血小板源性生长因子B

血小板源性生长因子B（通用4篇）

血小板源性生长因子B 篇1

近年来血管生成在肿瘤发生发展中的作用备受关注。研究表明, 肿瘤的生长属血管依赖性, 新血管的发生是肿瘤生长和转移的形态学基础, 而血管的生长是由一系列促血管生成因子诱导的。其中血小板源性生长因子 (platelet-derived growth factor, PD G F) 是重要的内皮生成因子, 目前对肿瘤中PD G F-B表达的研究己成为国内外热点之一。微血管密度 (m icrovessal density, M V D) 是衡量肿瘤血管生成的定量指标, 可以评价血管生成的程度, 并且可用于判断肿瘤的预后。本研究拟采用免疫组织化学的方法检测非小细胞肺癌 (non-sm all cell lung cancer, N SCLC) 组织中PD G F-B的表达, 探讨其与N SCLC恶性程度的相关性以及与肿瘤血管生成的相互关系, 为探讨肺癌的发病机制和抗血管生成治疗提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本

选取本院2008年7月~2010年2月手术切除的肺癌组织标本65例作为实验组。均经病理证实, 手术前后均未经放疗或化疗。男27例, 女38例, 年龄25~80岁, 平均58.6岁。根据1997年国际抗癌联盟的临床分期:Ⅰ期16例, Ⅱ期23例, Ⅲ期26例。组织学分级:鳞癌30例, 腺癌35例;高及中分化29例, 低分化36例。取18例非特异炎症肺组织标本, 男性8例, 女性10例, 平均年龄51.3岁, 作为对照组。

1.2 试剂

鼠抗人CD 34单克隆抗体、鼠抗人PD G F-B单克隆抗体和S-P试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

石蜡切片 (4μm) 常规脱蜡和水化;滴加3%双氧水溶液50μL, 阻断过氧化物酶10 m in, 微波炉加热抗原修复10 m in, 加10%正常山羊血清封闭的非特异性抗原50μL, 37℃孵育10 m in, 滴加一抗, 37℃孵育过夜, 加生物素标记的二抗50μL, 37℃孵育20 m in, 滴加辣根酶标记的链霉卵白素溶液50μL, 37℃孵育10 m in, 加新鲜配制的D A B溶液100μL显色, 显微镜下观察3~10 m in。以上各步骤之间均用缓冲液冲洗3次, 共15 m in, 苏木素复染, 脱水, 透明, 封片, 镜下观察。PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 M V D计数

参照W EID N ER[1]方法, 任何被CD 34抗体染成棕黄色, 可与周围血管、肿瘤细胞和其他结缔组织分开来的内皮细胞或内皮细胞簇, 均作为一个微血管;只要结构不连续, 分支结构也作为一个血管。先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的3个区域, 然后在200倍镜下计数M V D, 3个区域的均值为该肿瘤的M V D值。

1.4.2 PD G F-B阳性结果的判定

根据阳性细胞所占比例及着色强度综合制定免疫组织化学半定量记分的标准为:阳性细胞<1%, 0分;1%~25%, 1分;26%~50%, 2分;>50%, 3分。着色强度记分:不染色0分, 轻1分, 中2分, 强3分。两种评分之和0分~2分时为阴性, 3~6分时为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行分析。PD G F-B表达与肺癌临床病理因素的分析采用χ2检验。M V D以均数±标准差 (x±s) 表示, M V D与肺癌临床病理因素比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 两变量之间相关性采用SPEA R M A N相关分析。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 P D G F-B

2.1.1 PD G F-B在肺癌组织中的表达PD G F-B的阳性着色主要分布于细胞质和 (或) 胞核, 呈棕黄色至深棕色, 正常肺组织中未见或少见PD G F-B的阳性表达, 见图1。肺癌组织中的阳性表达率为58.5% (38/65) , 18例正常肺组织中有2例表达阳性。PD G F-B在肺癌中的表达显著高于正常肺组织, 差异有显著性 (P<0.05) 。

2.1.2 PD G F-B在肺癌中的表达与临床病理因素的关系PD G F-B在肺癌中的阳性表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及临床分期均有关 (P<0.01) 。但与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤组织类型、大小及原发部位无关 (P>0.05) 。见附表。

注:1) 与Ⅲ期比较, 差异有显著性, P<0.01;2) 与Ⅲ期比较, 差异有显著性, P<0.05;

2.2 M V D

2.2.1 M V D在肺癌与对照组中的差异CD 34的表达局限于血管内皮细胞的胞膜, 呈棕黄色和条状的血管结构。微血管的分布呈异质性, 大多集中在肿瘤边缘, 而癌巢及癌细胞密集区的M V D显著少于癌周区域及增生活跃区域, 见图2。本组肺癌的M V D为 (34.66±8.91) , 显著高于肺正常组织的M V D (17.78±4.81) (P<0.01) 。

2.2.2肺癌M V D与临床病理因素的关系M V D与肿瘤的大小、分化程度、淋巴结转移和临床分期有关 (P<0.05或P<0.01) , 而与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型和原发部位无关 (P>0.05) 。见附表。

2.3 肺癌组织中P D G F-B的表达和M V D的相关性

肺癌组织中PD G F-B阳性表达者的M V D值 (38.95±7.63) 明显高于阴性表达者 (28.71±7.04) , 且PD G F-B与M V D两者呈正相关性, 差异有显著性 (R=0.488, P<0.05) 。

3 讨论

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一, 是一类严重威胁人类健康的疾病。恶性肿瘤无限制的侵袭性生长必须依赖于持续和广泛的新生血管形成[2]。实体肿瘤在血管生成前直径只能生长到约1.0~2.0m m, 此时肿瘤的生长和凋亡处于相对平衡, 但新生血管形成后, 肿瘤细胞会呈指数增长[3]。目前认为, 肿瘤新生血管的形成是一个复杂的病理过程, 许多特异性的血管形成因子在血管生成中起到调控的作用, 如BFG F、V EG F和PD G F。

PD G F是首先从血小板中分离出的一类重要的促有丝分裂的多肽生长因子[4], 与相应受体结合, 诱导早期应答基因编码蛋白的表达, 促进D N A合成和细胞分裂增殖[5,6]。PD G F是原癌基因C-SIS编码的一组细胞因子, 由A、B两条多肽链通过二硫键连接形成同源或异源二聚体, 正常组织表达水平很低或完全检测不到, 而在肿瘤细胞可表达。M CCA R TY等[7]研究发现, 胰腺癌中PD FD-B的表达呈阳性。BR U N A等[8]报道, PD G F-B参与了神经胶质细胞瘤的增殖。本试验证实:N SCLC组织中PD G F-B的阳性表达率为58.5%, 明显高于对照组 (P<0.05) , 且与肿瘤分化程度、淋巴结转移及临床分期有关 (P<0.05或P<0.01) , 并且随着临床分期的增加, PD G F-B的阳性表达率也随着增加。本实验表明:肺癌细胞以自分泌和 (或) 旁分泌方式促进PD G F-B的分泌增加, 刺激肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡, PD G F-B过表达可能对肺癌的生长、侵袭及转移起一定作用。

M V D可衡量肿瘤血管生成的活跃程度, 是肿瘤血供丰富程度的一个独立指标。BA N D O等[9]在乳腺癌的研究中发现, 乳腺癌的预后与微血管的数量之间有显著相关性。类似研究在其他肿瘤如食管癌、子宫内膜癌和肝癌等中也得到证实[10,11,12]。本试验显示, N SCLC组织的M V D值显著高于对照组 (P<0.01) 。M V D与肺癌的临床病理特征密切相关。肿瘤组织分化程度越高, M V D值越低;而直径越大、分化程度越低, M V D值也越高。有淋巴结转移及临床分期越高, M V D值越高, 相反则低, 并且随临床分期的增加M V D值有逐渐增高的趋势 (P<0.05) 。以上提示, 血管形成是肿瘤生长及发生转移的重要条件。

PD G F-B以一种非依赖V EG F的方式诱导瘤内淋巴管和血管的发生[13], 能刺激血管内皮细胞增生, 诱导新生血管形成, 从而有利于肿瘤的生长、侵袭和转移。SK O BE等[14]报道, 外源性PD G F-B能促进肿瘤内基质细胞的增殖, 并且促进肿瘤内血管的形成。JO[15]报道, 抑制PD FG-B的表达可有效降低眼内新血管的形成。为进一步确PD G F-B与N SCLC组织血管新生的关联性, 笔者分析了不同PD G F-B表达的组织中的M A D值, 实验表明:PD G F-B阳性表达的肿瘤中, M V D值明显高于阴性表达者, 两者差异具有显著性 (P<0.05) 。同时显示, PD G F-B的表达与M V D值呈正相关性 (R=0.488, P<0.05) , 说明M V D对PD G F-B存在一定的依赖关系。进一步说明了PD G F-B作为肿瘤新生血管形成的正性调节因子, 在肿瘤的发生、发展和转移的过程中发挥重要作用。

总之, 通过本实验结果显示, PD G F-B在肿瘤的生长和转移与新生血管的形成密切相关, 因此对肿瘤组织中M V D及PD G F-B的检测有可能作为另一种预测肿瘤恶性程度和预后的生物学指标。

血小板源性生长因子B 篇2

关键词：PDGF-BB,肺癌,表达,免疫组化

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤, 占全世界癌症死因的首位, 近年来我国肺癌的发病率和病死率均迅速上升。肺癌早期症状不明显, 往往错过最佳的诊断和治疗时机, 因而提高诊断水平是延长患者存活期的关键。血小板源性生长因子-BB (PDGF-BB) 是重要的内皮生成因子, 具有促细胞分裂增殖、细胞趋化, 以及血管收缩等生物效应, 是决定肿瘤大小、转移、复发和预后的重要因素[1]。笔者对我院肺癌患者及肺部良性病变患者PDGF-BB的表达水平进行检测, 以探讨其在肺癌发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

肺癌患者30例, 均为我院2006年12月至2010年6月收治的住院患者, 经胸片、胸CT、痰脱落细胞学、纤维支气管镜活检或胸腔积液脱落细胞学检查确诊, 无放化疗史, 剔除病理诊断不明确者、高血压病和糖尿病患者。其中男性25例, 女性5例, 年龄45～85岁, 平均 (60.7±9.4) 岁。组织学分型:鳞癌11例, 腺癌10例, 小细胞癌9例。按1997年国际抗癌联盟 (UICC) 非小细胞肺癌分期标准进行分期:Ⅱ期4例、Ⅲ期12例、Ⅳ期14例。肺部良性病变患者30例, 既往无心、肝、肾、肺等重要脏器疾病。家族中无肿瘤病史。其中男性24例, 女性6例, 年龄50～72岁, 平均 (59.2±8.5) 岁。肺炎16例、支气管扩张症8例、慢性支气管炎6例。2组患者在年龄、性别方面无统计学方面无统计学意义, 具有可比性, P>0.05。

1.2 方法

1.2.1 血清PDGF-BB浓度的测定

清晨取2组患者的空腹静脉血3mL, 在不加入抗凝剂的情况下迅速离心10min分离出血清, 置-70℃冷藏贮存待检。采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测2组患者的血清PDGF-BB, PDGF-BB定量ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司, 操作步骤严格按照说明书进行, 绘制标准曲线。

注:观察组与对照组相比, *P<0.05

1.2.2 免疫组织化学染色

免疫组织化学 (SABC法) 检测PDGF-BB链的表达水平。麦默通穿刺活检标本和术后切除标本经10%多聚甲醛固定后, 石蜡包埋, 制成4μm切片, 将固定切片置于60℃恒温箱中烘烤30min, 切片常规脱蜡水化, 3%双氧水即用型, 室温10min灭活内源性酶;柠檬酸缓冲液进行高温高压抗原修复, 山羊血清封闭非特异性抗原, 滴加一抗湿盒内4℃过夜, 依次滴加山羊抗兔IgG-HRP多聚体, 苏木素复染, 脱水、中性树胶封固。以用0.1mol/L PBS代替一抗作为阴性对照, 选已知阳性的切片作为阳性对照。兔抗人PDGF-BB抗体和SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, 仪器为Elecys 2010全自动电化学发光免疫分析仪。

1.3 阳性结果判定方法

PDGF-BB的表达先在在X400倍视野下每张切片随机观察10个视野, 根据细胞染色程度评分:染色深度以多数细胞为准, 无着色为0, 浅着色为1, 深着色为2;再为切片中阳性着色范围评分:无着色为0, 着色<1/3为1, 着色>1/3为2, 弥漫着色为3, 最后将上述2项得分相加, 得分≥3为阳性。

1.4 统计学方法

用SPSS 11.0统计软件。记数资料采用均数±标准差表示, 组间计量资料采用t检验, P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

观察组患者的血清PDGF-BB水平为 (378.56±34.26) pg/mL、PDGF-BB链阳性表达率分别为66.7% (20/30) , 均显著高于对照组, P<0.05, 见表1。

3 讨论

肺癌为肺部原发性恶性肿瘤, 是最常见的恶性肿瘤之一, 死亡率极高, 且其发病率和死亡率均呈上升趋势。早期肺癌不易早发现, 对该病如能做到早期发现、早期诊断、早期治疗, 预后效果很好[2]。PDGF主要由血小板、部分肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等产生, 与肿瘤血管生成、肿瘤转移密切相关。正常组织内PDGF的表达受到严格的调控。本研究结果表明肺癌患者血清和组织中的PDGF-BB的水平均显著高于肺部良性病变组, P<0.05。这说明PDGF-BB参与了肺癌血管的形成, 有利于形成有功能的新生血管系统, 从而间接促进了肿瘤的生长。其在肺癌组织中的高表达, 说明PDGF能够促进结缔组织间质细胞生长, 细胞分裂增殖, 诱导细胞产生V型胶原, 调节Ⅲ型及Ⅳ型胶原的合成, 其在加速肿瘤细胞增殖, 促进肿瘤的侵袭与转移。此外, PDGF抑制癌细胞凋亡和使5-Fu抗肿瘤敏感性降低, 并与其受体结合可提高细胞外机质 (ECM) 的降解[3]。综上所述, 随着肺癌发病率的不断上升, 只有不断提高肺癌的诊断水平才能尽量使患者得到有效的治疗。PDGF-BB在肺癌的发生发展中可能起着重要作用, 在肿瘤的诊断和预后判断中起作用, 其表达的检测有一定的临床指导意义。但具体作用机制有待进一步探讨。

参考文献

[1]黄竹英, 聂新民.血小板源性生长因子在肝细胞肝癌中的表达[J].现代医药卫生, 2007, 23 (21) :3167-3169.

[2]秦建文, 周静敏, 马淑萍.非小细胞肺癌血清VEGF和PDGF测定的临床意义[J].天津医药, 2007, 35 (12) :897-899.

血小板源性生长因子B 篇3

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD大鼠由河北省实验动物中心提供,PDGF购自Oncogene公司,基因芯片购自美国Super Array公司,PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 血管平滑肌细胞培养

5周龄雄性SD大鼠,取胸腹主动脉,按贴块法分离、培养VSMC。运用免疫组化特异性抗鼠α-actin抗体鉴定VSMC。0.25%胰蛋白酶消化传代,选4~8代细胞进行实验。

1.2.2 MMP-2活性的检测

用含明胶的SDS-PAGE检测MMP-2活性。分离胶浓度为8%(含0.2%明胶),浓缩胶浓度为5%。分别取15μg/L PDGF[1]刺激0 min、20 min和6 h的VSMC培养基恒压电泳。电泳结束后,凝胶经2.5%Triton X-100漂洗两次,洗去凝胶中的SDS,使酶蛋白复性。随后加入反应缓冲液37℃孵育9 h。0.5%考马斯亮蓝染色1.5-2 h,脱色液脱色至蓝色背景下显现出清晰的白色条带为止。应用数码成像分析软件对酶图明胶降解区带的信号强度进行相对定量分析。

1.2.3 基因芯片检测

培养的VSMC生长至100%融合时,换成1%FBS培养基培养24 h,使细胞同步于G0期。分别加入15μg/L PDGF作用0 min、20min和6 h。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从上述时间点的VSMCs中提取总RNA,以此为模板,以Oligo(d T)7为引物,按照Super Array的反转录试剂盒说明书合成c DNA。得到的c DNA经过线性聚合酶反应转录合成反义RNA,同时加入生物素标记的d UTP,合成探针。

按照Super Array说明书进行杂交。将杂交膜沥干后,用X-射线胶片曝光。用扫描仪扫描胶片上的图像。运用Scan Alyze软件(Super Array公司)分析结果。

1.2.4 R T-PCR检测

培养的VSMC生长至100%融合时,细胞同步于G0期后,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分别从PDGF处理0 min、20min和6 h的VSMC中提取总RNA。以上述RNA为模板,反转录合成c DNA。以c DNA为模板,分别加入大鼠MT1-MMP c DNA上下游引物:上游引物:5'-GTACTACCGCTTCAATGAGG-3';下游引物:5'-C ACTGCCAGTACCAGGAG-3'。MT1-MMP c DNA扩增片段长度354 bp。以大鼠β-actin为内参照。

同样,以c DNA为模板,分别加入大鼠TIMP-2c DNA上下游引物:上游引物:5'-TCTTTCATCATGA GGCAGAGG-3';下游引物:5'-GGAAGGGATGTCAA AGCTGGA-3'。TIMP2 c DNA扩增片段长度442 bp。以大鼠β-actin为内参照。

按照PCR Kit说明书进行PCR。取RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用UVP凝胶图像成像系统拍摄,并用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.5统计软件处理。实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,统计结果以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 PDGF显著提高MMP-2的活性

明胶酶谱结果表明:PDGF刺激VSMC 20 min及6 h后与不用PDGF刺激的对照细胞(0 min)比较,培养基中MMP-2的活性呈明显升高趋势。经图像分析系统对酶图进行分析的结果显示:0 min条带灰度为198.7±17.1、20 min为289.2±26.5及6 h为405.3±41.2,分别升高1.46倍、2.04倍(见图1)。

1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的VSMC分泌MMP-2活性情况

2.2 PDGF具有提高MT1-MMP基因表达的作用

PDGF刺激VSMC后,基因芯片筛查发现PDGF促进MT1-MMP的表达(GEArray Analyzer分析显示:0 min处理组为0.04,20 min处理组为0.17,6 h处理组为0.44)。PDGF作用于细胞20 min、6 h后,MT1-MMP基因表达分别是对照组(0 min)的4.25倍和11.0倍(见图2)。

RT-PCR进一步检测MT1-MMP的基因表达。PCR产物电泳后经Gel-Pro Analyzer Version 3.0分析,PDGF作用0 min、20 min和6 h,数据分别为0.14±0.06、0.26±0.08和0.41±0.10。PDGF作用于细胞20 min,基因表达是对照组的1.86倍,6 h是对照组的2.93倍(P<0.05)。证实PDGF具有提高MT1-MMP表达的作用(见图3)。

1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的MT1-MMP m RNA表达

2.3 PDGF增强TIMP-2 m RNA表达

PDGF刺激VSMC后,基因芯片可检测到TIMP-2m RNA的表达(GEArray Analyzer分析为:0 min处理组为0.14,20 min处理组为0.27,6 h处理组为0.5)。PDGF作用于细胞20 min、6 h后,TIMP-2基因表达分别是对照组(0 min)的1.93倍和3.57倍(见图4)。

1:Marker;2~4:PDGF作用0 min、20 min和6 h的β-actin扩增产物;5~7:PDGF作用0 min、20 min和6 h的MT1-MMP扩增产物

1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的TIMP-2 m RNA表达

相同处理的VSMC中,用RT-PCR也检测到TIMP-2 m RNA的表达(经Gel-Pro Analyzer Version 3.0分析,PDGF作用0 min、20 min和6 h,数据分别为0.34±0.03、0.46±0.04和0.62±0.08),并且跟基因芯片表达趋势一致。PDGF作用于细胞20 min,TIMP-2基因表达量是对照组的1.35倍,6 h是对照组的1.82倍。由此可见,PDGF能显著增强TIMP-2 m RNA表达(P<0.05)(见图5)。

1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的TIMP-2扩增产物;4~6:PDGF作用0 min、20 min和6 h的β-actin扩增产物;7:Marker

3 讨论

PCI术中由于血管内膜受到机械损伤,血小板被激活、白细胞与血管内皮细胞粘附增强[2],随之启动了一系列炎症反应,促进VSMC向内膜迁移、增殖及分泌ECM,导致了动脉再狭窄的发生。PDGF是一种重要的细胞趋化剂和促细胞分裂剂,可由激活的血小板、损伤部位的巨噬细胞和VSMC产生,其可以刺激VSMC迁移和增殖,尤其对VSMC的迁移有显著影响[3]。VSMC从中膜向内膜的迁移过程中,需要降解细胞周围的ECM,而ECM的降解则依赖于MMPs的活化。其中MMP-2是一个必不可少的因子[4],其为VSMC迁移扫清道路。

从明胶酶谱中可以看到,在PDGF作用VSMC0 min、20 min和6 h,随着作用时间的延长,MMP-2活性逐渐增强。说明在PDGF作用下很短的时间内通过各种机制调节了MMP-2的活性,从而为VSMC的迁移做好准备。

MMP-2活性调节主要有转录水平调节和转录后调节。转录后调节包括酶原形式调节和TIMPs对MMP-2活性调节。酶原形式调节即pro-MMP-2的激活,MMP-2以酶原(pro-MMP-2)的形式分泌,其是无活性的。MT1-MMP(或MMP-14)是激活pro-MMP-2的关键酶[5]。TIMPs对MMP-2活性调节体现在TIMP-2对MMP-2活性的抑制作用,TIMP-2是MMP-2的主要生理性抑制剂。

该实验中,从未经处理的VSMC中,可看到MT1-MMP的表达。与SHOFUDA等[6]使用Northern blotting分析显示MT1-MMP在正常的鼠组织中广泛表达的结果基本一致。说明在正常的鼠VSMCs中,MT1-MMP的表达通过影响MMP-2的活性,从而共同维持血管正常的形态与功能。基因芯片和RT-PCR的结果显示:PDGF作用20 min和6 h后,VSMC中MT1-MMP的表达逐渐增强,分别为对照组的4.25和11倍(基因芯片结果)或1.86和2.93倍(PCR结果)。表明PDGF促进VSMC中MT1-MMP表达,进一步通过转录后调节机制,即高表达的MT1-MMP激活pro-MMP-2来提高MMP-2的活性。

转录后调节机制的另一个重要因素是TIMP-2。正常情况下MMP-2与TIMP-2在组织内保持着相对的平衡,影响细胞基质的降解。本试验中的基因芯片和RT-PCR结果都证实,在PDGF刺激20 min及6 h的VSMC中,TIMP-2 m RNA的表达逐渐提高,分别为对照组的1.92和3.57倍(基因芯片结果)或1.35和1.82倍(PCR结果),表明PDGF也具有促进VSMC中TIMP-2的表达的作用,但低于对MT1-MMP的促进作用。

钟林[7]等将TIMP-2基因转染到培养的VSMC中,发现MMP活性受到抑制。但我们的基因芯片、RT-PCR和明胶酶谱结果显示随着TIMP-2表达的增强,MMP-2的活性不但没有被抑制,反而呈现升高的趋势。分析可能有以下两个原因:一是在正常情况下,MMP-2主要以酶原pro-MMP-2的形式存在,并且储备量很大,当PDGF作用后,pro-MMP-2快速、大量的被激活,同时转录后翻译的速度加快,继续补充pro-MMP-2的数量。HAQUE等[8]研究发现鼠股动脉损伤后,MMP-2活性增加的同时,也伴随着pro-MMP-2的增加;另一方面在PDGF作用下,TIMP-2产生的数量相比MT1-MMP和MMP-2要低。已知TIMP-2可以抑制MT1-MMP自身的降解,并与MT1-MMP形成复合物在细胞表面积聚[9]。MT1-MMP/TIMP-2复合物作为pro-MMP-2的受体,参与pro-MMP-2的激活。当TIMP-2浓度比较低时,随着复合物形成增多,游离的TIMP-2就相对少,那么对MMP-2的抑制作用就减弱;最近研究[10]也表明TIMP-2可以抑制MT1-MMP的活性,当TIMP-2低表达时,MT1-MMP的活性增加。所以,尽管在PDGF刺激下TIMP-2的表达相对增强了,但是从明胶酶谱中仍可看到的MMP-2的活性升高。

综合MT1-MMP和TIMP-2的基因芯片结果及PCR结果可以看出:未经处理的VSMC中TIMP-2基因的相对表达量比MT1-MMP基因高,即TIMP-2/MT1-MMP﹥1,但是在PDGF作用VSMC后,这种比率发生了逆转,虽然TIMP-2有所增加,但是增加的量没有MT1-MMP多并参与了MT1-MMP与TIMP-2受体复合物的形成,削弱了其对MMP-2的抑制作用,最终导致MMP-2的活性,与对照相比,呈明显的增加趋势。ITO等[11]曾报道PDGF通过ERK信号转导途径调节MMP-TIMP之间的平衡,从而促进细胞迁移。那么该实验中PDGF是否也通过此信号通路调节MMP2-TIMP2-MT1-MMP三者之间的平衡,以及这种比率转变的机制以后有待进一步研究。

可见PCI术后,VSMC中MMP-2活性的提高,既有转录水平的调节,又有转录后调节机制的参与,即MT1-MMP与TIMP-2协同作用使MMP-2的活性增强,促进VSMC迁移。从该实验可以看出,在再狭窄发展过程中,若金属蛋白酶抑制剂活性占优势,可以对VSMC的迁移起到一定的抑制作用,这一点可为再狭窄的预防和治疗提供新的思路。

摘要：目的 研究在血小板源性生长因子作用下,大鼠血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的变化,同时探讨两者对基质金属蛋白酶-2活性的影响。方法 体外培养的血管平滑肌细胞经血小板源性生长因子处理0 min、20 min和6 h后进行如下检测:利用明胶SDS-PAGE酶谱检测血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶-2活性;基因芯片和RT-PCR技术检测血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的变化。结果 明胶酶谱测定表明:血小板源性生长因子显著提高血管平滑肌细胞分泌的基质金属蛋白酶-2的活性;基因芯片和RT-PCR结果显示:血小板源性生长因子对血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶有明显的诱导作用,作用20 min和6 h后的表达是对照组(0 min)的1.86倍和2.93倍(P<0.05);同样血小板源性生长因子显著增强基质金属蛋白酶组织抑制物的表达,作用20 min和6 h后的基因表达是对照组(0 min)的1.35倍和1.82倍(P<0.05)。结论 血小板源性生长因子显著增强了血管平滑肌细胞对膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的表达,同时两者的协调作用使MMP-2的活性呈明显的增加趋势。

关键词：血小板源性生长因子,血管平滑肌细胞,基质金属蛋白酶-2,膜型基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶组织抑制物

参考文献

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血小板源性生长因子B 篇4

关键词：烟雾病,肝细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,血管源性生长因子

侧支循环是近年来国内外研究的热点问题[1,2],通过侧支循环,可以维持病变血管的远端血液供应,从而避免出现脑梗死,当侧支循环好时,预后较好。故其在缺血性脑血管病的发生、发展、治疗、预后中都起到了十分关键的作用,更为重要方面其还是一条可干预的途径[3]。因此需要加强侧支循环建立的基础和临床方面的研究,从而为缺血性脑血管病的治疗开启新的方向。烟雾病是一种以双侧颈内动脉末端及大脑前、中动脉起始部狭窄或闭塞,并在颅底有异常增生血管网的脑血管病[4],其突出特征之一便是出现颅外向颅内代偿的侧支循环和新生的毛细血管网,其分别代表次级及三级侧支循环。随着病情的发展,新生的毛细血管网会发生不断地变化,呈现出增生、旺盛及衰减的过程,而次级侧支循环也会逐渐建立并起主要代偿供血作用,是目前研究侧支循环变化最好的途径[5]。目前很多国内外研究已提示多种细胞因子在烟雾病患者中表达明显增加[6,7,8,9],其中,肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)及血管源性生长因子(VEGF)最具有代表性[10],但烟雾病毛细血管网的增生、旺盛和衰减的具体过程及次级侧支循环变化与上述细胞因子的相关性尚不清楚,本研究探讨HGF、b-FGF、VEGF)在成人烟雾病不同阶段的变化,现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2013年11月~2014年12月江西省人民医院(以下简称“我院”)神经内科住院的行全脑血管造影检查确诊为烟雾病的41例患者临床资料,其中男15例,女26例,平均年龄为(51.34±8.71)岁,上述患者行相关检查排除相关疾病,同时行全脑血管造影检查确诊为烟雾病,影像学评判标准选择Suzuki分期,2位神经内科医师分别单独进行判定,8例患者为早期(Suzuki分期1~2期),17例为中期(Suzuki分期3~4期),16例为晚期(Suzuki分期5~6期)。同时选择在我院诊治40例脑动脉粥样硬化患者为阳性对照,另选择我院20例健康体检者为正常对照。所选健康对照人员均为血象、血生化、常规心电图、胸片、腹部B超、经颅多普勒超声检查等上述检查项目正常的健康成人。

烟雾病诊断标准:①颈内动脉(internal carotid artery,ICA)末端和/或大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)、大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)起始端狭窄或闭塞;②其颅底可见烟雾状异常血管网;③病变为双侧性。

脑动脉粥样硬化诊断标准:①全脑血管检查发现血管管腔有狭窄;②排外肌纤维发育不良等其他原因所致血管管腔变化。

烟雾病Suzuki分期的标准[11]:第1期,双侧颈内动脉末端分叉处狭窄。第2期,颈内动脉末端分叉处狭窄,ACA和MCA起始部狭窄并分支扩张,颅底有烟雾血管形成,但无颅外至颅内侧支循环形成。第3期,ACA和MCA主要分支闭塞,烟雾血管非常明显,形成烟雾血管团,但大脑后动脉(PCA)或后交通不受影响,仍无颅外至颅内侧支循环形成。第4期,颅底烟雾状血管开始减少,ICA闭塞已经发展到与后交通动脉的联合处。从颅外到颅内的侧支循环逐渐形成,或有异常增生的新生血管吻合支。第5期,从ICA发出的全部主要动脉完全闭塞,烟雾血管比第4期更少,从颅外到颅内的侧支供血进一步增多。第6期,烟雾状血管完全消失,ICA主干闭塞,仅见到从颅外进入颅内的侧支循环。

1.2 检测方法

烟雾病和动脉粥样硬化组在入院后第2天,正常对照组在当天即采取空腹静脉血6 m L,常温放置30 min,以3000 r/min离心15 min,取血清并将其置于-70℃冰箱备检。各组血清中HGF、b-FGF及VEGF浓度均采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测。检测试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司,检测步骤严格按操作说明书进行。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人一般资料比较

烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人的一般资料,烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者危险因素比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:“-”表示无

2.2 烟雾病患者、动脉粥样硬化患者、健康人血清中HGF、b-FGF、VEGF比较

烟雾病早期、中期、晚期患者的HGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05),烟雾病早期、中期、晚期患者之间HGF相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病晚期患者b-FGF与其他各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组间b-FGF差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病早期患者VEGF与其它各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

根据国内外相关研究报道[6,7,8,9],HGF、b-FGF、VEGF均在烟雾病患者病变处的颈内动脉颅内段及其分支血管中层和增厚的内膜中广泛表达,另外在患者脑脊液中检测含量明显增高,而正常对照组则未发现,表明这些相关病变组织中含有上述细胞因子,提示与烟雾病的发生发展有关。

烟雾病的病变血管不同于动脉粥样硬化病变,其以内膜增厚为主要表现,从而造成了血管管腔变细、狭窄,直至闭塞,同时周围逐渐出现新生毛细血管网,上述病理过程均与血管内皮细胞增生有相关性[12]。随着病程的进展,新生毛细血管会逐渐衰减,而次级侧支循环则起主要代偿供血作用,根据这些影像学变化可行Suzuki分期,8例早期,17例中期,16例晚期,分别代表了不同的次级和三级侧支循环变化阶段。

HGF是一种很强的促血管再生因子[13,14],它不仅促进血管的生成,而且可调节内皮细胞的生长、运动。本实验揭示血清中HGF浓度在烟雾病各个阶段均有明显的升高,既使烟雾病后期毛细血管网减少时,HGF浓度仍未下降,提示其从始至终一直参与新生毛细血管网及次级侧支循环的形成,可能是一种主要的促侧支循环开放的细胞因子。

b-FGF在体内分布很广,可诱导内皮细胞的迁移和增殖,并促进内皮细胞的黏附和形成血管腔[15],临床试验也进一步证明其具有强大的血管再生作用[16]。本研究发现烟雾病晚期患者血清中b-FGF含量明显增加,此时烟雾病变的血管闭塞达到最高峰,而新生毛细血管网已处于衰减期,但第二级侧支循环逐渐出现并起主要作用,故推测其在烟雾病侧支循环变化的后期病变中发挥了重要作用。

VEGF是一种血管生长因子,主要作用不但可刺激血管内皮细胞增生,调节细胞的生长,而且还可促进血管形成[17,18,19],临床试验显示通过特异性VEGF纳米抗体能抑制血管的生长,反证其具有促进血管再生作用[20]。本研究提示烟雾病早期组血清中VEGF含量明显增加,此时烟雾病患者病变血管尚处于病变早期,新生毛细血管处于增生期,推测其在烟雾病的侧支循环早期的变化发挥了重要作用。