的菌落配成孢子悬浮液 (浓度为1×106个孢子/m L) 进行接种。接种方法为微伤口涂抹法及无伤口涂抹法, 将接种后的植株放入25℃, 相对湿度95%的光照培养箱中, 定期观察发病情况。用相同的健康甜柿嫁接苗喷灭菌水作为对照。

2 结果与分析

2.1 病害症状

该病危害植株主杆基部, 发病部位嫁接口附近产生较多黑色浸渍状斑点, 随着时间的推移, 嫁接口黑色斑点不断扩大并连结成片, 形成黑色病疤 (图1-a) , 植株提前落果并成遍死亡。环境湿度大时病斑表面出现白色霉层, 霉层中伴有黑色颗粒。

注:a为甜柿黑腐病的田间症状;b为病原菌在PDA培养基上的菌落形态;c为病原菌分生孢子的形态;d为分生孢子盘释放分生孢子。

2.2 病原菌形态

病原菌菌落为白色, 放射状生长, 后期菌落上产生小黑点即为病原菌的分生孢子盘 (图1-b) 。寄住上的病菌分生孢子盘 (图1-d) 埋生在甜柿树表皮下, 成熟后突破表皮外露, 黑褐色, 直径112~238μm;分生孢子梗短, 不分枝;分生孢子纺锤形或近梭形, 有4个隔膜, 分隔处稍缢缩, 中间3个细胞榄褐色, 大小21.6~30.6 m×7.2~10 m, 顶端具纤毛3~4根, 无色 (图1-c) 。病原菌鉴定为柿拟盘多毛孢Pestalotiopsis diospyri (Syd.) Sun et Ge, 其分类地位属半知菌亚门 (Deuteromycotina) -黑盘孢目 (Melanconiales) -黑盘孢科 (Melanconiaceae) -拟盘多毛孢属 (Pestalotiopsis) [3]。

2.3 致病性测定结果

接种第14天, 在伤口涂抹法接种的植株嫁接口附近开始出现若干黑色病斑, 21d后发现其症状与田间发病植株相同, 取病组织分离培养, 镜检病原菌, 发现其分生孢子盘和分生孢子的形态特征和果园病株上的病原菌一致, 说明柿拟盘多毛孢就是造成甜柿黑腐病的病原菌, 并且该菌也感染砧木君迁子。无伤口涂抹法和清水对照组的接种均未发病, 表明该病由病原菌通过伤口进行侵染。

3 结论与讨论

甜柿黑腐病 (溃疡病) 在2006—2009年间在巴西南部普遍发生, 主要危害柿树的枝杆, 产生溃疡斑, 该病和甜柿炭疽病都是巴西甜柿的主要病害, 成为当地甜柿生产的一大障碍。国内学者对该病害的研究报道较少, 目前随着甜柿种植面积的扩大, 病害的危害也随之严重, 严重影响当地果业的发展, 开展甜柿黑腐病害的系统性研究很有必要。

参考文献

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[3]Zhang Z Y, Flora Fungorum Sinicorum (中国真菌志) Vol.14[M].Beijing:Science Press, 2003:211-233.

病原菌鉴定 篇2

自下半年开始,南方杂色鲍苗出现大规模死亡的.问题,严重影响到南方鲍鱼产业的发展.从汕尾鲍鱼场发病杂色鲍苗中分离到一批菌株,本研究对16号优势菌株进行了比较深入的工作,回归感染试验证明其为病原菌,API 20E条带分析表明其为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),药敏试验揭示其对卡那霉素、氯霉素、氨苄西林、链霉素、四环素有抗药性,但对青霉素、复方新诺明、庆大霉素、多粘霉素敏感.本研究结果为我国南方杂色鲍苗掉板症的防治提供科学依据.

作 者：周晶 蔡俊鹏 杨洪志 CAI Jun-peng ZHOU Jing YANG hong-zhi  作者单位：周晶,CAI Jun-peng(华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510640)

蔡俊鹏,ZHOU Jing(华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510640;华南理工大学食品学院,广东,广州,510640)

病原菌鉴定 篇3

关键词：奶牛；乳房炎；病原菌；分离鉴定

中图分类号： S858.237.2+6 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0271-04

奶牛乳房炎是奶牛的一种常见多发性疾病，发生乳房炎的奶牛产奶量下降，牛奶品质降低，干扰正常繁殖机能，病情严重时造成奶牛患病乳区废弃、失去泌乳能力而被淘汰，造成巨大的经济损失。引起奶牛乳房炎的因素很多，可由创口、环境微生物、传染性微生物等引起，其中传染性病原微生物引起的乳房炎最为常见，危害最大[1]。奶牛乳房炎的病原体有80～130种，其中主要为无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、霉形体、乳房链球菌、大肠杆菌、化脓杆菌等。据调查，无症状的隐性乳房炎发病率更高，约占整个牛群的50%，其中约90%由链球菌和葡萄球菌引起[2]。本试验针对天山北坡地区的4个奶牛场进行了乳房炎的调查和病原的分离与鉴定，以期找出导致该地区奶牛乳房炎的主要致病菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 来自天山北坡养牛经济带的4个奶牛场的300头产奶牛乳样。

1.1.2 培养基及试剂 绵羊鲜血琼脂培养基，BHI培养基，普通营养琼脂，购自杭州微生物试剂有限公司；奶牛隐性乳房炎临床诊断（CMT）试剂，购自北京福茂大地商贸有限公司。

1.1.3 仪器 VITEK-2全自动生化鉴定仪，精密恒温培养箱，乳品分析仪（Lactoscan 5557），体细胞计数仪（Nucleo Counter SCC-100）。

1.2 方法

1.2.1 奶样的采集及分析 分别从4个奶牛场的挤奶厅里，随机确定采样奶牛。先用温水拭净采样乳区皮肤，再用75%乙醇消毒，采用无菌操作挤奶，弃去头3把奶，用无菌瓶分别收集4个乳区的乳样，每个乳区采集约30 mL，低温冷藏保存，4 h内送回实验室进行乳品品质分析和体细胞计数。

1.2.2 乳房炎的检测 在乳样采集时，先用温水擦洗奶牛乳房，擦洗过程中注意观察乳房是否有不同程度的充血、肿胀、发硬、发热，尤其观察是否有疼痛感。若有以上症状，在挤奶过程中要特别注意，并记录牛号，观察乳汁有无变稀薄，且有无絮状物或凝块，以及脓汁和血液，若有以上症状并结合乳房变化判定为临床乳房炎。如果眼观无明显变化，则在反应盘留取奶样2 mL左右，加入等量的CMT诊断液，缓慢摇动，使奶样与诊断液充分混合，观察凝集现象并记录结果，按CMT判定标准对每个检样进行判定是否为隐性乳房炎。

1.2.3 细菌的分离培养和染色镜检 将判定为临床乳房炎的10份乳样（L1至L10）和隐性乳房炎的10份乳样（Y1至Y10），分别取0.1 mL均匀涂布于5%绵羊鲜血琼脂平板上，放入37 ℃温箱中培养24～48 h。培养后观察培养基上有无菌落生长，观察在不同培养基上所形成单个菌落的形态特征、溶血及生长情况等，对不同形态的菌落进行涂片、染色、镜检。在鲜血平板上生长的菌落形态特征、溶血及生长情况等一致，染色镜检结果相同的暂归为同一种菌；在同一个平板上同一病料初次接种生长的同一种菌，菌苔和菌落数量明显较多的归为优势菌株。

1.2.4 生化鉴定 分离到的不同种类的细菌，根据革兰氏染色情况，革兰氏阳性菌上GP生化鑒定卡，革兰氏阴性菌上GN生化鉴定卡。按照VITEK-2说明书操作进行生化鉴定。

1.2.5 药敏试验 将纯化优势菌株的单菌落接种到BHI液体培养基，37 ℃摇床培养24 h，用灭菌棉签均匀涂布于5%绵羊鲜血平板上，再分别贴上药敏纸片37 ℃培养24 h。观察对常用兽药（阿奇霉素、头孢噻肟钠、氨苄西林钠、庆大霉素、氧氟沙星、泰乐菌素、克林霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、链霉素、青霉素G）的敏感性（药敏纸片药品含量与判定标准参考杭州天和微生物试剂有限公司）。

2 结果与分析

2.1 调查概况

本试验共采集300头产奶牛的1 162份乳样，其中有38个乳区瞎。其中，临床乳房炎阳性的乳样，由于奶性质变化较大，未检测乳品品质和体细胞计数。经检测，奶牛生鲜乳平均体细胞在78.06万/mL，非脂乳固体为7.75 g/100 g（国家限量标准为≥8.1 g/100 g），密度1.026 g/mL 20 ℃/4 ℃（国家限量标准为≥1.027），蛋白质为2.86 g/100 g（国家限量标准为≥2.8 g/100 g），脂肪为4.28 g/100 g（国家限量标准为≥3.1 g/100 g），冰点为-0.48 ℃（国家限量标准为-0.5～-0.56 ℃），杂质度为2.5 mg/L（国家限量标准为≤4.0 mg/L），矿物质为0.73 g/100 g。

2.2 奶牛乳房炎发病率

通过对300头产奶牛临床诊断和乳汁变化分析，临床乳房炎结果按乳区计算的发病率为8.0%，按牛头数计算为11.2%。用CMT法检测隐性乳房炎发病率，按乳区计算为42.81%，按牛头数计算为73.24%。

2.3 细菌的分离鉴定

通过对20份乳样的细菌培养，10份临床乳房炎乳样品中，培养均发现有病原菌存在，根据菌落的形态特征、溶血和染色镜检情况等挑选分离得到8株细菌（A1至A8）；隐性乳房炎的10份乳样，在5%绵羊鲜血平板培养有8份发现有细菌生长，2份未发现任何细菌生长，根据菌落的形态特征、溶血和染色镜检情况等挑选分离得到10株细菌（B1至B10）。将分离到的18株菌，根据革兰氏染色情况，用VITEK-2 Compact鉴定出10种不同的细菌（表1），主要有：无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、少动鞘氨醇单胞菌、溶血葡萄球菌、阴道加特纳菌、西宫皮球菌/坐皮肤球菌、口腔链球菌/缓症链球菌、产硫球链菌、玫瑰色库克菌、奈瑟菌。少动鞘氨醇菌在临床乳房炎和隐性乳房炎乳样中都被分离到。临床乳房炎乳样中还分离到无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，其他菌均只在隐性乳房炎乳样中分离到。通过表2细菌分布情况可以看出，临床乳房炎中无乳链球菌占70%、金黄色葡萄球菌占80%和少动鞘氨醇单胞菌占50%，为主要优势病原菌。隐性乳房炎中少动鞘氨醇单胞菌占40%，溶血葡萄球菌占30%，西宫皮球菌/坐皮肤球菌占30%，口腔链球菌/缓症链球菌占40%，玫瑰色库克菌、产硫球链菌、阴道加特纳菌和奈瑟菌各占10%。因此，病原菌较复杂，没有明显的优势病原菌。

nlc202309010031

2.5 药敏试验

金黄色葡萄球菌全部耐药，无乳链球菌对青霉素有敏感性，少动鞘氨醇单胞菌对庆大霉素和氧氟沙星有敏感性，溶血葡萄球菌对氧氟沙星和恩诺沙星有敏感性，玫瑰色库克菌对青霉素、阿奇霉素、克林霉素、庆大霉素、氧氟沙星、氟苯尼考和头孢噻肟钠等敏感，阴道加特纳菌对头孢噻肟钠、克林霉素、氨苄西林钠、氧氟沙星、阿奇霉素和庆大霉素等有敏感性。

3 讨论

本试验中检测乳房炎的发病率非常高，隐性乳房炎头数阳性率可达73.24%，乳区阳性率达42.91%，比2008年李建军报道新疆集约化牛场隐性乳房炎头数阳性率为64.75%、乳区阳性率为36.6%有所增加。近几年规模化养殖都有合理、配套的管理程序和规范，以及先进配料和挤奶设备，为什么乳房炎的发病率有增无减呢？笔者采样时发现，在本试验采样中近10%临床乳房炎阳性牛，发病乳区所产的乳汁明显不正常，但这样的牛仍然出现在挤奶厅里，并且这样的乳区还在正常机械化挤奶。患有乳房炎的牛继续挤奶，除挤奶工本身的问题外，还有监管的问题。因此，要加大对挤奶人员的技术培训，提高专业素质；严格监管，提高责任心；严格按挤奶程序进行规范操作；及时检查奶牛个体情况，及早发现隐性乳房炎给予治疗；患乳房炎的奶牛严禁上厅挤奶，防止交叉感染。

如此高的乳房炎发病率严重影响奶牛生鲜乳的品质。本试验中生鲜乳品质分析，蛋白质含量为2.87 g/100 g，虽然达到了我国最新奶业安全标准2.8 g/100 g， 但远低于发达国家氨醇单胞菌；B9、B10：奈瑟菌

3.0 g/100 g以上的标准，与欧美国家有很大差距。非脂乳固体为7.69 g/100 g，未达到国家标准的8.1 g/100 g，密度为1.026 g/mL，也未达到国家标准的1.027 g/mL。通过比较发现，我国生鲜乳品质与欧美国家还有很大差距，因此，提高奶牛的饲喂营养水平，加强乳品质投入品的质量；改善饲养管理和环境卫生条件，严格控制和预防乳房炎的同时，也需要社会各界对奶牛产业的发展提供支持和帮助。

我国生鲜乳检测标准中还未将体细胞数列入检测指标。但国际奶牛联合会规定，体细胞数在20万～40万/mL为隐型乳房炎，50万/mL以上为临床型乳房炎[3]。目前我国也只有三元、光明、伊利等少数几家大型乳业公司在收购原料奶的时候要求控制体细胞数， 一般的要求是≤60万/mL[3]。本试产硫球链菌；i：奈瑟菌；j：阴道加特纳菌。

验检测平均生鲜乳体细胞在78.06万/mL，这也进一步反映了奶牛乳房炎的严重性。如果按照体细胞数大于60万/mL为乳房炎计算，头数乳房炎阳性率可达60.56%，乳区乳房炎阳性率达25.82%。控制体细胞的关键是控制乳房炎的发病率。在国外乳业发达国家，体细胞数是必检指标，并且都有强制的规定，比如欧盟、澳大利亚、新西兰要求不超过40万/mL，美国要求不超过75万/mL。生鲜牛奶中平均体细胞数限量最低的国家是瑞士，约为10万/mL[4]。因此我国的牛奶体细胞数控制历程还很严峻。

本试验对10份有明显症状的临床乳房炎的乳样进行细菌分离，10份乳样均检出细菌，细菌的检出率为100%。根据菌落形态分离到8株菌，鉴定为无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和少动鞘氨醇单胞菌3种菌。对10份经CMT检测阳性的隐性乳房炎的乳样进行细菌分离，8份乳样检出细菌，细菌的检出率为80%。而2份未分离到细菌，可能是因为该隐性乳房炎病原可能是支原体、衣原体或病毒等较难培养的微生物引起。根据菌落形态分离到10株菌，鉴定为8种菌。临床乳房炎为乳房炎发病后期，病原菌较单一，为常见优势病原菌，而隐性乳房炎分离到细菌较复杂，没有特定的优势菌。金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是报道的常见乳房炎病原菌。本试验从隐性乳房炎中分离到的少动鞘氨醇单胞菌[5-6]、溶血葡萄球菌[7-8]、玫瑰色库克菌[9-10]、奈瑟菌[11]、阴道加特纳菌[12]均有致病性的报道。虽然由于细菌生化鉴定仪VITEK-2 Compact 对口腔链球菌和缓症链球菌、西宫皮球菌和坐皮肤球菌两两不能区分菌种，但西宫皮球菌[13]、口腔链球菌和缓症链球菌[14]也有相关的致病性报道。坐皮肤球菌和产硫球链菌相关文献较少，是否有致病性，还有待进一步验证。

药敏试验结果显示，临床乳房炎病原菌由于长期使用抗生素治疗，产生很强的耐药性，而隐性乳房炎分离菌对大多数抗生素有敏感性，在早期治疗过程中有很好的借鉴作用。文献报道中隐性乳房炎病原菌主要有金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等[15-17]。本试验分离到隐性乳房炎细菌与报道的差异很大。可能是本試验确定的隐性乳房炎更接近发病初期，因此，所分离到的细菌均为医院报道病原菌，在发展到临床型乳房炎时被致病性更强的如金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等所取代。本试验在临床乳房炎中分离到金黄色葡萄球菌和无乳链球菌，但未分离到大肠杆菌，也可能是由于本试验样品量较少所致。

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病原菌鉴定 篇4

1 材料与方法

1.1 乳样的采集

乳样主要采自廊坊地区的 10个奶牛场, 所选牛只中12头有明显症状, 其他无临床可见症状或症状不明显。牛只按常规挤奶消毒后, 再用乙醇棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头挤去头 2～3把乳后, 无菌取乳样 10 mL, 每头牛采10个乳样, 共采集120个乳样, 贴好标签立即送检。

1.2 培养基及试剂

伊红美蓝琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、甘露醇卵黄多黏菌素B 琼脂培养基 (MYP培养基) 、营养肉汤、乳房炎诊断液、生化鉴定所用的微量发酵管及药敏纸片, 均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 乳样的检测及结果判定

在每个测试盘中倒 2 mL 乳样, 加入等量诊断液, 将测试盘水平旋转摇动, 使诊断液与乳汁充分混合, 10 s后观察, 根据混合液有无絮状物及沉淀程度来判定结果:混合液均匀, 流动性好, 无絮状物判定为阴性, 用-表示;有少许絮状物或沉淀判定为弱阳性, 用+表示; 有明显絮状物或沉淀判定为阳性, 用++表示; 絮状物或沉淀黏集成凝胶状或呈凝胶状团块判定为强阳性, 用+++或++++表示。

1.4 细菌的分离和鉴定

1.4.1 细菌的增殖

无菌操作将每份乳样加入灭菌离心管中, 3 000 r/min 离心 12 min;弃去管中上层油脂和中层液体, 用挑菌环挑取沉淀物接种于营养肉汤中, 37 ℃培养24 h, 使乳样中的细菌恢复活性并增殖。

1.4.2 细菌的分离培养

用吊菌环划线的方法将增菌后的乳样分别接种于鲜血琼脂培养基、MYP培养基、伊红美蓝琼脂培养基, 置37 ℃培养 24～48 h, 观察菌落生长情况及形态特征。

1.4.3 革兰染色

将分离、纯化的细菌进行革兰染色、镜检, 分出革兰阳性菌和革兰阴性菌, 对细菌的种类进行初步诊断。

1.5 药敏试验

选择典型的分离菌株 (葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌和大肠杆菌) 用试管法进行药物敏感试验。所选药敏纸片有青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、红霉素和克林霉素共 10种。

2 结果

2.1 乳房炎的检测结果

120个乳样中 22 个为阴性;98 个为阳性, 其中强阳性或强阳性以上的为 64个。因为其中有 34头采样牛曾用过青霉素、链霉素, 所以这个结果并不能完全反映乳房炎的感染情况。

2.2 细菌的分离鉴定结果 (见表1)

在98个阳性乳样中, 有94 个乳样检出 12 种共 224个菌株, 其中葡萄球菌 106株, 占 47.32%;链球菌 48株, 占 21.43%;大肠杆菌 32株, 占 14.29%。由葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌引起的乳房炎83.04%。

2.3 药敏试验 (结果见表2)

药敏试验结果表明:葡萄球菌对环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟和克林霉素较敏感; 链球菌则对氨苄西林、头孢噻肟和克林霉素较敏感; 丁胺卡那、氨苄西林和头孢噻肟对大肠杆菌较敏感。

3 讨论

3.1 乳房炎病原学特点

引起奶牛乳房炎的病原微生物很多, 通常主要的病原菌由葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌及支原体组成, 前两者占病原菌的 80%～95%。奶牛乳房炎主要病原的区系分布通常并不是固定的, 有地区差异, 如不少地区以无乳链球菌为主, 有些地区以停乳链球菌为主, 有些地区则以金黄色葡萄球菌为主。在同一地区, 其主要病原菌也随着抗生素的广泛应用, 挤奶和环境卫生措施的改善而发生动态变化, 如有些地区的乳房炎致病菌已由链球菌转变为葡萄球菌。本次试验结果表明, 廊坊地区10个规模奶牛场临床乳房炎的主要病原菌为葡萄球菌和链球菌, 约占68.75%;而大肠杆菌所占比例仅为 14.29%。

3.2 细菌检出情况

此次试验所检测的 120 份乳样中, 金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率远远高于其他致病菌, 是导致乳房炎的主要致病菌。金黄色葡萄球菌检出率为38.39%, 是此次试验检出率最高的一种菌。链球菌的检出率为21.43%。近年来, 各地大肠杆菌的检出率呈上升趋势。除上述主要致病菌以外, 试验还检出相对较少的其他细菌, 也是导致乳房炎的致病菌。

从此次检出的致病菌情况看, 廊坊地区的奶牛乳房炎的致病菌都是环境性致病菌, 金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率特别高, 说明廊坊地区规模化奶牛场的饲养管理条件还不完善, 对畜舍的消毒、清洁工作还有待提高。在挤奶过程中, 乳头药浴和乳房擦拭环节还没有达到技术规范要求。

3.3 乳房炎的预防

3.3.1 搞好环境卫生, 保持牛体清洁

牛舍、运动场的粪便及牛床上的垫料要及时清理, 堆积发酵;牛舍、牛床要经常用清水冲洗干净, 并定期用2%火碱水消毒;运动场要保持清洁、干燥, 尤其是雨后要及时排出积水;每日刷拭牛体, 冬季干刷, 夏季可水刷。尤其注意产后护理, 应尽量避免排出的恶露污染牛后躯。

3.3.2 要加强管理, 减少应激因素

牛栏大小设计要合理, 牛床应铺上垫草、沙子、锯末等材料以保持松软;牛舍要保持安静, 严禁惊扰牛群;夏天要做好防暑降温, 冬天要防备严寒侵袭;保证饲料品质优良, 严防饲喂发霉、变质饲料;对较大的乳房, 特别是下垂的乳房要注意保护, 免受外伤。

3.3.3 加强挤奶卫生, 严格按程序操作

1) 挤奶前应清洗乳头。

清洗乳头最好先用1∶4 000的漂白粉溶液或0.1%高锰酸钾溶液淋洗乳房及乳头;再用40～50 ℃的温水洗净乳房及乳头;最后按摩乳房, 促使乳汁释放。这一过程要轻柔、快速, 建议在15～25 s内完成。

2) 废弃最初2把乳。

废弃奶不要挤在牛床上, 应用专门容器盛装, 以减少对环境的污染。

3) 规范挤奶操作。

手工挤奶时, 应用拳握法, 禁用拉长乳头的扯捋法。分娩10 d以内的牛及乳房炎患牛要用手工挤奶, 不能上机挤奶。挤奶员要固定, 应定期查体保证健康;指甲要剪平磨光, 每次挤奶前要用消毒液洗涤双手。机器挤奶时, 真空泵压应保持在46 550～50 540 Pa (350～380 mmHg) , 频率保持在60～70次/min。

4) 挤奶后要药浴乳头。

方法是将乳头浸入药浴杯中的药液内约30 s。常用于药浴的药液有4%次氯酸钠、0.2%过氧乙酸、0.3%～0.5%洗必泰。临产牛应在预产期前10天开始, 每天1～2次药浴;泌乳牛在每班挤奶后立即进行1次药浴。

3.3.4 做好干奶期的预防工作

停乳后的头3周是重新感染乳房炎的最危险期。在干奶前最后一次挤奶后, 通过乳头管向乳房内注入长效抗菌药物是一个有效的预防措施。

3.3.5 及时治疗或淘汰病牛

羊猝死症的病原分离鉴定及其防治 篇5

羊猝死症的病原分离鉴定及其防治

羊猝死症是近年来发生的`一种新病,该病往往没有任何前驱症状,突然发病死亡,以全身实质器官及消化道出血、小肠分段性坏死为特征.给养羊业造成了巨大的经济损失.

作 者：于立业 李国锋  作者单位：于立业(梅河口市动物卫生监督所,吉林,梅河口,135000)

李国锋(梅河口市动物疫病预防控制中心,吉林,梅河口,135000)

刊 名：吉林畜牧兽医 英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2009 30(10) 分类号：S858.26 关键词： 

病原菌鉴定 篇6

关键词：雪莲果；叶腐病；链格孢；鉴定；生物学特性

中图分类号： S432.4+4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0121-03

雪莲果，属菊科葵花属植物，含有酚酸、黄酮、酯类、挥发油、多糖等成分，清肝解毒、清理肠胃、排毒通便、养颜美容，并有降血糖、降血脂、抑菌、促进铁钙吸收等药理作用，特别适合糖尿病人和减肥者食用[1-2]。近年来通过多种途径进入我国，目前已在云南、福建、贵州等地引种栽培成功[3-4]。然而，雪莲果自传入我国这十余年来，其相关理论和技术研究较少，尤其对种植过程中病虫害的发生情况及其防治措施未见深入研究及报道，这显然与近年来其发展趋势是相矛盾的。同时，近年来由于雪莲果在四川攀西地区的大面积连年种植以及气候变化等原因，雪莲果种植的各个时期叶腐病、镰刀叶斑病、褐斑病、紫斑病等叶部病害发生较为严重，且有逐年加重的趋势，对其生产带来了较大的危害，但国内外学者对雪莲果叶部病害尤其是叶腐病进行系统研究的资料甚少，这显然已不适应当前雪莲果产业的发展要求[5]。由此可知，研究雪莲果叶腐病的发生、发展规律及防治措施对雪莲果产业的发展具有重大的理论和现实意义。鉴于此，本研究在攀西地区特定条件下，对雪莲果叶腐病进行了病原菌鉴定和生物学特性研究，为雪莲果种植及病害的防治提供一定的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离、纯化及鉴定

1.1.1 样本采集及病原菌分离

病害样本采集于西昌学院农业科学学院试验田（该试验田雪莲果种植的整个时期均未施用任何化学农药），对叶部（叶面、叶缘、叶尖）病害进行症状观察和记录并带回实验室供室内试验。参照《植病研究方法》中病原真菌的组织分离法[6]对叶片上的病原菌进行分离、纯化，并经单孢分离获得纯培养菌株。

1.1.2 病原菌形态特征观察与鉴定 将菌株移于PDA平板上，置于22 ℃的恒温培养箱中培养，逐日观察记录病原菌的培养性状。经过PDA培养纯化后，挑取所得的纯菌株制片，并在显微镜下观察病原菌孢子的形态特征。根据以上性状并查阅相关文献，初步判定病原菌的种类。

1.1.3 病原菌的科赫氏法则鉴定 用所得的菌株配成孢子悬浮液，采用刺伤和无伤接种法[7-8]，把孢子液涂于雪莲果的健康叶片上，以无菌水涂抹葉片保湿作对照，然后将接种的雪莲果叶片放入具有湿润无菌纸的培养皿中，置于22 ℃的恒温培养箱内保湿培养。每处理重复3次，观察和记录接种结果，比较其发病症状是否与初次分离时的症状一致，并对接种成功的病斑再次进行组织分离，确认致病菌株。

1.2 雪莲果叶腐病病原菌生物学特性研究

处理的设置分别如下：选择燕麦培养基、PDA、PSA、玉米培养基和牛肉膏蛋白胨培养基共5种不同培养基进行雪莲果叶腐病病原菌最佳培养基筛选试验，其最优结果作为其他试验所采用的培养基；病菌最适培养pH值试验分别设置pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6个pH值梯度，筛选得到的最佳pH值作为后续试验的基础条件；病菌适宜培养温度试验设置18、20、22、24、26、28、30 ℃共7个温度梯度，所得出的最佳温度作为后续试验培养该菌的基本温度；病菌最佳培养湿度试验设置35%、50%、65%、75%、79.8%和88%共6个梯度；光照对菌落生长的影响试验设全黑暗、半光照（日光灯照射12 h光暗交替）和全光照3个处理。以上各试验每处理均做3次重复。

将活化的菌种用打孔器打成直径为0.4 cm的菌饼，分别接种后放到不同试验条件下培养，采用“十”字交叉法逐日测量菌落直径并观察生长情况。

将各项试验记录数据分别录入相应的数据文件，用Microsoft Excel和SigmaPlot 10.0软件计算各处理的平均值和标准差，并进行统计分析比较和作图。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 病原菌症状描述

该病危害雪莲果叶片，初期病部为淡黄色圆形或不规则小点，无明显晕圈，后期病斑沿叶脉呈条形散射状扩大，继而连成一片，天气潮湿时叶片腐烂，其上产生大量黑褐色霉层（图1）。

2.1.2 病原菌的培养性状及形态特征

病原菌在PDA培养基上菌落呈绒毛状，不规则圆形，菌丝初期呈灰白色至灰褐色，后期菌落表面颜色有明显分层现象，菌落中间灰黑色，边缘灰白色；接种1～2 d内气生菌丝以垂直生长为主，菌落隆起高度可达1 cm，接种3 d后菌丝横向生长速度加快，接种 6 d 后菌丝成熟，其顶端出现黑色小粒点，开始产孢（图2）。菌丝直径0.82～2.87（平均1.63） μm，早期菌丝无隔，后期逐渐产生隔膜；无性孢子为分生孢子，孢子有隔，单生或串生呈球形、卵形至长圆形，大小在7.12～13.79（平均9.72） μm×1.98～7.54（平均4.57） μm范围内；节间产生小格孢，成不规则的灰黑色四边形，格孢大小为3.30～14.41（平均9.88） μm×1.83～8.22（平均494） μm（图3）。

2.1.3 科赫氏法则证病

把从发病部位分离获得的病原菌菌株回接到健康无病的雪莲果叶片上，刺伤接种的叶片5 d后开始发病，无伤接种的叶片10 d后开始发病。无论是刺伤接种还是无伤接种，其症状特点与自然发病叶片相同，清水对照不发病。从接种的病组织分离的病原菌与自然发病组织分离的病原菌形态一致。

根据病原菌症状特点、形态特征、培养性状及科赫氏证病结果，并参考相关文献，确定从该地区雪莲果叶片上分离得到的病原菌为链格孢属（Alternaria spp.）真菌。

2.2 雪莲果叶腐病病原菌生物学特性研究

2.2.1 不同培养基对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 经活化后的雪莲果叶腐病菌在5种培养基中均可正常生长，各菌落生长的平均直径大小不一（图4）。在PDA、PSA培养基中生长无显著性差异，它们与其他培养基上的菌落平均直径呈极显著差异（P<0.01），在玉米培养基中生长最慢。在5种培养基上菌株的直径大小依次为：PDA>PSA>燕麦>牛肉膏蛋白胨>玉米培养基。其中，菌株被培养96 h时菌落直径在PDA培养基中优先达到最大，达7.13 cm，且菌丝灰白、浓密，整齐度高。因此，PDA培养基是雪莲果叶腐病菌生长的最佳培养基，并且在接下来的pH值、温度、湿度和光照条件的试验中均采用该培养基作为该菌的基础培养基。

2.2.2 不同pH值对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 将经活化后的雪莲果叶腐病菌接种到不同pH值的PDA培养基上，菌株在pH值为4.0～9.0范围内均能生长。pH值为4.0～7.0范围内菌株的菌落平均直径随pH值增加而增加；pH值为 80～9.0 时，菌落平均直径随pH值升高而减小 （图5）。菌株在pH值为4.0时生长最慢，培养7 d时其菌落平均直径仅为2.8 cm；在pH值为7.0的培养基中生长良好，培养7 d时其平均菌落直径达到7.17 cm，与其他各处理间差异达到极显著水平（P<0.01）。因此，通过该试验可以得出雪莲果叶腐病菌的最适宜生长pH值为7.0。因此，在接下来的温度、湿度和光照条件的试验中均采用该pH值条件为其基本培养条件。

2.2.3 不同温度对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 图6表明，各种温度下菌落平均直径有明显的差异，温度是影响菌株生长的重要因子。菌株在18～30 ℃都能生长，但生长的适温范围是24～26 ℃，以26 ℃最佳，在此温度下培养的菌落生长最快且菌丝浓密整齐，培养7 d时平均菌落直径达到6.97 cm，与其他各处理间差异极显著（P<0.01）。当培养温度为18 ℃和30 ℃时菌丝生长受到抑制，培养7 d时其菌落平均直径最小，分别仅为2.77 cm和2.97 cm， 与其他处理呈极显著差异。以上结果说明，雪莲果叶腐病菌生长的最适温度为26 ℃，温度过高或过低均不利于该菌株生长。因此，在接下来的湿度和光照条件试验中均采用该温度条件为该菌的基本生长条件。

2.2.4 不同湿度对雪莲果叶腐病菌菌丝生长情况的影响 将在pH值为7.0的PDA培养基上以26 ℃恒温培养的雪莲果叶腐病菌在不同湿度条件下进行培养，菌株的生长情况如图7所示。该菌在供试湿度范围35%～88%内均可生长，在湿度为50%～75%时生长较快，以65%最佳，此条件下培养的菌落生长最快，培养7 d时其平均菌落直径高达7.10 cm，与其他湿度条件的处理差异极显著（P<0.01），而當湿度为88%和35%时菌丝生长受到抑制，其菌落直径最小。通过该试验可以得出雪莲果叶腐病菌的最适宜生长湿度为65%，并将其作为光照条件试验的湿度条件。

2.2.5 不同光照条件对雪莲果叶腐病菌菌丝生长的影响 将经活化后的雪莲果叶腐病菌菌丝块接种到pH值为7.0的PDA培养基上，在温度26 ℃、湿度为65%条件下置于不同光照环境中培养，该菌株均能够正常生长，在全光照、半光照、全黑暗的生长条件下菌落的生长直径之间没有显著性差异，不同的光照条件对雪莲果叶腐病菌的生长影响不大（图8）。

3 结论与讨论

通过对雪莲果叶腐病症状的观察、病原菌的分离培养以及病原菌的鉴定，确定雪莲果叶腐病病原菌为链格孢属（Alternari spp.）真菌。

病原菌生物学特性试验中分别研究了不同培养基、pH值、温度、湿度和光照条件对雪莲果叶腐病菌生长情况的影响，采用只允许一个变量发生变化，而其他量不变的单因素试验方法，通过分步骤试验，并进行单因素方差分析找出相应的显著性关系，最后依次找出最佳试验因子。结果表明，雪莲果叶腐病菌的最适生长培养基为PDA培养基，最佳pH值为7.0，最适生长温度为26 ℃，最适生长湿度为65%，光照对其影响不大。这些结果与王仕玉等对齿瓣石斛病原链格孢菌（Alternaria tenuis）和王春江等对小麦链格孢（Alternaria triticina）的生物学特性研究的结果[9-10]基本相近，仅在对pH值变化的反应方面存在一定的差异。这可能是由于菌株在不同的地域及寄主植物上产生不同的寄生适应性，而这些适应性导致其在某些生物学特性上可能显示出一定的差别。

本研究明确了雪莲果叶腐病的致病病原菌及该菌的主要生物学特性，为进一步研究该菌奠定了基础，对于有效控制该病提供了重要的参考价值。

参考文献：

[1]吴先英，韦廷才. 新型水果——雪莲果[N]. 科学快报，2007-04-28.

[2]范金亭. 稀世保健水果——雪莲果[J]. 北方园艺，2006（5）：29-31.

[3]冷明初. 滇中新品——雪莲果的引种及管理[J]. 云南农业，2006（2）：18.

[4]郑金利. 亚贡引种观察及栽培技术[J]. 北方果树，2005（2）：51.

[5]吴先英，韦廷才.雪莲果的生物特性及其栽培技术[J]. 农技服务，2007，24（4）：101.

[6]方中达. 植病研究方法[M]. 3版.北京：中国农业出版社，1998：23-125.

[7]梁巧兰，徐秉良，杨克泽，等. 裸仁美洲南瓜叶枯病病原菌鉴定及其寄主范围和侵染条件[J]. 植物保护学报，2010，37（2）：128-132.

[8]于占晶，侯晓杰，崔建州，等. 壶瓶枣褐斑病病原菌的鉴定[J]. 植物病理学报，2010，40（1）：7-13.

[9]王仕玉，萧凤回. 齿瓣石斛病原链格孢菌生物学特性研究[J]. 华北农学报，2009，24（增刊1）：243-246.

病原菌鉴定 篇7

1材料

1.1采样

猪场采集无菌污染的10~20日龄以内出生仔猪的腹泻粪便5份,放置4℃冰箱,待检。

1.2培养基

营养琼脂,SS琼脂,麦康凯琼脂,三糖铁琼脂(TSI),蛋白胨水,葡萄糖蛋白胨水均自制,4℃保存,备用。

1.3生化试剂

甲基红,对二甲基氨基苯甲醛,乙醇,糖发酵管。

1.4药敏纸片

链霉素(10微克/片)、卡那霉素(30微克/片)、庆大霉素(10微克/片)、壮观霉素(100微克/片)、新霉素(30微克/片)、强力霉素(30微克/片)、四环素(30微克/片)、氨苄青霉素(10微克/片,)、阿莫西林(10微克/片)、苯唑青霉素(1微克/片)、洁霉素(2微克/片)、氟哌酸(10微克/片)、环丙沙星(5微克/片)、蒽诺沙星(5微克/片)、氟苯尼考(75微克/片)等15种药敏纸片。

2方法

2.1病原菌的分离

2.1.1仔猪白痢大肠杆菌的初步分离

无菌采集猪场发病仔猪粪便,将病料直接涂片,进行革兰氏染色,低倍镜下观察菌体形态、颜色、大小。然后挑取红色或砖红色的单个菌落接种于EMB琼脂平板上,37℃培养18~24小时。

2.1.2分离培养

无菌操作,取可疑菌落涂片、染色、镜检后,若符合大肠杆菌特性则将剩余的半个可疑菌落接种于EMB琼脂平板上,37℃培养18~24小时。

2.1.3纯培养

取分离培养后的EMB琼脂平板的单个菌落涂片染色镜检,无菌操作,在试管斜面上扩增培养,37℃培养18~24小时。

2.2病原菌的鉴定

2.2.1选择培养基上的生长表现

无菌条件下用接种环吊取上述所培养的一个菌落分别接种于个麦康凯琼脂、SS琼脂、EMB琼脂,37℃培养18~24小时,观察生长情况及菌落形态。

2.2.2生化试验

2.2.2.1接种糖微量发酵管

无菌操作下,吊取琼脂培养基中的菌落,分别接种于乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖等糖发酵管,37℃培养18~24小时。

2.2.2.2穿刺接种三糖铁培养基

用接种针挑取菌落,垂直刺入培养基内,然后缓缓抽出,37℃培养18~24小时。

2.2.2.3穿刺接种三糖铁培养基

用接种针挑取菌落,垂直刺入培养基内,然后缓缓抽出,37℃培养18~24小时。

2.2.2.4甲基红试验

向葡萄糖蛋白胨水的细菌培养物中加入几滴试剂、振荡,变红或橙红为阳性反应,黄色为阴性反应(从葡萄糖产酸,培养液的p H值低于4.2)。

2.2.2.5吲哚试验

向蛋白胨水的细菌培养物中先滴入2~3毫升戊醇或二甲苯,振荡,静置,再沿管壁加入试剂3~4滴,静置观察,在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应,否则为阴性反应。

2.3药敏试验

取纯培养菌接种液体培养基扩增后,再接种普通琼脂培养基,15种药物用常规的药敏纸片法进行药物敏感性试验。

3实验结果与分析

3.1病料的直接涂片、染色、镜检结果

镜下菌体呈散在的Gˉ短杆菌,菌体染色为红色,两端钝圆,有的菌体两极颜色略深,个别的弯曲呈1/3弧菌形。

3.2分离培养结果

该菌在EMB琼脂平板上,菌落圆形、湿润、表面光滑、边缘整齐的小菌落,有金属光泽。

3.3接种各种培养基上的观察结果

在营养琼脂、伊红美蓝、三糖铁、麦康凯等琼脂培养基上的均生长良好,SS琼脂上的菌落呈红色,且符合大肠杆菌生长特性,初步确定为该分离菌为大肠杆菌。

营养琼脂:灰白色、光滑、湿润、边缘整齐的圆形或椭圆形菌落。

麦康凯培养基:红色或粉红色、边缘整齐、表面光滑、露滴样的小菌落。

EMB培养基:铜绿色、有金属光泽菌落。

SS培养基:红色、露滴样的小菌落。

3.4接种糖发酵管结果

3.4.1在葡萄糖、乳糖、麦芽糖以及甘露醇发酵管中产酸产气,在蔗糖发酵管中为阴性。

3.4.2斜面穿刺三糖铁反应结果:斜面穿刺,产酸,培养基变黄,并产生气泡。

3.4.3甲基红试验结果:阳性。

3.4.4吲哚试验结果:阳性。

3.4.5分离的大肠杆菌菌株对卡那霉素、新霉素、壮观霉素中度敏感,对强力霉素轻度敏感,对其他11种药物均表现耐药现象。

4讨论

病原菌鉴定 篇8

通常水生生物个体较小,各种细菌性病原的侵袭造成的病理特征往往极为相似,难以确诊,给疾病的正确治疗带来了困难,因而在养殖生产中各种不合理用药的情况普遍存在,既增加了养殖用药成本,又给食品安全带来难以逆转的危害。因此,对疾病进行正确的诊断,分离、鉴定细菌并对其耐药性进行科学的评价就显得极为重要。在此基础上,才能摒弃不规范的用药方式,保障水产养殖业的健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 菌株

实验中所用到的菌株分离自病鱼、虾、蟹和甲鱼等标本,标本取样地点为江苏盱眙、宝应、泗阳、高淳、句容、江都、浦口和大丰。病鱼取样132份,病虾取样88份,病蟹取样39份,病甲鱼取样30份。

菌株分离纯化方法严格按照无菌操作要求,从发病症状典型的濒死动物的皮肤、鳃、肝、肾、脾等组织分别取样划线接种于普通营养琼脂培养基和硫柠胆蔗琼脂等平板,置32℃恒温培养箱内培养18～24 h后,挑取形态特征一致的优势菌落于硫柠胆蔗琼脂平板上再次划线进行纯化培养,将纯化的菌株转接到普通营养琼脂培养基斜面于4℃保存备用。

1.2 生化试剂

营养琼脂、营养肉汤、硫柠胆蔗琼脂(TCBS)、革兰氏染色液试剂盒,购自南京便诊生物科技有限公司。氧化酶、触酶、HX-21细菌鉴定药敏分析仪随机体外诊断试剂板,购自合肥恒星技术开发有限公司。

1.3 主要仪器与设备

微型漩涡混合仪、高速冷冻离心机、细菌鉴定及药敏分析仪HX-21,高压灭菌锅HVE-50,医用净化工作台,恒温振荡器等。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 革兰氏染色

参照文献[2]的方法进行,主要步骤是涂片、干燥、固定、染色和镜检。

1.4.2 氧化酶、触酶鉴定

氧化酶实验:取白色滤纸一张,蘸取菌落少许,加氧化酶试剂一滴,10 s后,紫红色为阳性,无色或黄色则为阴性。触酶实验:取18～24 h培养菌苔,置洁净玻片上,滴加1滴3%H2O2溶液,30 s内出现气泡为阳性,不产生气泡的为阴性。

1.5 自动化细菌鉴定及药敏实验

参照HX-21细菌鉴定/药敏分析仪随机体外诊断试剂板使用说明书进行。药敏实验中选择的药物有:阿莫西林、甲砜霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、多西环素、环丙沙星、土霉素、新霉素。药敏结果根据临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2006年制定的标准判读,以敏感(S)、中介(I)、耐药(R)报告结果。

1.6 分析方法

采用SPSS 16.0软件对药敏数据进行统计分析。在统计结果中以非参数检验中的Mann-Whitney U test方法确定不同类型病原菌以及气单胞菌不同群体间耐药性的差异。P<0.05作为差异显著的标准,P<0.01作为差异极显著的标准。

2 结果

2.1 病原菌的鉴定

对所采集的患病动物进行细菌分离,结果共获得菌株213株,其中鱼类样品中分离112株,虾类样品中分离63株,蟹类样品中分离29株,甲鱼样品中分离9株。对其中的130株病原菌进行了菌种鉴定,结果显示,革兰氏阳性菌仅占13%,革兰氏阴性菌占87%。革兰氏阳性菌主要为链球菌(S.agalactiae)和诺卡氏菌(N.seriolae)。革兰氏阴性菌的种类组成进行分析结果(图1),嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)和温和气单胞菌(A.sobria)仍为水生动物细菌病的主要病原菌,分别占29.80%和28.0%,豚鼠气单胞菌(A.caviae)排第三,占14.50%。创伤弧菌、弗尼斯弧菌和副溶血弧菌占比依次为9.0%、3.50%和2.80%。其他非常见病原菌如霍乱弧菌(V.Cholera)、类志贺邻单胞菌(Plesiomus Shigelloides)、威隆气单胞菌(A.Veronii)、溶藻弧菌(V.Alginolyticus)等占比12.40%。

2.2 病原菌的耐药性

2.2.1 已鉴定病原菌对受试药物的耐药性

对鉴定的130株病原菌进行总体药物敏感性实验,结果显示病原菌普遍对氧氟沙星的耐药率较高,为32.17%;其次为阿莫西林,耐药率为27.59%;新霉素最低,为11.25%(图2)。病原菌对多西环素的敏感率高达70.17%,对阿莫西林的敏感率最低,为34.57%。病原菌对阿莫西林中介率最高为62.17%,对多西环素的中介率最低为9.38%。

本实验鉴定出的病原菌对各药物的敏感率极显著高于病原菌对各药物的中介率和耐药率(P=0.001和P=0.000),而在病原菌对各药物的中介率和耐药率间无显著差异(P=0.280)。

2.2.2 气单胞菌对受试药物的耐药性

嗜水气单胞菌和温和气单胞菌是导致水生生物细菌病最主要的两种病原菌。嗜水气单胞菌对多西环素最为敏感(图3),敏感率高达98.82%。其次为新霉素和土霉素,敏感率分别为78.82%和68.24%。对恩诺沙星的耐药率最高,为69.41%,其次为阿莫西林和甲酚霉素,耐药率分别为45.88%和44.71%。

温和气单胞菌对多西环素和土霉素最为敏感(图4),敏感率为82.50%,其次为氟苯尼考,敏感率为76%。温和气单胞菌对环丙沙星最为耐受,耐药率为46.25%。

运用Mann-whitney U test检验方法统计比较了嗜水气单胞菌和温和气单胞菌耐药率、中介率和敏感率,结果显示嗜水气单胞菌和温和气单胞菌两个群体的敏感率、中介率和耐药率均无显著差异(P=0.218、P=0.971和P=0.436)。

3 讨论

实验采用的是革兰氏染色、生化反应的方法来鉴定水生生物病原菌的种类的。对于细菌的具体种属不明且对细菌的性状不了解的情况下该方法是最适合的。革兰氏阳性菌、阴性菌的区别在于其细胞壁通透性的不同,在革兰氏染色过程中脱色时间的长短会对鉴定的结果产生关键性的影响[3]。在触酶反应中,菌龄太长易造成假阳性的出现,因此在细菌培养过程中,要注意观察,合理控制菌龄。本研究表明嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌是江苏地区主要的水生生物病原菌,共占72.30%,其中嗜水气单胞菌占29.80%。

实验中对分离、鉴定出的病原菌菌株进行了药物敏感性测定,发现菌株对氟喹诺酮类药物的敏感性最低,调查统计的常用10种抗生素中,江苏地区水生生物病原菌对氧氟沙星最为耐药,这一结果与现阶段水产养殖中大量频繁使用这类药物是一致的。此外,研究还发现很多病原菌株存在对多种药物耐药的现象,尤其是对氟喹诺酮类药物的交叉耐药。陆文浩等[4]对从银鲫体内分离出的5株气单胞菌(温和气单胞菌和嗜水气单胞菌)进行药物敏感实验结果显示也存在交叉耐药现象。因此,为了保障水产养殖业的健康可持续发展,在实际生产中对于疾病应尽量明确诊断,对症下药,选择适宜的药品种类及用药剂量,同时注重轮换用药和联合用药。

参考文献

[1]马小荣,王晓丰,薛晖.江苏省渔用抗菌药物使用现状、存在问题及对策[J].水产养殖,2012,9:48-49

[2]周庭银,赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海:上海科学技术出版社,2001:5-6

[3]石鹤.菌龄和脱色时间的改变对革兰氏染色结果的影响[J].湖北师范学院学报(自然科学版),2002,22(1):93-94

病原菌鉴定 篇9

1 材料

1.1 试验动物

5尾患病中国大鲵 (体重为568~803 g) , 重庆市奉节地区养殖户送检。

健康大鲵[平均体重为 (480±50) g], 来自重庆市彭水县大鲵研究基地, 在实验室内暂养2周后用于试验。驯养和试验期间, 每2 d喂食1次, 均为鲜活、无病的草鱼和泥鳅。

健康草鱼[平均体重为 (159.5±11.8) g], 购自重庆市永川区某渔场, 在实验室内驯养1周后用于试验。

试验鱼驯养和试验期间, 每日以商品饲料喂食1次。养殖用水为曝气6 d的井水, p H值为6.8, 水温为 (19±2) ℃, 溶氧6.8~7.1 mg/L。

1.2 试验药品及试剂

试验所用中药大黄、五倍子、黄芩等) 均为市购。肠杆菌科细菌生化鉴定管及其他细菌生化鉴定所需试剂, 购自中国人民解放军浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。

2 方法

2.1 病原菌的分离、纯化

无菌条件下解剖濒临死亡的患肠炎大鲵, 采集病鲵的肝脏、肾脏和腹水, 用研钵碾碎组织并制成组织悬液, 挑取组织悬液在LB培养基平板上划线, 37℃培养过夜;挑选形态、颜色相同的单个菌落, 再次划线分离、纯化;纯化后的分离菌4℃保存, 用于毒力测定。

2.2 细菌的形态学观察与鉴定

参照参考文献[2]的方法, 观察分离、纯化的菌落形态并进行涂片, 革兰染色, 硝酸银鞭毛染色, 光学显微镜观察, 用标准测微尺测定细菌大小。

将分离、纯化的细菌接种于各种鉴定试剂管和自制的营养液中, 37℃过夜培养, 根据标准管比较观察结果。细菌鉴定参照参考文献[3]进行。

2.3 人工回归感染试验

1) 将试验草鱼驯养在1.0 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中, 胸鳍基部注射浓度为1×106cfu/m L的纯菌液1 m L, 饲养96 h后观察受试草鱼的症状, 并进行病理学检查。2) 按照暂养条件在2个饲养池中各驯养3尾大鲵, 分别采用肌肉注射和投喂两种方式开展回归感染试验:肌肉注射, 每尾注射浓度为1×106cfu/m L的纯菌液1 m L, 饲养96 h;投喂患肠炎的草鱼, 观察摄食情况, 饲养10 d。观察受试大鲵的症状, 并进行病理学检查。

2.4 细菌毒力的测定

参照参考文献[2]的方法, 按照等对数间距法将菌液浓度稀释为1×105cfu/m L、1×106cfu/m L、1×107cfu/m L、1×108cfu/m L、1×109cfu/m L 5个浓度梯度试验组, 每组试验草鱼30尾, 腹腔注射0.5 m L。同时设定对照组, 每尾试验鱼注射等量无菌生理盐水。试验组和对照组各做3个重复。按照驯养条件在同规格水族箱中饲养观察96 h, 试验期间不投饵, 并及时清污。记录试验草鱼的发病症状及死亡情况。按Karber统计法计算96 h LC50。

2.5 中草药药敏试验

将大黄、五倍子、黄芩3味中草药粉碎后各取25 g, 分别加水200~300 m L, 浸泡30 min;过滤, 将滤渣再同样煎煮2次;过滤, 将3次滤液收集在一起, 浓缩成30 m L (该药液的浓度相当于1.0 g/m L生药) ;高压灭菌, 4℃保存, 备用。复方按1∶1∶1混合, 每味中草药取10 g, 煎制方法同上。将用LB液体培养基培养的菌液稀释1 000倍后涂布培养于LB培养基, 再将浸泡中草药液的纸片贴在LB培养基上。

2.6 统计学分析

试验数据以平均数±标准差表示。所有试验数据采用SPSS 11.0软件进行One-way ANOVA分析, 显著水平为P<0.05。

3 结果与分析

3.1 患病大鲵的临床症状

患病大鲵体表黏液增多, 皮肤无光泽, 食欲减退甚至废绝, 有吐食现象, 无精打采, 行动呆滞;有些患病大鲵激动不安、乱撞池壁;有些软弱无力, 活动极少;粪便不成形, 入水不久后即散开, 严重的出现黏液脓血便;泄殖孔呈红色, 严重者轻压腹部有血水流出, 腹部膨胀。解剖病死大鲵, 可见肠道发炎、充血, 出现糜烂、黏液、脓血。

3.2 细菌的分离、纯化及形态学观察结果

从患肠炎大鲵中分离出1株致病菌, 命名为CQWL008。分离菌在LB培养基上形成灰白色、半透明、光滑、湿润的菌落, 革兰染色后镜检可见革兰阴性短杆状细菌, 大小为 (0.3~0.4) μm× (0.6~0.9) μm, 无芽孢。

3.3 细菌的生化鉴定结果

根据伯杰氏 (Bergey’s) 细菌鉴定手册, 初步鉴定所分离的大鲵肠炎致病菌为肠型点状气单胞菌。

3.4 感染试验结果

细菌毒力试验结果显示, 注射细菌的草鱼均在96 h内发病, 临床症状同3.1。回收细菌, 其形态、染色特性、生化特性与自然病例分离的致病菌相同。

根据试验结果, 大鲵肌肉注射致病菌后72小时即出现发病症状;而投喂患肠炎的草鱼, 6 d也能使大鲵发病。病原菌回收、鉴定, 可确定其为菌株CQWL008所致。

3.5 分离菌株的毒力测定结果

肠炎致病菌对草鱼96 h致死情况见表1。经病理检查, 确定试验鱼为肠型点状气单胞菌感染致死。采用Karber法计算得到肠型点状气单胞菌对大鲵的96 h LC50为1×106.2cfu/m L。

3.6 中草药药敏试验结果 (见表2)

mm

注:I表示中度敏感;S表示高度敏感。

由表2可知, CQWL008对大黄、五倍子、黄芩均具有敏感性, 对五倍子高度敏感, 也对这几种中草药组成的中草药复方高度敏感。

4 讨论

根据笔者的研究, 大鲵生产中可能致使大鲵发生肠炎的原因[4]:1) 细菌感染, 导致水产动物肠炎的病原菌为肠型点状气单胞菌, 本研究结果符合这个范畴;2) 大鲵饵料投喂过多, 摄食过饱, 导致大鲵消化不良;3) 摄食感染肠炎的饵料。大鲵肠炎的致病机制还有待进一步研究。

笔者从患肠炎大鲵肝脏组织及腹水中均分离出了相同的菌株, 初步鉴定为肠型点状气单胞菌。该菌为条件性致病菌, 具有很强的毒力, 草鱼肌肉注射96 h LC50为1×106.2cfu/m L。

在防治水产动物病害过程中, 应尽量减少药物残留和环境污染, 规范药物使用准则。可采用内外结合的方法, 避免单一用药, 以免导致病原菌产生耐药性或抗药性[5]。为此, 笔者采用几种常用中草药对病原菌开展药敏试验, 发现病原菌对五倍子或者复方高度敏感, 可以作为预防治疗药物的选择。

参考文献

[1]陈云祥, 江辉.大鲵水霉、肠炎、烂尾“三病”综合防治技术[J].中国水产, 2006 (6) :54-55.

[2]孙翰昌, 杨帆.草鱼肠炎病病原菌的分离鉴定[J].湖北农业科学, 2008, 47 (7) :824-825.

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[4]孙翰昌, 李龙非, 丁诗华, 等.两种饵料对中国大鲵生长性能的影响[J].重庆文理学院学报:自然科学版, 2012, 31 (6) :53-55.

病原菌鉴定 篇10

1 材 料

(1) 试验动物。

实验选用晋中种鸡场疑似禽霍乱死亡的病鸡, 实验所需的小白鼠 (购自山西医科大学) 。

(2) 病料。

病死鸡的肝、脾、肾、肺等。

(3) 培养基。

鲜血琼脂培养基和麦康凯培养基, 均按常规方法配制, 各类生化反应培养基和试剂购自广州合华科技有限公司。

2 方 法

2.1 从流行病学特点进行鉴定

禽霍乱病原菌为多杀性巴氏杆菌, 是一种环境中广泛存在的条件性致病菌, 当细菌和鸡体之间的平衡状态被破坏时, 细菌毒力增强而鸡体抵抗力下降, 就会发生本病。鸡群的饲养管理不当, 营养不良, 阴雨潮湿, 高温高湿, 突然换料, 通风不良, 停电, 停水, 免疫, 断喙, 长途运输, 患其他疾病等诸因素都能引起本病的发生和流行。本病有地方流行性和鸡舍局部性的特点, 传播速度较慢, 若诊治及时, 一般不会发生整群大面积发病的情况, 因此死亡率一般不高。

2.2 从临床症状及病理剖检变化进行鉴定

在该鸡场饲养密度集中的地区连续不断出现发病现象, 病鸡主要表现为精神沉郁、食欲废绝、呼吸困难、排白色水样或淡绿色稀粪。发病及死亡率都很高, 曾用多种抗生素治疗, 但效果均不理想, 应用多杀性巴氏杆菌疫苗也不能控制该疫病的流行。经剖检死鸡多只, 病理变化主要表现为心包积液, 心冠脂肪和心外膜有多量针尖大小出血点, 有肌胃和腺胃交接处可见出血点和出血斑[1], 肠道出血严重, 尤以十二指肠明显, 肠黏膜脱落, 浆膜层可见斑块状弥漫出血, 肝脏病变有特征性, 表现为肿大, 质脆, 呈棕红色或棕黄色或紫红色, 表面广泛分布针尖大小, 灰白色或灰黄色, 边缘整齐, 大小一致的坏死点。肠道内容物含有血液[2]。

2.3 从实验室检查进行鉴定

(1) 血清学检查。

采集病死鸡羽髓样本19份, 将羽根置于青霉素瓶中, 加入适量生理盐水浸毒, 用玻璃棒轻捣将羽髓压出, 反复冻融3次, 4 ℃ 8 000 r/min离心15 min , 取上清液作为待检抗原样本;从翅静脉采集病鸡血液样本3份, 4 ℃ 8 000 r/min离心15 min, 取分离血清作为待检抗体样本[3]。

(2) 细菌学检查。

①染色镜检。取病鸡肝脏直接触片, 甲醇固定, 姬姆萨慢染色12 h , 镜检可见大量两极浓染、无鞭毛的卵圆形球杆菌;将细菌纯培养物制片, 革兰氏染色, 为阴性细菌, 可观察到荚膜[4]。②分离培养。从6只病、死鸡的肝脏取病料在鲜血琼脂平板上划线分离细菌[5], 37 ℃培养24 h。

(3) 毒力试验。

将经分离纯化的菌株培养出来的菌落用生理盐水稀释后, 皮下接种小白鼠, 按0.2 mL/只, 注射5只, 同时取5只小白鼠注射生理盐水作空白对照。在同一条件下分开饲养, 观察发病情况。经过攻毒的5只小白鼠在接种多杀性巴氏杆菌后在12～24 h内全部死亡, 对照组5只小白鼠饲喂7 d均健活, 取攻毒死亡小白鼠的肝, 脾病料触片染色镜检并同时进行细菌分离培养, 镜检可见革兰氏阴性球杆菌, 美兰染色呈两极着色, 细菌分离培养后可见到典型多杀性巴氏杆菌的菌落特征。

2.4 从药敏实验进行鉴定

(1) 药敏纸片制备。

参照参考文献[6]方法, 取新星102号定性滤纸, 用打孔机制成直径为6 mm的圆形纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的试管中, 瓶口用单层牛皮纸包扎, 经高温高压灭菌15～20 min后放入37 ℃温箱使之完全干燥。吸取制备好的各抗菌药液0.5 mL分别加入装有50片圆纸片的试管中, 放入冰箱中浸润1～2 h后, 放入37 ℃温箱中使之完全干燥后放入冰箱保存备用。

(2) 药敏试验方法。

①纸片扩散法。用无菌棉签蘸取已制备好的菌液, 均匀地涂布在制备好的血琼脂平板上。等其干燥后, 用无菌镊子夹取药敏纸片贴上, 然后放入37 ℃温箱中培养18 h , 用直尺量抑菌圈直径, 记录数据[7]。②试管稀释法。每种药物需要10支无菌试管, 各组第1管加肉汤1.9 mL, 其余各管加1.0 mL。取已制备好的药液, 用吸管吸取0.1 mL加入第1管中, 充分混匀后吸取1.0 mL加入到第2管中, 充分混匀后吸取1.0 mL加入到第3管中, 依次进行倍比稀释到第9管, 充分混匀后吸取1.0 mL弃去。第10管不加药液作为空白对照。向各管内加入已制备好的菌液0.05 mL。混匀后, 放入37 ℃温箱中培养18 h。观察结果, 没有细菌生长 (培养液澄清) 的药液最大稀释倍数即为最小抑菌浓度 (MIC) 。

3 结 果

3.1 血清学检查结果

采用标准马立克病毒抗原与阳性血清, 对待检样本作琼脂凝胶扩散试验, 结果3份羽髓样本出现白色沉淀线, 阳性率为15.8% (3/19) ;病鸡血清样本均为阴性 (0/3) 。

3.2 分离培养结果

生长出直径1～2 mm, 圆形, 光滑, 半透明, 湿润的菌落, 在鲜血琼脂平板上无溶血现象, 在普通平板上生长贫瘠, 形成细小的菌落, 在马丁琼脂平板上形成水滴样小菌落, 在麦康凯琼脂平板上不表现生长。

3.3 纸片扩散法结果

9种抗菌药物对禽多杀性巴氏杆菌的体外抑菌活性结果见表1 , 敏感性评价标准参见文献[8]。从表1可以看出分离到的禽多杀性巴氏杆菌对青霉素钾和土霉素耐药。对硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、甲砜霉素和氟哌酸等5种药物敏感, 对环丙沙星和恩诺沙星极敏感。对复方新诺明的敏感性与选用的培养基密切相关, 用含蛋白胨培养基培养时, 复方新诺明对禽多杀性巴氏杆菌有较强的体外抗菌活性, 而用无蛋白胨培养基培养时, 复方新诺明对禽多杀性巴氏杆菌的体外抗菌活性明显增强。

3.4 试管稀释法的结果

9种抗菌药物对禽多杀性巴氏杆菌分离菌的体外抑菌活性结果 (试管稀释法) 见表2。各药对细菌最小抑菌浓度 (MIC) 的结果评价标准参见参考文献[9], 从表2中可以看出各种抗菌药物的MIC值从大到小依次为土霉素、青霉素钾、庆大霉素和链霉素、卡那霉素和氟哌酸及甲砜霉素、环丙沙星和恩诺沙星。

4 分析与讨论

通过分离得到的细菌的形态特征, 培养特性和生化特性试验表明, 所分离到的细菌为禽多杀性巴氏杆菌;通过动物试验进一步证明, 分离所得多杀性巴氏杆菌为致病菌。同时依据病鸡群流行病学, 临床症状, 病理变化以及病原分离鉴定结果, 确定该鸡场流行的是禽霍乱。

该鸡场发生本病后, 曾用抗生素进行治疗, 但是效果不佳, 说明禽巴氏杆菌容易产生耐药性, 因此也增加了生产成本。据报道, 禽多杀性巴氏杆菌存在多种血清型, 不同地区的菌型又有差别。但是通过应用分离纯化的细菌做成的蜂胶自家苗对以后的养殖生产有很好的保护作用, 进一步说明各地细菌流行的血清型可能不同, 这在指导临床生产疫苗应用上具有重要意义。

鸡霍乱的病原是多杀性巴氏杆菌, 该菌平时生存在鸡的呼吸道和消化道内, 鸡体健康时, 细菌再体内保持平衡状态, 不引起发病, 当鸡抵抗力降低或因环境条件改变时, 这种平衡状态即被打破, 细菌大量繁殖, 疫病迅速流行。因此预防该病的关键措施是做好平时的饲养管理工作, 使家禽保持较强的抵抗力。

近几年用禽霍乱冻干苗免疫鸡群, 常出现免疫失败, 其原因是多方面的, 其中一个非常重要的原因是疫苗菌株与致病菌抗原交叉保护性差。用发病鸡肝脏制成鸡霍乱组织灭活苗, 与禽霍乱731弱毒苗联合使用, 用于当地鸡群的免疫具有良好的效果非常值得推广应用。

鸡群发生鸡霍乱后, 紧急注射鸡霍乱组织灭活苗。同时配合使用敏感抗菌药物饮水或拌料, 可以很快地控制疫情。

禽群一旦发生禽霍乱后, 在治疗病禽的同时对禽舍, 饲养环境和饲养用具应彻底消毒或冲洗干净;粪便及时清除, 堆积发酵沤熟后利用, 将病死禽全部烧毁或深埋。

摘要：从晋中种鸡场的发病鸡采集病料, 经过涂片镜检、细菌分离培养、生化试验、动物接种, 确诊该批鸡患有鸡霍乱并从病鸡上分离到1株禽多杀性巴氏杆菌, 采用纸片扩散法和试管稀释法分别测定了青霉素钾、土霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、甲砜霉素、氟哌酸、环丙沙星和恩诺沙星等9种药物对分离菌的体外抗菌活性。结果表明分离到的禽多杀性巴氏杆菌对青霉素钾和土霉素耐药;对硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、甲砜霉素、氟哌酸敏感;对环丙沙星和恩诺沙星极敏感。结合临床症状及实验室诊断, 确诊此次疾病为多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。

关键词：禽霍乱,多杀性巴氏杆菌,药敏试验,病原分离鉴定

参考文献

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[7]黄志坚.纸片扩散法在药敏试验中的应用[J].福建畜牧兽医, 2004, 26 (6) :9-10.

[8]中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社, 1998:123.

病原菌鉴定 篇11

关键词：雪莲果；叶斑病；病原菌；杀菌剂；毒力

中图分类号： S43244文献标志码： A[HK]

文章编号：002-302（204）2-079-02[HS）][HT9SS]

收稿日期：204-03-07

基金项目：四川省教育厅青年基金项目（编号：09ZB078）

作者简介：涂勇（978—），男，四川南充人，硕士，副教授，从事植物病虫害防治方面的研究。Tel：（0834）2580028；E-mail：tuy-09@63com。

[ZK）]

雪莲果（Smallanthus sonchifolius）别称菊薯、雅贡、亚贡，原产于南美洲安第斯山。雪莲果富含人体所需的20多种氨基酸和钾、镁、锌、硒等多种微量元素及丰富的矿物质，它可调理血液，降低血糖、血脂和胆固醇，预防和治疗高血压和糖尿病，对老年人心脑血管也有明显的保健作用[2-3]。近年来雪莲果通过各种途径引入我国，目前已经在云南、福建、贵州、湖南、湖北等多个省份引种栽培成功[4-6]。然而，雪莲果自传入我国以来，与其相关的研究较少。近年来由于环境条件的变化和气候等原因，雪莲果种植的各个时期镰刀叶斑病、褐斑病、紫斑病等叶部病害发生较为严重，且有逐年加重的趋势，对其生产带来了较大的危害，但国内外学者对雪莲果叶部病害尤其是镰刀叶斑病进行系统研究的资料甚少。 因此，我们对雪莲果镰刀叶斑病进行病原菌鉴定和杀菌剂室内毒力测定，以期能筛选出高效、低毒、低残留的药剂，为雪莲果叶部病害的防治工作提供依据。

材料和方法

病原菌的分离、纯化及鉴定

样本采集及病原菌分离200—203年于西昌学院农业科学学院试验田采集具有典型病害特征的雪莲果叶片，并对照雪莲果镰刀叶斑病的田间症状（含叶面、叶尖和叶缘三个部位）特点及危害情况进行记录和描述。参照方中达的方法[7]对叶片上的病原菌进行分离、纯化，并经单孢分离获得纯培养菌株。

2病原菌形态特征观察与鉴定将菌株移于DA培养基上，置于26 ℃培养箱中，进行恒温培养，每日观察，并且记录病原菌的培养性状，并挑取已产孢的菌株制片，利用光学显微镜描述记载孢子形态及产孢结构，测量孢子大小。根据以上性状并查阅文献[8-0]，初步判定病原菌的种类。

3病原菌的科赫氏法则验证用所得的菌株配成孢子悬浮液，浓度为5×04孢子/mL，采用刺伤和无伤接离体叶片接种法，把孢子悬浮液涂抹于雪莲果的健康叶片上，以等量无菌水涂抹的叶片作为对照，然后将已接种的雪莲果叶片放入含充分湿润的无菌纸大培养皿中，置于26 ℃的恒温培养箱内保湿培养。每个处理3次重复，观察和记录结果，比较其发病症状与初次分离时的症状是否一致，并将发病叶片进行再次分离，培养获得的病原菌与原分离菌株进行比较观察，鉴定致病菌株的一致性。

2不同药剂对雪莲果镰刀叶斑病病原菌的室内毒力测定

2供试药剂供试药剂见表。

[FK（W7][HT6H][Z]表供试药剂[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK4，WK5W]药剂生产厂家

[BHDG2，WK4ZQ，WK5ZQ0W]20%烯肟·戊唑醇悬浮剂沈阳科创化学品有限公司

[BHDW]400 mg/L氟硅唑乳油上海杜邦农化有限公司

[BH]0%苯醚菌酯悬浮剂浙江禾田化工有限公司

[BH]37%苯醚甲环唑水分散粒剂[3]上海沪联生物药业（夏邑）有限公司

[BH]25%丙环唑乳油江苏丰登农药有限公司[H][BG）F][FK）]

22室内毒力测定方法

采用生长速率法[-3]对雪莲果镰刀叶斑病病原菌进行杀菌剂室内毒力测定，分别将20%烯肟·戊唑醇悬浮剂稀释成00、005、00、050、00、2000、0000 mg/L；400 g/L氟硅唑乳油稀释成00、00、050、00、2000、5000、20000 mg/L；0%苯醚菌酯悬浮剂稀释成00、005、050、00、2000、5000、20000 mg/L；37%苯醚甲环唑水分散粒剂稀释成00、005、00、050、00、2000、0000 mg/L；25%丙环唑乳油稀释成005、00、050、00、500、000、2000 mg/L。药剂各浓度配制时均比设计浓度扩大50倍进行配制，待培养基溶化后，用移液管吸取不同浓度药液 mL注入49 mL DA中，得到50 mL含药培养基溶液，趁热将其摇匀后倒入灭菌培养皿中，冷却备用。每个浓度3次重复，以 mL无菌水加入49 mL DA制作的培养基作为对照。在无菌条件下，将已活化的直径为4 mm的菌丝块分别接种于含药的培养基及对照培养基正中央，每个培养皿接菌饼块，置于26 ℃的恒温下培养5 d，用“十”字交叉法测量菌落直径（cm）。同时计算供试药剂不同浓度对病菌的抑制率，通过最小二乘法求出各单剂的毒力回归方程，对方程进行显著性分析，再求出EC50、EC90。

[HS2][4]抑菌率=[SX（]对照组菌落平均直径-处理组菌落平均直径对照组菌落平均直径[SX）]×00%。

2结果与分析

2病原菌鉴定

2症状描述

nlc202309041116

该病主要危害雪莲果叶片，叶尖、叶缘和叶面均可发病，初期病部为褐色圆形或不规则小斑点，后期逐渐蔓延扩大为深褐色不规则形病斑，严重时形成穿孔，并逐渐开始向周围扩散（图）。

22病原菌的培养性状及形态特征

将该病原菌移于DA培养基上，于26 ℃的恒温箱中人工培养7 d后，菌落直径达到64～70 cm。气生菌丝羊绒状、淡粉色，易产生军绿色黏孢团型分生孢子座（图2）。无性生殖产生分生孢子，大型分生孢子为镰刀形，0～2个分隔，多数分隔不明显，大小为（469～265） μm×（29～254） μm（图3）；未发现小型分生孢子。厚垣孢子球形，表面光滑，单生或串生。

[CM（26]23病原菌科赫氏法则鉴定结果

通过离体接种法观察[CM）]

[FK（W][TTY2tif][FK）]

[FK（W][TTY3tif][FK）]

发现，刺伤接种的叶片发病症状特点与自然发病叶片症状基本相同，清水对照不发病。从接种的病组织中分离的病原菌与自然发病病组织中分离的病原菌形态基本一致。

根據病原菌形态特点、培养性状及科赫氏法则鉴定结果，并参考相关文献，认为从西昌地区雪莲果叶片上分离得到的病原菌为镰刀菌属（Fusarium sp）真菌。

22不同药剂对病原菌的室内毒力

由表2可知，5种杀菌剂的毒力回归方程均存在极显著的直线回归关系，5种杀菌剂对雪莲果镰刀叶斑病病原菌菌落的生长均具有较强的抑制作用。其中以20%烯肟·戊唑醇悬浮剂的抑菌效果最好，其EC50为099 2 mg/L，EC90也仅为33829 8 mg/L；其次为37%苯醚甲环唑水分散粒剂，EC50为0230 5 mg/L；400 g/L氟硅唑乳油的效果在供试药剂中相对较差，其EC50为0933 9 mg/L。[FL）]

[FK（W9][HT6H][Z]表25种杀菌剂对雪莲果镰刀叶斑病菌的毒力回归方程[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK4。2，WK8。4W]药剂名称毒力回归方程t检验相关系数EC50（mg/L）EC90（mg/L）

[BHDG2，WK4ZQ，WK4ZQ2，WK8。4DWW]20%烯肟·戊唑醇悬浮剂y[DD（-][HT6]^[DD）]=0574 7x5402 722530 2[KG-3]0995 099 233829 8

[BHDW]400 g/L氟硅唑乳油y[DD（-][HT6]^[DD）]=0622 x508 55022 3[KG-3]0989 0933 907250 7

[BH]0%苯醚菌酯悬浮剂y[DD（-][HT6]^[DD）]=037 2x525 225606 0[KG-3]0989 30460 0 304067 3

[BH]37%苯醚甲环唑水分散粒剂y[DD（-][HT6]^[DD）]=0467 7x5298 262 8[KG-3]0984 50230 526706 8

[BH]25%丙环唑乳油y[DD（-][HT6]^[DD）]=0938 8x563 34308 8[KG-3]0997 90670 35538 2[H][BG）F]

注：[KG-3]表示t检验达极显著水平。[FK）]

[FL（2K2]3结论

通过对雪莲果镰刀叶斑病症状的观察，病原菌的培养性状、病原菌的产孢特性、孢子特点以及科赫氏法则证病，鉴定从病叶上所分离得到的病原菌为镰刀菌属（Fusarium sp）真菌，将其定为雪莲果镰刀叶斑病；采用低毒杀菌剂对其进行室内毒力测定结果表明，5种供试药剂的抑菌效果均较好，以20%烯肟·戊唑醇悬浮剂最佳，其EC50 仅为099 2 mg/L，EC90 为33829 8 mg/L。由于此试验仅在室内对雪莲果镰刀叶斑病病原菌进行毒力测定，20%烯肟·戊唑醇（SC）的田间防治效果以及是否具有促生作用和增产效果，有待进一步验证。

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病原菌鉴定 篇12

奶牛乳房炎的成因较多, 与病原微生物、饲养条件、营养水平、生产管理水平及奶牛自身遗传因素等都有密切的关系。其中, 病原微生物侵入乳腺组织引起炎症是该病最主要的成因。报道表明, 能够引起奶牛乳房炎的病原微生物多达80多种, 由细菌、真菌、病毒等共同组成[3]。由于地理位置及季节等因素影响, 病原微生物的组成也不尽相同, 给该病的治疗带来很大困难。本试验对大连某奶牛养殖场患临床型乳房炎奶牛牛进行病原菌分离、鉴定, 为该场及该地区奶牛乳房炎的治疗提供依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细菌鉴别培养基营养肉汤 (NB) 、营养琼脂、麦康凯琼脂、甘露醇氯化钠琼脂、SS琼脂均购自北京奥博星生物技术有限公司;改良爱德华琼脂基础购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.1.2微生物生化鉴定管肠杆菌科生化常规鉴定管、葡萄球菌属生化鉴定管、链球菌细菌生化编码鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3大肠杆菌“O”抗原定型血清大肠杆菌“O”抗原定型血清购自中国兽医药品监察所。

1.2方法

1.2.1乳样的采集采集大连某奶牛养殖场15头患临床型乳房炎病牛乳样。15头患病奶牛乳房均呈不同程度的肿胀, 皮肤发红。乳房触诊有大小不等的硬块, 疼痛敏感。并伴有体温增高、乳上淋巴结肿大、逃避及踢人现象。乳汁为灰白色、淡黄色或有血水, 呈絮状沉淀, 甚至有脓样、水样乳。

牛只按常规挤奶消毒后, 再用酒精棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头挤去头3把乳后无菌采集乳样3 m L左右, 置于灭菌的塑料离心管中, 做好标记, 放于含冰袋的保温箱中, 尽快运至实验室。1.2.2培养基的制备按照培养基说明配方配置高盐甘露醇、麦康凯、SS、改良爱德华培养基。

1.2.3细菌初步分离将乳样分别涂抹于高盐甘露醇、麦康凯、SS、改良爱德华培养基中, 37℃培养24 h, 观察各鉴别培养基中的典型菌落, 初步分离出葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌等病原菌。分别挑取典型菌落于营养肉汤中扩增, 而后20℃保存于30%甘油中待后续鉴定。

1.2.4细菌鉴定按照鉴定管说明书, 将初步分离的病原菌分别接种于肠杆菌科生化常规鉴定管、葡萄球菌属生化鉴定管、链球菌细菌生化编码鉴定管中, 孵育18~24 h后观察结果, 根据鉴定结果表或编码鉴定手册判定细菌种类。

1.2.5大肠杆菌血清型鉴定

1.2.5.1大肠杆菌血清稀释配制多价血清, 即将多种大肠埃希氏菌因子冻干血清混合溶解于10 m L0.5%石炭酸生理盐水中, 装入小瓶, 盖紧, 置2~8℃冰箱保存备用。配制单因子血清, 即将一种大肠埃希氏菌因子血清溶解于5 m L 0.5%石炭酸生理盐水中, 装入小瓶, 盖紧, 置2~8℃冰箱保存备用。

1.2.5.2大肠杆菌抗原制备将被检菌株划线接种于麦康凯琼脂平板上, 置37℃培养24 h。挑取光滑、圆整的红色菌落1~2个, 接种于半固体小管, 37℃培养24 h。取半固体培养物分别接种普通琼脂斜面小管、普通肉汤小瓶培养基, 置37℃培养24 h, 培养期间振荡普通肉汤数次。

用0.5%石炭酸生理盐水2 m L洗下普通琼脂斜面小管培养物, 置小圆底试管中, 制成浓稠菌悬液, 然后与普通肉汤小瓶培养物一起于121℃高压2 h, 破坏其“K”抗原, 制成高压抗原。

1.2.5.3玻板凝集反应取小圆底试管的高压抗原先与大肠埃希氏菌多价血清进行玻板凝集反应, 然后再与大肠埃希氏菌单因子血清进行玻板凝集反应。即高压抗原和血清各取一铂金耳置玻板上混匀, 半分钟内出现明显凝集者为“阳性”反应。同时以高压抗原与0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照, 观察有无自凝集现象。

1.2.5.4试管凝集反应在一排小圆底试管中先加稀释液0.5%石炭酸生理盐水, 第1管加1.5 m L, 从第二管起各管加0.5 m L, 然后第1管加入大肠埃希氏菌单因子血清 (1:5) 0.5 m L, 混合后, 从第1管吸0.5 m L, 加入到第2管, 依次作1:20、1:40、1:80、1:160、1:320……1:10 240对倍系列稀释, 然后各管加普通肉汤高压抗原 (被检抗原, 均10亿/m L) 0.5 m L, 振荡, 使血清和抗原充分混匀, 放入37℃温箱18~20 h, 取出后在室温静置2 h, 记录每管的反应情况。如效价达到原血清“O”效价的1/2即可作出判断。每个试验均应设有:1标准抗原+阳性血清对照;2被检抗原+阴性血清对照;3被检抗原+生理盐水对照。

结果判定:“#”——液体完全透明, 管底覆盖明显的伞状凝集沉淀物;“+++”——液体略呈混浊, 管底的伞状凝集沉淀物明显;“++”——液体呈中等程度混浊, 管底有中等量的伞状凝集沉淀物;“+”——液体不透明或透明度不明显, 有不太显著的伞状凝集沉淀物;“-”——液体混浊, 无任何凝集沉淀物, 细菌可能沉于管底, 呈圆滑圆盘状, 震荡时呈均匀混浊。以“++”作为被检抗原的效价终点。

2结果和分析

2.1被检乳样病原菌分离结果本试验共采集该奶牛养殖场15头患乳房炎奶牛的25个乳区的乳样, 分离得到病原菌37株。挑取麦康凯鉴别培养基中的金属红色圆形菌落, 进行肠杆菌生化鉴定管试验;高盐甘露醇鉴别培养基中的金黄色菌落进行葡萄球菌生化鉴定试验;改良爱德华培养基中乳白色透明针尖状菌落进行链球菌生化鉴定试验;SS培养基中金属光泽黑色菌落进行沙门氏菌生化鉴定。其中大肠杆菌15株、葡萄球菌8株、链球菌13株、沙门氏菌1株。病原菌分离比率分别为40.5%、21.6%、35.1%和2.7%。

2.2大肠杆菌血清型鉴定结果对经分离鉴定的15株大肠杆菌, 用大肠杆菌“O”抗原定型血清进行“O”型鉴定, 共鉴定出13株分离菌的血清型, 占分离菌株的86.7%。其中以O51、O148、O78、O604个血清型为主, 共10株, 占已定血清型菌株的76.9%。具体鉴定结果见表1。

3讨论

引起奶牛乳房炎的病原菌种类繁多、组成复杂, 且与地理分布及季节有关。诸多因素给该病的防治带来很大困难。因此, 准确对病原菌进行分离、鉴定, 能够为奶牛乳房炎的有效治疗提供依据。

本试验结果显示, 受试养殖场奶牛乳房炎阳性率为5.2%, 乳区阳性率为2.2%。低于国内相关报道相比[4,5], 该场发病率相对较低。与相关病例调查报道相比, 该牛场大肠杆菌及金黄色葡萄球菌分离率较高[6], 链球菌与沙门氏菌分离率与报道基本一致[7,8]。

引起该奶牛场奶牛临床型乳房炎的主要病原菌为大肠杆菌及链球菌, 且大肠杆菌主要以O51、O148、O78、O604个血清型为主。建议该场及附近的奶牛场防治奶牛乳房炎时, 可主要针对防治大肠杆菌及链球菌感染为主。

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