病原与诊断（通用9篇）
病原与诊断 篇1
腐败梭菌病又称快疫 (Braxy) , 是由梭状芽孢杆菌 (Clostridiosis) 中的腐败梭菌引起的一种急性传染病, 该菌广泛存在于土壤、粪便、灰尘等自然界环境中, 很容易污染饲料、饮水和周围环境, 通过创伤和免疫注射等途径, 引起牛、猪、鹿等多种动物感染发病。该病的特点是发病快、死亡率高。我国很多地区经常发生该病。国际上对腐败梭菌的研究比较深入, 其分泌毒素的基因序列大部分已经测序出来, 国内对腐败梭菌的各种毒素保护性基因的提取、克隆及致病机理的研究已经有了很大的进展。本文从对腐败梭菌病的病原学、流行病学、感染途径、发病症状、病理变化、诊断及防治措施等方面对该病作一概述。
1 病原
腐败梭菌是革兰氏阳性大杆菌, 细长且两端钝圆, 在动物体内外均能产生柠檬状芽孢, 不形成荚膜。在脏器中一般为单个或2~3个相连, 在肝被膜触片中可见无关节的长丝状形态。该菌能产生4种主要的外毒素, 即α、β、γ、δ毒素, 其中α毒素具有坏死、致死和溶血作用, 能产生致死毒素、坏死毒素、溶血毒素和透明质酸酶等, 是致病的重要因素, 所以国内外对α毒素的研究比较多。Gale E F等对无糖和含糖培养基及pH对产气荚膜梭菌S107株α毒素产量的影响作了比较, 结果表明, 含糖培养基在一定p H范围内均能提高α毒素产量, 且最适p H为7.0~7.5, 而无糖培养基仅在pH5.5~7.0间能产生α毒素, 且最适pH为6.0;另外, 培养基中Zn2+、Ga2+等离子含量也影响α毒素的产量。张燕等对腐败梭菌所产α毒素的激活与作用机理、功能以及对腐败梭菌α毒素的克隆、核苷酸序列和表达做了深入的研究, 并用表达的的α毒素蛋白制成类毒素疫苗, 免疫小鼠后具有一定的保护功能。陈小云等应用聚合酶链式反应 (PER) 技术, 从腐败梭菌强毒株C55-1中, 扩增出大小为1327 bp的腐败梭菌α毒素全基因。由此可见, 随着生物技术的不断发展, 对腐败梭菌的研究不仅仅局限于其病原菌的形态及生理生化特性等方面, 而且已经深入到对其所产毒素的分子水平的研究, 这将使我们更加深入的了解该菌的生物学特性, 为研制新型的基因工程疫苗, 建立快速的诊断方法提供基础的生物学理论知识。
2 流行病学
这类疫病多呈散发, 在低洼潮湿地区有时也呈地方性流行。多发生于春、秋气候骤变之时和牧草青枯交替之际。该病主要因绵羊采食了被病原菌污染的饲草和饮水而感染。在正常情况下, 此类梭菌在羊体消化道内繁殖比较缓慢, 产生的毒素也很少, 对羊体健康不构成损害, 可长期存在于羊体消化道内, 有的羊终生带菌而不发病。但在不良外界诱因作用下, 特别是在秋冬季节, 羊只受寒感冒或采食了冰冻带霜的饲草料, 机体遭受刺激, 抵抗力减弱时可导致此类细菌快速增殖, 产生大量毒素, 其中的α毒素成分使消化道黏膜, 特别是真胃黏膜发生坏死和炎症, 同时经血液循环进入体内, 刺激神经中枢系统, 短时间内使羊只发病, 而引起突然死亡。
3 病理变化
剖解可见心冠处有少量出血点, 心包积液。肝脏肿大, 呈黄褐色, 半熟状, 质脆, 局部有针尖大出血点。肾脏外观正常。脾脏出血, 边缘钝厚, 表面有针尖大坏死灶。胃粘膜脱落, 胃大弯处可见有大小不等的陈旧性出血性溃疡灶。结肠系膜严重充血, 浆膜有大量散在的出血斑, 肠壁内膜增厚, 肠道内血液和胃黏膜及饲料混合, 外观如红肠子。肠系膜淋巴结充血, 有针尖大坏死灶。
4 实验室诊断
4.1 涂片镜检
无菌取死亡鹿的心血、肝、脾、肺、肾及肠系膜淋巴涂片染色镜检, 均未见细菌。
4.2 细菌分离培养
4.2.1
无菌取死亡鹿心血、肝、脾、肺、肾及肠系膜淋巴等脏器及肠内容分别接种于普通肉汤、厌气肝汤及鲜血斜面, 37℃培养24h, 观察细菌生长情况。结果普通肉汤及鲜血斜面无细菌生长;肝脏和肾脏及肠内容物的厌气肝汤管可见产生大量气体, 抹片镜检可见大量柠檬状芽孢。
4.2.2 将上述产气的厌气肝汤培养物划线接种于鲜血琼脂培养基, 37℃培养, 观察结果。
48h后打开鲜血平板可见有薄纱状弥漫性生长、边缘不整齐的菌落。从鲜血平板上挑取菌落于厌气肝汤中37℃培养24h, 抹片镜检为纯的梭状杆菌, 并产有大量柠檬状芽孢。
4.3 动物试验
小白鼠毒性试验:取肝, 肾及肠内容物纯培养物0.2mL, 16~18g小白鼠各皮内注射2只, 观察小鼠死亡情况。结果:试验小鼠全部于24h内死亡。肝被膜涂片镜检可见长丝状梭状杆菌。小鼠肝脏无菌接种于厌气肝汤中, 37℃培养24h后可见产大量气体, 抹片镜检可见大量柠檬状芽孢。
5 预防与控制
5.1
在该病常发地区, 每年定期注射羊快疫、猝狙、肠毒血症三联苗, 不论大小羊, 均皮下或肌肉注射5mL。有条件地区可从当地病死羊只中分离致病菌株, 研制成单价疫苗免疫羊群会有更好的效果。国外用腐败梭菌毒素中纯化的α毒素制成1种α类毒素疫苗。
5.2
本病发生严重时, 应将所有未发病的羊只转移到地势高、干燥的地区放牧, 早上不宜出牧太早。
5.3 及时隔离病羊, 病羊尸体及排泄物应深埋。
对被污染的圈舍和场地、用具, 用3%的烧碱溶液或20%的漂白粉溶液消毒。
关键词：腐败梭菌,病原与诊断
食品病原微生物检测与控制技术 篇2
食品病原微生物检测内容及技术
食品病原微生物的检测内容分析
对食品污染程度指示菌的检测。首先，是细菌总数的检验，对食品或饮用水进行处理，在一定条件下培养，检测样单位质量或单位体积样品中所含细菌菌落的个数，以此为依据就能够判断出食品或饮用水的被污染程度。第二，是对大肠菌群系的检测，大肠菌群系指的是一群革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，人和牲畜的粪便是大肠菌群系的主要来源，对粪便中大肠菌群系的检测能够评价食品的卫生质量。
对食品致病菌的检测。食品中可能存在引起疾病的微生物，即食品致病菌，因此应当对这些食品致病菌进行检测，例如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，通过检测结果与GB4789食品检验标准进行比对，以此来评价食品质量。
食品病原微生物的检测技术探讨
传统食品病原微生物检测技术主要采用琼脂平板培养法，这种方式检测时间较长，应用有着一定的局限性，随着科技的发展，各种新兴的食品病原微生物检测技术被开发出来，下面进行具体分析。
电阻抗法检测技术。细菌在培养基内生长过程中会将培养基火电惰性物質代谢为具有电活性的小飞子物质，增加培养基的导电性，从而使培养基阻抗产生变化，电阻抗法检测技术就是利用这个原理，通过对培养基电阻抗变化来反映出细菌的生长特性，从而检测出相应的细菌。电阻抗法检测技术主要应用于霉菌、大肠杆菌等食品病原微生物的检测。
快速酶触反应及代谢产物检测技术。细菌在生长过程中会合成一些特异性的酶，根据酶特性来选择底物和指示剂，并对反应结果进行记录，就能够检测出相应细菌的种类和数量，从而实现食品病原微生物的检测。
分子生物学检测技术。分子生物学检测技术主要包括两种：①核酸探针检测技术：核算探针检测技术以碱基互补原则为基础，能够采用特定的方法未实现对标记物的测定，从而实现检测；②PCR检测技术：PCR检测技术指的是聚合酶链式反应检测技术，在加热的过程中能够促进双链DNA的裂解，裂解生成的单链能够作为DNA聚合酶模板和引物，通过扩增特异性未实现检测。
食品病原微生物控制技术
食品病原微生物控制技术主要指的是杀菌技术，例如加热杀菌、低温杀菌、非热杀菌等，下面对非热杀菌技术和生物活性成分杀菌技术进行分析和研究。
非热杀菌技术分析
超高压均质化杀菌控制。超高压均质化杀菌控制技术是一种连续的冷杀菌技术，超高压会对液体食品产生积压，在释放压力的过程中，告诉的碰撞和强烈的剪切能够导致食品中微生物的细胞结构发生变化，从而使食品病原微生物失去活性，实现杀菌。
微波杀菌控制。微波杀菌控制技术主要指的是通过微波对食品进行加热灭菌，但微波杀菌控制技术也有着一定的局限性，例如非热效应机理问题和量化问题等，同时当前难以有效的实现对微波加热温度的探测和控制，其工业化成本较高，这就限制了微波杀菌控制技术的推广和应用。
高压脉冲电场杀菌控制。采用高压脉冲对微生物进行杀灭，其能够达到巴氏杀菌的水平，耗能较低、杀菌时间短，有着环保性和安全性的优点，但需要注意的是，高压脉冲电场杀菌控制技术难以对液体食品中的空肠弯曲杆菌、蜡样芽胞杆菌等微生物进行杀灭。
生活活性成分杀菌技术分析
通过植物提取物来杀菌、抑菌。一般植物提取物中含有这多种杀菌和抑菌功能的生物活性成分，因此其在食品病原微生物的控制中较为常用。例如苦瓜果肉、种子以及果品等部分的提取物对食品中假单胞菌属微生物进行控制。
通过细菌素来杀菌、抑菌。细菌素是一种微生物代谢产物，主要为蛋白质或多肽类物质等，细菌素有着抑菌活性，且其有着不会产生耐药性的特点，因此在食品病原微生物的控制中被广泛应用。例如细菌素Thurincin对蜡样芽胞杆菌等食品病原微生物就有着杀灭作用和抑制作用。
综上所述，食品病原微生物的检测和控制是保证食品安全的重要手段，本文简要分析了食品病原微生物的检测内容，探讨了具体的病原微生物检测技术和控制技术，并分析了食品病原微生物控制技术的优缺点。
牛巴氏杆菌病的病原诊断与治疗 篇3
2012年10月青海省某养殖场送来死亡牛病料一份。据了解, 该种牛场从2011年11月5日开始发生牛死亡, 以1岁牛为主要发病对象, 截至送检时已死亡牛10余头。病牛主要表现为呼吸困难, 流涎、体温在40~41℃, 现场解剖发现喉头充血水肿, 心脏肥大, 心包积液, 肺脏充血呈大理石样, 脾脏边缘出血。现将结果报告如下:
1 材料
1.1 病料采集
将送检心、肝、脾、肾、肺、喉头经初步处理后待检。
1.2 药物
药敏纸片, 抗菌素种类为羧苄青霉素, 头孢氨苄, 利复平, 先锋、卡那霉素, 呋喃妥因, 强力霉素、多粘菌素B。
1.3 实验动物
健康昆明系小白鼠6只 (16～18g) , 购于青海地方病研究所。
2 方法
2.1 镜检
取病死牛心、肝、脾、肾、肺、喉头等病料进行触片, 并进行瑞特氏染色, 镜检。
2.2 分离培养
将病料分别无菌接种于普通斜面、鲜血平板和营养肉汤及厌气肝汤中, 37℃温箱培养24h。
2.3 生化试验
选取相应的生化试验管, 将分纯的单个菌落接种于生化管中, 37℃温箱培养24h, 观察记录结果。
2.4 动物试验
用生理盐水洗涤鲜血斜面上的2~3个菌落, 皮下注射体重16~20g的昆明系小白鼠2只, 0.2mL/只, 观察并剖解死亡小白鼠。
2.5 药敏试验
将纯化好的细菌用接种环均匀涂布于鲜血琼脂平板上, 贴上各种药敏纸片, 37℃培养24h后记录结果。
2.6 致病性测定试验
用生理盐水将培养了48h的平板上的菌落进行洗涤后与标准巴氏杆菌比浊管比对, 确定相应含菌浓度后做倍比稀释, 0.2mL/只皮下注射16~20g的昆明系小白鼠, 同时注射生理盐水作为对照组, 观察记录试验结果。
3 结果
3.1 病料经触片瑞特氏染色后, 镜检发现肺脏和喉头有较单一的疑似巴氏杆菌的小杆菌, 其它脏器看不到细菌。
3.2 菌落形态及培养特性的观察结果, 肺脏和喉头在鲜血琼脂平板上有灰白色, 圆形微隆起, 半透明, 湿润, 表面光滑、边缘整齐的露珠样不溶血的菌落外, 其它脏器在培养基上均无细菌生长。
3.3 生化试验结果见表1。
注:“+”表示阳性, “-”表示阴性
3.4动物试验结果:小白鼠于24h内全部死亡, 剖检后采取肝脏进行触片, 瑞特氏染色后, 镜检可见与上述一致的两极浓染的小杆菌。
3.5药敏感试验结果, 该菌对羧苄青霉素 (3.0cm) 、先锋霉素 (2.8cm) 、呋喃妥因 (2.3cm) 高度敏感, 对强力霉素 (1.8cm) 、利福平 (1.6cm) 等药物中度敏感。
3.6致病力测定结果注射1000MLD/mL的小鼠于24h内死亡。
4 诊断
病原与诊断 篇4
【摘要】病原生物学与免疫学是医学的基础课程，对医学专业学生学好专业课程，实现培养实用型人才培养目标具有重要的意义。笔者在相关的教学过程中对于课前准备、理论及实验课教学的内容和教学方法提出了相关的改革探索，希望帮助学生提升学习兴趣，提高课堂教学质量。
【关键词】病原生物学 免疫学 教学改革
【中图分类号】G642 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）01-0032-02
病原生物学与免疫学是非常重要的医学基础课程，是基础与临床的桥梁课，因此，医学生学好这门课程能够为后续其他有关临床各科的学习打下一个坚实的理论基础。为了能够达到培养实用型人才的相关需求，同时也为了能够有效的提升医学教学方面的质量，笔者对有关病原生物学与免疫学课程提出了以下的改革以及探索。
一、 教学改革的主要方式
首先，改变传统教学之中单一“封闭式”的相关教学方式以及满堂灌输知识形式的教学方式，实施讨论式和开放式的教学，从而有效的提升学生对于课堂教学的主观能动性。其次，改变传统之中只侧重于理论教学，反而轻视实践教学的相关教学方法，强化学生在基本操作技能方面的训练，从而帮助学生将实际掌握的基础理论知识和相关的实践活动合理有效的结合起来。再次，转变传统之中单纯的有关病原生物学和免疫学方面具体知识的传授方式，将其与其它基础学科有关课程以及临床学科之中的相关课程等方面的知识内容联系起来，并进行知识的精讲以及展开讨论，从而拓宽学生自身的学习思路，提高学习的积极性。最后，转变传统单纯用笔试来检验学生对于所学知识实际掌握程度的方式，应该使用多种不同的、更加灵活的有关考试手段，为学生创造一个良好的条件，给予遗漏知识补救的机会。
二、教学改革的具体措施
1.重视专业人才培养模式方面的改革
调整以及改革相关的教学计划，编写更加具有专业特色与特点的教学大纲，我校总课时为54学时，其中理论课46学时、实验课8学时。应用和专业相配套的相关教材；提高实践教学方面的比重，对于那些涉及到过深的知识内容进行精简，促进学科之间的有效沟通。增设能够体现专业特色的相关教学内容，帮助学生形成专业思想以及提高学生对于学习的兴趣，从而构建一个能够妥善适应社会需求、有效培养学生自身的创新思维、稳步提升学生综合素质的一个更加合理、高效的教学模式。
2.强化学生在基本操作技能方面的训练
高等教育的任务是为国家培养高素质的创新型人才，实践教学是其不可缺少的重要环节，实验教学则是实践教学的基础性环节[1]。病原生物学与免疫学实验课程是基础医学和临床医学之间的桥梁课程[2]。每次进行实验课之前必须要求学生一定要提前预习相关的实验内容，如凝集试验、细菌接种方法、细菌生长现象观察、革兰染色法，从而使学生在进入实验室之后，能够在最短的时间内就进入到实际操作的状态。在实验将要结束之前，利用十分钟的时间对于此次实验之中存在的不足以及问题进行剖析，分析出现问题的原因并给予解决。
3. 加强和其他相关学科知识之间的联系
病原生物学与免疫学涉及面广，并且理论性很强，在实际进行讲授或者是指导学生进行自学时，一定要重视和其他学科例如药物学、病理学、预防医学以及传染病学等之间的联系。如在学习肿瘤相关性抗原时，运用临床案例引导学生思考、分析问题，学生通过临床案例的思考与分析获得处理解决问题方法[3]。这样一方面来说使这门课程切实的起到了身为基础课的作用，而另一方面也极大的激发了学生对于学习方面的兴趣，为之后的课程学习打下一个牢固的基础。
4. 重视引导学生进行自学
在实际传授知识的同时，教师应该更重视培养学生的学习方式，让学生学会学习，知道怎样学习。挑选一些较为简单的知识让学生通过自学来达到教学目标，之后再由教师对其所学知识的具体情况进行检查评价，并根据具体的情况给予相应的建议。另外，教师可以根据课堂讲授的知识内容要求学生阅读一些和本学科相关的其它学科的知识内容，并在其中找到相关的信息以及临床疾病等，这时由教师提供一定的线索和有关知识内容的提要，让学生到网络上或者是图书馆之中搜寻资料，并将这些资料写成摘要，方便学生之间的沟通交流。
5.改善单一的传统理论考试模式
树立科学合理的考试观，针对不同的专业，改善相关的考试方法以及模式，强化技能考试方面的比重。加强对于学生在动手能力方面的培养，逐渐朝着职业资格考试的有关模式靠拢。经过课后作业、课堂以及不定期的有关课堂目标教学方面的反馈测验等诸多方式来对于学生所学知识的具体掌握程度进行测评。总结课堂、课后以及实验方面的考试成绩对于本门课程具体成绩的计算，科学合理的评价学生具有非常大的促进作用。
三、小结
通过对病原生物学与免疫学方面的教学改革，提高了学生在学习上的主观能动性，适应了医学学生所具有的个性特征，强化了学生自身的思维发展。与此同时，对于相关的教学模式进行改革，也能有效的调动教师在整个教学过程之中的主动性以及积极性，为培养出更多的实用型人才打下牢固的基础。
参考文献：
[1]王少华，诸欣平，胡永秀等.病原生物学与免疫学实验课教学改革的探索与实践[J].医学教育探索，2012，9（02）：248-250.
[2]高劲松，龚灿，李豫皖等.《病原生物学与免疫学》课程实验教学改革实践[J].畜牧与饲料科学，2013，34（11）：54-55.
病原与诊断 篇5
1 资料与方法
1.1 病例资料
吴某, 男, 3岁, 2013年2月11日因发热 (39.5℃) 、畏寒、咽痛、头痛等不适入院。12日患者出现神志不清, 意识模糊, 脑膜刺激征, 不能遵嘱动作, 烦躁不安, WBC 3.3×109/L, 中性粒细胞91.4%, 淋巴细胞2%。11日以常规方法于第3~4腰椎棘突间隙提取脑脊液标本, 测得压力为240 mm H2O, 同时采集患儿血液5 m L及咽拭子标本3 m L。
1.2 主要试剂与仪器
细菌培养所需培养基及生化鉴定试剂均购自广东环凯;麻疹病毒Ig M抗体诊断试剂盒 (IBL, 德国) ;风疹病毒Ig M抗体诊断试剂盒 (IBL, 德国) ;风疹病毒QIAamp viral RNA Mini kit (QIAGENE, 德国) ;Prime Script 1st Strand c DNA Synthesis Kit、LA PCR KitRVer.2.1、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、p MD-18T载体、T4 DNA连接酶、100 bp DNA Marker均为宝生物工程 (大连) 有限公司产品;PCR仪 (PCT-200 Thermal, 德国) 。
1.3 细菌检测
查阅文献资料, 确定临床常见引起脑炎脑膜炎的细菌, 包括脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、新型隐球菌、B族链球菌, 参照《全国临床检验操作规程》 (第2版) 进行常规培养, 脑脊液标本以2 000 r/min离心20 min, 取离心下层液体100μL接种到血平板和巧克力琼脂平板;血标本与咽拭子标本直接接种血培养皿, 于35~37℃全自动血培养仪培养, 5 d内培养仪如报警即进行细菌接种和鉴定, 对于分离到的细菌依据菌落形态、革兰染色、生化反应等进行鉴定, 鉴定方法参照《细菌培养物的鉴定标准操作程序》进行, 5 d后仍未报警视为培养结果阴性。
1.4 病毒检测
查阅文献资料, 确定常见的引起脑炎脑膜炎的病毒, 包括乙脑病毒、腮腺炎病毒、肠道病毒 (柯萨奇病毒、埃可病毒以及EV71等) 、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒 (Ⅰ型和Ⅱ型) , 其中麻疹病毒与风疹病毒检测采用ELISA试剂盒检测特异性Ig M抗体, 其余病毒利用DNA Star primer select软件依据各自基因的保守区域设计特异性扩增引物, 委托宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 引物序列见表1。取140μL脑脊液、血液及咽拭子样品, 参照QIAamp viral RNA Mini kit试剂说明书提取病毒总RNA, 溶于40μL DEPC水。应用随即引物及Prime Script 1st Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒合成c DNA, 应用LA PCR Kit试剂盒与各特异性引物进行PCR扩增R, 反应体系与反应条件参照试剂盒说明书进行操作, PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行初步确认。
1.5 基因测序及分子进化分析
PCR阳性产物琼脂糖凝胶电泳通过Agarose Gel DNA Purification Kit DNA胶回收试剂盒进行纯化回收, 取1μL产物连接到4μL p MD-18T载体, 应用蓝白斑实验及PCR鉴定后, 送上海生物工程技术有限公司进行序列测定, 测序结果进行校对与拼接后, 应用BLAST程序与Gen Bank报道的腮腺炎病毒序列进行核苷酸比较。选择Gen Bank公布的不同地区有代表意义的腮腺炎病毒基因序列用于分子进化分析, 应用Clustal W软件进行多重序列比对, Mega 5.0软件邻接法构建分子进化树, 参数选择为1000次重复构建。
2 结果
2.1 临床指标检查
患儿入院时血常规白细胞计数为3.3×109/L, C反应蛋白不高, 脑脊液外观清亮, 压力增高 (240 mm H2O) , 糖和氯化物正常, 脑脊液直接涂片未发现细菌生长。脑电图检查背景波轻-中度异常和高波幅慢波。
2.2 实验室细菌培养
患者脑脊液、血液及咽拭子标本应用常规方法进行脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、新型新型隐球菌、B族链球菌的分离培养, 培养皿均未见阳性菌落生长。
2.3 实验室病毒检测
患者脑脊液、血液及咽拭子标本麻疹病毒、风疹病毒Ig M抗体检测均为阴性;经乙脑病毒、腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒以及EV71、单纯疱疹病毒 (Ⅰ型和Ⅱ型) 病毒核酸检测, 咽拭子标本检测出腮腺炎病毒阳性, PCR反应产物大小约300 bp, 与预期结果一致, 产物琼脂糖凝胶电泳见图1、2。反应产物经基因序列测定, 应用BLAST进行序列比对, 进一步确定所扩增基因为腮腺炎病毒SH基因, 与腮腺炎病毒F型基因代表株 (Gen Bank No:Z77161) 进行比较, 核苷酸同源性为99%, 关键位点未发生变异, 存在3个位点的核苷酸改变:89位的T突变为C, 218位的C突变为A, 290位的C突变为T, 见表2。
3 讨论
脑膜炎按照感染病原体的种类分为细菌性脑膜炎、结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、急性化脓性脑膜炎、新生儿脑膜炎、流感杆菌脑膜炎, 临床以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎最常见[2]。细菌性脑膜炎通常表现为化脓性脑膜炎, 全球每年约120万左右的脑炎脑膜炎由细菌感染引起, 致残率最高可达50%, 儿童是此类疾病的高发人群[3]。病毒性脑炎指病毒感染引起的脑实质或脑膜炎症, 据估算全球每年有约20万以上的病毒性脑炎病例报告, 其中80%以上由肠道病毒感染引起, 包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒[4], 有文献报道水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型也可引起严重的脑炎脑膜炎, 并且常伴有小脑性共济失调[5]。因细菌培养是细菌性脑膜炎诊断的金标准, 本研究对该危重脑炎脑膜炎患儿血液、咽拭子及脑脊液标本进行了包括脑膜炎奈瑟菌、B型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、新型隐球菌、B族链球菌在内的细菌谱感染筛查, 结果均为阴性, 初步排除了患儿细菌感染的可能。在进行细菌培养的同时对采集的患儿标本进行了病毒感染谱的筛查, 包括应用ELISA方法检测麻疹病毒与风疹病毒Ig M抗体及应用PCR技术检测乙脑病毒、腮腺炎病毒、肠道病毒 (柯萨奇病毒, 埃可病毒以及EV71等) 、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒 (Ⅰ型和Ⅱ型) , 除咽拭子标本腮腺炎病毒PCR检测为阳性外, 其余标本的所有检测项目均为阴性, 在第一时间内初步确定了所感染病原体的种类。
腮腺炎病毒为不分节段的负链RNA病毒, 目前发现有A~L 12个基因型, 编码7种蛋白基因, 其中疏水蛋白基因 (Hydrophobin, SH) 全长316 bp, 编码57个氨基酸, 最易发生变异, 国际上一般选择SH基因作为腮腺炎病毒的分型依据[6,7], 通过对此次PCR扩增阳性的产物进行了序列测定与分析, 经过Blas序列比对确定为腮腺炎病毒SH基因, 进一步通过分子进化树分析为腮腺炎病毒F基因型, 与国际F基因型代表株比较抗原位点没有发生改变, 提示当前疫苗能有效预防腮腺炎的爆发流行, 经流行病学调查, 该病例未接种腮腺炎相关疫苗。
患儿经过有效对症治疗和腮腺炎病毒感染特殊治疗, 目前已经康复出院, 本研究建立的综合检测体系能为临床脑炎脑膜炎病例的实验室确诊提供有效手段, 不过由于引起脑炎脑膜炎的病原体种类众多, 所建立的检测体系目前仅局限于较常见的病原体, 在以后的工作中将不断扩大病原体的检测范围与检测特异性。
摘要：目的 对脑炎脑膜炎病例进行临床诊断与实验室检测, 在病原学上为临床治疗提供直接依据。方法对入院患儿进行血常规、尿常规、生化及血凝检查, 采集患儿脑脊液、血液及咽拭子标本, 进行脑膜炎奈瑟菌、B型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌等分离培养;ELISA法检测麻疹病毒、风疹病毒IgM抗体;设计特异性引物RT-PCR法检测肠道病毒、乙脑病毒、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒, 对核酸检测阳性的病原体进行基因测序、Blast比对及应用Mega 5.0构建分子进化树;根据病原体的种类及基因型别, 有针对性地选择药物进行临床救治。结果 脑炎脑膜炎患儿脑脊液、血液及咽拭子标本细菌培养均为阴性;咽拭子标本腮腺炎病毒PCR核酸检测阳性, 琼脂糖凝胶电泳产物大小约300 bp;阳性产物测序结果与腮腺炎病毒疫苗株比较, 存在部分核苷酸变异, 关键的抗原位点没有发生变化;所测基因序列经分子进化分析确定为腮腺炎病毒基因F型, 与目前中国流行毒株基因型别一致, 患儿经对症治疗已康复出院。结论细菌学和病毒学实验室筛查, 对引起脑炎脑膜炎的常见病原体具有积极的作用, 早期病毒核酸测序能确诊腮腺炎病毒感染类别及基因型别。
关键词：脑炎脑膜炎,临床诊断,病原学检测,腮腺炎病毒
参考文献
[1]SELTZ LB, COHEN E, WEINSTEIN M.Risk of bacterial or herpes simplex virus meningitis/encephalitis in children with complex febrile seizures[J].Pediatr Emerg Care, 2009, 25 (8) :494-497.
[2]GRAHNQUIST L, LUNDBERG B, TULLUS K.Neonatal Proteus meningoencephalitis case report[J].APMIS, 1992, 100 (8) :734-736.
[3]KOSKINIEMI M, MANNINEN V, VAHERI A, et al.Acute encephalitis.A survey of epidemiological, clinical and microbiological features covering a twelve-year period[J].Acta Med Scand, 1981, 209 (1-2) :115-120.
[4]STAHL JP, MAILLES A, DACHEUX L, et al.Epidemiology of viral encephalitis in 2011[J].Med Mal Infect, 2011, 41 (9) :453464.
[5]CINQUE P, BOSSOLASCO S, VAGO L, et al.Varicella-zoster virus (VZV) DNA in cerebrospinal fluid of patients infected with human immunodeficiency virus:VZV disease of the central nervous system or subclinical reactivation of VZV infection[J].Clin Infect Dis, 1997, 25 (3) :634-639.
[6]MALIK T, SHEGOGUE CW, WERNER K, et al.Discrimination of mumps virus small hydrophobic gene deletion effects from gene translation effects on virus virulence[J].J Virol, 2011, 85 (12) :6082-6085.
病原与诊断 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
金黄色葡萄球菌, 购自中国兽医药品监察所;细菌微量生化反应管, 购自杭州天和微生物试剂有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 及普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、加NAD的巧克力琼脂平板和胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 培养基, 由河南科技学院动物科学学院实验中心提供。
1.2 病理剖检与病料的采集
疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪为来源于河南省3个猪场送检的17头仔猪, 分别进行病理剖检和取样。无菌抽取心脏血、心包液和腹水, 采集病变明显的肺脏、心脏和肾脏等病料进行病原学检查。另外, 采集心脏、肺脏、脾脏和肺门淋巴结等器官的组织样品, 用100 mL/L 中性甲醛溶液固定。
1.3 细菌的分离、培养与生化鉴定
无菌采集心脏血、心包液、腹水、肺脏、心脏、肾脏等病料, 首先在加NAD的巧克力琼脂平板或TSA培养基上划线接种, 37 ℃培养48 h, 然后挑取单个菌落进行进一步纯化培养。取培养后的单个疑似菌落进行涂片, 亚甲蓝染色和革兰染色、镜检, 观察菌体形态及染色特性。
取疑似副猪嗜血杆菌的菌落分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、加NAD的巧克力琼脂平板和TSA培养基上, 37 ℃培养48 h, 观察菌落的生长情况。同时分别挑取经纯培养的可疑菌落再接种于各生化反应管中, 37 ℃培养48 h, 观察生化反应情况。
1.4 卫星现象观察
挑取经纯化培养的可疑菌落, 于绵羊鲜血琼脂平板上水平划线, 再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线, 37 ℃培养24 ～48 h, 观察是否有卫星生长现象。
1.5 病理组织学观察
将用100 mL/L中性甲醛溶液固定的心脏、肺脏、脾脏和肺门淋巴结等器官的组织样品按参考文献[1]中的方法制作组织切片。
2 结果
2.1 病理剖检结果
急性败血症病猪常突然死亡, 剖检可见全身皮肤发绀;心壁肿胀, 心外膜出血, 心冠脂肪水肿, 心包、胸膜腔和腹膜腔内有数量不等的无色、清亮的液体;肺脏充血、出血、水肿;肝脏肿大、出血;肾脏有出血斑点, 严重时呈黑紫色;脾脏肿大;下颌淋巴结、第一肋腋淋巴结、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结等肿大、充血或出血;胃黏膜严重出血。
多发性浆膜炎病猪外观多消瘦, 被毛粗乱;有的腹部膨大;心壁肿胀, 心外膜出血, 心包增厚, 心外膜和心包附有纤维蛋白 (见图1) , 有时心外膜与心包黏连;肺脏充血、出血、水肿, 肺尖叶、心叶发生实变, 肺脏表面有纤维蛋白附着, 肺脏与胸膜黏连 (见图2) ;肝脏肿大、出血;脾脏肿大, 有时有梗死灶;肾脏有出血点, 髓质出血;胃有溃疡, 肠浆膜和腹膜有出血点;腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、第一肋腋淋巴结、肺门淋巴结、纵膈淋巴结、肾淋巴结、肠系膜淋巴结、髂外侧淋巴结等肿大、充血或出血;腹膜、肝脏、脾脏、胃、肠等表面有纤维蛋白附着, 常黏连成一团, 无法分开 (见图3) ;心包内、胸膜腔、腹膜腔有数量不等的无色、清亮或黄 (红) 色、浑浊的液体 (见图1～3) 。
2.2 菌落形态特征
接种培养48 h后, 分离到3株可疑菌株, 分别命名为Hps1、Hps2、Hps3;在普通琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板上均不生长, 在加NAD的巧克力培养基和TSA培养基上菌落呈光滑、灰白色、半透明、露珠状、针尖大小、扁平的小菌落;革兰染色呈阴性短小杆菌, 有的呈球杆状;对出现急性败血症症状的病猪的血液进行涂片、亚甲蓝染色, 可见大量细菌, 其形态符合副猪嗜血杆菌的菌落特征。
3株可疑菌株均能发酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖, 但不发酵甘露醇和木糖, 对棉籽糖反应不稳定 (Hps1为阳性, 其余为阴性) , 鸟氨酸、硫化氢、山梨醇、吲哚试验反应结果均为阴性;在金黄色葡萄球菌划线两侧均有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长, 越接近划线菌落越大, 呈现出典型的“卫星现象”, 并且不出现溶血现象, 均为NAD生长依赖菌。
2.4 病理组织学观察结果
心外膜表面有大量的纤维素渗出, 其中有大量细胞核碎片, 纤维素渗出物内有大量单核细胞、淋巴细胞和浆细胞等炎性细胞浸润;心肌细胞断裂、变性、坏死, 肌纤维间有数量不等的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润 (见图4) 。肺脏表面有纤维素渗出, 其中有大量嗜中性粒细胞和细胞核碎片形成的脓肿灶, 纤维素渗出物内有大量的淋巴细胞、浆细胞、单核细胞, 小叶间质水肿, 血管扩张、充血, 可见浆细胞和单核细胞局灶性浸润 (见图5) 。脾脏表面有纤维素渗出, 呈丝网状, 其间有较多的淋巴细胞、单核细胞和少量的红细胞。结缔组织轻微增生、水肿, 血管扩张充血。脾脏发生局灶性坏死, 脾组织消失, 其间有大量纤维素和少量淋巴细胞 (见图6) 。淋巴结被膜淋巴窦扩张, 炎性细胞浸润。皮质淋巴滤泡区淋巴细胞坏死、消失, 被渗出的纤维素、嗜中性粒细胞及吞噬细胞取代, 形成大小不等的纤维素化脓性炎症灶。淋巴小结、副皮质区淋巴窦明显扩张, 腔内有少量脱落上皮、嗜中性粒细胞以及大量纤维素, 使整个淋巴窦呈网状结构 (见图7) 。
3 讨论
副猪嗜血杆菌曾被认为是一种随机入侵的次要病原, 在与圆环病毒、猪瘟病毒、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌等协同作用时才引发疾病[2], 目前, 本病高发的主要原因是猪场引入病猪或易感猪、隔离消毒效果差、继发病原的普遍感染和遭受气候突变等[3]。由于Hps的分离培养比较困难, 但基于检测其DNA的PCR方法和Southern杂交方法很难应用于实践, 并且Hps有15种已知的血清型和多种未知的血清型, 在实践中应用ELISA方法也存在不足之处[4]。Hps的分离培养常受到抗生素或化学治疗剂等因素的影响, 营养条件要求高, 而且保存时间短, 长期保存很困难[5]。本试验在分离病原时, 对没有使用过抗菌药物的发热期病猪采集耳缘静脉或前腔静脉的血液, 或在病猪死后采集心脏血、心包液、胸水、腹水、纤维蛋白性渗出物、肺脏、肝脏等作为病料, 并进行无菌操作, 在患猪剖杀或死亡后12 h以内进行病原分离, 可提高副猪嗜血杆菌的分离率。细菌培养通过直接利用磷酸化NAD提供V因子, 解决了配制培养基的问题[6]。本试验所分离的菌株菌落较大, 呈短杆状或球杆状、圆形、灰白而突起的革兰阴性菌, 细菌形态与参考文献[7]报道的一致。对3株可疑菌株进行的生化试验结果表明, 均符合副猪嗜血杆菌的培养特性[7,8], 明显提高了细菌的分离效率。
根据症状和病理学观察, 副猪嗜血杆菌病可分为急性败血症型、多发性浆膜炎型、关节滑膜炎型和脑膜炎型等[9]。急性败血症型表现为突然死亡、皮肤发绀、菌血症、肺脏水肿和浆膜腔积液。多发性浆膜炎型主要表现为发热、精神沉郁、食欲减退、被毛粗乱、消瘦、腹围缩小或腹部膨大、腹水、干咳、呼吸困难、发生浆液-纤维素-化脓性多发性浆膜炎和支气管肺炎等。脑膜炎型主要表现为发热、颤抖、反应过敏、尖叫、共济失调、四肢泳动、脑轻度水肿、蛛网膜下腔出血等[8,9]。临床快速诊断时, 根据临床症状、病理变化和病原形态学检查可以基本确定为副猪嗜血杆菌病, 必要时进行生化反应和培养特性试验。
病理组织学观察见到心脏、肺脏和脾脏等含有大量嗜中性粒细胞, 发生化脓性纤维蛋白性浆膜炎可作为副猪嗜血杆菌病的诊断依据, 但病理组织学观察对临床病例的诊断可能具有一定的局限性, 诊断时应结合病原学诊断, 以达到快速正确诊断的要求, 如进行血清学和PCR检测, 可以为本病的确切诊断和免疫防制提供依据。
参考文献
[1]王天有, 刘保国, 赵恒章.猪传染病现代诊断与防治技术[M].北京:中国农业科学技术出版社, 2005:54-58.
[2]郭振光, 沈志勇, 王威.猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊治[J].中国动物检疫, 2009, 26 (1) :49-50.
[3]王金合, 王居强, 陈益, 等.副猪嗜血杆菌病病原的分离鉴定与药敏试验[J].河南农业科学, 2006 (10) :104-106.
[4]石碧, 崔耀文, 贾凡.副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立[J].中国兽医科学, 2007, 37 (11) :964-968.
[5]TURNI C, BLACKALI P J.Comparison of the indirect haemaggluti-nation and gel diffusion test for serotypingHaemophilus parasuis[J].Vet Microbiol, 2005, 106 (1/2) :145-151.
[6]李尚华, 剡根强, 王静梅.副猪嗜血杆菌新疆株的分离及PCR鉴定[J].畜牧与兽医, 2009, 41 (4) :71-73.
[7]高鹏程, 储岳峰, 赵萍, 等.副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏试验[J].动物医学进展, 2007, 28 (12) :27-29.
[8]王艳, 夏万田, 柏坤桃.副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立[J].畜牧与兽医, 2006, 38 (3) :5-7.
羊口疮病毒的病原特性及诊断 篇7
1 病原学
羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属。该病毒比一般的痘病毒体积略小, 长250~280 nm, 宽170~200 nm, 呈椭圆性, 表面线团状, 病毒粒子表面呈现特征性的编织螺旋结构, 此外, 病毒粒子具有两种互变的形态, M型, 呈特征性的羊毛球状;C型, 呈光滑的球形。其中M型占绝大不多, C型多数为人工感染的病料中, M型粒子在碱性溶液中或者有机溶剂中可以失去表面结构变成C型粒子。
2 生物特性
本病为一种人兽共患病, 通过直接接触传染, 其中以绵羊、山羊最易感, 幼畜 (包括初生畜) 比成年畜易感。其中以3~6个月的羔羊最为易感, 成年羊发病较少。
病毒经唇、足端的皮肤、口腔或者外阴部黏膜的创伤侵入机体后, 在该部位上皮细胞中繁殖, 引起上皮层的角质化细胞突然增生、空泡化、膨大, 使网状组织恶化等。由于表皮浮肿、毛细血管增生, 导致了血管内皮生长因子的产生;血管内淋巴细胞和单核细胞向外周渗透, 产生嗜碱性胞浆内包涵体并且最后液化, 从而形成水泡, 继而因嗜中性性粒细胞移往网状组织坏死区, 形成脓疱。表面的上皮细胞坏死, 纤维蛋白凝结, 脓疱干燥后成为痂块, 痂块脱落后不留疤痕, 成为再生皮肤。
3 诊断
3.1 临床诊断
根据病灶的不同部位, 分为唇型、蹄型、外阴型。唇型比较常见, 病羊首先在口角、上唇或鼻镜上发生散在的小红斑点, 很快形成小结节, 继而成为水疱或者脓疱, 破溃后形成黄色或棕色的疣状硬痂。蹄型几乎仅侵害绵羊, 多单独发生, 偶有混合型, 多数仅一肢患病, 但也可能同时或相继侵犯多数甚至全部蹄端。外阴型很少见, 有黏性和脓性阴道分泌物, 在疼痛肿胀的阴唇和附件的皮肤上有溃疡。
在临床上, 该病与羊痘容易混淆, 误诊, 特别是羊痘发病早期, 较难区别。从疫病危害上看, 羊痘的流行更快, 群发明显。羊痘通常导致患羊体温升高, 全身反应重, 痘疹圆形, 突出皮肤, 界线明显, 以后呈脐状, 其中唇形羊痘更容易误诊。这在临床鉴别诊断中很有价值。
3.2 实验室诊断
该病病情属高度嗜上皮性病毒, 主要以细胞免疫和局部免疫为主, 在血液中产生的抗体水平低下, 本病在免疫学上的特殊性使得对本病的诊断和免疫至今尚无完整的、特异的免疫学诊断方法和良好的疫苗。
应用PCR诊断高效、快速, 并且具有很强的特异性。颜新敏等根据羊痘病毒的P32全长基因序列设计P1:5’-CTCATTGGTGTTCGGATT-3’, P2:5’-ATGGCAGATATCCCATTA-3’, 扩增目的片段969bp;根据羊口疮病毒保守区域H2L设计一对引物, P3:5’-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3’, P4:5’-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3’, 扩增目的片段507bp。
除了聚合酶链式反应外, 对流免疫电泳和中和实验都被应用于该病的诊断, 然而, 前者快速、简便, 但敏感性略低。后者具有较高的特异性, 但比较费工费时。
4 防治
由于羊只表皮、黏膜损坏, 病毒侵入、繁殖, 造成局部的病灶与损伤, 所以防止外伤是预防该病的一个重要方面, 此外, 应该强化消毒, 降低病毒含量。实验表明弱毒变异株进行股内皮肤划痕, 皮内注射及唇黏膜上轻微划痕进行涂擦, 比较三种免疫注射方法最有效的是唇黏膜法。
一旦发现病畜, 应该限制其它羊只的出入以及合群放牧, 对发病羊只的圈舍、用具等彻底消毒。患处用0.1%~0.3%的高锰酸钾溶液擦拭, 每日2~3次。若病羊体温升高, 症状严重, 可按每公斤体重0.2~0.5 mL肌肉注射黄芪多糖注射液, 以及针对并发症对症治疗。
摘要：羊口疮病毒具有较强的传染性、发病率高, 给养羊业造成巨大的损失, 并且偶尔感染人类, 具有一定的公共卫生意义。本文主要对该病在我国的病原学、临床症状、诊断和防治等方面进行了概述, 以期对该病的诊断和防治提供参考。
关键词：羊口疮,羊痘,病原学
参考文献
[1]王延璞, 薛双虎, 吕武夫.羊传染性脓疱炎病毒的免疫特性.中国兽医科技, 1990 (2) :15-17.
[2]颜新敏, 张强, 吴国华, 等.双重PCR快速鉴别羊痘病毒和羊口疮病毒.中国人兽共患病学报, 2008 (10) :945-948.
[3]王良娟, 马维卿, 张再清.应用对流免疫电泳检测细胞培养物中羊口疮病毒抗原.甘肃畜牧兽医, 1992 (3) :7-8.
病原与诊断 篇8
2011年10月以来,贵州省某规模化养羊场引进的波尔山羊不断出现疑似CCPP病例,病羊呼吸困难、渐进性消瘦、倒地不起至死亡,已死亡山羊440余只,造成了严重经济损失。为快速对该病例做出确切诊断,本研究采用分子生物学和生物信息学技术对临床病料进行了实验室分析,以期为本次疫情的治疗与控制提供技术支持。
1 材料与方法
1.1材料
采自贵州省某规模化养羊场疑似患CCPP病死山羊肺脏组织1份,鼻腔拭子1份;Mmc标准株PG3(CVCC 368)与Mo标准株Y98(CVCC 384)购自中国微生物菌种资源库。
1.2试剂
PCR扩增试剂、TIANgel Midi Purification Kit胶回收试剂盒、TIANprep Mini Plasmid Kit质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;Amp、X-gal、IPTG、克隆载体pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司;限制性内切酶(BamH I、Pst I)购自Fermentas公司;其他试剂为贵州大学预防兽医学实验室配制保存。
1.3引物
参考GenBank所公布Mmc PG3株(登录号:U26036.1)与MoY98株(登录号:NR_025989.1)16S rRNA序列分别设计Mmc的特异性引物与Mo的特异性引物Ps/Pa与Ms/Ma(见表1),送上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.4 CCPP病原核酸检测
取山羊病变肺脏组织无菌研磨成组织匀浆后,以10 000 r/min离心10 min 后取上清液,采用SDS-Protein K法提取病料组织、鼻腔拭子浸出液及标准菌株核酸。以Mmc、Mo 16S rRNA基因特异性引物Ps/Pa与Ms/Ma按本实验室所建双重PCR方法对所提DNA进行PCR扩增,以50 μL为反应总体系,加入10×buffer 5 μL,Mg2+(25 mmol/ L)3 μL,dNTP(10 mmol/ L)1 μL,Taq酶(2.5 U/μL)1 μL,引物Ps/Pa(10μmol/ L)及Ms/Ma(10 μmol/ L)各1 μL,模板3 μL,ddH2O补足。按94 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s,54 ℃退火40 s,72 ℃延伸1.5 min,共34个循环后72 ℃延伸10 min,取扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,凝胶成像仪观察结果。
1.5目的基因序列分析
1.5.1 目的基因纯化与克隆:
扩增产物经电泳后,参照TIANgel Midi Purification Kit胶回收试剂盒操作说明书对目的基因进行纯化,与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞,经含Amp、X-gal、IPTG的LB平板筛选后,挑取单个白色菌落增菌培养,按TIANprep Mini Plasmid Kit质粒提取试剂盒操作说明书进行重组质粒提取。
1.5.2 重组质粒PCR与双酶切鉴定:
以所提取重组质粒作为模板,以上述引物与反应条件进行PCR 反应,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。并采用限制性内切酶BamH I与Pst I,对重组质粒进行双酶切鉴定。
1.5.3 序列测定与分析:
将初步鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)公司测序,使用Clustal W、MEGA4.0生物软件与BLAST对测序结果与GeneBank登录的CCPP主要病原标准株进行系统发生树分析(参比序列见表2)。
2 结果
2.1 CCPP病原核酸检测结果
取病变组织、鼻腔拭子及标准菌株所提DNA以引物Ps/Pa与Ms/Ma进行PCR扩增,结果见图1。
M:100 bp maker;1:阳性对照;2:阴性对照;3:公山羊病变肺组织;4:母山羊病变肺组织
由图1可知,从送检山羊病变肺组织和鼻腔拭子所提DNA中均未扩增到Mmc 412 bp目的条带;从山羊肺脏组织中扩增到Mo 534 bp目的条带,而鼻腔拭子中未扩增。表明所检测疑似患CCPP病羊存在Mo感染。
2.2病原基因生物信息学分析结果
病原基因经纯化,与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。疑似阳性菌经培养提取质粒进行PCR和双酶切鉴定,鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)公司进行测序并进行系统发生树分析。
2.2.1 重组质粒PCR鉴定结果:
取重组质粒为模板,以引物Ms/Ma进行PCR扩增,扩增产物经1%凝胶电泳检测,结果见图2。
M:100bp maker;1:阳性对照;2:阴性对照;3:重组质粒
由图2可知,重组质粒经引物Ms/Ma进行PCR扩增后,1%凝胶电泳检测,扩增出约534 bp的目的条带,与预期片段大小相符,初步表明了目的片段已插入重组质粒中。
2.2.2 重组质粒双酶切鉴定结果:
对重组质粒进行BamH I与Pst I双酶切,经1%凝胶电泳检测后,结果见图3。
M:100 bp maker;1:阳性对照;2:阴性对照;3:重组质粒
由图3可知,重组质粒经BamH I/Pst I双酶切后,凝胶电泳检测呈2条带,1条为目的条带,约550 bp;另1条为载体带,约2 700 bp。结果与预期相符,进一步证明目的条带已成功插入重组质粒。
2.2.3 系统进化树分析:
将序列测定结果与GeneBank所登录CCPP主要病原标准Mo Y98株、Mmc PG3株、Mmm LC型Y-Goat株、Mccp F38株的16S rRNA序列构建系统进化树(见图4),比较系统发生关系。由图6分析亲缘关系可知,序列测定结果与Mo Y98株在分子进化上亲缘关系更近,表明引起该场山羊患CCPP致高死亡率的主要病原确诊为Mo。
3 讨论
3.1 本试验以同时检测CCPP主要病原Mmc与Mo的双重PCR方法,从临床疑似CCPP病例肺组织中检测到Mo病原核酸,并通过对目的基因的克隆、测序及系统进化树分析,确诊该场山羊CCPP病例的病原为Mo。
试验结果证实本次贵州省CCPP疫情为感染绵羊肺炎支原体所致,结果表明贵州省山羊传染性胸膜肺炎病原不仅存在Mmc,还存在Mo感染,这与张双翔等人[6]所报道结果一致。
3.2 自万一元等人于1999年首次报道[7]贵州省首例山羊传染性胸膜肺炎病原为丝状支原体山羊亚种(Mmc)以来,当地对该病的防控措施主要针对Mmc,然而,随着养羊业的发展,引种羊规模不断扩大,贵州山羊胸膜肺炎疫情变得越来越严重。本试验采用分子克隆技术对山羊传染性胸膜肺炎病原流行株进行克隆、测序及系统发生树分析,结果表明,Mo贵州流行株16S rRNA基因与Mo标准Y98株间仅存在5个碱基的变异或缺失,从分子水平上进一步鉴定本次疫情病原为Mo,这将为当地采取针对性措施防控该病流行提供科学依据。
3.3 资料显示[8,9],因空气潮湿、气温骤降等原因,山羊易感染CCPP致病支原体,并且病原会在群体间通过飞沫—空气经病羊呼吸道进行传播,发病后,山羊死亡率较高。随着养羊规模的扩大,该场于2011年8月从外地引进种羊,因此大量的种羊迁徙可能是山羊感染Mo的主要原因。根据有关研究报道[10],对于临床发病山羊以盐酸多西环素、盐酸林可霉素等抗生素药物进行治疗。因目前市场暂无针对Mo疫苗出售,饲养管理者应首先规范引种程序,加强引种过程中的检疫工作,并且要加强继发山羊疾病预防意识,避免继发感染。
参考文献
[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].北京:中国农业出版社,2001.233～261.
[2]Thiaucourt F,Bolske G.Contagious caprine pleuropneu-monia and other pulmonary mycoplasmases of sheep andgoats[J].Review Science Technique Office Internationaldes Epizooties,1996,15(4):1 397～1 414.
[3]Hutcheon D.Contagious Pleuropneumonia in goats atcope colony[J].South Africa.Vet J,1889,(29):399～404.
[4]农业部畜牧兽医司.中国动物病志[M].北京:科学出版社,1993.
[5]李希友,吕桂霞.山羊传染性胸膜肺炎的诊断与治疗试验[J].畜牧兽医杂志,2005,24(5):12～131.
[6]张双翔,周碧君,程振涛,等.山羊传染性胸膜肺炎继发大肠埃希氏菌感染的诊断[J].贵州农业科学,2011,39(6):144～146.
[7]万一元,龙鳌,万晴姣,等.贵州山羊传染性胸膜肺炎病原的分离鉴定[J].中国草食动物,2001,3(4):44～46.
[8]McMartin DA,MacOwan KJ,Swift LL.A century ofclassical contagious pleuropneumonia:from original de-scription to aetiology[J].BritVet J,1980(136):507～515.
[9]Longley,E.O.A study of the disease in Nigeria[J].Vet-erinary Science amd Animal Husbandry,1951(7):4～27.
病原与诊断 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
该院住院的呼吸道感染的0~6岁患儿, 平均 (1.6±0.3) 岁, 共计104例, 其中男74例, 女30例。无菌采集患有呼吸道感染的住院患儿的静脉血数毫升, 离心分离血清, 于采集当天由专人完成检测。
1.2 方法
九联检检测采用间接免疫荧光法 (IFA) , 基于待测样本中的特异性抗体与吸附在载玻片上的特定抗原反应, 未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去, 在接下来的步骤中, 抗原-抗体复合物与荧光标记的抗人球蛋白反应, 通过荧光显微镜即可观察结果。质量控制:每一次试验设立阴性和阳性对照, 严格按照九联检试剂说明规范操作, 以保证结果的准确性和有效性。试剂盒名称:九项呼吸道感染病原体Ig M抗体检测试剂盒 (PNEUMOSLIDE Ig M) ;产品标准编号:YZB/SPA 5210-2009。
1.3 统计方法
数据统计学分析均采用SPSS19.00软件进行处理, 同组数据以阳性率表示, 不同组间样本阳性率比较采用χ2检验。
2 结果
104例患儿中, 检出阳性例数60例, 阳性率57.69%;其中男性74例, 阳性42例, 阳性率56.76%;女性30例, 阳性18例, 阳性率60.00%。男性组与女性组间阳性率比较差异无统计学意义 (χ2=0.09, P>0.05) , 性别间差异无统计学意义。见表1。
在所检测的九种病原体中以肺炎支原体阳性率最高, 占阳性例数的56.7%;其次是腺病毒, 占阳性例数的40%;排在第三位的是嗜肺军团菌, 占阳性例数的23.3%;第四位的是乙型流感病毒, 占阳性例数的15.0%;第五位的是呼吸道合胞病毒, 占阳性例数的10.0%;以上五种病原体占总阳性例数的94.6%, 为呼吸道常见病原体。见表2。
在60例检测出阳性的患儿中, 有20例为混合型感染, 比例为33.3%, 其中以嗜肺军团菌+肺炎支原体+腺病毒、嗜肺军团菌+肺炎支原体、支原体+腺病毒三种类型最常见, 分别为5例 (23.8%) 、5例 (23.8%) 、3例 (14.3%) 。肺炎支原体合并其它病原体感染合计18例, 占混合感染的90.0%。见表3。
3 讨论
呼吸道感染的发病率一直位居小儿各类疾病的首位, 对它的早期诊断对于临床治疗及用药有十分积极的意义。近年来, 由于抗生素的广泛应用、病原体的变异及流行病学的改变等多种因素的影响, 各种病原体在小儿呼吸道感染中的比例均有所变化, 为临床准确用药、对症治疗造成了一定困难;因此, 我们针对各种病原体感染后引起血清抗体的改变, 并结合Ig M抗体的特点选择了九联检这种试剂, 仅需一份血清即可对呼吸道感染中的九种病原体进行检测, 通过检测患儿的血清, 探讨该方法在其中的临床应用价值。结果表明, 在小儿呼吸道感染患者中, 九种病原体检出的阳性率达57.69%, 占呼吸道感染病原体的一半以上, 且检测的是机体抗感染中最早出现的Ig M抗体, 为临床快速准确地确定呼吸道感染的病因以及及时用药治疗有十分重要的意义。
在所检测的九项病原体中, 以肺炎支原体最为常见, 占阳性例数的56.7%, 较董玉琳报道的21.98%高[4], 而比较接近国外文献报道的50%, 是小儿最易感染的呼吸道病原体, 主要引起小儿上呼吸道感染和肺炎;其次是腺病毒, 占阳性例数的40.0%, 能引起上呼吸道疾病, 常伴随有急骤发热和轻度呼吸道感染, 在所检测的腺病毒感染患儿中有22.7%出现不同程度的呼吸困难;第三位的是嗜肺军团菌, 占阳性例数的23.3%;其后依次是乙型流感病毒15%, 呼吸道合胞病毒10.0%, 肺炎衣原体和甲型流感病毒3.3%, 副流感病毒0%。该次实验中未发现副流感病毒, 可能与该病原体感染的患者数目较少有关。在该次实验60例病原体检出阳性患儿中, 有20例属于混合型感染, 占感染比例的33.3%, 混合感染的比例较高, 主要以嗜肺军团菌+肺炎支原体+腺病毒、嗜肺军团菌+肺炎支原体、肺炎支原体+腺病毒三种类型最常见, 分别为5例 (23.8%) 、5例 (23.8%) 、3例 (14.3%) , 合计占混合感染的65.0%, 提示临床医生在治疗呼吸道感染的患儿时注意混合感染的情况, 避免遗漏病因, 彻底治疗。
由于该次实验的呼吸道感染的患儿例数偏少, 并不能精确反应小儿呼吸道感染的情况, 故仅提供参考, 有待进一步探讨。
4 结论
呼吸道病原体Ig M九联检在小儿呼吸道感染检测中检出阳性率高, 检测的病原体种类多, 发现病原体时间早, 对临床的及时诊断、治疗及用药有十分重要的意义。
参考文献
[1]王卫平, 沈晓明.儿科学[M].北京:人民卫生出版社, 2012.
[2]秦茵茵, 吴国锋, 秦笙.九项呼吸道联检试剂对多种呼吸道感染病原体检测的临床意义[J].2012, 18 (2) :124-127.
[3]金伯泉.医学免疫学[M].北京:人民卫生出版, 2011.
[4]董玉琳.呼吸道病原体九联检在小儿急性呼吸道疾病中的应用[J].中外医疗, 2012, 31 (33) :170-172.
[5]刘德贝, 曹艳林.常德地区小儿呼吸道病毒性感染病原学分析[J].检验医学与临床, 2012, 9 (18) :2286-2287.
[6]程敏婷, 陈敬国, 李丽, 等.新生儿社区获得性呼吸道感染的病毒源性研究[J].健康大视野, 2012, 20 (7) :256.
[7]肖爱莲.呼吸道Ig M九联检临床观察240例分析[J].卫生职业教育, 2013, 31 (14) :147-148.
[8]Johnstone J, Majumdar SR, Fox JD, et a1.Viral infection in adults hospitalized with community-acquired pneumonia:prevalence, pathogens, and presentation[J].Chest, 2008, 134 (16) :1141-1148.
[9]Canducci F, Debiaggi M.Sampanlo M, et a1.Two-year prospective study of single infections and CO-infections by respiratory syncytial virus and viruses identified recently in infants with acute respiratory disease[J].J Med Viral, 2008, 80 (4) :716-723.
[10]万江, 杨树杰, 程黎.小儿呼吸道感染病毒检测新进展[J].临床肺科杂志, 2012, 17 (2) :321.
[11]钟丽.呼吸道病原体Ig M九联检质控孔出现阳性结果的影响因素分析[J].医学理论与实践, 2014 (14) :1926-1927.