培养制备（通用3篇）
培养制备 篇1
在兽医诊疗工作中, 常常需要运用到药敏试验。就锦州市动物疫病预防控制中心禽病门诊为例, 天天都有用到培养基平板做药敏试验。由于需要大量的药敏培养基平板, 在长期的实践工作中, 笔者探索出了新的培养基制备方法。现将试验过程总结如下。
1 材料与方法
1.1 器材与试剂
立式压力蒸汽灭菌器 (YXQ-LS-30SⅡ) , 上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品。恒温培养箱 (JKDP.360) , 厦门医疗电子仪器厂产品。生物安全柜 (NU-437-400E) , 美国Nuaire。试验室p H计 (PHSJ-3F) , 上海雷磁精密科学仪器有限公司产品。营养琼脂粉 (批号20151005) , 北京奥博星产品。冰箱、250ml生理盐水玻璃瓶 (以下简称玻璃瓶) 、棉绳、注射器针头、无菌培养皿、封口塑料膜、天平、250ml量筒、自制药敏片、蒸馏水。
1.2 试验方法
同时用传统方法和新方法各制备10个培养基平板。传统方法制备的培养基平板编号为A, 新方法制备的培养基编平板号为B。同时进行大肠杆菌药敏试验。
2 培养基制备新方法
2.1 配料
按照营养琼脂粉说明书给出的比例称量出干粉倒入250ml玻璃瓶中, 倒入相应比例的纯化水。然后盖上瓶塞, 再用塑料膜包裹整个玻璃瓶瓶口部分, 用棉绳绑紧。最后剧烈震荡, 充分混合。瓶中的液体不要超过220ml, 如果需要的量大, 可以多配几瓶。
2.2 加热溶解与灭菌
(1) 把玻璃瓶放入立式压力蒸汽灭菌器中。用注射器6号针头扎穿封口膜与瓶塞, 针头保留其中, 使瓶中压力与蒸汽灭菌器中的压力同步。
(2) 高温可破坏培养基的营养成分, 因此必须严格控制灭菌温度和时间, 并且不可重复灭菌[1]。在立式压力蒸汽灭菌器中121.3℃灭菌15~20min。这个湿热灭菌的过程包含了传统的培养基加热溶解的步骤。
(3) 灭菌15~20min后, 灭菌器自动停止加热。这时候拔除电源, 让灭菌器自然冷却减压。1~2h后, 压力仪表显示为0时可以打开放气阀, 排出残余蒸汽, 使灭菌器内外压力一致时, 带棉布手套取出玻璃瓶, 拔除注射器针头。瓶中的培养基已经完全溶解, 这时候需要注意反复倒置轻摇玻璃瓶20次, 使里面的液态培养基充分均匀透明。
2.3 矫正p H值
培养基配方要求的p H值为灭菌或者消毒后的p H值, 即培养基使用前的p H值[2]。把玻璃瓶转移到无菌操作台或者生物安全柜中, 缓慢的打开瓶塞, 用试验室p H计进行测量, 然后用无菌的1mol/L Na OH或1mol/L HCl矫正。
2.4 分装
待矫正后的培养基冷却至50℃左右就可以在无菌操作台或生物安全柜中向培养皿中倾倒培养基了。倒入培养皿中的液态培养基要全部自然覆盖培养皿的底部, 厚度为3~5mm。
2.5 检定
每批培养基平板制成后须经检定方可使用, 新制成的平板培养基, 含水量较多, 不利于药敏试验, 应将冷却凝固后的平皿倒扣搁置于37℃恒温培养箱中, 培养24h。24h后培养基平板没有长菌才可以使用。
2.6 保存
检定合格的培养基要转移到无菌湿盒中保存, 正面朝上摆放, 然后一起放入2~8℃冰箱里保存。
3 大肠杆菌药敏试验
在禽病门诊采取10户10只大肠杆菌病鸡的肝脏, 每份肝脏分别涂抹A、B培养基平板, 贴上同样的药敏片, 进行37℃培养24h。观察A、B平板大肠杆菌生长情况。观察同类型药敏片在A、B平板上的抑菌效果。
4 结果
4.1 新方法制作的培养基
新方法制作的培养基淡茶色透明, 质地均匀, 无絮状物或沉淀。药敏试验中培养基平板软硬度适中不易划破。细菌生长方面与传统方法制作的培养基相比较无明显差异。
4.2 大肠杆菌药敏试验结果
两种方法制备的培养基均能让大肠杆菌正常生长, 并且不同的药敏片在A、B两种培养基平板上的抑菌效果差别不明显, 见附表。
5 讨论
本文通过培养基平板药敏试验检验了培养基制备新方法的可行性, 从而证明在普通营养琼脂培养基制备方法可以运用该新方法。培养基制备新方法较传统方法有九处优点, 一是缩短了制备时间;二是减少了制备器材 (电炉、石棉网等) ;三是有效防止加热溶解过程中的烧焦和外溢事故;四是缩短了高温时间, 减少了高温过程对培养基的营养破坏;五是可以批量制备, 不像传统方法一次只能加热溶解一个烧杯;六是实现了仪器标准化, 不会因人的技能水平差异或者个人行为的偶然性而导致不同批次的培养基质量差异;七是防止水分散失导致浓度变化;八是节省能源;九是防止电炉引起的烫伤甚至火灾。
参考文献
[1]刘荣华.微生物检测中培养基的制备及注意事项[J].当代临床医刊, 2015 (1) :1236.
[2]马莉.浅谈微生物试验室培养基制备[J].现代测量与试验室管理, 2011 (3) :35-36.
培养制备 篇2
1 硫乙醇酸盐液体培养基的制备和保存
1.1 硫乙醇酸盐液体培养基的成分及作用
硫乙醇酸盐液体培养基所含成分有胰酪蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化钠、L-胱氨酸、硫乙醇酸钠、0.075%的琼脂、刃天青等, 其中胰酪蛋白胨、酵母浸出粉提供氮源以及供合成蛋白质必须的各种氨基酸和生长因子, 葡萄糖提供碳源及能源, 氯化钠维持均衡的渗透压, 胱氨酸、硫乙醇酸钠、葡萄糖均可降低氧化还原电位的作用, 防止过氧化物的积累对某些细菌产生毒性, 有利于厌氧菌生长。另外, 硫乙醇酸盐有钝化含砷和汞类药物及其金属防腐剂的有害作用;刃天青作为氧化还原的指示剂, 氧化时呈红色, 以此指示培养基的氧化还原电位pH值3.8 (橙) ~6.5 (深紫) 。琼脂可以防止液体对流, 即防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散, 有利于厌氧环境的形成, 就是所谓的分层。
1.2 硫乙醇酸盐液体培养基的购买
购买成品培养基时, 供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告, 报告内容包括培养基的p H值、无菌检查结果和促菌生长 (灵敏的) 试验结果等项目。同时应注意培养基有效期。对买来的培养基进行质量监控, 确定检验所用培养基符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。
1.3 制备过程中的注意事项
1.3.1 培养基的水化
培养基水化时不得用铜锅或铁锅, 以防有离子混入培养基中, 影响微生物的生长。配制培养基最好用的溶剂是纯化水, 不能含有任何可能抑制或者影响微生物生长的物质。
1.3.2 培养基的溶解
在培养基分装灭菌前, 各成分应溶解均匀, 使用电炉等设备煮沸培养基时, 应用小火加热, 并边加热边搅拌, 避免培养基焦化或爆沸溢出。
1.3.3 pH值测试
微生物的生长繁殖除需要一定的营养物质以外, 还要求适当的pH值范围。所以在分装前需对培养基的pH值进行测试。如果测试值与预期值相差0.2单位以上, 则需要酸碱调节。一般灭菌后比灭菌前pH值低0.2~0.3, 所以灭菌前pH值要调高0.2~0.3。
1.3.4 培养基的分装
溶解好的培养基应分装到干燥洁净灭菌处理过的玻璃容器中, 定量分装。
1.3.5 培养基的灭菌
已配置好的培养基必须立即进行高压灭菌, 以免杂菌生长。灭菌时必须严格控制灭菌温度和时间, 以免破坏营养成分和pH值。
1.3.6 培养基的保温
灭菌以后培养基应该迅速冷却至保存温度, 避免长时间保存在灭菌锅内, 造成过度灭菌, 影响培养基的营养成分或选择性效果。
1.4 培养基的保存
(1) 培养基应保存在2~25℃避光的环境, 一般在3周内使用。
(2) 配置好的培养基, 使用时应遵循先入先出的原则;用前应尽量避免反复加热, 多次的加热会使营养成分被破坏。凡受过污染、长过细菌的培养基, 不得滤净后作灭菌使用。
(3) 建立培养基制作、使用、回收记录。
2 硫乙醇酸盐液体培养基的质量控制
2.1 物理性状检验
使用时应检查培养基的物理性状, 培养基上部约1/4处呈现淡红色的可以使用, 若淡红色部分超过1/5高度时, 应将培养基用100℃水浴加热至粉红色消失, 迅速冷却至45℃以下, 且驱氧加热只限1次。若全管呈现淡红色时, 不得再使用。
2.2 杂菌检验
将制备好的硫乙醇酸盐液体培养基随机取10只, 5只一组, 分别在37℃、25℃下恒温培养5 d, 观察是否有杂菌生长, 以检验是否灭菌彻底。
2.3 灵敏度检验
培养基的灵敏度是决定产品无菌检验结果最关键的一项, 中华人民共和国兽药典2010年版规定的硫乙醇酸盐液体培养基灵敏度检验菌种为需氧菌金黄色葡萄球菌 (CVCC2086株) 、铜绿假单孢菌 (CVCC2000株) 和厌氧菌生孢梭菌 (CVCC1180株) 。
培养制备 篇3
1材料
1. 1病毒株
H9亚型禽流感病毒流行毒株共3株: WD98株, 由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室于1998年从河北省望都县分离、纯化及鉴定,毒株代号为A/Chicken/Hebei/WD/98 ( H9N2) 株,简称WD98株; ZD04株,由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室于2004年从河北省正定县分离、纯化及鉴定,毒株代号为A/Chicken/Hebei/ZD/ 04( H9N2) 株,简称ZD04株; HN04株,由河南农业大学王泽霖教授赠送,毒株代号为A/Chicken/ Henan / HN /04( H9N2) 株,简称HN04株。
3株毒株分别作为鸡胚繁殖抗原和悬浮培养制备疫苗抗原的种毒,同时也用作免疫攻毒试验的毒株。
1. 2试验鸡
21日龄SPF鸡,购自北京实验动物中心。
1. 3鸡胚
SPF鸡胚,自北京实验动物中心购入SPF鸡种蛋,在北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室孵化至10日龄,用于毒种繁殖、毒价测定及攻毒后的病毒分离试验; 非免疫鸡胚,自北京蓝风家禽养殖有限公司购人非免疫鸡种蛋,在北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室孵化至10日龄,用于鸡胚尿囊液抗原液的制备。
1. 4 MDCK细胞
MDCK细胞,购自中国兽医药品监察所,由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室传代至76 ~79代,用于悬浮培养制备疫苗抗原的细胞基质。
2方法
2. 1抗原的制备和检测
分别取WD98株、ZD04株、HN04株接种10日龄非免疫鸡胚,收获24 ~120 h内死亡鸡胚的尿囊液和120小时时活胚尿囊液,测定HA效价和鸡胚半数感染量( EID50) ,收获的3种抗原用于鸡胚尿囊液病毒抗原疫苗的制备; 分别取WD98株、ZD04株、HN04株在MDCK细胞上传3代后的毒种,接种在生物反应器中微载体悬浮培养的MDCK细胞,根据病变情况收获72 h培养液,测定HA效价和EID50,收获的3种抗原用于悬浮培养抗原疫苗的制备。
2. 2疫苗的制备
分别取3株毒株的鸡胚尿囊液抗原,加入终浓度为2 mL/L的甲醛溶液,置37 ℃ 恒温摇床内灭活24 h; 另外,分别取在生物反应器中微载体悬浮培养的MDCK细胞制备的悬浮培养抗原液,加入终浓度为2 mL/L的甲醛溶液,置37 ℃ 恒温摇床内灭活24 h。6种抗原液经灭活检验合格后,以吐温80及司本80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成油包水型的6种灭活疫苗,油相与水相比例为2∶1。
2. 3免疫试验
将80只21日龄SPF鸡分成10组: 第1 ~6组为免疫组,每组10只,其中1 ~ 3组分别经颈背侧皮下注射H9亚型禽流感病毒WD98株、ZD04株、HN04株鸡胚抗原制备的灭活疫苗,4 ~ 6组分别经颈背侧皮下注射利用MDCK细胞悬浮培养得到的H9亚型禽流感病毒WD98株、ZD04株、HN04株抗原制备的灭活疫苗,免疫剂量均为0. 3 mL/只; 第7 ~9组为攻毒对照组,每组5只,分别用于H9亚型禽流感病毒WD98株、ZD04株、HN04株的攻毒试验; 第10组为健康对照组,5只。
2. 4攻毒试验
1 ~ 6组SPF鸡免疫后21天时采血测定HI抗体效价,采血后免疫组1,4,7组采用静脉注射攻击10倍稀释的WD98株强毒,0. 5 mL / 只,滴鼻点眼攻击10倍稀释的WD98株强毒,0. 2 mL/只; 2,5,8组采用静脉注射攻击10倍稀释的ZD04株强毒, 0. 5 mL / 只; 3,6,9组采用静脉注射攻击10倍稀释的HN04株强毒,0. 5 mL / 只; 第10组5只鸡为健康对照组,不免疫不攻毒。
2. 5血清HI抗体效价的测定
免疫后21天采血,分离血清,分别使用3种H9亚型禽流感病毒抗原测定SPF鸡的HI抗体效价。
2.6病毒分离试验
攻毒后第5天,采集泄殖腔拭子及咽拭子,分别放入装有1 mL PBS液( 含1万IU/mL青霉素、链霉素双抗,pH值调至7. 2) 的Eppendorf管中,用漩涡振荡器混匀后,3 000 r/min离心5 min; 将同一只鸡的泄殖腔拭子与咽拭子的上清液混合作为1个样品,立即接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔,每个样品接种5枚,接种剂量为0. 2 mL/枚。接种后定期照蛋,及时取出死亡鸡胚,收获尿囊液,测定其HA效价; 至120小时时,取出所有活胚,收获活胚尿囊液,分别测其HA效价。如果一个样品接种的5枚鸡胚中有1枚鸡胚尿囊液HA效价≥4 lb,该样品判为病毒分离阳性; 如果接种样品的5枚鸡胚均为HA阴性,将这5枚鸡胚的尿囊液混合后,再接种5枚10日龄SPF鸡胚进行盲传,最终确定样品病毒分离试验结果。
3结果与分析
3. 1抗原液毒价的测定( 结果见表1)
由表1可知,3株H9亚型禽流感病毒分离株利用鸡胚和悬浮培养制备的抗原液的病毒含量基本相同,HA效价分别为7 ~ 9 lb,EID50为1 × 106. 9 ～ 7. 9 EID50/ mL。
悬浮培养的细胞毒抗原为培养72 h的抗原,鸡胚尿囊液抗原为培养24 ~ 120 h内死亡鸡胚和120小时时存活鸡胚尿囊液的混合液。悬浮培养病毒液的效价与相应的鸡胚源病毒液HA效价无明显差异, 无规律性。WD98株细胞培养的抗原液EID50稍高于鸡胚培养的抗原液,而ZD04株、HN04株细胞培养的抗原液EID50稍低于鸡胚培养的抗原液。
3. 2 6种疫苗免疫SPF鸡后21天HI抗体效价的测定( 结果见表2)
由表2可知: 不同培养方法制备出的6种灭活疫苗免疫SPF鸡21 d后,HI抗体效价均明显上升,达到3. 5 ~9. 3 lb; 其中鸡胚尿囊液制备的疫苗HI抗体效价均高于MDCK细胞制备的疫苗抗体效价; 同一毒株制备的灭活苗免疫组鸡的血清样品采用不同毒株作为工作抗原进行HI抗体效价测定时,其HI抗体效价在多数情况下存在一定差异,其中采用WD98株作为工作抗原检测ZD04株免疫鸡21天的抗体水平时,差异最大,鸡胚毒抗原制备的疫苗抗体水平较细胞毒抗原制备的疫苗抗体效价高2. 7 lb。
lb
注: 第7 ~10组未检测到抗体。
3. 3攻毒试验结果
21日龄SPF鸡免疫后,第21天使用3种H9亚型禽流感病毒株攻毒,第5天采集咽拭子和泄殖腔拭子,采集的拭子混合后接种10日龄SPF鸡胚,进行攻毒试验,结果见表3 。
由表3可知,使用与制苗毒株同源的病毒对SPF鸡进行攻毒,无论是使用鸡胚尿囊液抗原制备的疫苗还是使用悬浮培养抗原制备的疫苗,均可以使SPF鸡得到很好保护,两者无差异。
在病毒分离试验中,如果同一组的5枚鸡胚病毒检测均为HA阴性,则无菌收集同一组阴性鸡胚的尿囊液,混合后盲传,每个样品同样接种5枚鸡胚进行盲传,测定病毒分离情况,结果显示均为阴性。
4讨论
3株H9亚型禽流感病毒分离株鸡胚培养和MD- CK细胞悬浮培养制备的抗原液的病毒含量基本相同,病毒HA效价分别为7 ~ 9 lb,鸡胚EID50为1 × 106. 9 ～ 7. 9EID50/0. 1 mL,证明两种方法均可用于制备抗原液。
以3株毒株分别用两种方法培养的抗原制备的6种灭活疫苗免疫SPF鸡21 d后,HI抗体效价达到3. 5 ~ 9. 3 lb。鸡胚尿囊液制备的疫苗HI抗体效价均稍高于MDCK细胞悬浮培养制备的疫苗,推测可能原因是: 第一,尽管免疫剂量相同,但每羽份的抗原含量不同; 第二,测定HI抗体效价时采用的是鸡胚毒,而不是细胞毒。
采用异源毒株作为工作抗原进行HI抗体效价测定时,其HI抗体效价存在一定差异,差异范围最大为2. 7 lb,这与姜北宇等[9]的研究结果相同。病毒分离试验证明,两种方法制备的抗原在攻毒保护率上没有任何差异,说明悬浮培养制备的抗原液可以用于制备低毒力禽流感疫苗。本研究结果为探讨禽流感疫苗的制备提供了新途径,采用悬浮培养可大大降低鸡胚用量,并且可降低处理废弃带毒鸡胚给环境造成的生物安全危害。
摘要：为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。