脑源性神经生长因子

脑源性神经生长因子（共7篇）

脑源性神经生长因子 篇1

深入探讨创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)迟发性神经元损伤发生机制,研究如何控制其发病过程,寻找新的更有效的治疗方法一直为人们所研究。乙酰胆碱(ACh)是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一,其主要功能是维持意识的清醒,在学习记忆中起重要作用。脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一种主要分布于中枢神经系统中的神经营养因子,被认为是抗凋亡剂、抗氧化剂和钙通道阻滞剂,对神经细胞的生长发育及保护修复有重要作用。本实验通过观察不同程度TBI及TBI不同时间不同部位脑组织中ACh、BDNF含量的变化,探讨它们在脑损伤后随着时间的发展呈现的表达变化规律,以及二者与不同程度脑损伤的关系。

1 材料与方法

1.1 实验主要器材

自由落体打击装置,脑立体定位仪,Strong204台式牙钻(Saeshin)。

1.2 实验对象及分组

健康雄性SD大鼠192只(山西医科大学实验动物中心购得),体重250～300 g,随机分成两组:对照组48只,TBI组144只,TBI组再分为轻度组、中度组、重度组(每组48只)。轻、中、重度组分别再随机分为伤后15 min、0.5、1、3、6、12、24和48 h组,各6只。

1.3 模型制作

参照FEENEY′S法建立脑损伤模型,用10%水合氯醛以0.35 mL/kg腹腔内注射进行麻醉,俯卧位。先将大鼠顶枕部鼠毛剪去,常规消毒后于顶部中线切开头皮,剥离骨膜,暴露右顶骨,在人字缝前方2 mm,颅骨中线旁2 mm,钻直径为5 mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好无损,采用自制自由落体打击装置,将撞杆置于硬膜上,用20 g砝码分别于10、30 cm高处沿外周导管坠落,撞击撞杆从而间接撞击硬膜,致右顶叶轻、中度脑挫裂伤;另用40 g砝码于25 cm高处坠落致重型损伤。打击后切口内滴注4万U硫酸庆大霉素4～5滴,记录打击时间,骨蜡封闭颅骨破损区,缝合头皮。对照组仅开颅窗,不施加打击。实验中未达观察时间而死亡的大鼠,给予相应补充。

1.4 组织处理及测定

在设定的时间内处死大鼠,将大鼠过量麻醉后,断头取脑,迅速剥离脑组织,立即在冰盘上分离海马和皮层,称湿重后,按1∶20(W/V)加入0.01 mol/L、pH 7.0的PBS,用高速均质机在冰水浴中匀浆,4℃4 500 r/min离心10 min,仔细收集上清液,分装后保存在-80℃超低温冰箱中待测。取出脑组织浸入10%中性甲醛溶液固定24 h,按打击处将大脑矢状切面作常规石蜡包埋作HE染色。用上海源叶生物科技有限公司酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定脑组织ACh及BDNF含量,严格按照说明书操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件处理,对各组数据先行Shapiro-Wilk法和Levene法分别进行正态性检验和方差齐性检验,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析、两因素方差分析及重复测量资料的方差分析,相关性采用Spearman秩相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE结果

对照组:大脑皮质神经元呈三角形或锥体形,胞核圆形或椭圆形,蓝染,胞质呈粉红色。锥体形神经元细胞可见突起。神经胶质细胞核深染,胞浆少。脑内小血管内皮细胞完整。轻度损伤组:局灶性蛛网膜下腔出血,大脑皮质浅层挫伤出血,挫伤灶周围神经元可见,核仁不清,神经元胞体嗜伊红染色增强。神经元、神经胶质细胞周围间隙增宽。中度损伤组:顶叶蛛网膜下腔出血,大脑皮质挫伤出血,挫伤灶周围神经元变性、坏死范围增大。重度损伤组:顶叶蛛网膜下腔出血,有的可见硬膜下血肿形成。挫伤灶可见于大脑皮质,还可见于白质深部的海马、胼胝体等结构。挫伤灶周围神经元变性、坏死范围进一步增大。

2.2 酶联免疫吸附ELISA法

2.2.1 关联性分析结果

TBI中ACh与BDNF海马含量变化呈明显正相关(r=0.340,P<0.01),ACh与BDNF皮质含量变化也呈明显正相关(r=0.311,P<0.01),ACh变化规律是损伤后立即升高,随之迅速下降,降至正常水平以下;BDNF变化规律是损伤后缓慢升高,随之缓慢下降。

2.2.2 方差分析结果

2.2.2. 1 不同程度TBI不同时间点大鼠皮质、海马ACH含量相同时间点不同程度TBI组及对照组之间ACH皮质含量不同,差异有高度统计学意义(F=47.11,P<0.01),重度组ACH皮质含量高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.008 3)。相同时间点不同程度TBI组及对照组之间ACH海马含量不同,差异有高度统计学意义(F=63.71,P<0.01);重度组ACH海马含量与对照组、轻度组比较差异有统计学意义(P<0.008 3)。TBI中相同程度不同时间点之间ACH脑组织含量不同,差异有高度统计学意义(皮质F=86.32,P<0.01;海马F=81.91,P<0.01)。TBI中损伤程度和时间对于ACH脑组织含量有交互作用(皮质F=10.87,P<0.01;海马F=12.53,P<0.01)。各损伤组ACH皮质、海马含量均于15 min达高峰,之后明显降低,低于正常水平,0.5～1.0 h下降幅度最大。各TBI组ACH含量在48 h时均低于对照组,差异均有高度统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2.2. 2 不同程度TBI不同时间点大鼠皮质、海马BDNF含量相同时间点不同程度TBI组及对照组之间BDNF皮质含量不同,差异有高度统计学意义(F=216.19,P<0.01),轻度、中度、重度各组BDNF皮质含量均明显高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.008 3),中度组、重度组BDNF皮质含量高于轻度组,差异有高度统计学意义(P<0.008 3)。相同时间点不同程度TBI组及对照组之间BDNF海马含量不同,差异有高度统计学意义(F=60.50,P<0.01),中度、重度各组BDNF皮质含量均明显高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.008 3)。TBI中相同程度不同时间点之间BDNF脑组织含量不同,差异有高度统计学意义(皮质F=37.17,P<0.01;海马F=15.39,P<0.01)。TBI中损伤程度和时间对于BDNF脑组织含量有交互作用(皮质F=4.95,P<0.01;海马F=2.52,P<0.01)。各TBI组BDNF脑组织含量均于1 h时明显增加,3 h时达高峰,6 h后开始下降,24 h时高于对照组。各TBI组在3 h时达高峰时与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

3 讨论

ACh是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一,广泛分布于乙酰胆碱能神经末梢,尤其是脑干、丘脑-基底节区和隔-海马-杏仁核等结构,与运动、学习和记忆等有密切关系。脑损伤后脑组织中的ACh在短时间内迅速升高。人体脑脊液中也可检测到ACh的浓度升高。用微量注射法将拟胆碱药物卡巴胆碱导入动物脑桥,激活脑桥的胆碱能系统,可以导致类似脑震荡后的可逆性意识障碍[1]。TBI急性期ACh过度释放并与毒蕈样胆碱能受体结合同脑损伤后意识障碍和神经功能障碍有关;在神经兴奋性细胞毒性病理过程中起重要作用,引起神经元癫痫样放电和突触后神经元坏死[2]。虽然增加脑组织乙酰胆碱水平会立即发生TBI症状,但在受伤后一段时间,这个水平会下降到正常脑组织水平以下,这一下降可能与认知功能障碍有关。颅脑损伤,尤其是海马损伤,导致短期记忆丧失和认知功能障碍威胁到中度或轻度颅脑损伤患者恢复正常的生活[3,4]。

注:与对照组相同位置比较,*P<0.05.**P<0.01;相同时间点与轻度组比较,◆P<0.05,◆◆P<0.01;相同时间点与重度组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01

注:与对照组相同位置比较,*P<0.05.**P<0.01;相同时间点与轻度组比较,◆P<0.05,◆◆P<0.01

BDNF是神经营养因子家族的一个成员,主要分布在海马和皮质,也存在于纹状体、基底前脑、丘脑、脑干和小脑[5],在神经元损伤后再生修复和防止神经细胞退行性变等多方面发挥重要作用。BDNF可使培养的海马神经元内的钙结合蛋白Calbindin mRNA及Calbindin的含量增加,使细胞内超量的Ca2+排出,维持细胞内钙稳定,从而保护神经元抵御损伤[6]。脑损伤后BDNF可通过调节caspase 3的活性来对抗神经元凋亡起到治疗作用,如果损伤导致caspase 3丧失活性,则BDNF的治疗无作用[7]。BDNF对缺氧神经元有确切的保护作用[8],削弱因缺氧所启动的脑损伤[9]。研究表明BDNF可通过作用于内源性神经祖细胞来增强神经的再生功能[10]。

TBI除包含原发的脑组织损伤外,还有脑水肿、神经元变性坏死、神经元凋亡等继发性脑损伤,后者的发生机制十分复杂。本实验显示TBI后ACh表达在不同部位变化趋势一致。大鼠脑创伤后ACh脑组织含量短时间内迅速升高,可能是机械暴力兴奋脑内乙酰胆碱能神经元,使ACh大量释放,致脑组织中的ACh在短时间内迅速升高。但一过性增高之后,ACh水平急剧降低,48 h时仍低于正常,则可能是乙酰胆碱神经元遭受损伤时造成乙酰胆碱快速释放,至迅速耗竭,造成突触间隙的乙酰胆碱浓度水平下降,与TBI患者认知功能障碍出现的时间相符。本实验显示TBI后BDNF的表达在不同部位变化趋势一致。正常大鼠脑内即有BDNF的广泛分布,提示了BDNF对脑神经元的营养作用。脑损伤后1h BDNF表达急剧上升,至3 h时达高峰,可见脑损伤后刺激BDNF表达,对神经元的早期损伤的修复有明显作用。

BDNF对中枢胆碱能神经元有刺激生长作用。研究发现,给予外源性的BDNF有增加大鼠基底前脑胆碱神经元的功能,可增加大鼠海马突触体释放ACh[11]。Knipper等[12]在研究中认为BDNF mRNA受大鼠海马毒蕈碱受体的激活上调。相反,BDNF增强大鼠海马突触包含隔胆碱能神经元神经末梢释放ACh,提示BDNF可以改善TBI认知功能障碍。本实验发现ACh与BDNF在TBI中的脑组织含量变化呈正相关,且均与损伤程度有关,通过ACh与BDNF脑组织含量可以间接反映TBI病变及损伤程度,有可能为临床脑损伤的治疗、损伤程度及预后的判断提供新的方法。

脑源性神经生长因子 篇2

关键词：脑源性神经营养因子,阿尔茨海默,临床作用

阿尔茨海默病俗称老年性痴呆, 属神经系统退行性疾病, 具有隐匿性、进展性等特点, 临床主要表现为全面性痴呆, 如记忆障碍、失语失认等[1]。该病症多见于老年群体, 目前临床对病因尚无明确定论, 考虑可能与生物、社会、心理等众多因素有关。脑源性神经营养因子是一种在神经系统内广泛表达的蛋白质, 具有营养神经的功效, 笔者所在医院近年来以此缓解阿尔茨海默病取得良好疗效, 为进一步探究其临床效果, 本文以笔者所在医院收治的80例阿尔茨海默病患者为例进行分析和研究, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机从2013年12月-2015年1月笔者所在医院收治的阿尔茨海默病患者中抽取80例进行分析和研究, 所有患者经临床诊断均符合《美国神经障碍诊断统计手册》中关于阿尔茨海默病的相关诊断标准。抽取病例时, 排除严重脏器疾病者、疾病所致痴呆者及无法配合治疗者, 抽取后将入选病例随机均分成两组。试验组40例:男22例, 女18例;年龄64~86岁, 平均 (73.2±4.1) 岁;病程1~6年, 平均 (2.6±0.7) 年。对照组40例:男21例, 女19例;年龄63~88岁, 平均 (73.6±4.3) 岁;病程1~7年, 平均 (2.8±0.6) 年。两组患者基本临床资料差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

治疗前, 以成人WMS (韦氏记忆量表) 、MMSE (简易智能精神状态量表) 对患者的记忆力、智力进行判定, 以ADL (日常生活能力量表) 对患者的自理情况进行评估。

对照组:积极对本组患者的基础疾病进行维持治疗, 如降糖、降压等, 在此基础上每日睡前给予患者药物盐酸多奈哌齐 (安理申, 卫材药业) , 初始用药剂量5 mg/d, 维持用药1个月后, 评估患者临床反应及盐酸多奈哌齐稳态血药浓度, 在此基础上适当调整患者用药剂量, 维持服用, 每日用药量最多不超过10 mg;试验组:本组患者在对照组治疗基础上加用脑源性神经营养因子, 每日夜间肌注, 一次用量30μg。

治疗6个月及1年后, 再以成人WMS、MMSE、ADL对患者的记忆力、智力及日常自理能力进行评估。

1.3 疗效判定标准

(1) 成人WMS评分:记忆商共分7等级, 等级越高, 记忆水平越好。其中130分以上很优秀, 120~129分优秀, 110~119分中上, 90~109分中等, 80~89分中下, 70~79分差, 69分以下很差。 (2) MMSE评分:最高分为30分, 患者得分越低, 痴呆程度越严重, 其中27~30分为正常, 0~9分为重度痴呆。 (3) ADL评分:优, 95~100分, 患者生活自理;良, 70~94分, 患者轻度自理功能障碍;中, 40~69分, 患者中度自理功能障碍;差, 39分及以下, 患者重度自理功能障碍[2,3]。

1.4 统计学处理

以SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析, 计量资料以 (±s) 表示, 结果采用t检验, 计数资料采用字2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后WMS评分比较

与治疗前比较, 两组患者的成人WMS评分均有所增加, 且试验组分数改善更为明显, 治疗6个月及1年后得分均优于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 两组患者治疗前后MMSE评分比较

治疗前, 两组患者MMSE评分比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 治疗后, 试验组患者MMSE评分逐渐上升, 对照组MMSE评分存在波动但与治疗前比较无明显变化, 治疗6个月及1年后两组MMSE评分比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

2.3 两组患者治疗1年后ADL评分比较

治疗1年后, 试验组患者ADL评分14例良, 17例中, 良中率明显高于对照组, 比较差异有统计学意义 (P=0.022) , 见表3。

3 讨论

3.1 阿尔茨海默病概述

阿尔茨海默病 (老年性痴呆) 是一种以记忆障碍、失语失认、人格行为改变为主要临床表现的神经系统退行性疾病, 发病群体多集中在70岁以上的老年人, 典型病理改变为神经元纤维缠结、神经元缺失、神经细胞间大量老年斑等。目前, 临床尚未明确阿尔茨海默病的发病原因, 发病机制假说众多, 近年来借助基因定位研究、流行病学研究发现阿尔茨海默患者脑内淀粉样蛋白病理基因位于第21对染色体上, 由此家族史遗传是该病危险因素成为比较肯定的观点[4,5,6]。

3.2 脑源性神经营养因子及其受体

脑源性神经营养因子 (BDNF) 由德国神经生物学家于1982年首次发现, 它作为一种碱性蛋白质经临床研究发现能防止神经元死亡。该物质多分布在大脑海马和皮质之中, 与受体一同在神经系统中广泛表达。BDNF受体包括Trk B和p75, 前者亲和力高, 而后者亲和力相对偏低, BNDF与Trk B受体特异性结合后, 可通过激活信号传导通路活化AKT, 从而在细胞存活和凋亡中发挥重要作用[7]。

3.3 BDNF与阿尔茨海默病的关系

(1) BDNF能有效保护阿尔茨海默病患者的神经元。临床研究证实, 阿尔茨海默患者神经元内的BDNF m RNA与常人相比表达显著降低, 且阿尔茨海默病患者的SP内有BDNF免疫活性物质, 这些研究表明BDNF能有效作用于神经元的生长、分化、修复和再生之中, 参与神经元代偿机制, BDNF异常可能引起神经元营养不足, 故给予患者BDNF能有效保护阿尔茨海默病患者的神经元。 (2) BDNF能帮助调节学习记忆。人的学习记忆能力与中枢胆碱能神经系统存在密切关联, BDNF经临床研究发现能够保护胆碱能神经元, 促进其生长、分化, 并减轻其退化, 即其在胆碱神经元运作周期中能够发挥正向性效应, 从而帮助阿尔茨海默人群改善学习记忆神经环路, 帮助调节患者认知能力。 (3) BDNF能营养神经元, 降低其损伤, 改善认知加重症状, 适用于阿尔茨海默病中早期治疗。大脑中BDNF表达变化同ACh E间关系密切, 其表达下调时, 则可能会导致胆碱能系统逆行性运输减少, 从而加速神经元变性与凋亡。将BDNF与神经生长因子联合使用可阻止上述退行性变化情况的发生, 从而降低神经元损伤, 缓解认知障碍。

3.4 BDNF联合用药缓解阿尔滋海默的临床分析

本次临床研究中, 给予患者药物盐酸多奈哌齐 (安理申) 的同时联合用药BDNF。治疗结果显示, 试验组治疗6个月及1年后, WMS评分分别为 (70.4±9.3) 分和 (76.2±5.7) 分, MMSE评分分别为 (18.6±5.1) 分和 (22.9±4.7) 分, 与治疗前比较, 分数改善情况均优于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;治疗1年后, 试验组患者14例ADL评分为良, 17例ADL评分为中, 良中率 (77.5%) 明显高于对照组 (57.5%) , 差异有统计学意义 (P<0.05) , 表明给予阿尔茨海默患者脑源性神经营养因子可有效缓解患者临床病症, 在一定程度上改善患者的记忆能力和自理能力, 值得临床推广使用。

参考文献

[1]郁俊昌, 唐牟尼, 韩海英, 等.阿尔茨海默病、血管性痴呆及轻度认知障碍患者血浆脑源性神经营养因子浓度变化[J].实用医学杂志, 2013, 29 (9) :1429-1431.

[2]李剑.阿尔茨海默病患者血清脑源性神经营养因子水平的研究[D].南宁:广西医科大学, 2011.

[3]张敏.阿尔茨海默病与脑源性神经营养因子的关系[J].海南医学, 2010, 21 (2) :15-17.

[4]丁兆生, 张晓斌.脑源性神经营养因子 (BDNF) -阿尔茨海默氏病治疗的新靶标[J].国际精神病学杂志, 2010, 37 (4) :215-218.

[5]李荷君, 韩柏.脑源性神经营养因子在阿尔茨海默病中的作用[J].中华临床医师杂志 (电子版) , 2014, 8 (21) :3888-3891.

[6]龚其海, 李菲, 黄彬, 等.脑源性神经营养因子:治疗阿尔采末病的新策略[J].中国新药与临床杂志, 2011, 30 (4) :245-250.

脑源性神经生长因子 篇3

关键词：脑源性神经营养因子,抑郁症,信号通路

抑郁症是一种长期慢性疾病,是精神科常见的疾病之一。据统计,每100个人中就有2~3人患抑郁症。抑郁症不仅给患者带来巨大的痛苦,而且由于其病程长、易复发、自杀风险高,给患者家庭和社会也带来了巨大的负担,因此越来越受到全社会的普遍关注。抑郁症的发病机制至今未明,一般认为其发生和发展与生物、心理、社会环境等多种因素有关。近年来国内外很多研究发现,抑郁症的发生与治疗与海马结构和功能上的变化密切相关。进一步研究表明,海马区的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在抑郁症的发生发展及介导抗抑郁药物作用的过程中发挥了重要作用,因此研究BDNF为解释抑郁症发病机制提供了新的视角。

1 BDNF与抑郁症

临床研究发现,抑郁症患者的海马区及前额叶皮层BDNF水平明显下降[1]。精神抑郁发生时,BDNF的含量和功能都会降低,某些研究结果甚至提出可以通过检查血液中BDNF基因的甲基化程度判断抑郁症[2]。如果使用抗抑郁药或电针治疗,则可以提升血清BDNF水平[3]。大量的动物实验也同样证明BDNF的含量与抑郁症存在着相关性。在慢性温和应激抑郁模型中,大鼠海马区BDNF m RNA的表达明显减少,给予抗抑郁药物治疗,能够增加海马区BDNF的m RNA表达水平。在其他类型的抑郁动物模型[4]中也发现了相似的趋势。由此可见,BDNF的表达水平与抑郁症的发生发展紧密相关,但要深入理解BDNF在抑郁症的作用,还须进一步理清影响BDNF表达的调节因子,即在神经系统中BDNF的上下游信号通路。

2 与BDNF相关的信号通路

2.1 以BDNF为靶点的上游通路

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)信号转导通路是研究抑郁症最早且最深入的通路,在情绪调节中起到重要作用。c AMP信号转导通路的级联反应过程为:腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)活化→生成c AMP→蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)激活→环磷腺苷反应元件结合蛋白(cyclicadenosinemonophosphate response element binding protein,CREB)磷酸化→BDNF表达,由此调节促细胞生长、增殖、存活和神经可塑性。

2.2 BDNF调节的下游靶点

Trk B是BDNF的特异性受体,在BDNF信号传递系统中,Trk B酪氨酸磷酸化是整个程序的启动程序。识别结合BDNF→受体分子二聚化,亚基间相互催化酪氨酸残基磷酸化→转录因子磷酸化→进入细胞核→启动细胞内信号传导途径,从而起到保护神经元、促进再生的作用。目前的研究表明,BDNF的下游信号通路主要有2条,分别为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路和磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/信号通路。其中MAPK通路尤为重要。该途径在调节突触的可塑性、长时程增强效应、以及修复和维持受损神经元的存活等方面都起到积极作用。胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK 1/2)是家族中的一员,ERK1/2可以被生长因子、神经营养因子多种细胞外信号激活,调节细胞生长、发育和分裂。近年的研究发现,除了遗传、心理和社会因素外,炎症反应也可能是抑郁症的诱因之一。因此与炎性反应相关的信号通路也进入了人们的视野。例如P38-MAPK通路及C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)通路,它们在一系列应激或创伤应答反应中促细胞凋亡及诱导炎性反应[5]。

由上可知,这些与BDNF有关的通路调节着细胞生长、发育、分裂、凋亡,也与行为反应和认知方面,如学习、记忆密切相关,加上临床发现抑郁症患者常常伴有海马神经元的萎缩、 凋亡以及BDNF的变化,表明抑郁症的发生可能与BDNF的信号传导通路有关。

3 BDNF信号通路在抑郁症中的作用

3.1 c AMP/PKA-CREB-BDNF通路

Shelton等[6]临床研究表明自杀死亡的抑郁症患者前额叶皮层中c AMP和PKA活性均降低,被c AMP或PKA激活的神经保护和突触可塑性分子Rap-1 表达也下降。 动物模型研究也表明,大鼠逃避失败的行为与海马和皮层中的c AMP和PKA活性降低呈显著相关。 如能激活AC-c AMP/PKA通路,动物的行为学表现也随之改善[7]。 使用抗抑郁药治疗抑郁症能使受体后细胞中c AMP通路上调,长期使用抗抑郁药治疗AC有所增加,进而激活PKA活性。 以上研究结果显示抑郁症患者中c AMP信号通路功能下调,而对其进行抗抑郁治疗后能够上调c AMP通路的功能。

研究发现,抑郁症患者大脑颞叶[8]和额叶皮质CREB表达下降[9],使用抗抑郁药能够逆转这一过程[8]。抑郁症下调c AMP-CREB系统功能,减少CREB及磷酸化CREB(p CREB)表达,从而减少BDNF及其受体Trk B的表达[10]。如果逆转p CREB的表达,抑郁症状也会显著缓解,因此Koch等[11]提出p CREB可能是抗抑郁症治疗显效的分子标志物。

总之, 抑郁症患者的CREB蛋白表达和功能下降,增加CREB表达水平有抗抑郁作用。 c AMP/PKACREB-BDNF通路与抑郁症的发生存在着密切的连锁关系。

3.2 BDNF-Trk B-MAPK通路

临床文献报道,抑郁症自杀患者前额叶皮层和海马中ERK1/2 的活性显著降低[12]。 动物实验结果也表明MAPK通路可能参与了抑郁症的发生。 在O'Leary等[13]的试验中,氟西汀能明显增加实验大鼠海马突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)水平,而如果大鼠Trk B受体表达受损,氟西汀的干预则无效。这说明抗抑郁药物可能是通过BDNF及其受体Trk B来发挥作用的。 在Trk B的下游靶点中,ERK通路与抑郁行为有很大关系。 慢性强迫游泳应激抑郁模型中,大鼠的ERK1/2 表达增加[14,15]。 与正常对照小鼠相比,抑郁模型小鼠额叶和海马区的磷酸化胞外信号调节激酶1/2(Phospho-ERK1/2,p ERK1/2)和ERK-2 明显减少[16]。 如果阻断MAPK途径,例如使用丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitoge-activated protein kinas kinase, MEK)的抑制剂PD184161,会导致小鼠产生抑郁样行为,即使使用抗抑郁药物如去甲丙咪嗪和舍曲林也无法改善[17]。在MAPK家族中,除了MEK-ERK1/这条途径外,P38-MAPK也被证明受到BDNF表达的调节。 例如使用去N-3 多不饱和脂肪酸饮食饲喂小鼠[18],结果发现小鼠额叶皮质的不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA) 的含量与BDNF的表达和P38 -MAPK的活性成正相关,即DHA下降,BDNF含量和P38-MAPK活性也下降; 补充DHA,BDNF蛋白的表达也随之增加。 使用P38-MAPK的抑制剂进一步证实了此通路的调节作用:使用通路阻断剂后,补充饮食DHA对上调BDNF表达失效,说明剥夺了DHA是通过降低P38-MAPK的活性来引起BDNF减少的。

3.3 BDNF-Trk B-PI3K-Akt通路

P13K/Akt是重要的细胞存活通路,P13K激活Akt后,介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长,能经多种途径促进细胞存活。Akt是P13K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶,激活后可使信号进一步转导,参与生长、发育、分化和细胞的存活[19]。周璇和等[20]采用了通路抑制剂预处理,发现文拉法辛增加的Akt和Fox03a的磷酸化水平能够被P13K和Akt特异性通路抑制剂所阻断,进一步确认了抗抑郁药文拉法辛的抗抑郁作用可能是部分通过P13K/Akt/Fox03a通路调控Akt以及Fox03a的磷酸化水平发挥神经保护作用从而产生抗抑郁效果。Luo等[26]发现使用Trk B抑制剂能消除大花八角醇对抑郁症状的改善,减弱BDNF和p Akt的含量,逆转海马区Bcl-2、caspase-3的表达,推测BDNF-Trk B及其下游PI3K/Akt-Bcl-2/caspase-3是抑郁症的重要通路。

3.4 新的潜在通路

最近有研究发现[21], 在下丘脑神经元细胞中, 除了已经被证明的c AMP-CREB途径外,黑皮质激素可能通过Src或PI3K调节ERK, 促进立早基因c-Fo表达,进而增加BDNF的表达水平。

3.5 单胺递质途径与经典通路CREB-BDNF的进一步连接

现在对于外界信号如何调节CREB-BDNF这一经典通路又有了一些新的进展,补充了部分上游环节的潜在靶点,使通路图进一步完整。 一直以来人们都认为抑郁症与大脑神经递质如5-HT异常有关[22],可能通过5-HT1A受体调节CREB-BDNF。 但具体机制并不清晰。 新的研究发现所有的单胺类抗抑郁药物都能下调细胞死亡因子Sirt2 的表达, 进而增强神经可塑性标志物CREB-BDNF[23]。 另有研究显示,K+通道家族的TREK-1(TWIK-related K+channel 1) 在情绪调节方面起作用。 TREK-1 阻断剂能显著上调PKAp CREB-BDNF信号通路, 并且与5-HT1A受体存在协同效应[24]。

3.6 新型抗抑郁剂与经典通路BDNF-Trk B进一步连接

H2S被认为是一种新的抗抑郁物,但其机制一直未明。 新的研究发现H2S能够阻断皮质酮对神经细胞的毒性, 消除活性氧ROS的聚集, 阻断BDNF-Trk B通路,从而起到抗抑郁作用[25]。

4 小结与展望

脑源性神经生长因子 篇4

1 资料与方法

1.1 材料及试剂

DMEM/F12基础培养基、B27无血清添加剂为Gibco公司产品;表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维生长因子 (b FGF) , BDNF为Pepro Tech公司产品;Brd U及其小鼠抗体购自Sigma公司;羊抗小鼠Ig G-FITC购自Zymed公司;兔抗大鼠神经丝 (NF) 多克隆抗体, 兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 多克隆抗体, 羊抗兔Ig G-CY3均购自Chemicon公司。新生SD大鼠 (<24 h) 4只和SD雄性大鼠 (体重250~300 g) 16只均购于中山大学医学院动物实验中心。

1.2 试验方法

1.2.1 海马NSCs的培养

无菌条件下分离出新24h内的SD大鼠海马组织, 仔细剔除血管, 机械剪碎, 加入D-Hank’s液反复吹打, 经200目滤网过滤后制成单细胞悬液, 计数后以5×104/m L的密度接种于含10 m L DMEM/F12的25 m L培养瓶中, 再加入终浓度为2%B27, 10 ng/m L b FGF, 10 ng/m L EGF, 放置在37℃, 5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内培养。每天镜下观察, 待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液, 按上述条件继续培养细胞。以后每5~7 d分离克隆传代一次, 方法同前。经过几次传代, NSCs即可得到纯化。

1.2.2 AD模型的建立及分组

采用经典的穹隆-海马伞切断来建立AD模型[6], 具体方法如下:SD大鼠用1%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 经腹腔注射麻醉后, 采用平头颅位固定于大鼠脑立体定位仪上。参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱, 以前囟为零点, 确定左侧海马伞的切割范围为: (1) 前囟后1.4 mm、正中线左旁开1 mm; (2) 前囟后1.4 mm、正中线左旁开3mm两点之间。手术过程分三步:第一步, 刀尖按前囟后1.4 mm、正中线左旁开3 mm插入, 深5.4 mm (以脑膜为准) , 往上抽动刀片, 再回到原处, 幅度为3 mm, 如此抽动10次;第二步, 把刀尖上升1 mm, 内进2 mm, 同样往上抽动刀片, 再回到原处, 幅度为3 mm, 如此抽动10次;第三步, 刀片按进刀轨迹退回至第一步入刀处, 再往上抽出刀片。

将建立好AD模型的SD大鼠16只随机分成对照组和BDNF组两组, 每组8只, 即刻行NSCs移植。

1.2.3 NSCs移植

移植前向培养瓶中加入Brd U (6ng/m L) , 培养48 h。移植时用25μL微量注射器吸取细胞悬液5μL (1×104个/μL) , 同样参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱, 按左侧基底前脑坐标:前囟前0.6 mm, 正中线左旁开0.6 mm进针, 深6.5 mm。每分钟注入细胞悬液0.5μL, 10 min注射完毕, 留针5 min, 最后在10 min内缓慢拔出针头。伤口消毒, 缝合皮肤, 单独饲养。对照组单独移植NSCs, BDNF组则在移植的细胞悬液中加入终浓度为100 ng/m L的BDNF。

1.2.4 取材及染色

每组8只大鼠在移植后第2周灌注固定, 从移植位点冠状切面切片开始, 前后每5张 (100μm) 取1张切片, 片厚20μm, 取7张组成1套切片, 取2套切片分别行NF+Brd U和GFAP+Brd U免疫荧光双标染色以检测NSCs在体内的分化情况。

1.3 计数及统计学分析

在200倍视野下对每张染色切片进行双标阳性细胞数的计数。对于每只动物, 从7张切片获得一个总数值。统计学分析软件采用SPSS 13.0。结果用均数±标准差 (±s) 表示, 组间的差异用t检验进行分析。P<0.05被认为差异存在显著性。

2 结果

2.1 移植细胞的存活

通过Brd U免疫荧光染色能对移植前被其标记的NSCs进行示踪。结果表明大部分均能够在体内良好存活, 表现为细胞胞核圆, 部分呈单个散在分布, 部分呈团块状分布, 估计由单个细胞增殖而成或几个细胞团聚一起。也有少数移植细胞呈现凋亡特征, 表现为浓染致密的颗粒块状荧光或碎片状荧光。

2.2 移植细胞的分化

移植后第2周, 两组切片在移植处或移植处周围均可见GFAP+Brd U免疫荧光双标染色 (图1) 和NF+Brd U免疫荧光双标染色 (图2) 阳性的细胞, 表明移植的细胞在体内可以分化为胶质细胞和神经元。其中, GFAP+Brd U免疫荧光双标染色阳性细胞较多, 与体内反应性的GFAP阳性细胞夹杂在一起, 形态上有明显较多的突起, 胞核圆, 胞浆着色明显。而NF+Brd U免疫荧光双标染色阳性细胞较少, 表现为在胞体中央有一个大而圆的核, 胞浆少, 可见延伸较长的轴突。

A~C:对照组染色结果;D~F:BDNF组染色结果

2.3 统计学分析

对两组切片的NF+Brd U免疫荧光双标阳性细胞进行计数, BDNF组双标阳性数为 (86.0±13.6) , 对照组为 (59.5±12.2) , 行t检验分析, t=3.56, 两组相比差异有显著性 (P<0.05) 。而对GFAP+Brd U免疫荧光双标阳性数进行计数, BDNF组双标阳性数为 (475.2±22.2) , 对照组为 (452.3±27.9) , 行t检验分析, t=1.57, 两组相比并未呈现明显差异 (P>0.05) 。

A~C:对照组染色结果;D~F:BDNF组染色结果

3 讨论

因为神经元才是神经系统结构和功能的基本单位, 对于像AD和PD等退行性病变, 神经元的变性、坏死是其功能障碍的主要原因, 本实验用穹隆-海马伞切断来建立AD模型, 很好地模拟了AD基底前脑胆碱能神经元的大量死亡, 是已被广泛实验研究应用的经典模型[6]。对于移植到脑内的NSCs, 人们总是希望它们能更多地分化为神经元, 更好地达到替代治疗受损神经元的目的。然而影响NSCs分化的因素同样十分复杂, 何种物质诱导NSCs分化为何种特定表型神经元目前尚无定论。所以对于NSCs分化方向的控制已成为当今神经科学研究的一个热点问题[7]。

研究表明, NSCs具有很强的可塑性, 其分化不局限于来源区域, 内环境在其中起着有极其重要的地位。FRICKER等[8]将人胚前脑NSCs移植到室下带、海马和纹状体的不同区域, 结果发现移植的细胞可分化成这些区域的特异神经元, 提示局部区域存在诱导NSCs分化成特定神经元的信号。因此, 在NSCs的移植治疗中, 应充分认识和利用NSCs的强可塑性, 结合改变植入的微环境来操控其分化, 达到治疗目的。

脑源性神经生长因子 篇5

急性脊髓损伤动物实验中新方法和临床中治疗措施是层出不穷,细胞移植是一非常有前途的修复策略。本实验对大鼠急性损伤脊髓局部注入神经干细胞,嗅鞘细胞,神经干细胞+嗅鞘细胞,通过BBB评分、斜板实验、运动诱发电位(MEP)及免疫组化检测BDNF表达情况,来评判各组受损脊髓恢复情况,比较两种细胞各自、联合对急性脊髓损伤修复的能力,以期可作为临床治疗的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SD大鼠88只,成年SD大鼠85只(80只实验,5只备用);另3只(出生3 d)SD大鼠为神经干细胞和嗅鞘细胞取材。随机分组(每组20只):对照组(假手术组)、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组(分别记为实验A、B、C组)。

1.2 试剂与仪器

兔抗鼠巢蛋白(Nestin)单抗、兔抗鼠P75单抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔二抗、兔抗大鼠BDNF多克隆抗体、免疫组化SABC试剂盒、生物素标记羊抗兔Ig G二抗等试剂、IX71型倒置荧光显微镜、Thermo3110型5%CO2培养箱、TGL-16B型普通台式离心机等。

1.3 实验方法

1.3.1 新生SD大鼠海马和嗅球的取材

将(出生3 d)SD大鼠消毒后,引颈脱位法处死,无菌操作显露两大脑半球、嗅球和小脑。完全剥离海马,分离嗅球保持两侧嗅鞘完整。去除表面毛细血管等软组织,4℃下分别清洗后备用。

1.3.2 细胞培养及鉴定

1.3.2. 1 嗅鞘细胞的培养及鉴定

将嗅球入DMEM/F12培养液,剪碎吹打分离,细胞筛网过滤后离心沉淀,沉淀入DMEM/F12细胞培养液(按比例配入b FGF、EGF和B27),至培养箱(37℃、5%CO2)。每3天全换一次培养液,16 d传代1次。第二代细胞悬液入凹玻片,培养、弃液,PBS漂洗,固定,依步骤进行至滴兔抗鼠P75一抗(1∶200),PBS漂洗3次,滴羊抗兔二抗(1∶400),孵育封片。倒置荧光显微镜下观察。

1.3.2. 2 神经干细胞的培养及鉴定

将海马同法制备,每2~4天换半量培养液,传代1次约6~8 d。鉴定同样,兔抗鼠Nestin为一抗(1∶100),羊抗兔二抗(1∶200)。封片观察。

1.3.3 大鼠急性脊髓损伤Allen’s模型的制备及局部注射细胞移植

将大鼠麻醉见效,俯卧固定,术区备皮消毒,脊正中切口(约3 cm),显露T10~12棘突及椎板。定位切除T12棘突及椎板上半部分,T11全椎板和棘突,T10棘突及椎板下半部分[2],显露T11相应脊髓节段的硬脊膜,定为损伤区。自制改良Allen’s撞击器重物15 g高度6 cm自由落下,瞬间下落能量对T11段脊髓致伤即制为大鼠急性脊髓损伤实验模型[3],打击后重物停3 min,硬脊膜静脉充血增粗,局部紫红色,鼠尾痉挛摆动,后肢回缩抽动,即打击有效。造模后即行细胞移植(生理盐水植入对照组、NSCs植入实验A组、OECs植入实验B组、NSCs与OECs混合1∶1植入实验C组):用1 m L无菌注射器慢注入0.1 m L细胞悬液(数量约为1×105个)。逐层关闭伤口。术后禁食水数小时。

1.3.4功能检测在术后1、3、7、14 d和21 d,随机抽取对照组、实验组各15只大鼠,进行BBB评分,评分基本内容:双后肢可活动的关节数量、活动范围、步态、负重、前后肢协调性及尾部活动情况,共22个分数级别;斜板实验[4],实验时将大鼠头朝前,身体躯干与斜板平行,角度渐大,大鼠在板上停留5 s且不滑落,记录角度,测3次取平均值。两检测法对大鼠后肢运动功能进行双盲法评分来了解受损脊髓功能恢复情况;再行神经电生理运动诱发电位(motor evoked potentials,MEP)潜伏期检测,刺激电极穿骨膜置于皮层,记录电极置于暴露的坐骨神经,参考电极位于大鼠硬腭下。观察脊髓传导或外周运动神经功能状况。

1.3.5 大鼠灌注、取材、固定与免疫组化

每组随机抽一只大鼠麻醉开胸,用静脉针头经左心室入主动脉,待冰盐水从右心耳流出后灌注4%多聚甲醛。切取T10~12对应脊髓节段(损伤处为中心约1 cm),入10%福尔马林固定,脱水沉底后石蜡包埋,厚度10μm连续切片。按SABC试剂盒操作说明进行。按步骤进行,其中按步滴入一抗兔抗鼠BDNF多克隆抗体(1∶200)、生物素化标记的二抗羊抗兔Ig G。封片选最优切片15张。10倍光镜下分别计数4个视野内BDNF染色阳性细胞占总计数细胞比例,即为阳性细胞标记指数,染色阳性标志是细胞浆或细胞膜呈明显棕黄色。即检测BDNF在受损脊髓中表达情况。

1.4 统计学处理

实验结果采用SPSS 17.0软件处理,计量资料以(±s)表示,比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化

除第1天外,各实验组恢复程度均明显大于对照组(P<0.05),第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

2.2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板实验角度变化

第1周开始,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

2.3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP(N1波)潜伏期变化

自第3天,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。

2.4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性的细胞数变化

细胞移植后,各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高,第3天到高峰后减少。术后第3天开始,四组中任意两组比较均有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。

*与对照组比较,P<0.05;△与实验A组比较,P<0.05;#与实验B组比较,P<0.05

3 讨论

3.1 造模方法及脊髓损伤治疗方法的选择

实验中改良Allen’s重物打击挫伤法,不仅减小重物致伤力量延长挤压时间,还有稳定、简便、可重复性等优势,且实验中对脊髓阶段(T11)制损并未发生硬脊膜破损及脑脊液外渗等现象,与临床急性脊髓损伤更为相近,更贴切体现治疗方法及疗效对比。细胞移植在临床中对ASCI治疗国外已有报道,国内学者将嗅鞘细胞移植治疗SCI处于临床试验,效果颇为满意,有望推广。NSCs有多向性分化能力,OECs可调节受损脊髓局部微环境。将NSCs和OECs分别、联合移植到急性受损脊髓中发挥各自特性,观察比较效果,来体现对受损脊髓功能恢复的强弱。

3.2 各项实验结果分析

3.2.1 BBB评分和斜板实验结果分析

BBB评分法侧重双后肢运动的各行为细节,如关节、脚趾、尾部等,斜板实验注重双后肢肌力情况,两评法从不同角度分析对比,各有侧重又有弥补,评价更加客观。

实验中各组大鼠造模前BBB评分均21分,造模细胞移植后24 h全是0分,随实验进行有不同程度恢复,各实验组比对照组明显增高(P<0.05),说明细胞移植对急性脊髓损伤有修复作用,且大于脊髓损伤后自身恢复作用。NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组的增高差异都有统计学意义(P<0.05),也说明NSCs+OECs联合移植对急性脊髓损伤后运动功能发挥最大恢复作用。这与损伤早期进行联合移植会有较好效果的研究假设相符合。

造模前,各组大鼠斜板实验平均角度(81.50±2.33)°,造模细胞移植后,第1天斜板实验角度降至(12.71±1.19)°,降低幅度之大与脊髓损伤导致后肢肌力减退呈直接关系,说明急性脊髓损伤造模成功。随实验进行各组斜板实验角度都回复增大,第7天开始实验组比对照组增大幅度更明显(P<0.05),NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组增大幅度有统计学意义(P<0.05),OECs组次之,NSCs组最弱,再次证实单种或多种细胞移植对损伤脊髓均有不同程度修复且急性脊髓损伤后有一定自身恢复性。

3.2.2 运动诱发电位(MEP)检测结果分析

采用MEP(N1波)潜伏期为检测标准,反复刺激取平均值。造模细胞移植后各组大鼠MEP(N1波)潜伏期明显延长,对照组潜伏期延长幅度比三实验组都大,第3天开始三实验组缩短幅度大于对照组缩短幅度(P<0.05),说明细胞移植促进受损脊髓的运动传导功能,NSCs+OECs组缩短幅度比OECs组、NSCs组都大(P<0.05),OECs组次之,NSCs组最差,与BBB评分和斜板实验结果趋于一致。表明大鼠急性脊髓损伤后有些许修复作用,细胞移植促进修复效果应是由NSCs、OECs对轴突再生的促进,再髓鞘化及延长,建立新突触连接有助于传导束功能恢复。

3.2.3 BDNF染色表达阳性细胞数结果分析

实验观察发现,急性脊髓损伤后BDNF表达明显增大,术后第3天到高峰,后下降,说明大鼠脊髓受损早期会自我保护性的提高BDNF分泌,那么BDNF很可能参与损伤早期有限的恢复过程。三实验组BDNF表达量比对照组的增多部分,在第3、7、14、21天比较差异均有统计意义(P<0.05)。无论BDNF上升或下降,三实验组与对照组的变化趋势相一致基础上且表达要高,说明细胞移植对BDNF表达有明显促进。OECs+NSCs组与OECs组、NSCs组相比增大很明显(P<0.05),说明OECs+NSCs组产生BDNF最多,除OECs+NSCs分泌BDNF外脊髓损伤后自身也分泌,OECs组比NSCs组所表达BDNF要多(P<0.05),实验组中NSCs组表达BDNF最弱,OECs组较强,OECs+NSCs组最强。

OECs、NSCs移植可提高BDNF表达,且BDNF参与ASCI修复过程,作用机制可能降低继发性损伤的炎症反应,与神经生长抑制因子进行对抗及竞争,在ASCI中对受损神经元起改善和修复的生物效应及抗损伤性的保护作用,促进轴突塑造,引导干细胞分裂方向,减少自由基代谢及堆积,以调控到满足神经元再生所需微环境,促进脊髓损伤后功能恢复。

3.3 NSCs与OECs移植修复ASCI

脑源性神经生长因子 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究涉及的研究对象是2011年12月~2013年10月连续就诊于南京医科大学附属精神卫生中心精神科门诊或住院的患者, 符合《中国精神疾病分类方案与诊断标准》第3版 (CCMD-3) 关于抑郁症的诊断标准, 年龄≥60岁, 汉密尔顿抑郁量表 (HAMD-17项) 评分18分[11]。排除双相情感障碍、精神分裂症、精神活性物质所致精神障碍等。本研究经医院伦理委员会批准通过, 并且患者知情同意。同期门诊或住院的老年抑郁症患者582例, 本研究纳入病例62例, 脱落4例, 其中2例随子女到外地失访, 2例病情好转后自行停药, 实际完成研究58例。其中, 男21例 (36.21%) , 女37例 (63.79%) ;年龄60~88岁, 平均 (76.8±4.3) 岁;病程1个月~15年, 平均 (11.3±5.4) 个月;合并躯体疾病情况:合并脑卒中20例, 高血压22例, 糖尿病20例, 脂肪肝9例, 冠心病7例, 各种癌症5例。

1.2 研究方法

1.2.1 服药方法

根据患者的病情和躯体情况, 米氮平[华裕 (无锡) 制药有限公司生产, 30 mg/片]初始剂量7.5 mg或15 mg, 以其病情和耐受性逐渐增加剂量, 最大剂量45 mg, 晚上睡前0.5~1 h顿服。对于睡眠障碍较重患者可加服苯二氮卓类镇静剂, 2周内米氮平加至治疗量时渐减直至停用。对于合并躯体疾病需要治疗的患者, 所服药物与米氮平间隔1 h服用。患者入组时即告知研究人员的电话, 以方便患者及其家属与研究人员联系。

1.2.2 量表评定

由经过培训的2名以上的副主任医师对研究对象采用汉密尔顿抑郁量表 (HAMD) 与临床疗效总评量表 (CGI) [12], 分别在米氮平治疗前和米氮平治疗后8周评定。国内外研究证实HAMD具有良好的信度和效度, 由17项组成, 由0~4五个等级评分。用于总体临床疗效评定的CGI量表, 包括病情严重程度 (SI) 、疗效指数 (EI) 和疗效总评 (GI) 三项, SI采取根据患者的病情由0~7八个等级的评分评估;EI是根据综合治疗的效果和治疗引起的副作用评定;GI是采取根据患者的病情与研究开始时比较由0~7八个等级的评分评估。

1.2.3 血清BDNF测定

在患者入组的次日清晨, 空腹肘部静脉血采集5 m L, 恒温水浴箱中静置1 h, 以3000 r/min, 离心5 min后, 吸取上清液 (血清) 放于1.5 m L离心管, -20℃冰箱储存备用。血清BDNF水平采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 集中测定, 批间变异系数小于5%, 批内变异系数小于4%。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供, 敏感性<2 pg/m L, 范围为31.2~2000 pg/m L。

1.3 临床疗效评定标准

采用HAMD于治疗前、治疗后各评定1次, 临床疗效按HAMD减分率评定, 减分率≥75%为痊愈, ≥50%为显著进步, ≥25%为好转, <25%为无效。显效=痊愈+显著进步。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件包, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 老年抑郁症患者临床米氮平剂量及疗效

米氮平的开始剂量为7.5~15 mg/d, 平均 (12.8±6.2) mg/d。治疗剂量为15~45 mg/d, 平均 (31.3±7.8) mg/d。8周结束时20例痊愈, 24例显著进步, 好转14例, 无效0例, 显效率为75.86%。

2.2 米氮平治疗前和治疗8周后临床症状及血清BDNF的变化

58例老年抑郁症患者米氮平治疗8周后的HAMD总分较米氮平治疗前明显下降, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。米氮平治疗8周后的SI、GI和EI与米氮平治疗前相比也明显下降, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;8周治疗后体重稍有增加, 但差异统计学意义 (P>0.05) ;米氮平治疗8周后的BDNF较米氮平治疗前明显升高, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

注:HAMD:汉密尔顿抑郁量表;CGI:临床疗效总评量表;SI:病情严重程度;EI:疗效指数;GI:疗效总评;BDNF:脑源性神经营养因子

2.3 性别不同的老年抑郁症患者比较

在年龄、病程、米氮平开始服用剂量、8周末服用剂量、治疗前及治疗8周后HAMD评分、SI、BDNF以及治疗后GI、EI等方面, 老年抑郁症患者在男女性别之间差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

2.4 副作用

在为期8周的治疗过程中, 患者均未发生严重的不良反应, 仅有的不良反应:过度镇静11例, 入睡时下肢不适8例, 头晕4例, 未影响治疗的腹泻2例, 不良反应均出现在1~2周内, 患者均能耐受, 经过任何处理, 过度镇静症状多数在2~3周内消失;在研究的整个过程中, 未出现兴奋和诱发躁狂发作等副作用。

注:HAMD:汉密尔顿抑郁量表;CGI:临床疗效总评量表;SI:病情严重程度;EI:疗效指数;GI:疗效总评;BDNF:脑源性神经营养因子

3 讨论

老年期由于生理、心理的变化, 老年人对生活的适应能力较青壮年减弱, 应激状态下容易引起抑郁等心理障碍。老年抑郁症可单发, 也可以继发于各种躯体疾病, 如高血压、冠心病、糖尿病以及各种癌症等。有些患者在家庭等社会因素刺激下诱导起病, 也有许多患者发病没有明显的诱因和病因。约70%以上的老年抑郁患者在抑郁的背景上产生焦虑和激越, 自杀率远远高于一般人群。治疗的目的在于减轻患者的抑郁症状, 预防自杀、复发或症状复燃, 提高患者的生活质量[5]。老年抑郁症患者合并躯体疾病较多, 常常需要服用多种相应的药物, 药物之间的配伍禁忌是临床医生和患者必须要关注的, 米氮平较少与其他药物有配伍禁忌[13], 并且米氮平过量也不太可能造成严重的不良反应[14], 比较适用于老年患者, 尤其是合并躯体疾病的老年抑郁症患者。

本研究采用米氮平对58例老年抑郁症患者进行了为期8周的治疗, 获得了比较好的临床效果, 显效率达75.86%。经8周的治疗后SI、GI和EI都有明显改善, 表明老年抑郁症患者服用米氮平治疗有较好的效果。尤其对伴有焦虑、睡眠障碍以及对合并躯体疾病的老年抑郁症患者显示其优良之处。国外报道也取得了相似研究结果[15,16], 能在短期内缓解老年抑郁症的主观躯体不适、焦虑、睡眠障碍等主诉症状, 对于老年抑郁症的早日康复回归社会有明显的益处, 能有效地提高患者的生活质量。

米氮平是去甲肾上腺素 (NE) 和5-羟色胺 (5-HT) 能抗抑郁剂, 通过阻断α2受体, 促进NE释放, 增强NE能神经传导, 引起5-HT释放增加;通过阻断5-HT2和5-HT3受体的作用可促进5-HT1A受体介导的5-HT传递, 同时阻断5-HT能神经元末稍的受触后抑制性, 促进5-HT的释放, 最终通过促进NE和5-HT神经传递。因此, 米氮平不仅对抑郁症有治疗作用, 而且对焦虑症有较好的抗焦虑作用。同时米氮平又具有抗组织胺受体 (H1) 的特性, 因而起着镇静的作用[15,16]。米氮平对细胞色素P450酶的抑制作用小, 与其他药物合并使用时较少引起药物间相互作用[17], 据报道心血管病伴有抑郁的患者接受米氮平抗抑郁症治疗可提高患者的生存率[18]。因此比较适合应用于伴躯体疾病, 尤其伴有心血管病的老年抑郁症患者。

本研究结果显示, 老年抑郁症患者服用米氮平治疗的平均剂量为31.3 mg/d, 对性别不同的患者均有明显的疗效。治疗期间患者的副作用较少, 一般在15 mg/d左右时出现, 仅仅是患者能够耐受的恶心、入睡前双下肢不适、腹泻, 患者2~3周内无需任何处理可自行缓解, 剂量增加至45 mg/d时也没有明显增加患者的副作用少。老年抑郁症常常伴有入睡困难, 建议米氮平使用于有睡眠障碍的患者, 在入睡前服用, 如是过度镇静作用反而有利于患者入睡, 成了治疗作用。

本研究结果显示治疗8周后在临床疗效好转的同时, 血清BDNF较治疗前明显提高。可能是由于米氮平可增加BDNF基因m RNA表达的水平, 从而改善血清BDNF水平[20]。Katsuki等[20]将84例符合《美国精神疾病诊断与统计手册》第四版修订版 (DSM-Ⅳ-TR) 标准的抑郁症患者进行4周的米氮平治疗观察, 发现米氮平可改善血清BDNF水平。但国外也有报道[21,22]抗抑郁剂对血清BDNF的影响并不明显。BDNF主要分布于海马、大脑皮质、纹状体、基底前脑等胆碱能神经元中, 是神经营养素家族的重要一员, 具有调节细胞迁移、神经元存活和突触功能的作用。部分抑郁症的病理生理反应是异常的神经网络, 异常的神经网络可能形成于早年生活关键期, 受到负面环境经历影响, 并导致皮质神经网络的组织再生不利。而抗抑郁药物通过BDNF介导, 引起皮质可塑性的再激活可能使得连接不畅的神经网络再次连通, 以便更好地适应一个正常的环境。而最近的研究显示, BDNF与女性抑郁症患者更具有相关性[23,24,25,26,27,28]。米氮平是如何通过调节BDNF而改善抑郁的具体作用机制有待于进一步探讨。

脑源性神经生长因子 篇7

脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质,它广泛分布于中枢神经系统内,BDNF为一种碱性蛋白质,对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用;并具有调节突触可塑性和神经递质传递等功能;同时,能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。本实验通过免疫组织化学法观察局灶性脑缺血大鼠(MCAO)治疗后脑组织BDNF的蛋白含量,以判断滋肾通络方对缺血周围区神经细胞损伤修复的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康Wistar雄性大鼠,体重250～300克,由山东大学动物实验中心提供,许可证号SCXK鲁20030004。摄食饲料为山东大学动物实验中心提供的混合饲料,实验期间自由饮水,室温18～25 ℃,相对湿度62%～72%。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型大鼠的制备

参照Zea-Longa[1]报道的颈外动脉栓线法制备局灶性大鼠脑缺血模型。Wistar雄性大鼠用1%戊巴比妥钠45 mg/kg行腹腔注射麻醉,并取仰位固定;剪去大鼠颈部毛发后,常规碘伏消毒颈部皮肤,沿颈部正中切开,钝性分离皮下组织,从两侧颌下腺之间剪开浅筋膜,暴露左侧胸锁乳突肌,钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌肌之间的肌间隙,暴露左侧颈总动脉(CCA),沿此间隙继续向上方分离,找到CCA分叉,在颈总动脉深面穿一细线,钝性分离颈内、外动脉。提起该侧CCA,在接近颈内动脉(ICA)与颈外动脉(ECA)分叉处,用眼科剪小心在CCA剪一约0.2 mm的横切口,将一直径约0.2 mm的鱼钩线(尼龙线),穿入ICA,穿线前标记从动脉切口到眼外眦的距离,将鱼钩线缓慢穿入至接近标记位置,当感到有一定阻力时即停止推送,此时栓线进入距CCA分叉处约1.8～2.0 cm,头端正好位于MCA起始部位,阻断MCA血流,可见大鼠右眼虹膜颜色变浅,出现Honer’s征。然后将切口的远心端及动脉内的丝线牢固结扎,剪去多余的丝线,逐层缝合皮肤,局部撒青霉素粉,将栓线的尾端暴露在皮外。术中及术后保持室温25 ℃左右,采用60 W的白炽灯照射动物以维持其肛温在(37.5±0.3)℃,相当于脑温(37.9±0.4)℃左右。

1.2.2 动物分组

上述Wistar雄性大鼠50只,随机分成5组,即模型组、假手术组、中药低剂量组、中药高剂量组、西药组各10只。假手术组仅把栓线插入ICA 6 mm而不入颅,术后不给予任何处理。

1.2.3 用药方法

西药组灌胃给予吡拉西坦片(南利民制药有限责任公司生产,每片0.4 g,产品批号:0612146),按50 mg/100 g大鼠/每日计算;中药低剂量组、中药高剂量组灌胃给予滋肾通络方(由制首乌、白芍、生山楂、红花按15∶12∶12∶5比例组成)水溶液2 ml(中药低剂量组1 ml≈1.28 g生药,中药高剂量组1 ml≈2.55 g生药),按成人千克体重剂量的6倍、12倍给予;余二组分别灌胃给予生理盐水2 ml,每天1次,共20天。于造模成功后24小时给药,固体饲料和水自由摄取。

1.3 免疫组织化学染色及图像分析

1.3.1 制片

上述MCAO模型大鼠灌胃20天后,麻醉后迅速断头,在低温下取脑,将左侧海马部分脑组织迅速切成1.8 mm厚的冠状脑片,置10%福尔马林液固定,常规梯度酒精脱水后,石蜡包埋后进行连续切片,切片厚度约4 μm。

1.3.2 染色进行免疫组化染色

蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟;3% H2O2去离子水孵育5～10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性;滴加山羊血清工作液室温孵育10～15分钟,倾去,勿洗;再滴加适当比例稀释的BDNF抗体,37℃孵育2～3小时或4℃过夜。PBS冲洗3次,每次3分钟;滴加生物素化二抗工作液,室温或37℃孵育10～15分钟;PBS冲洗3次,每次3分钟;再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温或37℃孵育10～15分钟;PBS冲洗3次,每次3分钟;DAB显色剂显色;自来水充分冲洗后用封片剂封片。

1.3.3 检测方法

首先光镜下观察神经元出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。再在高倍镜(×400倍)下每张切片随机选取5个不重叠的区域进行拍摄,将图像输入到HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统内,在相同的背底倍体条件下选择相应的参数进行计算机完全定量分析,用平均灰度值来表述BDNF的蛋白含量。

1.4 统计学处理

脑组织平均灰度值用$\overline{x}\pm s$表示,组间比较采用单因素方差分析,用SPSS 14.0软件进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组脑组织BDNF蛋白表达的比较见图1～5及表1。由图1可见,假手术组海马区BDNF切片染色很弱,几乎无阳性细胞表达;图2可见,切片染色增强,阳性细胞略有表达;

图3、图4、图5可见,西药组、中药低剂量组及中药高剂量组均见到切片染色强,BDNF阳性细胞强表达,尤以中药高剂量组阳性细胞表达最强。 由表1可看出, 模型组大鼠局灶性脑缺

注:与假手术组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.01;与西药组比较,cP<0.05;与中药低剂量组比较,dP<0.05

血后, 脑组织BDNF平均灰度值升高,但与假手术组比较无显著性差异(P>0.05);西药组、中药高剂量组、中药低剂量组脑组织BDNF平均灰度值较假手术组及模型组显著升高(P值均小于0.01)。中药高剂量组平均灰度值较中药低剂量组及西药组明显升高(P<0.05)。

3 讨论

脑梗死有病死率高、致残率高的特点,在脑缺血损伤过程中,神经细胞损害与死亡是导致神经功能永久性丧失的重要因素。基于此,本研究开创滋肾通络法治疗本病,并用免疫组化法揭示实验性大鼠脑梗死的发病机理及滋肾通络方对模型动物神经细胞的保护作用和神经修复作用的影响。旨在改善临床脑梗死的防治现状,并为中医药防治该病提供分子水平的理论依据。

根据临床多年治疗缺血性中风的经验,把滋补肾阴和活血通络法结合起来,提出滋肾通络是缺血性中风的基本治法,使肾精得复,脑髓得充,经络畅通“补而不腻,通而不泄”,脑络得以濡养。滋肾通络方药凡4味,由何首乌、白芍、山楂、红花组成,是笔者多年在临床观察应用于缺血性卒中治疗的经验方。本方药味虽少,但能充分体现滋肾通络的治法,其制方遣药,谨遵君臣佐使方意。

BDNF广泛存在于脑内各组织,以大脑皮质、海马、纹状体分布最为丰富。BDNF在脑内对发育中的交感、感觉和运动神经元的存活、分化和增殖有促进作用[2,3,4],并具有抗凋亡作用[5]。BDNF是唯一不断的在中枢神经系统和周围神经系统组织中表达的神经营养因子,它能促进神经元生存、延缓变性的自然死亡,参与脑缺血损伤的保护过程[6]。

本实验研究表明,模型组大鼠局灶性脑缺血20天后BDNF表达反应性增强,说明BDNF与损伤后神经元的修复作用有关。经滋肾通络方治疗后BDNF表达显著增强,特别是中药高剂量组增强更明显,与西药组及模型组比较有显著性差异(P<0.05)。说明滋肾通络方可通过调节BDNF的合成,促进神经细胞的存活和损伤修复,从而减轻缺血性脑损伤。

摘要：目的 观察滋肾通络方对MCAO大鼠脑组织脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)蛋白含量的变化,以探讨BDNF在脑缺血中的意义及滋肾通络方对缺血周围区神经细胞损伤修复的作用。方法 制作MCAO大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组和西药组。灌胃20天后,取大鼠脑组织,用免疫组织化学法检测各组BDNF的蛋白表达。结果 假手术组海马区几乎见不到BDNF阳性细胞表达;模型组切片染色增强,阳性细胞略有表达;西药组、中药低剂量组及高剂量组均见到切片染色强,BDNF阳性细胞强表达,尤以中药高剂量组阳性细胞表达最强。结论 BDNF与损伤后神经元的修复作用有关。滋肾通络方可通过调节BDNF的合成,促进神经细胞的存活和损伤修复,从而减轻缺血性脑损伤。

关键词：滋肾通络方,MCAO大鼠,脑源性神经营养因子基因表达

参考文献

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[3] Barde YA,Edger D,Thoenen H.Puritication of a new neurotro- phicfactor from mammalian brain[J].EMBOJ,1982,1(5):549-553.

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