五环三萜类化合物（精选5篇）
五环三萜类化合物 篇1
五环三萜类化合物 (Pentacyclic Triterpenoids) 是一类广泛存在于天然植物中的三萜类化合物, 是植物内产生的次级代谢产物, 具有较强的生物活性, 包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、护肝、抗心律失常、免疫调节、调节血糖和降血压等方面的功效。从化学结构上看, 三萜类化合物大多是由6个甲戊二羟酸 (30个碳) ) 缩合而成, 在自然界中以链状或环状形式存在五环三菇是其中数目最多, 药理作用最广泛的一类化合物, 按照其碳骨架的不同, 可将五环三萜分为齐墩果烷 (oleanane) 型, 乌苏烷 (ursnae) 型, 羽扇豆烷 (lupane) 型和木栓烷 (Friedelane) 型, 其中墩果烷 (oleanane) 型和乌苏烷 (ursnae) 型的研究较为广泛。
1 典型五环三萜类化合物
1.1 齐墩果烷型五环三萜类化合物
齐墩果烷 (oleanane) 型又称为β-香树脂烷 (β-am yrane) 型, 其中A/B, B/C, C/D环反式骈合, D/E环顺式骈合。德国的U LLSPER G ER E于1954年07月20日申请的专利 (D E1152221B) 首次于专利申请中记载了一种从植物中提取并精制齐墩果酸的方法, 此后各国研究者发现, 齐墩果酸存在于多种植物中, 并且其可以通过多种方式提取获得。研究发现, 齐墩果酸的抗肿瘤作用可能与其诱导细胞凋亡有关。
1.2 乌苏烷型五环三萜化合物
乌苏烷 (ursnae) 型又称为α-香树脂烷 (α-am yrane) 型, 此类三菇大多是乌苏酸的衍生物, 乌苏酸又称为熊果酸 (ursolicacid) 。同齐墩果酸, 熊果酸首次于D E1152221B提取得到并保护, 研究发现, 熊果酸具有良好的抗肿瘤活性, 且抗瘤谱广。
2 具有抗肿瘤活性的典型五环三萜类化合物的主要来源及其专利技术分析
2.1 来源分布
对截止2014年05月27日检索到的专利申请进行统计分析发现, 涉及具有抗肿瘤活性的典型五环三萜类化合物主要来源于植物提取 (57%) 、化学半合成 (36%) 、生物转化 (6%) 及其他 (1%) , 其中涉及天然来源的典型五环三萜类化合物的专利申请从上世纪50年代至今一直源源不断, 而涉及化学半合成以及生物转化, 尤其是生物转化制备典型五环三萜类化合物的研究起步较晚, 其专利申请于20世纪初才大量涌现出来。
2.2 提取、分离纯化工艺分析
从植物中获得具有抗肿瘤活性的典型五环三萜类化合物的过程可从工艺整体上分为提取和分离纯化两部分, 统计发现, 五环三萜类化合物的提取包括如下方法:溶剂加热提取、超临界提取、微波辅助提取、超声提取、逆流提取、加压酶解提取、动态提取、真空脉动式提取、亚临界提取, 其中以溶剂加热提取为主要提取方式, 涉及专利申请56件, 约占整体的71.79%, 五环三萜类化合物的分离纯化包括如下方法:大孔树脂吸附法、碱酸法、硅胶柱层析法、溶剂结晶法、凝胶柱色谱法、离子交换树脂法、膜过滤法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法、薄层色谱法、分子蒸馏法, 其中以大孔树脂吸附法为主, 涉及专利申请29件, 约占整体的37.18%。
2.3 工艺比较
天然产物的提取分离过程中, 各申请的提取工艺相对较单一, 一般只采用一种提取工艺对经过前处理的原料进行提取, 然而在分离纯化过程中, 通常采用多种分离纯化工艺相结合的方式对提取得到的浸膏或提取液进行分离纯化, 进而得到目标提取物, 其中以大孔树脂或硅胶柱层析结合溶剂结晶的方式居多, 并且根据申请中记载的提取效率或产品纯度分析发现, 通常情况下常采用多种分离纯化工艺相结合的方式对提取得到的浸膏或提取液进行分离纯化所得到的产品纯度优于采用单一分离纯化工艺。此外, 分析还发现传统提取分离工艺的产品提取率均较低, 且耗时较长, 而采用高新技术提取分离得到的产品, 其提取率相对较高, 且提取周期较短, 但设备成本较高。其中, 如U S3732202A和G B 1277417中均记载了一种齐墩果酸的提取分离工艺, 其原料经石油醚脱脂后用甲醇回流提取, 采用酸碱法对提取得到的化合物分离, 该申请中虽未记载该方法的提取率以及所得到产品的纯度, 但根据其说明书可知, 该提取得到的产品纯度较低, 有待于进一步的纯化。C N 1923844A公开一种以糖胶树叶为原料提取熊果酸的方法, 先用水煮去除糖胶树叶中的水溶性杂质, 加入醇, 热提2~4次, 合并提取液浓缩得浸膏, 加入酸水溶剂, 搅拌分离得沉淀, 乙醇多次重结晶得熊果酸纯品, 该方法仅用了水和乙醇, 不涉及其他溶剂, 生产成本低廉, 并且由于反复重结晶的引入, 其熊果酸产品的纯度也相对较高, 约为98%, 然而又正是因为多次重结晶的引入, 产品必然会有较大的损耗, 因此该申请的提取率应该有待进一步的提高。C N 101857625A中以超临界C O2提取方式对沙棘中的齐墩果酸进行提取, 并结合高效液相色谱法对其进行分离, 该工艺实现了资源的优化配置, 并且能够实现产品的有效分离, 其产品提取率高且纯度好。
3 小结
根据上述分析可知, 传统的提取分离方法普遍存在有效成分提取率不高、杂质清除率低、提取周期长等问题, 这些根本问题制约着具有肿瘤活性的五环三萜类化合物的开发进程。正因为此, 科研人员为了高效高质的提取得到植物中的五环三萜类化合物, 在此基础上不断开发一些新的技术并将其应用于此类化合物的提取中, 如超声场强化、超临界流体萃取以及微波辅助提取技术等, 这些新技术提取中药有效成份的方法具有产率高、纯度高、提取速度快等优点, 有着广阔的应用前景, 但设备成本高确是阻碍是实际生产的一个重要因素。此时, 如何衡量好生产周期、成本与产品品质之间的关系将是企业需要考虑的重要问题, 从主要角度产品品质方面的考虑, 可采用设备成本合理但效率较高的微波辅助提取或产生提取, 分离纯化过程中则根据产品的用途进行合理选择, 通过制备型色谱分离精制产物是保证产品收率以及纯度的较好工艺。
摘要：肿瘤严重危害人类的健康, 而五环三萜类化合物对癌细胞具有选择性的杀伤作用, 对正常细胞无碍, 典型五环三萜类化合物包括齐墩果烷型和乌苏烷型化合物, 本文综述了上述典型五环三萜类抗肿瘤化合物的来源, 并对其专利技术进行了重点的分析。
关键词：五环三萜,齐墩果烷型,乌苏烷型,提取,技术综述
参考文献
[1]王杰军, 王兵, 郭静, 等.熊果酸体外抑制血管形成的研究[J].第二军医大学学报, 2002.
[2]姚庆生.天然药物化学[M].第3版.北京:人民卫生出版社, 2002.
[3]黄炜, 等.五环三萜类化合物抗人肺癌细胞侵袭和诱导细胞凋亡的研究[J].中国肺癌杂志, 2003.
五环三萜类化合物 篇2
三萜类化合物具有广泛的生理活性,通过对三萜化合物的生物活性及毒性的研究结果显示,其具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物、抗生育等活性[5,6,7]。由于广泛的应用于医药和化妆品等行业,导致三萜类化合物在市场上供不应求,尤其是纯度较高的三萜类化合物。三萜类化合物的生物活性的多样性和重要性备受人们重视,已成为中药化学研究的一个热点领域。本文从溶剂的选择,提取方法,提取次数和料液比对柿叶中三萜类化合物的提取进行了研究。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
材料:石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、盐酸、氢氧化钠(以上试剂均为分析纯),购自北京化工厂;柿叶药材于2009年购自河北安国。
仪器:旋转型蒸发仪(RE-52AA),上海振捷实验设备有限公司;电热恒温水浴锅(HHS2),山西金燕电热仪器厂;调温电热套(KDM),山东鄄城华鲁电热仪器有限公司;超声波清洗仪(KQ-500DB),上海昆山超声仪器有限公司;紫外可见分光光度计(752S),上海棱光技术有限公司;循环水式真空泵(SHB-B95),山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。
1.2 提取工艺流程
称取一定质量的干燥柿叶,加入溶剂提取,提取液真空浓缩;浸膏经石油醚萃取,石油醚层弃去,水层用氯仿萃取,得氯仿层;测定三萜含量。
1.3 三萜化合物含量的测定
采用紫外分光光度法,以熊果酸为对照品,称取一定质量的提取物,溶于乙酸乙酯并定容至10 mL,按标准曲线项测定吸光度A值,以标准曲线即可计算样品中三萜含量。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线的绘制
精密称量乌苏醇4.9 mg,用乙酸乙酯溶解并定容到10 mL分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6 mL于试管中。在80 ℃水浴中将乙酸乙酯蒸发,然后分别加入0.6 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和2 mL高氯酸并在60 ℃的水浴锅中恒温45 min,在室温下冷却,然后用冰醋酸定容到10 mL,并在548 nm波长处测定吸光度A。以所测得的各浓度的吸光度A为纵坐标,所对应的各浓度的熊果酸为横坐标作标准曲线(见图1)。由图1可知,在所取得浓度范围内,浓度和吸光度呈良好线性关系。
2.2 提取溶剂的确定
称取15 g 柿叶于500 mL圆底烧瓶中,分别加入10倍量的水、0.05 M NaOH水溶液、70%乙醇和90%乙醇,室温下浸提24 h。提取液中三萜含量的测定按上述工艺流程和测定方法进行。不同溶剂三萜提取率结果见图2。
由图2可知,水、0.05 M NaOH水溶液、70%乙醇和90%乙醇对柿叶中三萜化合物的提取率分别为0.023%、0.11%、0.78%和0.54%,其中70%乙醇的提取率最高。因此,选定70%乙醇作为提取溶剂。
2.3 提取方法的确定
称取15 g 柿叶于500 mL圆底烧瓶中,加入10倍体积的70%乙醇,选用四种方法进行提取,条件分别为室温下浸提24 h(冷浸)、80 ℃下浸提12 h(热浸)、回流提取2次(每次2 h)、50 kHz功率下超声提取20 min。提取液中三萜含量的测定按上述工艺流程和测定方法进行。不同提取方法三萜提取率结果见图3。
由图3可知,冷浸、热浸、回流及超声四种方法对柿叶中三萜类成分的提取率分别为0.78%、0.98%、1.32%和0.59%,其中回流提取法的提取率最高。因此,选用回流提取法来提取柿叶中的三萜类成分。
2.4 提取次数、时间及料液比的确定
影响回流提取柿叶中三萜类成分提取率的主要因素为料液比、提取次数和提取时间,本实验采用了三因素四水平L16(43)正交实验设计,考察了这三个因素对柿叶中三萜类成分提取率的影响,从而确定最佳提取工艺。正交实验各因素水平安及结果分析分别见表1和表2。
由表2可知,回流提取最佳提取条件是A3B4C4,即料液比为1:15,提取次数为4次,提取时间为4 h。但是,由极差可以看出,料液比对提取效率有显著影响,提取次数次之,提取时间对提取效率的影响不显著。因此,考虑到提取成本等条件,最终选定A3B4C2为最佳条件,三萜类成分的提取率为2.16%。
3 结 论
柿叶是一种丰富的资源,其廉价易得,可以通过分离提纯得到的三萜类化合物,具有较大的经济价值和实用价值。部分学者[8,9]对柿叶中的总三萜和熊果酸的提取工艺进行了研究,所采用工艺流程较复杂,制备量较少,使用有机溶剂较多,不利于柿叶的进一步开发利用。本文采用单因素实验验和正交设计实验优化了柿叶中三萜化合物的提取工艺,采用70%乙醇作为提取溶剂,利用回流提取方法,料液比1:20,提取次数为4次,提取时间为2 h,三萜类成分的提取率为2.16%。该提取工艺有效可行,为柿叶的进一步开发和利用提供了科学基础。
参考文献
[1]江维克,周涛.柿叶卡—一种具有巨大开发潜力的资源[J].贵阳中医学院学报,1997,19(2):52-53.
[2]陈光,徐绥绪.柿叶化学成分研究[J].中国药物化学杂志,2000,10(4):298-299.
[3]Chen G,Wang ZQ,Jia JM.Three minor novel triterpenoids from theleaves of Diospyros kaki[J].Chem Pharm Bull,2009,57(5):532-535.
[3]Kameda K,Takaku T,Okuda H,Kimura Y,et al.Inhibitory effects ofvarious flavonoids isolated from leaves of persimmon on angiotensin-converting enzyme activity[J].Journal of Natural Products,1987,50(4):680-683.
[5]Saraswat B,Visen PKS,Dayal R,et al.Protective action of ursolicacid against chemical induced hepatotoxicity in rats[J].Indian J Phar-ma-col,1996,28:232-239.
[6]Guevara AP,Amor E,Russell G.Antimutagens from Plumeria acumi-nata Ait[J].Mutat Res,1996,361(2-3):67-72.
[7]Tapondjou LA,Lontsi D,Sondengam BL,et al.In vivo anti-nocicep-tive and anti-inflammatory effect of the two triterpenes,ursolic acidand 23-hydroxyursolic acid,from Cussonia bancoensis[J].ArchPharm Res,2003,26(2):143-146.
[8]王丽峰,彭敬东,刘丽敏.高效液相色谱法同时测定柿叶和连翘中黄酮和三萜类化合物的含量[J].分析试验室,2008,5(27):176-179.
五环三萜类化合物 篇3
中药是我国的“国粹”、民族之“瑰宝”。近年来, 由于全球掀起了回归自然的狂潮, 也为中药发展带来了机遇。
天然产物中对化学成分的提取是研究中草药的首要步骤, 是进一步测定其化学结构、研究其药理作用和毒性的首要条件, 也是进行结构改造、化学合成和研究结构疗效的前提。
与传统的中药有效成分提取方法相比, 新型提取技术具有明显的优越性。其中, 微波萃取是一项非常具有发展潜力的新型提取技术, 即在天然药物有效成分的提取过程中 (或提取的前处理) 加入微波场, 是利用微波场的特性来强化有效成分浸出的新型提取方法。
三萜类化合物具有良好的应用价值和发展前景, 然而传统的三萜类成分提取方法存在溶剂消耗量大、提取效率低等问题。
由于微波具有很强的穿透性、极高的加热效率和破碎植物细胞壁的能力, 与传统的溶剂提取法相比, 微波萃取具有省时、节能、高效等优点, 它在中药及天然药物的研究中发挥着极其重要的作用。
1 微波萃取的原理及影响因素
微波是指波长在1 mm~1 m之间、频率在300~300 000 MHz之间的电磁波, 它介于红外线和无线电波之间。目前915 MHz和2 450 MHz这两个频率已被微波加热广泛采用[1]。
微波萃取技术应用于天然产物萃取的公开报道始于1986年[2], Gedye等将样品置于普通家用微波炉, 通过选择功率档、作用时间和溶剂类型, 只需几分钟即可萃取出目标产物, 而传统萃取方式则需要几个小时。20世纪90年代初, 由加拿大环境保护部和加拿大CWT-TRAN公司合作开发的微波萃取系统Microwave-Assisted Process, 简称MAP[3], 现已广泛应用于香料、调味品、天然色素、中草药和化妆品等领域, 并于1992年开始陆续在美国、墨西哥、日本、韩国和西欧等国家和地区取得了专利许可, 在中国也得到了知识产权保护。在我国, 微波萃取技术已经用于上百种中草药的提取生产线, 如葛根、三七、茶叶、银杏等。微波萃取已被列为我国2l世纪食品加工和中药制药现代化的推广技术之一[4]。
1.1 原理
微波萃取的原理可以从两方面考虑:一方面, 微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质, 到达物料的内部维管束和腺胞系统, 由于吸收微波能, 细胞内部温度迅速上升, 使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受的能力, 导致细胞破裂, 细胞内有效成分自由流出, 在较低的温度条件下被萃取介质捕获并溶解, 通过进一步过滤和分离, 便获得萃取物料;另一方面, 微波所产生的电磁场, 加速了被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散, 用水作溶剂时, 在微波场下, 水分子高速转动成为激发态, 这是一种高能量不稳定状态, 或者水分子汽化, 加强萃取组分的驱动力, 或者水分子本身释放能量回到基态, 所释放的能量传递给其他物质分子, 加速其热运动, 缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间, 从而使萃取速率提高数倍, 同时还降低了萃取温度, 最大限度地保证了萃取的质量[5]。
也可以这样解释, 由于微波的频率与分子转动的频率相关联, 所以微波能是一种由离子迁移和偶极子转动引起分子运动的非离子化辐射能。当微波能作用于分子上时, 促进了分子的转动运动, 分子若此时具有一定的极性, 便在微波电磁场的作用下产生瞬时极化, 并以24.5亿次/s的速度做极性变换运动, 从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞, 促进分子活性部分 (极性部分) 更好地接触和反应, 同时迅速生成大量的热能, 促使细胞破裂, 使细胞液溢出并扩散至溶剂中[6]。
1.2 影响因素
微波萃取操作过程中, 其主要工艺参数包括:萃取溶剂、萃取功率和萃取时间。影响萃取效果的因素很多, 如萃取剂的选择、微波剂量、物料含水量、萃取温度、萃取时间及溶剂p H值等。
1.2.1 萃取剂的选择
在微波萃取中, 应尽量选择对微波透明或部分透明的介质作为萃取剂, 也就是选择介电常数较小的溶剂, 同时要求萃取剂对目标成分有较强的溶解能力, 对萃取成分的后续操作干扰较小。微波萃取要求溶剂必须有一定的极性, 才能吸收微波进行内部加热。通常的做法是在非极性溶剂中加入极性溶剂。目前常见的微波萃取剂有甲醇、丙酮、乙酸、二氯甲烷、正己烷、苯等有机溶剂和硝酸、盐酸、氢氟酸、磷酸等无机溶剂以及己烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇、水-甲苯等混合溶剂。
1.2.2 微波剂量
在微波萃取过程中, 所需的微波剂量的确定应以最有效地萃取出目标成分为原则。一般所选用的微波能功率在200~1 000 W、频率20~30 MHz, 微波辐照时间不可过长[7]。
1.2.3 物料含水量
水是介电常数较大的物质, 可以有效地吸收微波能并转化为热能, 所以植物物料中含水量的多少对萃取率的影响很大。
另外, 含水量的多少对萃取时间也有很大影响, 因为水能有效地吸收微波能, 因而干的物料需要较长的辐照时间[4]。
1.2.4 萃取温度和时间
微波萃取的连续辐照时间与试样重量、溶剂体积和加热功率有关, 通常在10~100 s。对于不同的物质, 最佳萃取时间不同。连续辐照时间也不可太长, 否则容易引起溶剂的温度太高, 造成不必要的浪费, 还会带走目标产物, 降低产率[8]。
1.2.5 溶剂p H值
溶液的p H值也会对微波萃取的效率产生一定的影响, 针对不同的萃取样品, 溶液有不同的最佳萃取酸碱度。
孔臻、刘钟栋[9]等采用微波法从苹果渣中提取果胶时, 保持其他条件不变, 而仅改变体系的p H值。实验发现, 当p H值在1.9以上时, 随着p H值的降低, 果胶得率增加, 但是当体系p H值小于1.7时, 由于酸度过高, 使得果胶质水解得到的果胶进一步脱脂裂解, 造成果胶得率下降。
2 微波萃取的特点及应用
2.1 特点
2.1.1 选择性好
由于极性较大的分子可以获得较多的微波能, 利用这一性质可以选择性地提取极性分子, 从而使产品的纯度提高, 质量得以改善。微波萃取还可以在同一装置中采用两种以上的萃取剂分别萃取所需成分, 降低工艺费用[8]。
2.1.2 提取效率高
微波提取时, 物料的极性物质分子在快速振动的微波电磁场中吸收电磁能, 使物料快速升温, 减少了操作时间。微波萃取只需几秒到几分钟的时间就能达到提取效果, 而用传统的热提取、索氏提取法需要几个小时甚至十几个小时以上的时间才能达到, 因此大大提高了提取效率。
2.1.3 能耗低
由于微波加热过程是介质分子获得微波能并转化为热能的过程, 其能量直接作用于被加热物质、空气及容器, 对微波基本上不吸收和反射, 从根本上保证了能量的快速传导和充分利用, 既减少了溶剂用量, 又缩短了操作时间, 大大降低了能耗。
2.1.4 设备简单, 操作简便
不同于超临界流体萃取所需的复杂设备, 微波萃取的设备简单、操作便捷。
目前绝大部分利用微波萃取进行的提取都是在家用微波炉内完成的, 其造价低、体积小, 适用于实验室研究及应用[10]。
2.2 在天然产物提取中的应用
微波萃取具有选择性好、提取效率高、能耗小、设备简单、操作简便且符合环境保护要求的特点, 可广泛应用于中草药、香料、食品和化妆品等领域。近年来, 研究工作主要聚焦于天然产物的提取方面, 提取的成分涉及多糖、生物碱类、黄酮类、葸醌类等。
2.2.1 多糖类
付志红[11]等采用微波技术提取车前子多糖。通过正交试验确定了微波提取的最佳工艺参数, 得到车前子多糖在固液比为1:15、微波强度为60%的条件下提取65 s, 多糖提取率为1.867%, 为传统提取方法提取率的1.5倍。结果表明, 微波萃取在用于某些生物材料的多糖提取中可明显提高提取率。
2.2.2 生物碱类
Ganzler[12]等从羽扇豆种子中提取金雀花碱 (斯巴丁) , 与传统的振摇提取法比较, 微波法提取物中的斯巴丁含量比振摇法高20%, 且速度快, 溶剂消耗量也大大减少。
2.2.3 黄酮类
张梦军[13]等采用微波辅助提取法和水提法提取甘草黄酮, 并用四因素、十六水平的均匀设计考察并优化微波提取甘草酮的实验条件, 发现微波辅助提取甘草黄酮的最佳条件为:当固液比1:8、乙醇浓度为38%、加热功率为288 W、加热时间为1min时, 微波辅助提取法 (24.6 mg/g) 明显优于水提法 (11.4 mg/g) , 提取率高, 且提取时间大大缩短, 是一种适合甘草黄酮的提取法。
2.2.4 蒽醌类
郝守祝[14]等采用正交试验法研究微波技术对大黄游离蒽醌浸出量的影响, 并与传统提取方法做比较。考察了微波输出功率、药材粒径、浸出时间3个因素对提取效率的影响, 优选了大黄游离蒽醌的最佳浸出方案。
结果表明, 微波浸提法对大黄游离蒽醌的提取效率明显优于常规煎煮法, 同乙醇回流提取法相当。由此说明微波法是一种提取效率高、操作简便、省时的新型提取方法。
3 微波萃取在三萜类化合物提取中的应用
3.1 三萜类化合物
三萜类化合物 (triterpenoids) 是由30个碳原子构成的萜类化合物, 由6个异戊二烯单位连接而成, 是类异戊二烯代谢途径的重要产物之一[15,16]。三萜类化合物的生物合成途径从生源来看, 是由鲨烯 (squalene) 通过不同的环化方式转变而来, 而鲨烯是由焦磷酸金合欢酯 (farnesyl pyrophosphate, FPP) 尾尾缩合而成。
一般根据三萜类化合物碳环的有无和多少进行分类, 目前已发现的三萜类化合物, 多数为四环三萜和五环三萜, 少数为链状、单环、双环和三环三萜。近几十年来还发现了许多由于氧化、环裂解、甲基转位、重排及降解等而产生的结构复杂的高度氧化的新骨架类型的三萜类化合物。
药理研究证明, 三萜类化合物具有广泛的生理活性, 傅乃武[17]等人对甘草中三萜类化合物的抗氧化作用进行了研究, 得出其对抗H2O2的溶血作用明显, 而对超氧阴离子自由基 (O2-) 和Hp D光溶血无明显对抗作用。李薇[18]利用小鼠体内移植的瘤模型, 测定白桦三萜类物质 (TBP) 对小鼠黑色素瘤B16、肉瘤S180、Lweis肺癌和艾氏腹水癌等肿瘤的抑瘤率, 结果表明TBP有抗肿瘤作用。此外, 三萜类化合物还有抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物等活性。
3.2 三萜类化合物的提取方法
三萜类化合物包括三萜烯及三萜皂苷, 在自然界中分布很广, 菌类、蕨类、单子叶和双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布, 尤以双子叶植物分布最多。它们以游离形式或者以与糖结合成苷或成酯的形式存在[19], 几乎都不溶或难溶于水。
将三萜类化合物从天然植物中提取出来, 是研究此类化合物的前提。三萜类化合物常见的提取方法有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、半仿生提取法、微波萃取法、超声循环提取法等。
3.2.1 溶剂萃取法
溶剂萃取法是最常见的提取三萜类化合物的方法。一般根据其溶解性, 采用不同的溶剂进行提取分离。其中, 应用最广的为有机溶剂萃取法, 常用的有机溶剂为乙醇等。该方法需要消耗大量的溶剂, 易造成医药污染且提取的成分不高, 使制得的药物剂型单一, 多为汤剂或者丸剂、散剂等, 服用量大且携带不便, 不利于中药的现代化。
3.2.2 超临界流体萃取法 (SFE)
SFE将传统的蒸馏和有机溶剂萃取结合于一体, 利用超临界CO2优良的溶剂力, 将基质与萃取物有效分离、提取和纯化。崔星明[20]等采用SFE得到的芦笋提取物, 用甲醇溶解, 采用液相色谱-质谱联用仪检测得到了56个组分。发现有保留时间和熊果酸基本一致的峰, 其质谱分子离子峰和特征碎片峰都与熊果酸的一致。雒廷亮[21]等采用SFE对山茱萸中的熊果酸进行了提取研究, 结果表明, 在熊果酸提取率基本相同的前提下, SFE不仅可以实现清洁生产, 而且易于实现工业化。SFE具有速度快、效率高、操作简单等特点, 且产品中没有残留有机溶剂, 与传统的萃取分离工艺相比具有明显的优势。
3.2.3 半仿生提取法
半仿生提取法模拟口服给药, 为经消化道给药的中药制剂设计了一种新的提取工艺, 即将药材先用一定p H值的酸水提取, 继以一定p H值的碱水提取, 提取液分别滤过、浓缩, 制成制剂。据报道此种方法经济实用, 可保证疗效[22]。龚慕辛[23]等通过比较水、不同浓度的乙醇、半仿生法及碱水提取法研究了对齐墩果酸提取量的影响, 结果显示, 半仿生提取齐墩果酸的提取量远高于一般水提法;以p H=12的碱液提取女贞子可以使齐墩果酸提取量大于75%乙醇的提取量, 并且齐墩果酸不是以游离的形式存在, 吸收利用率提高, 提取成本也大大降低。
3.2.4 微波萃取法
微波是一种电磁波, 具有电磁波的通性, 如加热速度快、受热体系温度均匀、选择精确、穿透力强等。微波可直接作用于分子, 加剧分子热运动, 从而引起体系温度的升高, 促使植物中有效成分快速溶出。蒉霄云[24]等使用该法提取灵芝中的三萜类化合物, 其平均提取率达1.043%, 比未使用微波工艺的三萜提取率高150%, 且实验操作稳定性高。
3.2.5 超声循环提取法
超声波对各种成分提取分离的强化作用主要源于其空化作用, 同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解, 可显著提高提取效率。
黄书铭[25]等研究灵芝三萜类化合物的提取工艺时, 在常规提取方法的基础上, 增加了超声循环的处理步骤。通过实验对比, 超声循环提取所需各种溶剂用量减少, 提取时间缩短, 目的产物提取率提高了40%。
3.3 微波萃取三萜类化合物的研究
正如前文所述, 微波萃取是利用产生的高频电磁波穿透植物组织外层结构而迅速到达组织内部。由于吸收微波能使组织内部温度和压力迅速上升, 导致细胞破裂, 有效成分自由流出, 所以能够迅速、有效地提取植物类的有效成分。
该技术具有穿透力强、选择性好、提取效率高、能耗低、设备简单、操作简便等优点, 可适用于三萜类化合物的提取过程。
林倩倩[26]等人在提取树舌灵芝中的三萜化合物时, 确定的微波最佳提取条件为:提取温度75℃、提取时间15 min、料液比1:20 (g/m L) 。在此条件下, 树舌灵芝三萜类化合物的平均提取率为0.747%, 高于传统的浸提法、回流法和超声法。
易醒[27]等人将微波预处理技术应用在泽泻三萜总组分的提取中, 所用时间只有传统提取法的一半, 三萜总组分的提取率提高了0.6%左右。经过微波预处理后, 后续提取时间缩短, 提取速度大大加快, 此方法具有可行性。
梁佳[28]等利用响应曲面法考察了微波提取桑黄茵丝体中三萜的优化工艺, 研究了乙醇浓度、微波功率、微波时间对微波提取桑黄三萜工艺的影响。结果表明, 微波法提取的最佳工艺条件为乙醇浓度80%、提取时间10 min、微波功率600 W, 提取液中三萜类化合物的提取量达到1.48 mg/g。相对其他提取工艺而言, 微波提取操作时间短, 提取含量高, 可以降低生产成本, 提高提取效率, 且较环保, 具有明显的优势。另外, 微波提取细粉不会出现传统提取方法存在的糊化、堵塞等问题, 适宜大规模生产。
蒉霄云[24]等人以灵芝为原料, 采用微波技术提取其中的三萜化合物。试验结果表明, 微波法提取灵芝三萜具有明显优势, 其平均提取率达1.043%, 比未使用微波的工艺三萜提取率高150%, 且试验操作稳定性高, 同样证明了微波技术的高效性。
宗乾收[29]等人应用微波辐射对印楝种仁进行了萃取, 提取了其中的印楝素 (处理样品量5 g, 印楝素含量0.41%) , 他们对影响微波萃取的条件, 如微波功率、辐射时间和萃取溶剂进行了筛选, 得到最终的优化条件:以甲醇为萃取溶剂, 微波功率280 W, 辐射时间l00 s, 溶剂用量120 m L, 此时印楝素提取率为94.15%。同时, 将微波诱导萃取与常用的甲醇室温浸提法和加热回流法进行了比较, 结果表明微波萃取时间最短, 印楝素提取率最高。
4 结语
三萜类化合物具有广泛的生理活性, 因而具有很强的研究和开发价值。而三萜类化合物的提取一般多采用传统的溶剂萃取法, 传统方法提取时间较长、工艺繁琐而且纯度较低, 难以满足中药现代化发展的需求。
五环三萜类化合物 篇4
关键词：乳香,乳香酸,三萜化合物,药理活性
乳香是橄榄科植物卡式乳香树Boswellia carterii Birdw. 及其同属植物Boswellia bhaw-dajiana Birdw.树干切口中渗出的坚硬胶状树脂[1,2]。在中国, 乳香的用药历史悠久, 最早可见于《名医别录》, 乳香被列为上品, 具有活血行气、通经止痛、消肿生肌的功效, 常用于治疗跌打损伤、风湿、类风湿性关节炎。在印度的传统医学中, 乳香制剂常被用来治疗各种炎症性疾病。
现代药理研究表明, 乳香具有抗炎、镇痛、抗溃疡、抗哮喘、抗氧化、抑制补体系统、保肝、抑制胆固醇合成等活性, 其中, 三萜类化合物为乳香主要活性成分, 具有潜在的开发应用价值。现查阅国内外文献, 对乳香的三萜类化学成分及乳香中活性化合物药理作用等方面研究进展作一综述, 为乳香的开发利用提供参考。
1 三萜类化学成分
乳香中的活性成分主要为五环三萜类化合物 ( pentacyclic triterpenoid) 、四环三萜类化合物 ( tetracyclic triterpenoid) , 主要有57 个化学成分。
1. 1 五环三萜
五环三萜类化合物是乳香属植物中分布最多的化合物类型, 也是最具特征性的有效成分, 为目前研究最多的一类成分。国内外的一些报道也显示五环三萜类化合物一般具有较好的药理活性, 其中从乳香中已分得的五环三萜按其结构可细分为:乌苏烷型 ( 1 ~ 18) 、齐墩果烷型 ( 19 ~ 24 ) 、羽扇豆烷型 ( 25 ~ 33) 。
1. 1. 1 乌苏烷型目前从乳香中分得乌苏烷型五环三萜18 个, 是从乳香中分得较多的一类三萜化合物。此类化合物取代基主要有乙酰氧基、羧基、羟基、羰基, 还有羟甲基、甲氧基等。从乳香中分得的乌苏烷型三萜有: β-乳香酸[3] ( 1) , 乙酰基-β-乳香酸[4] ( 2) , 11-羰基-β-乳香酸[5] ( 3) , 乙酰基-11-羰基-β -乳香酸[6] ( 4) , 乙酰基-11- 羟基-β -乳香酸[7] ( 5) , 熊果-12-烯-3, 23-二醇, 二醋酸酯[8] ( 6) , 3β-羟基-乳香酸[8] ( 7) , 熊果-12-烯-23-酸[8] ( 8) , α-香树素[7] ( 9) , 乙酰基-11α-甲氧基-β-乳香酸[5] ( 10) , 3α-乙酰氧基-24-去甲基-11-氧代-乌苏烷-12-烯[9] ( 11) , 9, 11-去氢-β-乳香酸[4] ( 12) , 3α-乙酰基-9, 11-去氢-β-乳香酸[7] ( 13 ) , 乌苏烷-9 ( 11 ) : 12-二烯-3α-醇[9] ( 14 ) , 3β, 20β-18 Hα-马尿甾二醇[10] ( 15 ) , 3β-acetoxy-13-methyl-19β- ( 1-methyl-ethyl ) -26, 27, 28, 29, 30-tetranolean- 8-en-20α-ol[10] ( 16) , 熊果-12-烯-3, 23-二醇[11] ( 17) , 2 α, 3α-二羟基熊果-12-烯-24-酸[12] ( 18) 。
1.1.2齐墩果烷型从乳香中分得的齐墩果烷型三萜化合物有:α-乳香酸[3] (19) , 乙酰基-α-乳香酸[3] (20) , 3α-羟基-齐墩果-12-烯-24-醛[9] (21) , 3-羟基-11-甲氧基-齐墩果烷-12-己烯 (3-hydroxy-11-methoxy-olean-12-ene) [13] (22) , 9, 11-脱氢-α-乳香酸[12] (23) , 3-乙酰基-9, 11-去氢-α-乳香酸[12] (24) 。
1.1.3羽扇豆烷型从乳香中分得的羽扇豆烷型三萜化合物有表羽扇豆醇[14] (25) , 表羽扇豆醇乙酸酯[8] (26) , 羽扇-20 (29) -烯-3α-乙酰氧基-24-酸[15] (27) , 酰氧基-27-羟基羽扇烷-20 (29) -烯-24-酸[16] (28) , 3α-羟基-羽扇-20 (29) -烯-24-酸[17] (29) , 3α-羟基-羽扇豆-20 (29) -24-醛[9] (30) , 3α-羽扇豆-20 (29) -烯-3-酸酯 (3α-lup-20 (29) -en-3-acid ester) [13] (31) , 3α, 5α-双羟基-羽扇豆-20 (29) -烯-24-羧酸 (3α, 5α-dihydroxy-lup-20 (29) -en-24-oic acid) [13] (32) , 3-乙酰基-28-羟基-羽扇豆酸 (3-acetyl-28-hydroxy-lupeolic acid) [18] (33) 。
1. 2 四环三萜
从乳香中分离得到四环三萜类化合物大部分属于甘遂烷型四环三萜, 主要化合物有: 3β-羟基甘遂-8, 24-二烯-21-酸[19] ( 34) , 3α- 羟基甘遂-8, 24-二烯-21-酸[20] ( 35) , 3α-乙酰氧基甘遂-8, 24-二烯-21-酸[20] ( 36) , 3-乙酰氧基甘遂酸[21] ( 37) , 3-羰基-甘遂-8, 24-二烯-21-酸[21] ( 38 ) , 甘遂醇[21] ( 39 ) , ( 20S ) -3, 7-二羰基-甘遂-8, 24-二烯-21-羧酸[9] ( 40) , 3β-羟基-甘遂-8, 24-二烯-21-醛[9] ( 41) , ( 11S, 23R) -3, 7-二羰基-11β-羟基-甘遂-8, 24-二烯-21, 23-内酯[9] ( 42) , ( 23R) -3-二羰基-甘遂-8, 24-二烯-21, 23-内酯[9] ( 43) , ( 7R, 23R) -3, 11-二羰基-7α-羟基-甘遂-8, 24-二烯-21, 23-内酯[9] ( 44) , ( 7R, 23S) -3, 11-二羰基-7α-羟基-甘遂-8, 24-二烯-21, 23-内酯[9] ( 45 ) , ( 7R, 23R) -3α-羟基-7-羰基-甘遂-8, 24-二烯-21, 23-内酯[9] ( 46) , ( 3R, 24R) -3α-乙酰氧基-7-羰基-25-羟基甘遂-8-烯-21, 24-内酯[9] ( 47) , ( 24R) -3-羰基-25-羟基甘遂-8-烯-21, 24-内酯[9] ( 48) , 3α-羟基甘遂-7, 24-二烯-21-酸[21] ( 49) , 3α-乙酰氧基甘遂-7, 24-二烯-21-酸 ( 3α-O-acetyl-tir-7, 24-dien-21-oic acid) [21] ( 50) , 3-氧代甘遂-7, 9 ( 11) , 24-三烯-21-酸[10] ( 51) , 3α-羟基甘遂-24-烯-21-酸[10] ( 52 ) , 3, 4-secours-12-en-3-oic acid[8] ( 53) , ( 3R, 23R) -3α-羟基-6-羰基-甘遂-7, 24-二烯-21, 23-内酯[8] ( 54) , ( 24R) -3-羰基-25-羟基甘遂-7, 9 ( 11) -二烯-21, 24-内酯[9] ( 55) , 3α-acetoxymansumbin-13 ( 17) -en-16-one[9] ( 56) , 3β-O-acetyl-16 ( S) , 20 ( R) -dihydroxy-dammar-24-ene[22] ( 57 ) 。其中, 化合物53、56 是从乳香树中分离得到的两个比较特殊的四环三萜。
2 药理活性
2. 1 抗炎
研究表明, 乳香提取物及三萜类成分对多种急慢性炎症模型均有抗炎作用且可能是通过免疫途径实现的[23], 进一步对乳香中单体化合物研究显示, 乳香酸五环三萜类化合物中3-乙酰基-11-羰基-β-乳香酸 ( 3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid, AKBA) 抑制5-脂氧合酶, 11-羰基-β-乳香酸 ( 11-keto-β-boswellic acid, KBA) 具有独特的5-脂氧合酶、人白细胞弹性蛋白酶双重抑制作用, 且作用不是通过激活垂体—肾上腺轴活性实现的[24,25]。近代研究表明乳香酸抗炎作用可通过抑制炎症因子而实现。Liang等[26]研究发现, AKBA与三氧化二砷配伍能抑制基质金属蛋白酶-1 ( matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 、MMP-2、MMP-9 及肿瘤坏死因子-α ( tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、白介素18 的分泌增加, 作用可能是通过抑制炎症因子实现的。刘绍军等[27]研究表明: β-乳香酸可能是潜在的人多形核白细胞激动剂, 可激活丝裂原激活蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinases, MAPKs ) 中p42MAPK、p38MAPK, 抑制p38 蛋白激酶活性, 有效阻止促炎因子的产生, 并诱导抗炎因子, 减轻炎症反应。
乳香经配伍及炮制后在多种动物试验中也显示明显的抗炎作用: 陈婷等[28]实验表明, 乳香没药配伍后可显著抑制脂多糖 ( lippolysaccride, LPS) 诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生NO水平。田中心等[29]对比乳香炮制前后抗炎作用表明: 乳香炮制后抗炎作用显著增强, 且抗炎机制与抑制总蛋白渗出及抑制前列腺素E2、一氧化氮生成有关。Henkel等[30]研究发现, 乳香酸三萜类化合物可抑制脂多糖的活性。进一步研究表明, 乳香酸提取物的抗炎作用靶点为前列腺素合酶1 和丝氨酸蛋白酶及组织蛋白酶G[31,32,33]。
2. 2 抗肿瘤细胞增殖
乳香三萜类化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。α-乳香酸在体外抑制急性早幼粒细胞白血病血管新生, 从而抑制人早幼粒白血病细胞 ( HL-60) 的增殖, 其作用可能与下调血管内皮生长因子及受体Flt-1 有关[34]。Agrawal SS等[35]研究表明乳香酸提取物 ( 主要包含 β-乳香酸、β-乙酰-乳香酸、KBA、AKBA) 通过上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 ( caspase-3) 和Bax蛋白诱导细胞凋亡而抑制艾氏腹水瘤和艾氏实体瘤的生长。趋化因子及其受体是慢性炎症的介质, 同时是诸多肿瘤转移的重要介质。Park B等[36]研究发现AKBA是CXCR4 的特异性抑制剂, 具有良好的抗肿瘤侵袭、转移的活性。稳定蛋白媒体或溶媒体未能阻止AKBA引起的CXCR4 表达下调, 说明这种下调是转录水平的。AKBA对趋化因子的表达抑制作用在原位移植人胰腺癌模型上也得到证实, 与此同时, Park等[37]研究发现五环三萜AKBA能显著降低胰腺癌组织内NF-κΒ、环氧酶-2、MMP-9、CXCR4 和血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, VEGF) 的表达, 从而抑制4 种胰腺癌细胞株系 ( As PC-1, PANC-28, MIAPa Ca-2, Bx PC-3) 的生长, 由此可以认为AKBA是新的CXCR4 抑制剂, 是有潜力的抗肿瘤侵袭、转移的候选药物。王睿齐[38]通过对比乳香酸和阿司匹林对自发肠腺瘤模型小鼠 ( APCMin / +鼠) 肠腺瘤化学预防作用的比较发现, AKBA对APCMin / +小鼠肠腺瘤的预防疗效明显高于阿司匹林, 能显著地抑制Wnt信号通路异常激活, 其作用可能与其抗细胞增殖/促凋亡有关。
2. 3 诱导分化凋亡
乳香中乳香酸类化合物对肿瘤细胞分化诱导作用在20 世纪80 年代后期就有研究[39], 尤其是AKBA, 是一个低毒性且作用良好的抗肿瘤药物和肿瘤转移抑制剂。近年研究发现乳香酸ABA可抑制人乳腺癌细胞进攻性并能诱导其凋亡[40]。此外, 何蕊伶等[41]利用人结肠癌HCT-116 细胞研究发现:AKBA可将其细胞周期阻滞在G2 / M期, 从而诱导细胞凋亡。Khan MA等[42]发现乳香酸提取物和阿霉素联合用药对治疗肝癌细胞 ( Hep G2、Hep3B) 有协同作用, 且乳香酸提取物对阿霉素诱导的大鼠肝毒性有保护作用。Zhang YS等[43]研究AKBA对人胃癌生长的影响, 结果表明AKBA在体外与体内均展现出抗癌活性, 裸鼠移植瘤口服给药AKBA后, AKBA显著抑制人胃癌细胞SGC-7901 和MKN-45, 这种效应可能与它在细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的作用有关。研究还表明AKBA治疗后, 细胞核β 联蛋白表达被抑制, 膜 β 连环蛋白被激活, 可能与调节的Wnt /β-catenin信号通路活性相关。
2. 4 抗溃疡
乳香提取物能提高溃疡再生黏膜结构成熟度, 提高溃疡愈合质量, 是有前景的抗溃疡药[44]。柏景坪等[45]采用Na OH晶体化学灼烧法建立大鼠口腔溃疡动物模型测定乳香酸对实验性口腔溃疡的治疗效果, 结果显示乳香酸在降低溃疡组织丙二醛含量、提高超氧化物歧化酶活性方面优于溃疡散, 并可抑制溃疡组织中肿瘤坏死因子-α 和白介素-6 的表达水平。其作用机制可能与氧化应激和抑制炎症因子水平有关。
2. 5 降糖活性
Ruchita等[46]研究表明, 乳香与阿卡波糖协同作用的抗糖尿病新药可持续较长的时间, 从而避免重复给药, 同时消除了传统的多剂量阿卡波糖的需要并减少了阿卡波糖胃肠道不良反应。近期研究表明乳香提取物能够通过抑制小鼠体内粒细胞集落刺激因子 ( G-CSF) 和巨噬细胞集落刺激因子 ( GM-CSF) 而阻止胰岛素损伤, 降低Ⅰ型糖尿病模型小鼠血糖水平而不影响非糖尿病小鼠的血糖水平[47]。
2. 6 改善学习记忆
Karima等[48]研究表明以 β-乳香酸为主要成分的乳香提取物可促进海马神经元突触的生长和分枝从而显著提高神经轴突生长、分枝起到改善记忆作用。Hosseini等[49]研究证实乳香可以预防由甲巯咪唑导致甲状腺功能减退引起的学习和记忆力减退。
2. 7 其他
AKBA是一种抗牛皮癣的纯天然中药, 能够特异地抑制牛皮癣患者真皮内核酸转录因子NF-κB的活化, 并且阻隔信号转导下游TNF-α 的合成[50]。DPPH自由基清除实验结果显示乳香具有较弱的抗氧化活性[51]。进一步研究证明局部应用乳香酸类化合物可改善选择性的皮肤光老化症状。因此乳香的抗氧化作用可应用于化妆品及药品生产中[52]。乳香提取物具有促进大鼠创面愈合的作用, 并能促进雪旺细胞 ( schwann cells, SC) 的增殖, 对感觉神经肽P物质 ( substance P, SP) 、碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growth factor, b FGF) 及神经生长因子 ( nerve growth factor, NGF) 的表达都有一定程度的上调作用, 乳香提取物可能通过调节SC、SP、b FGF及NGF的表达促进周围神经损伤的修复[53]。张业奇等[54]研究发现, 乳香精油可不同程度地改善小鼠的行为学行为, 显著提高小鼠脑内单胺类神经递质5-羟色胺 ( 5-HT) 含量 ( P < 0. 05) , 具有抗抑郁作用, 对中枢单胺类神经递质5-HT的调节是其作用机制之一。传统医学中, 乳香还可加速伤口愈合[55]、具有抗凝血、抗哮喘、止泻、止痛、保肝等多种生物活性。
3 研究展望
五环三萜类化合物 篇5
1 仪器与试剂
1.1 药材
由亳州市中药饮片厂加工,东北产地,并经山西医科大学药学院中药学教研室高建平教授鉴定为桑寄生科槲寄生属植物槲寄生[V.coloratum(Kom.)Nakai]。药材标本保存于山西医科大学药学院中药学教研室。
1.2 培养基[5]
乙酸钠1 640 mg,CaCl2·2H2O 75 mg,MgSO4·7H2O 200 mg,EDTA 20 mg,酵母膏1 000 mg,K2HPO4900 mg,(NH4)2SO41 320 mg,KH2PO4600 mg,FeSO4·7H2O 1 118 mg,微量元素1 ml,去离子水1 000 ml(pH 6.8~7.2)。
1.3 菌种
紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌(rhodobacter sphaeroides),由山西大学光合细菌研究室分离鉴定保藏,菌液含菌数8.0×108个/ml。
1.4 主要仪器及试剂
UV 2802型紫外可见分光光度计(美国尤尼柯);齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110709-200304),其他试剂均为分析纯。槲寄生各提取物及各转化液样品,见表1。
2 方法与结果
2.1 固定化球形红细菌的制备
将已培养好的球形红细菌培养液在5 000 r/min下离心30 min,菌体用生理盐水洗涤2次,收集湿菌体。将终浓度为10%(g/g)的聚乙烯醇(PVA)加水加热溶解,冷却到35℃,加入终浓度为30%(g/g)的湿菌体,搅匀,注射器滴入pH值为6.5(用NaOH调节)的饱和硼酸水溶液中形成直径为3 mm左右的固定化球形红细菌细胞,将形成的小球放入4℃冰箱中固定化18 h,蒸馏水洗涤3次,培养液中活化24 h,待用[4]。
2.2 三萜类化合物的测定及对比研究[5,6,7,8,9]
2.2.1 对照品溶液的配制
精密称取齐墩果酸对照品20 mg,置于100 ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.2 mg/ml的齐墩果酸对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的配制
取10 ml待测样品溶液,减压蒸干,加乙醚适量回流提取至提取液无色,挥干溶剂,加甲醇稀释至刻度,摇匀。因样品中总三萜含量相差很大,如果不在线性范围内,做适当稀释后测定。
2.2.3 最大吸收波长的确定
分别取经显色后的对照品及供试品溶液,在200~800 nm范围内扫描。结果表明,样品、对照品均在535 nm处有最大吸收,故选择535 nm作为测定波长。
2.2.4 专属性试验
取经显色后的常规光合细菌培养基(即阴性对照,按“1.2”项下方法配制),在200~700 nm范围内扫描。结果在535 nm处没有吸收,说明选择535 nm作为测定波长,阴性对照无干扰。
2.2.5 标准曲线及线性范围的考察
精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml,分别置具塞的试管中,挥去溶剂,准确加入5%的香草醛-冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸,混匀,在60℃恒温水浴中加热15 min,冰水浴中冷却至室温,加入5.00 ml的冰乙酸,转移至10 ml量瓶中,加乙酸乙酯稀释至刻度,摇匀(浓度用C表示),在535 nm处测定吸光度(A)。线性方程为A=21.988C-0.072,相关系数r=0.989 5,线性范围为2~12μg。
2.2.6 精密度试验
取对照品溶液0.4 ml,按“2.2.5”项下方法显色,连续测定5次,测得含量的RSD=1.13%,表明分析方法精密度良好。
2.2.7 重现性试验
取同一批样品5份,按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液,按“2.2.5”项下方法测定,测得含量的RSD=3.12%,表明分析方法重现性良好。
2.2.8 稳定性试验
取经显色后的供试品溶液,在1 h内每隔10 min测吸光度1次,30 min内测得含量的RSD=3.65%,以后吸光度相差很大,故测定应该在显色后30 min内测定。
2.2.9 加样回收率试验
取已知总三萜含量的培养液5 ml,分别加入对照品溶液3、5、7 ml。按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液,按“2.2.5”项下方法测定,计算回收率。见表2。
(n=3)
2.2.1 0 样品含量测定及比较
取样品溶液分别制备供试品溶液,在535 nm处测定吸光度,如超出线性范围,稀释至适当倍数测定,表1中1~9号样品总三萜类含量(n=3)分别为1.80、0.22、4.34、4.44、2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。
3 讨论
本研究结果显示,槲寄生水提取液(样品2)及槲寄生水提取液的球形红细菌转化液(样品6、7、8),其总三萜含量都很低,说明水不能将槲寄生药材中的三萜类提取完全;75%的乙醇提取、半量常规培养基、游离球形红细菌细胞培养,所得培养液(样品3)总三萜含量和槲寄生75%的乙醇提取液(样品1)相比增加141%,说明经过球形红细菌转化可以增加槲寄生提取液中的总三萜的含量;样品4和样品3相比,总三萜含量稍有增加,说明固定化球形红细菌在一定条件下有利于样品中总三萜类化合物的转化,但球形红细菌固定化后不适合药用,需要进一步考虑;另外,样品4和样品5中总三萜含量相比增加111%,说明培养液中不添加常规培养基,适合固定化球形红细菌对槲寄生药材中三萜类化合物的转化,使总三萜的含量增加。由此可见,在不同的条件下,对各种类型化合物的最佳转化条件是不同的,也体现了中药全成分生物转化的复杂性。本文建立槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法,并对槲寄生及PSBT中各含量进行比较研究。为球形红细菌转化槲寄生化学成分和转化机制研究奠定基础。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:350.
[2]秦娟,李利华,杨官娥,等.光合细菌转化复方决明子口服液中蒽醌类成分的含量测定[J].山西医科大学学报,2009,40(3):254-256.
[3]Sasaki K,Watanabe M,Suda Y,et al.Applications of photosynthetic bacteria for medical fields[J].Journal of Bioengineering,2005,100(5):481-488.
[4]刘建红.混凝吸附-固定化光合细菌处理垃圾渗滤液的研究[D].太原:山西大学,2004.
[5]纵伟,夏文水,崔宝良.薄层分离-分光光度法测定大叶紫薇叶中的总三萜含量[J].食品科学,2005,26(4):222-225.
[6]王江海,袁建平,徐世平,等.薄层分离-光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量[J].中国食品学报,2004,4(3):76-79.
[7]帕丽达.阿不力孜,堵年生,丛媛媛,等.比色法测定琐琐葡萄中总三萜类成分的含量[J].华西药学杂志,2002,17(6):475.
[8]易中宏,郑一敏,胥秀英,等.分光光度法测定茯苓中总三萜类成分的含量[J].时珍国医国药,2005,16(9):847-848.