生长转化因子-15（精选7篇）
生长转化因子-15 篇1
生长分化因子-15 (growth differentiation factor15, GDF-15) 属生长分化因子 (growth differentiation factor s, GDFs) 家族, 隶属于生长转化因子β (Transforming growth factorβ, TGF-β) 超家族成员之一[1]。该家族成员在各组织中的表达不尽一致, 主要参与调节多器官生长、分化及组织修复等多种细胞功能和生物学过程。研究显示, GDF-15水平在肿瘤[2]妊娠[3]神经元损伤[4]以及骨骼肌发育异常等多种疾病状态下增高。近年研究发现, GDF-15不但具有上述生物学功能, 而且还参与心血管疾病的发生发展过程, 在心肌急性缺血和缺血/再灌注损伤、肌肥厚及心力衰竭等病理过程中水平增高, 防止心肌增厚、拮抗炎症和减弱心肌凋亡速度等, 还对心肌缺血/再灌注有一定保护功能[4,5]。在其血清或血浆中, GDF-15的浓度水平可能作为心力衰竭 (heart failure, HF) 病程发展的新型标记物。现就GDF-15在心力衰竭的病程发展中相关信号通路及其保护进行综述。
1 GDF-15的结构、生物学功能、表达
1.1 GDF-15的结构
GDF-15隶属于TGF-β超家族。DGF-15最初以二硫键集合的二聚体形成的前体蛋白, 然后通过蛋白水解将GDF-15前体蛋白裂解成N-末端前肤和成熟的GDF-15, 分子量大小约25 000D, 其细胞外分泌形式为单体蛋白, 分子量大小约12 000D的分泌蛋白, 经旁分泌或自分泌作用与自身细胞或周围细胞[6,7]。
1.2 GDF-15表达及生物学功能
GDF-15基因表达受多个转录因子的调控, 如p53、SPI、AP-1、AP-4等[8]。GDF-15是P53基因调节的分泌蛋白, 在P53激活的情况下显著表达, 而且与TGFβ不同的是血清和血浆中的含量无血细胞依赖性而更加稳定和易于检测。在生理条件下, 人体内GDF-15的表达具有明显的组织特异性。GDF-15在胎盘和前列腺中高表达, 肾脏和胰腺中低水平表达, 而其他组织和器官以及心肌几乎不表达[9]。诸多研研究表明, 缺血、缺氧、压力负荷过重、损伤或肿瘤等情况下, GDF-15在P53、AP-1等转录因子的作用下表达增加, 发挥调节组织或器官生长、分化和修复等功能[10]。
G D F-1 5的主要生物学功能包括抗炎、抗细胞凋亡和抑制细胞生长。已有研究证实, GDF-15通过抑制白介素-1、肿瘤坏死因子-d、白介素-2等引起巨噬细胞活化;Baek等通过建立过表达GDF-15的裸鼠模型发现, GDF-15能抑制化学药物诱发肿瘤形成, 且GDF-15过表达能减少基因突变诱发的肿瘤发生;GDF-15通过激活Smad通路抑制心肌肥厚。
GDF-15的作用机制目前研究不多。GDF-15可通过与细胞膜表面受体结合而发挥生物学效应。GDF-15受体包括I型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体两种, 其胞内区都包含丝氨酸-苏氨酸蛋白酶, 可通过对转录因子Smad的磷酸化而启动胞内信号传导[11], 为Smad依赖通路和非Smad依赖通路。Smad依赖信号通路激活的Smad分子包括Smad2、3和Smadl、5、8。I型受体将Smad2和Smad3磷酸化, 后两者再与Smad4结合。最终Smad复合体进入细胞核, 通过细胞特异性的方式作用于多种转录因子而调节许多基因的转录。同时, GDF-15受体亦可以通过非Smad依赖信号通路转导信号。非Smad依赖信号通路激活的分子包括MAPK、TAK-1和P13K/Akt, 它们分别与不同的GDFs家族成员结合发挥其生物学效应。
1.3 GDF-15在心肌的表达及作用机制
GDF-15作用于心脏的机制目前尚未清楚。在正常的心肌细胞中不表达, 但在缺氧或压力负荷过重等应激状态下, 在心肌细胞表达增高。在小鼠心肌缺血模型中的高水平表达可以持续到心肌损伤后1周。研究发现, 一氧化氮 (NO) 能通过超氧化物或者过氧化硝酸盐依赖的途径介导GDF-15[12,13], 为Smad依赖和非依赖的信号通路可能共同参GDF-15调节心脏功能的信号传导[14]。GDF-15在心肌细胞迅速诱导高表达, 成熟的GDF-15蛋白被分泌到细胞外与心肌细胞表面TGF-β家族受体结合, 激活AKT、SMAD等下游信号通路, 反馈抑制心肌的损伤[13,15]在心血管系统中, GDF-15的细胞起源、上游调节因子、代谢途径以及功能效应尚未被明确阐明, 目前仍处于探索阶段。
2 GDF-15与心血管疾病
2.1 GDF-15与冠状动脉
Brown DA[16]报道血清GDF-15蛋白水平是妇女冠状动脉粥样硬化等心血管事件的独立危险因素, 首次将GDF-15与心血管疾病联系起来。动脉粥样硬化是一种动脉内膜疾病, 其发病机制至今尚未明了, 损伤反应学说是目前比较公认解释其发病机制的重要学说之一。此学说认为, 在机体刺激因子作用下, 巨噬细胞迁移到血管内皮并聚集到激活的内皮细胞下, 巨噬细胞即开始合成和分泌多种生长因子, 如PDGF、纤维母细胞生长因子CFGF, TGF-β及IL-1等, 这些局部分泌的细胞因子指导斑块发展, 诱导血管平滑肌细胞迁移, 促进并稳定血管损伤。认为巨噬细胞在动脉硬化的形成和发展过程中起了重要作用。虽然GDF-15血清浓度与传统的危险因素IL-6, CRP等相关, 但其仍为妇女患动脉粥样硬化等心血管事件的独立危险因素。动物模型中, P53的表达下调诱导斑块的不稳定。GDF-15活化的巨噬细胞中被激活, 并反馈抑制巨噬细胞的活化, GDF-15也是P53的重要下游基因, 可被P53所诱导, 发挥广泛的细胞调控作用。因此, Brown DA等认为, GDF-15可能在动脉粥样硬化的斑块中由活化的巨噬细胞生成, 分泌到血清中, 参与了动脉斑块的形成[16]。Jian Xu和Kempf[13,15]等同时报道GDF-15基因对心脏的保护作用, 他们研究发现, 原本在心脏中不表达的GDF-15基因在多种心血管疾病状态下被诱导在心肌细胞高表达, 抑制后负荷升高引起的心肌肥厚及其向心衰的转变, 抑制由缺血/再灌注引起的心肌损伤, 证实了GDF-15也是重要的心脏应激保护因子。
2.2 GDF-15与心肌梗死、缺血/再灌注损伤
冠状动脉闭塞后心肌缺血是心肌梗死的最重要常见病因。冠脉血运重建是急性心梗治疗的首要目标, 但是心肌再灌注会加重缺血造成的心肌损伤, 这一现象称为, 缺血/再灌注损伤。Kempf[13]发现GDF-15能减轻肌的缺血/再灌注损伤。该研究发现, 小鼠心梗模型和缺血/再灌注模型中, GDF-15在梗死区的表达迅速、显著地上调。同样, 在因急性心梗死亡的患者尸检标本中, 梗死区GDF-15表达也显著上升。通过敲除GDF-15基因的小鼠模型发现, GDF-15小鼠经过缺血/再灌注处理后的心肌梗死面积显著高于野生型小鼠, 而且缺血区心肌细胞凋亡明显较多。在体外细胞试验水平, 乳鼠心肌细胞在缺血和缺血-再灌注时, GDF-15表达都显著增加。而在培养液中加入重组GDF-15蛋白, 缺血时心肌细胞坏死及缺血/再灌注时心肌细胞的凋亡都显著减少。Tibor Kempf等认为缺血一再灌注损伤中, GDF-15主要通过PI3K-Akt信号通路保护心脏。GDF-15促进了Akt Ser473位点的磷酸化, 激活了Akt信号通路, 抑制了Bad诱导的心肌细胞凋亡。PI3K抑制因子和Akt的显性负突变体均消除了GDF-15对模拟的缺血和缺血/再灌注心肌细胞的保护作用。因此, GDF-15是心脏缺氧压力的应激反应基因, 正常情况下不表达, 在心肌缺血/缺血再灌注中, 被内源性ON合成酶2 (eNOS2) , P53或Egr-1等诱导表达, 通过PI3K-Akt抑制凋亡保护心脏, 减少缺血和缺血/再灌注造成的心肌损伤[10]。
2.3 GDF-15与心力衰竭
Kempf等[13]报道了GDF-15水平是慢性心衰预后的独立危险因素, 能为慢性心力衰竭的预后提供更多的信息。该研究测定了455名各种病因导致的慢性心衰患者基线血浆GDF-15水平, 调查后结果表明, GDF-15浓度可作为心功能分级指标。GDF-15能够预测HF患者疾病发展情况, 甚至还可以作为判断疾病预后的关键性标志[17,18]。另有学者研究证实HF患者与健康人的GDF-15血清或血浆浓度比较, 前者血清或血浆水平明显高于后者 (P<0.001) , 两组人群血清或血浆中GDF-15浓度相差四倍左右。综合分析大量文献, 在各种心血管疾病危险因素和常用的生化标记物中只有GDF-15, NT-proBNP和VEF是慢性心力衰竭患者死亡的独立危险因素。所以GDF-15可能成为在慢性心衰预后指标基础上进一步增加预测的效力。
GDF-15亦具有一抑制心肌肥厚向心衰转变及治疗心衰的作用。GDF-15基因敲除小鼠心衰模型手术后两周左心室功能即发生显著衰退著低于野生型手术小鼠, 提示GDF-15基因缺失使得心脏更快地失代偿, 由肥厚转为心衰。此外, 静脉注射重组GDF-15蛋白给实验基因敲除小鼠心衰模型, 发现其心脏左室射血分数增加, 左室舒张末期直径 (LVED) 均显著降低, 左室末期收缩直径 (LVES) 也显著降低, 提示GDF-15还可以逆转或改善已经心衰的心脏的功能。因此, GDF-15是心脏压力应激反应基因, 在心肌肥厚中被诱导高表达, 自分泌/旁分泌作用于心脏, 通过激活SMAD通路抑制心肌肥厚以及心肌肥厚向心衰转变, 同时还有一定的治疗心衰的作用。
2.4 GD F-15作为心力衰竭的预测生物标记物
鉴于GDF-15在正常人的心肌中的表达, 而在缺氧、缺血、炎症刺激下高表达, GDF-15可能作为心血管疾病心肌受到应激损伤时和进展中的生物标记物。Kempf[19]等人研究分析GDF-15在不同心血管疾病患者外周血中表达水平独立于传统的心血管危险因素。在动脉硬化的斑块中由活化的巨噬细胞生成, 分泌到血清中, 参与其形成他们研究表明GDF-15可能作为心血管事件的新的生物标记, 为心血管疾病开拓新的防治方向。Wollert[12]等人对非ST段抬高急性心肌梗死和ST段段抬高心肌梗死中外周血GDF-15表达升高。在死亡心肌梗死患者死检心肌组织中, GDF-15强表达, 说明心肌细胞的GDF-15高表达水平使外周血中的浓度也随之升高[20]。GDF-15可以对心血管事件患者危险分层, 可以发现预后信息。Kemp f等人在心衰患者研究发现其浓度高低与疾病严重程度相关[13], 综合分析说明, GDF-15的血清水平也可能提供心力衰竭独立的危险分层和预后信息, 在心力衰竭进展中评判独立的危险因子指导临床治疗。
3 总结与前景展望
GDF-15是TDF-β蛋白超家族成员之一, GDF-15的表达具有明显的组织特异性, 正常在心肌中不表达。在病理状态下GDF-15在病灶部位表达显著上调, 在外周血清GDF-15水平也上升。GDF-15的基因表达受多个转录因子的调控。其中P53下游基因的表达上调, 可诱导GDF-15成熟蛋白的活化和过度表达, 从而激活巨噬细胞反馈性抑制机制, 抑制其活化。也有学者研究证明GDF-15可能在HF部位的心肌细胞中抑制巨噬细胞的产生和形成, 并通过分泌的形式将其带入血清中, 从而减轻疾病程度。GDF-15分泌通过自分泌/旁分泌作用, 通过SMAD依赖和SMAD非依赖两种细胞内信号转导通路发挥效应。在心血管疾病中GDF-15发挥心肌细胞凋亡, 抗心肌细胞肥大的作用。
GDF-15水平对ST段抬高的急性冠状动脉心肌梗死、急性肺动脉栓塞、慢性心力衰竭等多心血管疾病的预测价值, 可能作为心血管疾病-心力衰竭进展中的生物标记物具有良好前景。采用GDF-15作为临床应用的生物标记物之前, 尚还有许多问题解决。首先, 心肌损伤GDF-15基因高表达保护心肌的联系机制尚不清楚。其次, 尽管许多研究GDF-15与心血管事件之间有关联, 但无法确立GDF-1 5 与心及梗死致心力衰竭的发生、发展和预后之间的因果关系。虽然目前研究提示GDF-15与心力衰竭的预后和心衰病人进行评判程度有关, 但GDF-15表达在心肌和外周血是否有相关性。那么如何将这个信息应用到临床是值得进一步探讨的。在前降支结扎后致心力衰竭发生过的不同时间段检查GDF-15水平表达, 探讨干预其信号通路是否更加合理有效的强化治疗心肌梗死致心力衰竭的逆转和延缓病情, 并寻找其治疗的规范化。上述现象综合分析在GDF-15参与了肿瘤心血管疾病之间共有的信号通路, 可能与不同细胞表面的受体亚型、潜在的信号传导机制以及GDF 15的下游靶基因, 将有助于我们深入理解GDF1 5 与心血管疾病之间的关系, GDF 1 5生物标记物在临床指导、预后价值及其作用机制与联系值得进一步深入研究。总之GDF-15作为心肌保护预测因子应用于心血管疾病的临床实践发挥指导作用之前, 还需进一步证实与挖掘, 需要更多的验证性研究。为这种人类目前最大健康杀手-心力衰竭治疗和干预提供新的靶点。
关键词：生长分化因子15,心力衰竭,信号通路,干预
生长转化因子-15 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析了2005年3月～2010年5月在我院行肺癌根治术收的73例NSCLC患者为研究对象，均有完整的临床资料并成功完成随访。纳入标准：所有患者均经病理组织学和/或细胞学诊断为NSCLC，并按肺癌国际分期标准(UICC,2002)为Ⅲ～Ⅳ期，KPS评分≤60分，预计生存期≥3个月，既往未接受过抗肿瘤治疗或者距离末次抗肿瘤治疗时间2个月以上。73例患者中，男44例，女29例;年龄36～78岁，平均(62.6±11.2)岁;病理类型：鳞状细胞癌58例;腺癌15例;Ⅲ期57例，Ⅳ期16例。另选同期在我院体检的健康查体者70例为对照组，男40例，女30例;年龄35～75岁，平均(61.8±14.3岁)。NSCLC组与对照组在性别和年龄构成方面差异无显著性(P<0.05)，具可比性。
1.2 方法
分别取NSCLC患者手术前空腹12 h清晨肘静脉血，对照组取体检日空腹12 h清晨肘静脉血，样本量为3 m L,3 000 r/min离心15 min后分取血清，置-80℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检定血清HGF、TGF-β水平，所用HGF和TGF-β试剂盒为深圳晶美公司产品，严格按试剂盒说明操作。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析，计量资料(均数之间的比较)用t检验，以P<0.05为差异有显著性。所有计量资料采用均数±标准差(x±s)表示。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 NS CLC组和对照组血清HGF和TGF-β水平比较
NSCLC组血清HGF、TGF-β均显著高于对照组，相比较差异有显著性(t=4.046,3.994,P<0.05)。结果见表1。
注：覮与对照组比较，P<0.05
2.2 HGF、TGF-β表达与NS CLC临床病理指标的关系
临床分期Ⅳ期的血清HGF、TGF-β水平显著高于Ⅲ期，相比较差异有显著性(t=3.941,3.898;P<0.05);肿瘤低分化组血清HGF、TGF-β水平显著高于高中分化组，相比较差异有显著性(t=3.471,3.656;P<0.05);发生肿瘤转移组血清HGF和TGF-β水平显著高于肿瘤未转移组，相比较差异有显著性(t=3.357,3.615;P<0.05)。血清HGF、TGF-β水平在性别、年龄和肿瘤病理类型之间比较差异无显著性(P>0.05)。结果见表2。
3 讨论
手术根治性切除仍然是NSCLC主要的治疗方法，但由于NSCLC易转移，大多数患者术后死于肿瘤转移和肺癌复发。传统的肺癌TNM分期作为评估患者术后转移和复发的指标很难做出准确的估计。近年来随着肿瘤分子生物学水平研究的不断发展，寻求NSCLC新的有效的预测指标，及早对NSCLC进行准确诊断，为患者争取手术时间、预测术后复发以及病情进展风险具有重要的现实意义。
由于肿瘤的发生与发展是一个多因素、多步骤的复杂病理过程，多种细胞因子与肿瘤的发生、肿瘤细胞增殖以及肿瘤分化密切相关[7]。研究发现HGF及TGF均是多效因子，在肿瘤的发生、发展中表现出多种生物学作用。HGF是一种在肝、肾组织受损后促进再生的生长因子，它具有刺激肝细胞再生的能力，并对上皮细胞集落有扩散作用[8]。TGF-β是一类多肽类生长因子超家族，具有多种生物学功能[9]。在多种肿瘤研究中均已证实HGF、TGF-β在肿瘤发生、发展中表现出多种生物学效应，有促进肿瘤细胞增殖、浸润转移的作用，有调节血管生长因子的表达和促进肿瘤血管生成的功能，有促进细胞增殖和抗凋亡作[10,11,12]。此外，HGF刺激可促进淋巴内皮细胞的增殖，促进淋巴管形成的作用[13]。TGF-β还具有免疫抑制作用，可以使高免疫原性肿瘤细胞逃脱免疫监视，从而形成肿瘤[14]。本研究结果显示：NSCLC患者血清HGF和TGF-β水平显著高于对照组(P<0.05)。提示NSCLC患者血清存在HGF和TGF-β高表达。
本研究进一步对血清HGF和TGF-β水平与NSCLC患者临床病理指标之间关系进行研究，结果表明临床分期Ⅳ期患者的血清HGF和TGF-β水平显著高于Ⅲ期(P<0.05)，肿瘤低分化组血清HGF和TGF-β水平显著高于高中分化组(P<0.05)。表明HGF和TGF-β在NSCLC血清中高表达，并随着肿瘤的恶性程度升高，其表达水平和强度增加。提示术前高水平的HGF和TGF-β意味着该患者可能处于肿瘤晚期，表明血清HGF和TGF-β水平作为监测肿瘤恶性程度是一个可行的指标。分析其原因可以在于：肿瘤进行晚期后，肺癌细胞丧失了对HGF和TGF-β负性调控作用的反应性，导致HGF和TGF-β无限增殖[15]。本研究结果显示：发生肿瘤转移组血清HGF和TGF-β水平显著高于肿瘤未转移组，相比较差异有显著性(P<0.05)。表明术前高水平的HGF和TGF-β意味着该患者已发生远处转移或淋巴结转移，进而提示研究者需要做进一步的检查，以避免进行不必要的手术。本研究结果表明HGF和TGF-β水平在性别、年龄和肿瘤病理类型之间差异无显著性(P>0.05)。提示HGF和TGF-β水平与NSCLC患者的性别、年龄和肿瘤病理类型无显著相关性。
生长转化因子-15 篇3
1 材料与方法
1.1 对象
选取2009年5月至2012年7月中南大学湘雅二医院病理科的存档标本 (宫颈鳞癌组织) 98例, 收集标本时所有患者均未接受放疗、化疗, 临床资料完整。所有患者均在我院行广泛子宫切除+盆腔淋巴结切除术, 术后病理诊断均为宫颈鳞癌, 按国际妇产科联盟 (FIGO) (2009年) 分期标准:Ⅰ期35例 (ⅠB1期19例, ⅠB2期16例) , Ⅱ期63例 (ⅡA期34例, ⅡB期29例) ;分化程度:高分化20例, 中分化48例, 低分化30例;有淋巴结转移40例, 无淋巴结转移58例。98例患者平均年龄48.3±9.05岁。同时收取因中、重度宫颈上皮内瘤变 (CINⅡ~Ⅲ) 在我院行子宫全切除术或者宫颈锥切手术的宫颈标本20例, 患者年龄39.0±7.82岁, 及正常宫颈组织10例, 10例平均年龄41.0±8.94岁。本研究获得中南大学湘雅二医院伦理学委员会的批准, 所有患者均已签署知情同意书。
1.2 主要试剂
CTGF兔抗人多克隆抗体Ig G购自北京博奥森生物工程有限公司, TGF-β1兔抗人多克隆抗体Ig G购自Protein-Tech Group公司。
1.3 方法
采用Power Vision免疫组织化学染色 (SP) 方法。各步骤均按试剂盒说明书严格操作, 在显微镜下观察, 严格质控。
1.4 结果判定
CTGF、TGF-β1阳性细胞为光镜下细胞的胞质或胞膜呈现棕黄色颗粒, 评分标准使用免疫反应评分 (immunoreactivity score, IRS) 系统包括阳性染色细胞数和染色强度两部分评价: (1) 阳性染色细胞数≤5%为0分;6%~25%为1分;26%~50%为2分;51%~75%为3分;>75%为4分; (2) 染色强度无色为0分;淡黄色为1分;黄色为2分;褐色为3分。将同一组织的两部分评分结果相乘即得出该组织标本的免疫反应评分, 0分为无表达;1~4分为弱阳性;5~8分为中等阳性;9~12分为强阳性。在本研究中, 为了便于分组统计, 将无表达和弱阳性定义为阴性表达 (-) ;将中等阳性和强阳性定义为阳性表达 (+) 。
1.5 统计学分析
采用统计学软件包SPSS 18.0进行统计学分析, 采用χ2检验、Spearman等级相关分析及多因素Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CTGF蛋白和TGF-β1蛋白在不同宫颈组织中的表达
CTGF、TGF-β1染色阳性均表现为细胞胞浆和胞膜呈棕黄色, 两者在不同宫颈组织中的表达见图1、图2、图3。CTGF蛋白在正常宫颈组织、CINⅡ~Ⅲ组织和宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为10.0% (1/10) 、40.0% (8/20) 、80.6% (79/98) , TGF-β1蛋白在正常宫颈组织、CINⅡ~Ⅲ组织和宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为20.0% (2/10) 、45.0% (9/20) 、62.5% (69/98) ;CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在3组间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 两两比较:CTGF、TGF-β1蛋白在宫颈鳞癌组织中表达率最高, 其与正常宫颈组织、CINⅡ~Ⅲ组织比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 而在正常宫颈组织和CINⅡ~Ⅲ组织中比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.2 CTGF蛋白和TGF-β1蛋白在宫颈鳞癌中表达的相关性
CTGF蛋白和TGF-β1蛋白在宫颈鳞癌组织中表达的阳性率分别为80.6%和62.5%, 通过Spearman等级相关性分析发现, 宫颈鳞癌组织中CT-GF与TGF-β1的表达呈正相关 (r=0.643, P<0.01) 。
2.3 CTGF蛋白和TGF-β1蛋白的表达与宫颈鳞癌临床病理因素间的关系
宫颈鳞癌组织中CTGF、TGF-β1蛋白的阳性表达率在不同的组织学分化程度、盆腔淋巴结有无转移和不同临床分期间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而在不同年龄、是否脉管浸润、不同肿瘤直径大小和肌层浸润深度不同的比较中, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
2.4 宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移与CTGF蛋白和TGF-β1蛋白表达及临床病理因素的关系
我们将宫颈鳞癌患者分为盆腔淋巴结转移组 (转移组) 和盆腔淋巴结未转移组 (未转移组) 进行对比分析:CTGF蛋白表达、TGF-β1蛋白表达、年龄<40岁、有脉管浸润、肌层浸润深度>1/2、肿瘤直径>4 cm、组织分化程度越低的宫颈鳞癌更容易发生盆腔淋巴结转移。见表2。将有统计学意义的影响因素引入到多因素非条件Logistic回归分析模型进行多因素统计分析, 结果显示:CTGF蛋白表达、年龄、组织分化程度、肿瘤直径是影响盆腔淋巴结转移的独立危险因素。
3 讨论
3.1 CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在不同宫颈组织中的表达及意义
目前研究显示, CTGF在不同的肿瘤中有不同的作用[5]。我们的前期实验利用基因芯片筛选出盆腔淋巴结转移组的差异表达基因CTGF[3]。本实验发现CTGF蛋白、TGF-β1蛋白的阳性表达率在正常宫颈组织、CINⅡ~Ⅲ组织、宫颈鳞癌组织中呈现逐步递增的趋势, 通过Spearman等级相关性分析发现:CTGF蛋白与TGF-β1蛋白在宫颈鳞癌中的表达呈正相关。我们的结果与近年来研究CTGF、TGF-β1在肝癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中高表达的结果是一致的, 提示宫颈鳞癌中CTGF蛋白、TGF-β1蛋白高表达与宫颈鳞癌的发生发展有关, 二者具有协同性。推测其促癌的机制是CTGF被TGF-β1等细胞因子诱导分泌后, 与细胞表面整合素受体相互作用后激活了局部黏着斑激酶 (FAK) 和促分裂原活化激酶 (MAPK) 信号通路, 最终导致癌细胞增殖发展, 具体原因有待于做分子机制等进一步的研究。
本研究进一步比较后发现, 宫颈鳞癌组织中CT-GF蛋白、TGF-β1蛋白的阳性表达率高于正常宫颈组织和CINⅡ~Ⅲ组织 (P<0.05) , 而在正常宫颈组织和CINⅡ~Ⅲ组织中表达率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 分析原因可能与正常宫颈组织及CINⅡ~Ⅲ组织的例数较少有关, 还有待扩大样本量作进一步分析。尽管在CINⅡ~Ⅲ组织中存在CTGF蛋白、TGF-β1蛋白的表达, 但表达水平较低, 说明CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在CINⅡ~Ⅲ进展为癌的进程中, 可能是参与因素, 不是起主要作用的因子, 但是两者在宫颈鳞癌中均呈现高表达状态, 提示CTGF蛋白、TGF-β1蛋白可能与宫颈鳞癌的恶性程度密切相关。
3.2 CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在宫颈鳞癌的表达与临床病理因素的关系
近年来在胃癌、食管腺癌[6]、软骨肉瘤[7]、喉鳞状细胞癌[8]中的临床研究表明, CT-GF的高表达与临床分期、恶性程度、预后的相关性不一致, CTGF在肿瘤中的作用取决于肿瘤的类型[9,10]。本研究中CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在98例宫颈鳞癌的阳性表达率与肿瘤组织分化程度、淋巴结转移、临床分期有关 (P<0.05) , 提示CTGF蛋白、TGF-β1蛋白可能参与了肿瘤的侵袭转移。
3.3 宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移与CTGF蛋白、TGF-β1蛋白表达的关系
盆腔淋巴结转移是宫颈癌扩散的主要途径之一, 同时也是影响宫颈癌预后的主要危险因素。本研究中将影响盆腔淋巴结转移的7个危险因素 (CTGF蛋白表达、TGF-β1蛋白表达、年龄<40岁、有脉管浸润、肌层浸润深度>1/2、肿瘤直径>4 cm、组织分化程度低) 进行多因素Logistic回归分析, 结果显示CTGF蛋白、年龄、组织分化程度及肿瘤直径是影响宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的独立危险因素, 这与潘秀玉等[11]收集286例宫颈癌的课题中报道的肿瘤大小是宫颈癌淋巴结转移的独立因素相一致, 同时与以往报道的CTGF高表达与食管癌的淋巴结转移有关相符[6]。
我们的研究表明, 宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移与临床分期没有关系, 推测原因可能与取材的实验标本有关, 本实验的标本都是Ⅰ~Ⅱ期的手术患者, 而晚期 (Ⅲ~Ⅳ期) 宫颈鳞癌的患者因无法获取淋巴结转移的相关资料缺如。另外, 本研究中CTGF蛋白在评价盆腔淋巴结转移的作用更优于TGF-β1。推测CTGF不单受TGF-β1的调控, 还可能受到其他因子的调节, 如肿瘤坏死因子 (TNF) 、骨形态发生蛋白 (BMPs) 等。CTGF能否作为宫颈鳞癌患者预后的一个评价指标, 有待于多中心、大样本的进一步研究。
摘要：目的:探讨结缔组织生长因子 (CTGF) 蛋白、转化生长因子-β1 (TGF-β1) 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系, 特别是与盆腔淋巴结转移的关系。方法:应用Power Vision免疫组织化学染色法检测正常宫颈组织 (10例) 、CINⅡⅢ组织 (20例) 和宫颈鳞癌组织 (98例) 中CTGF蛋白及TGF-β1蛋白的表达情况, 并比较两种蛋白的阳性表达率与宫颈鳞癌的不同临床病理因素间的关系及其与盆腔淋巴结转移的关系。结果:1CTGF蛋白、TGF-β1蛋白在正常宫颈、CINⅡⅢ、宫颈鳞癌中的阳性表达率呈现递增的趋势, 三者比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。2宫颈鳞癌中CTGF蛋白表达与TGF-β1蛋白表达之间呈正相关 (r=0.643, P<0.05) 。3宫颈鳞癌组织中CTGF、TGF-β1蛋白的阳性表达率在不同的组织学分化程度、盆腔淋巴结有无转移和不同临床分期间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。4多因素非条件Logistic回归分析示:CTGF蛋白、年龄、组织分化程度及肿瘤直径是影响宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的独立危险因素 (P<0.05) 。结论:CTGF蛋白、TGF-β1蛋白参与宫颈鳞癌的恶性程度进展, 且CTGF可作为宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的独立危险因素之一。
关键词：宫颈鳞癌,结缔组织生长因子,转化生长因子-β1,免疫组织化学法
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生长转化因子-15 篇4
关键词：生长分化因子15,成纤维细胞,内皮素1,心肌纤维化
生长分化因子-15(Growth differentiation factor-15,GDF15)是近年来新发现的一种心脏保护因子,属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员之一[1,2]。既往研究显示,GDF15在心肌细胞缺氧或压力负荷过重等应激状态下中表达,可以抑制心肌细胞肥大,抑制心肌肥厚,改善心室重构[3]。心室重构除心肌细胞肥大外还包括心肌纤维化,而心肌纤维化又包含成纤维细胞增殖和胶原分泌增加。成纤维细胞在心脏的细胞组成中占近2/3,而GDF15在其中的表达和功能则尚未见报道。研究已证实内皮素1(Endothelin 1,ET-1)可以促进成纤维细胞的增殖,参与心室重构,对慢性心衰等多种心血管疾病的发生和发展起重要作用[4]。本课题拟研究GDF15在ET-1刺激下在心脏成纤维细胞中表达及其对成纤维细胞增殖的影响,为进一步研究GDF15在心肌纤维化中的作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
SD乳鼠,出生1～3天,健康,由北京大学医学部实验动物中心提供。实验过程遵守《北京市实验动物管理条例》。
1.2 方法
1.2.1 原代心脏成纤维细胞的分离和实验分组
无菌取出生(1～3)天的SD乳鼠心室,剪碎,0.1%胰酶(Hyclone公司,生产批号:PF6104AC)和0.03%胶原酶(Invitrogen公司,生产批号:512030)反复消化,离心,收集细胞置于含10%胎牛血清(Hyclone公司,生产批号:AQB23240)的DMEM培养液(GIBCO公司,生产批号:1320158)中,采用差速贴壁法培养90min,倾去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM继续培养。实验采用第1-3代细胞。实验分组,对照组(control):培养过程中不加任何刺激剂;ET-1刺激组:细胞上清中加入10-6 mol/L ET-1;GDF15刺激组:细胞上清中加入人源性GDF15(Santa Cruz公司,批号:1006S396)3 pmol/L。原代成纤维细胞接种24小时后换以含无血清的DMEM培养液,18小时后加入上述因子,继续培养48小时。
1.2.2 realtime-PCR法检测GDF15 mRNA表达
按照Trizol试剂说明书提取细胞的总RNA,取1μg逆转录成cDNA作为PCR的模板。引物序列GDF15上游引物:5'-CTGCTCTTGCTGCTTCTGCT-3';GDF15下游引物:5'-TCGT CCGGGTTGAGTTGG-3'。18s rRNA上游引物:5'-TACCACATCCAA GGAAGGCAGCA-3';18s rRNA下游引物:5'-TGGAATTACCGCG GCTGCTGGCA-3'。实验重复3次,副孔3个。以公式2-ΔCTΔCT计算目的基因相对与内参基因的相对表达量。
1.2.3 Western印迹检测
GDF15蛋白的表达:用细胞裂解法提取蛋白,Bradford法测蛋白浓度,取30μg蛋白,100℃加热变性5 min。配制10%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶后加入样品,电泳,电转至硝酸纤维素膜,封闭,以抗GDF15多克隆抗体(Santa Cruz公司)(体积比1:200)室温孵育1 h,4℃过夜,TBST洗膜,继与辣根过氧化物酶-抗鼠-IgG (1:2 000)室温孵育1 h,常规洗膜,ECL显色系统X光片感光显影。
1.2.4 ELISA酶联免疫法检测分泌蛋白水平
应用大鼠生长分化因子15 ELISA试剂盒(北京中昊生物公司),将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入,37℃反应90分钟,洗涤,将生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。洗涤,将ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。洗涤,按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液,37℃避光反应5分钟加入TMB终止液0.1 ml/孔。用酶标仪在450nm测定O.D.值,根据标准曲线,求得细胞上清GDF15的浓度。实验重复4次。
1.2.5 MTT方法检测细胞增殖
将细胞消化计数,以密度为(2～3)×10[4]个细胞/ml、500μl/孔接种于24孔培养板中,经不同处理48小时后,将配制的MTT溶液加入培养基中,每孔100μl,37℃孵育4小时。吸去培养基,此时培养板底有蓝紫色不溶性结晶形成。每孔加入200μl DMSO溶解产物,振荡1 0min,用分光光度计读取492nm的吸光值。实验重复3次,副孔4个。
1.2.6 流式细胞计数检测细胞周期:胰酶消化收集细胞,75%(体积分数)乙醇固定,RNA酶37℃
消化30min,100目筛网过滤,碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色,流式细胞仪分析细胞周期。实验重复4次。
1.3 统计学分析
采用SPSS13.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用T检验。P<0.05为差异有统计学意义。P<0.01为差异显著。
2 结果
2.1 乳鼠心脏成纤维细胞的培养与鉴定
经倒置相差荧光显微镜观察细胞呈成纤维细胞典型形态:梭形、多角形,胞质透明,胞核圆形或椭圆形,有些呈双核。免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,显示Vimentin染色阳性,而α-SMA染色阴性,符合成纤维细胞的染色特点。(图1A-1C)
2.2 GDF15在成纤维细胞中的表达
realtime-PCR检测GDF15 mRNA表达水平,发现ET-1刺激组较对照组表达增加(1.20±0.03)倍,有统计学差异,P=0.02。(见图2 A)提取蛋白行Western印迹检测,可以发现ET-1刺激组表达较control组明显增加。(见图2 B)收集细胞上清,使用大鼠生长分化因子15 ELISA试剂盒检测分泌的GDF15,结果示对照组GDF15浓度为0.4±0.17pg/mL,ET-I刺激组为3.27±0.81 pg/mL,两组间差异有统计学意义,P=0.013。(见图2 C)。以上结果说明ET-1可以诱导GDF15蛋白表达增加。
故本研究发现GDF15在心脏成纤维细胞中有表达,同时ET-1可以使GDF15表达增加。
A real-timePCR检测mRNA表达水平,ET-1组较Con组升高,P=0.02;B western-Blot方法用大鼠GDF15多克隆抗体检测GDF15蛋白表达水平;C Elisa方法检测细胞培养液中GDF15表达,ET-1组较Con组升高,P=0.013。
2.3 GDF15对心脏成纤维细胞增殖的影响:
比较对照组和GDF15刺激组,MTT测定发现细胞增殖较对照组显著加强[con组(0.48±0.03),GDF15组(0.62±0.03)P=0.029]。(图3 A)流式细胞术检测发现GDF15刺激组S期比例为(9.62±1.17)%,明显增加,提示较对照组细胞(3.80±0.78)%,增殖明显(图3 B),有统计学差异,P=0.008。以上实验结果提示GDF15对成纤维细胞的增殖起促进作用。
图3 GDF15对心脏成纤维细胞增殖的影响:A MTT方法,各组间OD值比较,GDF15刺激组较对照组增殖明显,P=0.029;B流失细胞术,PI染色,GDF15刺激组S期比例明显增加,提示较对照组GDF15对心脏成纤维细胞增殖的影响;A MTT方法,各组间OD值比较,GDF15刺激组较对照组增殖明显,P=0.029;B流失细胞术,PI染色,GDF15刺激组S期比例明显增加,提示较对照组细胞增殖明显,P=0.008。
3 讨论
GDF15是一种分泌型的应激反应蛋白,是一种心脏保护因子,以往研究表明GDF15在多种疾病状态,以及在P53、AP-1等转录因子作用下被诱导表达,调控不同细胞系的细胞功能[2,5]。GDF15主要的生物学功能包括:(1)抗炎症反应:GDF15抑制白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白介素-2等引起的巨噬细胞活化;(2)抑制细胞生长:主要表现为抗细胞肥大和重塑作用,在心肌缺血/再灌注模型中发现其抑制心肌细胞肥大和心肌重构[3]。近年研究发现,GDF15参与多种心血管疾病的发生发展过程,临床研究发现其对急性冠脉综合征的预后和治疗有预测价值[6,7],Kempf等在心力衰竭病人中初步研究发现GDF15水平与心力衰竭的严重程度呈正相关,是心力衰竭患者2年病死率的独立预测因素[8],但进一步对于其在心力衰竭中的基础研究还十分欠缺。
本实验发现,GDF15在成纤维细胞中有表达,为以后将其作为心肌纤维化甚至早期心力衰竭的标志物提供了部分基础实验依据。心肌纤维化这种病理变化在多种心血管疾病中存在,现认为其与高血压病、心肌梗死及心力衰竭、风湿性心脏病、心房颤动、糖尿病性心肌病变[9,10,11]等疾病相关,是心源性猝死的潜在危险因素。通过对血液中GDF15的检测,可望实现对心肌纤维化的早期发现、早期干预,Kempf等人的前期研究也提示了这一前景。
本实验还发现,GDF15可以促进心脏成纤维细胞增殖。结合目前临床研究中发现的GDF15与心力衰竭存在相关性,故提示其可能与促进心肌纤维化,诱导心衰加重相关。但是本研究中发现的GDF15细胞培养液中含量仅(3～4)pg/mL,显著低于文献报道的在急性心梗和心衰患者血中高达1200ng/L的表达量[6,7,8],提示影响成纤维细胞发挥作用可能并非由其自分泌,可能主要是依赖心肌细胞或其它细胞旁分泌的GDF15。成纤维细胞的活化增殖是组织修复过程中最重要的细胞活动之一,而进一步结合Kempf等在体动物实验,采用大鼠缺血/再灌注及心梗模型,通过组织学检测发现持续性冠脉结扎组缺血区域GDF15快速表达,梗死区心肌细胞中GDF15 mRNA在1小时内表达显著增加[12],提示急性心梗时梗死区通过高表达GDF15,使心脏成纤维细胞增殖增加,以利于心梗的急性修复。
生长转化因子-15 篇5
1 TGF-β的结构与生物学特性
TGF-β是由两个结构相同或相近的分子量为12.5KD亚单位借二硫键连接而成的双体结构。TGF-β常见有3个亚型:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β受体分三型:TBRⅠ、TBRⅡ和TBRⅢ。每种TGF-β亚型均以前体形式合成,该前体包括了N端的信号肽(第1～29位氨基酸)、前肽区域(LAP,第30～278位氨基酸)和TGF-β区域(第279～390位氨基酸)。TGF-β分子被分泌出细胞外后,以一种休眠复合物形式储存于细胞外基质(ECM)或血小板α颗粒中,该复合物包括TGF-β分子、LAP和潜活的TGF-β结合蛋白(LTBP)三部分。TGF-β复合物在体内通过与血栓黏合素-1、纤溶酶和α5β5整合素(integrin)等的相互作用而以不同的方式被活化。TGF-β通过自分泌、旁分泌途径发挥以下生物学功能:(1)促进细胞肥大。TGF-β能诱导P27kipl基因的表达,后者能抑制Cyclin-cdk4复合物的活性,继而抑制cdk2的活性,最后导致Rb在C1中期不能及时被磷酸化,细胞不能从G1期过渡到S期,而RNA、蛋白质合成增加,表现为增殖受抑,细胞肥大[2]。(2)使ECM含量增高。能促进多种ECM成分(如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原)和多种蛋白多糖(如biglycan)的合成,抑制ECM的降解,包括抑制ECM成分的酶类如胶原酶、transin/serine蛋白酶和纤溶酶原激活因子(PA),并促进诸如纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)等蛋白酶抑制因子的表达,促进integrin表达而增强细胞-基质相互作用。(3)其他功能。促进损伤修复、胚胎发育、免疫调节及肿瘤发生等[3]。
2 TGF-β与脏器纤维化
2.1 TGF-β与胰腺纤维化
Vogelmann等[4]用TGF-β转基因小鼠模型鉴定了胰腺纤维化的组成及致纤维化介质。出生14d的小鼠,TGF-β的mRNA水平已升高,此时的纤维组织主要是Ⅰ、Ⅱ型胶原组成,70d时ECM的成分增加,并伴有纤维连接蛋白(FN)的沉积增多,与此相平行的胰腺星形细胞(PSC)数量的增高。这一结果提示TGF-β激活PSC,促进ECM沉积而介导胰腺的纤维化过程[4]。另有研究证实[5]:TGF-β还可通过上调其下游的效应因子如结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和VEGF等的mRNA表达,间接地调控胰腺纤维化进程。
2.2 TGF-β与肾脏纤维化
在各种病因的慢性肾纤维化过程中都显现TGF-β表达升高。Chin-weiyang等[6]用免疫荧光抗体法和原位免疫杂交法测定不同类型的肾小球疾病患者肾活组织标本中TGF-β1mRNA的水平,发现轻度硬化组的肾小球TGF-β1mRNA较肾小球微硬化组增高1.5倍,中度硬化组升高3.5倍,而同时测定的肾小球IV型胶原mRNA水平则分别增高1.3倍和2.2倍。同样,Tatsuo等[7]测定不同肾病肾组织的TGF-βmRNA水平,结果显示微小病变的TGF-βmRNA表达与正常组没有明显差异,而以ECM聚积为特征的IgA肾病、局灶节段增生性肾小球硬化、新月体性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和糖尿病肾病,其肾小球和小管间质的TGF-βmRNA水平显著增高,表明TGF-βmRNA可以有效地反映肾小球硬化程度。用HVj-liposome法给正常大鼠肾脏转入TGF-βcDNA使其过渡表达,结果导致肾小球硬化,而用反义多聚核苷酸抑制其活性,则可以延缓肾小球硬化的进展[8]。给大鼠注射抗胸腺细胞血清(ATS)制备实验性急性系膜增生性肾炎模型,发现肾小球损伤后,局部立即释放激活的TGF-β,并通过信号转导致大量的基因表达,进一步放大其生物效应[9]。在TGF-β的作用下,肾小球固有细胞大量合成FN、I、III型胶原和一些只有组织损伤时才出现的基质分子,还促进TIMP的产生,阻止基质降解,同时TGF-β诱导一些integrins受体在肾小球表面表达,如与相应配体结合后,则新合成的蛋白快速沉积于系膜区。这与人类的链球菌感染后急性肾小球肾炎的病理变化类似,一旦损伤持续存在,TGF-β将持续表达,使ECM过度沉积,导致慢性肾脏纤维化和肾小球硬化。Hoffman等[10]研究TGF-β在糖尿病性肾硬化中的作用,高血糖时细胞内TGF-βmRNA表达及TGF-β水平明显增加,同时肾小球肥大和ECM增多。利用形态学观察和增殖细胞核抗原(PCNA)、平滑肌动蛋白(SMA)、结蛋白(desmin)及波形蛋白(Vimentin)免疫组化等方法研究发现TGF-βmRNA表达于再生的上皮细胞及转化为成纤维细胞(MYOFB)的上皮细胞,说明TGF-β参与调节肾小管上皮细胞的分化[11]。最近研究表明[12]:某些药物、高糖、TGF-β及其受体是机械损伤的重要介质,TGF-β还介导CTGF、FGF等通过蛋白激酶C(PKC)途径、有丝分裂蛋白激酶(MAPK)途径增强API的DNA结合能力,从而促ECM的合成及细胞的增殖。
2.3 TGF与肝脏纤维化
Blesser等[13]用Northern杂交技术测定正常和纤维化肝脏TGF-β的表达,在正常肝脏,TGF-β1mRNA绝大部分布于Kupffer细胞,其次肝星状细胞(HSC),而肝窦内皮细胞和肝细胞则无表达,而纤维化肝脏,TGF-β1 mRNA在HSC上的表达较正常增加12倍,大大超过kuppffer细胞,而肝窦内皮细胞和肝细胞内亦有明显表达。在肝纤维化中,活化的HSC是产生ECM的主要细胞,而TGF-β可多方面影响HSC:(1)TGF'-β激活静态HSC,使其表型转化为类MYOFB。其特征是细胞明显增殖,趋化聚集,向炎症坏死部迁移,表达α-SMA,从而具有收缩性,使肝血窦内压力升高,促进肝硬化门脉高压形成,TGF-β促进MYOFB合成大量ECM,释放细胞因子及炎症介质,包括TGF-β自身,形成TGF-β的分泌环路。(2)TGF-β能增加ECM受体在HSC膜上的表达。经TGF-β处理的HSC与胶原、FN及其他基质的结合能力增强,这种结合须通过细胞膜上的integrin,TGF-β可提高各种integrin亚单位的mRNA表达水平,MCE与HSC的结合有助于HSC的持久活化。(3) HSC活化后胞膜上α2-巨球蛋白的受体表达,使α2-巨球蛋白入胞降解,不能清除TGF-β,从而进一步增高其水平。Eghabali等[14]进行了TGF-β对肝细胞影响的研究,培养的肝细胞加入1mg/mL的TGF-β1后,可使放射标记的胸腺嘧啶利用率下降到原的39%(24h)和69%(48h),并出现Ⅰ型胶原表达。Delhaye等[15]亦发现随着慢性肝病患者肝组织内TGF-β升高,作为肝细胞增殖标志的PC-NA明显下降。TGF-β还可通过抑制肝细胞DNA合成而诱导其凋亡。另有研究[16]证实TGF-β可在翻译水平抑制肝细胞合成和分泌清蛋白,而不影响清蛋白mRNA的转录。TGF-β抑制肝细胞再生并抑制其正常功能,从而加重肝脏损害。此外,TGF-β能刺激kupffer细胞产生过氧化氢而使肝损伤。Rideor[17]在培养的肝窦内皮细胞上发现了3种TGF-β受体的表达,并观察到TGF-β可增加其合成和分泌PAI-1,可能通过抑制纤溶酶活化而减少蛋白多糖等降解。近新的研究表现:TGF-β能增加HSC及其他间质细胞表达和分泌PDGF,亦能增加PDGF受体mRNA的稳定性,上调其受体蛋白在HSC上的表达,参与协同刺激HSC的活化[18]。在诸多细胞因子中,肝细胞生长因子(HGF)是TGF-β的拮抗者,Sato等[19]用重组人HGF治疗乙酰胺所致肝硬化鼠,Northern杂交显示TGF-βmRNA明显下降,前胶原α2(I)、α2(IV) mRNA表达亦下降,而肝细胞再生标志PCNA-LL升高。综合上述,TGF-β通过HSC,肝实质细胞、肝窦内皮细胞等细胞,其纤维化相关的其他生长因子施加广泛影响而起到致肝纤维化的作用。
2.4 TGF-β与心肌纤维化
诸多学者研究表明TGF-β对包括心血管在内的各个部位都发挥关键的作用[20]。Sun等[21]在体外培养中证实TGF-β促进成纤维细胞(FB)的分化和增殖,上调胶原合成并抑制胶原酶释放,TGF-β在纤维化部位的表达明显增加,并伴MYOFB和巨噬细胞增加。Pinto等[22]报道在Ren2高血压大鼠中,心肌厚度和外周血管纤维化显著增加,TGF-β表达增加。高盐饮食的自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar-kyoto大鼠(WKY)左室TGF-βmRNA表达均显著增加,大鼠心肌层、单核细胞和类FB细胞中都存在TGF-β表达的证据,同时在心肌血管中层也可检测到TGF-βmRNA的存在,显示高盐饮食对SHR和WKY左室、心肌血管的纤维化促进作用都与TGF-β的过度表达有关。Ammargnellat等[23]在DOCA-盐高血压大鼠中观察到在第1周时TGF-β1 mRNA表达增高,1周后心脏中TGF-β1蛋白水平是对照组的2.5倍,同时左室的肌层间质和外周血管胶原沉积显著增加。非特异性的TGF-β表达抑制剂曲尼司特(Tranilast)可减少左室TGF-β、水平胶原积聚、外周血管纤维化和左室肥大,且这种作用为非血压依赖方式。Brooks等[24]发现在24个月龄的TGF-β1杂合小鼠中心肌纤维化(MF)的发生更少,表明杂合子小鼠与同龄对照组小鼠相关的顺应性增加,而心肌结合的组织数量的减少说明TGF-β1等位基因的缺失能影响心脏生长过程中心室的重构。近来资料还显示受TGF-β1调节的血管紧张素I1(AngⅡ)对心肌成纤维细胞(CFB)可能产生影响[25]。
2.5 TGF-β与肺纤维化
Keerthisingam研究证实:在肺纤维化患者中前列腺素E2 (PGE2)水平降低,而PGE2有抑制FB增殖和胶原合成,其原因是由于TGF-β诱导FB的大量增殖,而FB不能上调COX-2的表达所致[26]。等[27]发现TGF-β与PDGF和TNF-a间在肺纤维化发生中可能存在级联关系,协同促进纤维化进行性发展。TGF-β的抑制物核心蛋白聚糖通过核心蛋白与TGF-β结合,抑制TGF-β活性,可减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化程度[28]。另有研究[29]发现:Samd7可以拮抗TGF-β,Samd7的过度表达可以拮抗BL大鼠模型FB内TGF-β的信号转导,减轻肺纤维化。可见TGF-β表达于肺FB并在肺纤维化的发病机制中担任了重要角色。
3 结语
生长转化因子-15 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠60只,雄性,无特定病原体级(SPF),质量(203±23.4)g,湖南省斯莱克景达动物中心提供。
1.2 实验药物注射
用0.9%氯化钠注射液由哈药集团有限公司生产。分析纯四氯化碳(CCl4)由北京鼎国生物有限公司生产。10%CCl4(v/v)用0.9%氯化钠注射液与分析纯CCl4按比例混合。检测血清TGF-β含量的ELISA试剂盒由R&D公司生产,丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)RT逆转录试剂盒由上海科华公司生产,实时定量PCR试剂由Fermantas公司提供,引物由上海生工合成。
1.3 主要仪器
日本日立公司Hitachi 7600型全自动生化仪,倒置荧光显微镜(Olympus公司,日本);酶标仪(Bio-Rad,美国),实时定量PCR仪(ABI,美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型制备及分组
SD大鼠喂养1周后,随机分为3组,每组20只,分别为正常对照组、生理盐水对照组和肝纤维化组。实验开始后每周一、四正常对照组不给于任何处理正常进食进水喂养;生理盐水对照组腹腔注射生理盐水(用量按0.1 m L/10 g体重),肝纤维化组腹腔注射10%CCl4。(用量按0.1 m L/10 g体重)造模。每次腹腔注射前均测量大鼠体质量,根据体质量注射相应剂量的生理盐水和10%CCl4。造模6周后,随即取各组大鼠各1只解剖肝脏,HE染色观察肝脏的组织变化。
1.4.2 标本的收集与处理
各组实验分别在用药的第6周最后1次腹腔注射后4 h,登记编号,记录状态,称质量后给予4%水合氯醛腹腔注射麻醉,下腔静脉取血,分离血清备用。
1.4.3 生化指标的检测
利用全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)2项指标。
1.4.4 血清TGF-β的检测
采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定血清TGF-β的含量,严格按说明书操作。
1.4.5 实时定量检测肝纤维化相关基因
TRIzol提取动物肝脏组织提取总RNA,根据上海科华公司PCR逆转录试剂盒操作说明书获取c DNA,按照Fermants实时定量试剂盒说明书25μL反应体系,MaximaTMSYBR Green Master Mix:3μL,模板:c D-NA 2μL,上下游引物(10 pmol/L)各:0.5μL,去离子水:21μL,总体积:25μL。反应条件95℃5 min预变性;94℃45 s,60℃45 s,72℃30 s,共35个循环;最后72℃5 min延伸。
1.4.6 引物序列
PDGF-BB引物序列:Forward,5'-ATGACAAGACGGCACTGAAGG-3',Reverse,5'-C AGACGGACGAGGGAAACAA-3';CTGF引物序列:Forward,5'-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3';Re verse,5'-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3'。GAPDH引物序列:Forward,5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3';Reverse,5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。
1.5 统计学分析
统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包。同一指标的组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 大鼠肝纤维化模型鉴定
各组大鼠肝脏组织切片见图1。HE染色结果显示:对照组及生理盐水对照组正常肝组织肝小叶结构完整,细胞索排列规则有序,肝细胞无脂肪性变。肝纤维化模型组大鼠肝组织正常结构被破坏,肝索排列紊乱,胶原纤维大量增生,增生的胶原纤维连接形成粗大的纤维纵隔,沿肝窦伸向肝小叶连接,形成完全假小叶,肝细胞脂肪性变,变件肝细胞大于全部肝细胞比例的1/2。
A:实验组PDGF-BB、CTGF实时定量PCR曲线,从左至右曲线分别为PDGF-BB内参(Ct值19.8)、CTGF内参(Ct值20.5),PDGF-BB(Ct值23.1)、CTGF(Ct值25.5);B:生理盐水组PDGF-BB、CTGF实时定量PCR曲线,从左至右曲线分别为PDGF-BB内参(Ct值23.3)、CTGF内参(Ct值25.83),PDGF-BB(阴性)、CTGF(阴性);C:正常对照组PDGF-BB、CTGF实时定量PCR曲线,从左至右分别为PDGF-BB内参(Ct值20.5)、CTGF内参(Ct值20.6),PDGF-BB(阴性)、CTGF(阴性)
2.2 各组大鼠血清ALT及AS T水平,及TGF-β含量比较
由附表可见与正常对照组比较,生理盐水对照组血清ALT、AST及TGF-β的含量差异无显著性(P>0.05)肝纤维化模型组血清ALT、AST水平较正常对照组及生理盐水对照组明显升高(P<0.01),肝纤维化模型组的TGF-β的含量高于正常对照组及生理盐水对照组(P<0.05)。
注:1)与正常组比较,P>0.05;2)与正常组及生理盐水对照组比较,P<0.01;3)与正常组及生理盐水对照组比较,P<0.05
2.3 荧光实时定量肝纤维化相关基因血小板衍生生长因子BB、结缔组织生长因子表达检测
肝纤维化模型组与肝纤维化相关基因PDGF-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达增强(图2A),而生理盐水组(图2B)与正常对照组(图2C)无表达。
3 讨论
肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程,是各种慢性肝病发展成为肝硬化的必经病理过程。近年来国内外学者对其发病机制进行不断的探索,证实肝硬化不能完全逆转[1,2,3]。因此,早期阻断和逆转肝纤维化是防治肝硬化的关键。国内外近年的研究证实肝纤维化的病理学基础为细胞外基质(ECM)合成增加,降解减少,导致胶原过度沉积[4,5]。肝星状细胞(HSC)是肝脏ECM的主要来源,HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,受到多种细胞因子的调节,例如TGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、结缔组织生长因子(CTGF)、白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)等。
本研究主要是通过动物实验模型研究转化生长因子β在肝纤维化过程中的作用及其机制。TGF-β是一类具有调节细胞生长和细胞分化的一类因子,它广泛存在于动物正常组织细胞当中,具有促进胚胎发育,免疫调节,抑制生长,创伤修复,促进血管生成和促进ECM沉积等多种生物学功能,人类TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3种。在人体内,淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、角化细胞、颗粒层细胞、白血病细胞、神经胶质细胞瘤细胞以及软骨细胞等都能产生TGF-β。而启动肝纤维化的TGF-β则是由Kupffer细胞、造血干细胞以及肝窦周细胞等肝脏实质细胞产生的[6]。
本研究发现大鼠肝纤维化模型组的TGF-β水平较正常对照组明显增高。正常情况下体内细胞产生的TGF-β都是以无活性形式存在的,又称之为潜在的TGF-β。同时它与体内潜在的相关肽(LAP)以共价键的形式相结合,这种状态下的TGF-β是不能与受体结合发挥生物学作用。各种原因引起的肝脏疾病导致肝脏处于炎症状态,此时肝细胞破裂坏死以及过氧化损伤诱导TGF-β由潜伏状态向活性状态转变,从而导致血清中参与ELISA反应的活化的TGF-β含量增加,激活的TGF-β与受体结合,通过Smad信号通路作用于肝星状细胞(HSC)、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞。HGF-β在促进HSC活化、增殖,向肌成纤维细胞转化的同时,还刺激活化的HSC合成和分泌大量的ECM以及EMC蛋白水解酶抑制剂,抑制ECM的降解,增加EMC在组织中的沉积,它的作用结果就是肝脏中的EMC沉积不断增多,最终导致肝纤维化的形成[7,8,9]。TGF-β是最为重要是启动邻近静息态HSC激活和转化的初始信号之一。
本研究还显示实验性肝纤维化模型组血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB),结缔组织生长因子(CTGF)基因表达水平也较正常对照组明显增高。这与国内外的最新报道结果一致。近年国外有报道[10,11,12,13]TGF-β与血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、结缔组织生长因子(CTGF)存在相关性。其原因是因为CTGF基因的启动序列中包含有TGF-β的顺式作用元件[14]。因此,TGF-β高表达的同时也可介导CTGF表达上调,从而进一步促进EMC的沉积。THIERINGER等[15]研究发现PDGF通过上调TGF-β之后激活HSC,从而促进肝纤维化的发展。
另外,有研究显示,血清TGF-β的含量与肝纤维化的程度有关[16,17],临床上可以通过检测血清TGF-β的水平来了解肝纤维化的程度。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。因此,检测血清中TGF-β也可能是诊断早期肝硬化的一个良好指标[18]具有检查方便的优势,同时也减轻了病理检查带给患者的痛苦。
本研究证实在大鼠肝纤维化的发生、发展过程中TGF-β起着较为关键的作用,同时其关键作用与血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、结缔组织生长因子(CTGF)有关。
摘要：目的 观察转化生长因子β(TGF-β)对肝纤维化模型SD大鼠肝功能的影响。方法 将60只SD大鼠随机平均分为3组:正常对照组不做任何处理;生理盐水对照组腹腔注射生理盐水;肝纤维化模型组腹腔注射10%四氯化碳(CCl4)建立肝纤维化模型。造模6周后采集血清全自动生化仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量,酶联免疫吸附(ELISA)方法检测TGF-β的含量,实时荧光定量PCR法检测肝纤维化相关基因血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)和结缔组织生长因子(CTGF)表达情况。结果 生理盐水对照组ALT、AST和TGF-β含量与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05);肝纤维化模型大鼠血清ALT、AST较正常对照组及生理盐水对照组大鼠明显增高(P<0.01),TGF-β的含量明显增高(P<0.05),肝纤维化模型组肝纤维化相关基因PDGF-BB、CTGF表达明显,而生理盐水组与对照组均无表达。结论 血清中TGF-β与大鼠肝纤维化密切相关,在大鼠肝纤维化模型中明显增高,同时肝纤维化组织中PDGF-BB、CTGF表达也增高。
生长转化因子-15 篇7
1 临床资料
1.1 纳入标准
采用国际通用Mogensen诊断分期标准[2]。微量白蛋白尿期 (糖尿病肾病早期) :持续性微量白蛋白尿 (UAGR) 在20~200μg/min之间, 24小时尿微量白蛋白定量在30~300mg之间, 尿常规蛋白多为阴性;肾小球滤过率正常;临床蛋白尿期 (糖尿病肾病期) :尿常规蛋白持续阳性, 24小时尿蛋白定量>0.5g, UAGR>200μg/min, 肾小球滤过率逐渐下降。
1.2 排除标准
(1) 年龄在18岁以下或70岁以上者; (2) 妊娠或哺乳期妇女; (3) 对本研究用药过敏者; (4) 其他原因所致的尿蛋白增多者 (如原发性高血压、心力衰竭、泌尿系感染、免疫系统疾病等) ; (5) 肝功能异常者; (6) 近1个月内有糖尿病酮症酸中毒者。
1.3 一般资料
全部病例均为2009年6月~2012年6月济南市中医医院肾内科、内分泌科门诊及住院患者, 采用数字表随机法分为治疗组和对照组。治疗组60例, 其中男性37例, 女性23例;平均年龄 (52.31±12.77) 岁;病程5~13年, 平均 (8.27±1.20) 年。对照组30例, 其中男性18例, 女性12例;平均年龄 (53.79±12.38) 岁;糖尿病病程4~13.5年, 平均 (8.65±1.33) 年。两组年龄、性别、病程等基线资料差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
2 方法
2.1 治疗用药
两组均给予西医常规治疗, 包括糖尿病教育、饮食控制、适量运动、胰岛素或口服降糖药控制血糖等, 采用非ACEI或者ARB类降压药控制血压。治疗组在此基础上口服四黄片 (由黄芪、黄芩、黄精、制大黄、川芎、生地等组成, 由济南市中医医院生产, 0.25g/片) , 每次4片, 每日3次;对照组应用苯那普利 (北京诺华制药有限公司) , 每次10mg口服, 每日1次。全部病例4周为1个疗程, 连续治疗两个疗程。
2.2 观察指标测定
测定空腹血糖, 血、尿TGF-β:采用ELISA方法, 试剂盒由上海科化生物技术有限公司提供。24小时尿蛋白定量、尿ALB:采用双缩脲法。胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、纤维蛋白原、肾功能等指标:采用71705全自动生化分析仪测定。于治疗前后各测量1次, 并作安全指标分析。
2.3 统计学方法
采用SAS9.0统计软件进行统计学分析, 计量资料采用t检验, 数据以 (±s) 表示;计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法, 以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1疗效标准
参照《中药新药临床研究指导原则》中有关标准判定疗效[3]。临床控制:临床症状、体征消失, 24小时尿蛋白定量、UAGR正常;显效:临床症状、体征消失, 24小时尿蛋白定量、UAGR较治疗前减少大于50%;有效:治疗后症状、体征好转, 24小时尿蛋白定量、UAGR较治疗前减少10%~50%;无效:治疗后症状、体征无好转, 24小时尿蛋白定量、UAGR较治疗前未减少或反而上升。
3.2 两组总疗效比较见表1。
χ2检验;△P﹤0.05
3.3 两组患者治疗前后血糖、肾功能及TGF-β1的变化
结果见表2。
与本组疗前比较*P<0.05;与对照组疗后比较△P<0.05
3.4 两组患者治疗前后血脂、纤维蛋白原的变化
结果见表3。
与本组治疗前比较*P<0.05;与对照组疗后比较△P<0.05
4 讨论
TGF-β1是具有独特致纤维化作用的细胞因子, 通过受体信号传递发挥生物学作用, 大多数组织细胞均能合成、分泌TGF-β1, 以肾脏表达最为丰富。Gilbert等[4]在实验中观察到2型糖尿病患者血、尿TGF-β1水平显著高于正常对照组, 提示随着肾脏TGF-β1产生的增加, 肾小球滤过膜屏障进一步加重, 尿白蛋白排出相应增加。血TGF-β1增加的主要原因是高血糖导致渗透压升高, 使潜体TGF-β1转化成活性TGF-β1, 另外高血糖激活肾素血管紧张素系统, 血管紧张素刺激TGF-β1及蛋白的表达。尿TGF-β1排出增加, 主要由于肾脏局部TGF-β1生成过量, 表明在糖尿病早期即有TGF-β1高水平表达, 且在糖尿病肾病病程中持续高水平表达, 糖尿病状态下TGF-β水平明显增高[5], 提示TGF-β作为始动因子在糖尿病肾病的发生发展中可能起着重要作用。
近年来, 广大研究者发现中药可通过抑制成纤维细胞增殖和促使其凋亡等发挥对肾纤维化的防治作用, 从而延缓肾脏疾病的进展, 为中医药在防治肾纤维化方面开辟了广阔的前景。四黄片由黄芪、黄精、大黄、黄芩、川芎等组成。张兰[6]研究表明, 含有黄芪、大黄的中药复方制剂具有抑制糖尿病大鼠肾皮质Ⅳ型胶原、TGF-β1mRNA表达的作用, 这可能是其延缓肾脏损害、保护肾功能的主要作用机制。杨红霞等[7]认为黄芪注射液对2型DM大鼠肾组织有保护作用, 同时发现黄芪除可减少TGF-β1的表达外, 使TGF-β1诱导的内源性Smad7产生减少, 从而发挥抗纤维化作用。临床研究[8]表明, 大黄酸能通过影响葡萄糖转运蛋白-1的表达及其对葡萄糖的亲和力, 而明显抑制转化生长因子-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增高, 进而减少细胞外基质合成, 减少尿蛋白、糖化血红蛋白。王少清等[9]对30例早期DN患者在基础治疗上加用川芎素治疗组血、尿β2-MG水平显著低于对照组, 表明川芎素能有效减少尿蛋白, 降低肾小球损害, 延缓肾功能不全的发展。
本研究证实:四黄片治疗组可以降低糖尿病肾病患者的空腹血糖、减少尿蛋白, 表明四黄片对糖尿病肾病有肯定疗效。本组临床肾病患者治疗前血、尿TGF-β均增高, 应用四黄片治疗后, 血、尿TGF-β均下降 (P﹤0.05) , 与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 表明四黄片能够改善肾纤维化、延缓肾功能不全的发展。
参考文献
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[2]Mogensen CE.Management of early nephropathy in diabetic patients.Annurev Med, 1995, (46) :79.
[3]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则 (试行) .北京:中国医药科技出版社, 2002:234.
[4]Gilbert RE, Alisoncox, Leonard L, et al.Expression of transforming growth factorβ1and type IV collagen in the renal tubulointestitium in experimental diabetes:Effect of ACE inhibition.Diabetes, 1998, 47:414.
[5]Hills CE, Willars GB, Brunskill NJ.Proinsulin C-peptide antagonizes the profibrotic effects of TGF-betal via up-regulation of retinoic acid and HGF-related aignaling signaling pathways.Mol Endocrinol, 2010, 24:822.
[6]张兰.中药复方对糖尿病大鼠肾皮质转化生长因子β1、Ⅳ型胶原mRNA表达的影响.中国中医药信息杂志, 2005, 12 (12) :29.
[7]杨红霞, 朱敏怡.黄芪对糖尿病大鼠肾组织的保护作用.实用医学杂志, 2005, 21 (17) :1964.
[8]赵洪军, 韩学忠, 徐梅, 等.大黄治疗糖尿病肾病32例.中国中西医结合杂志, 1996, 16 (7) :429.