检测板法

检测板法（共4篇）

检测板法 篇1

1材料与方法

1.1试验材料

鸡新城疫血凝抑制试验抗原、阳性血清、阴性血清,购自青岛易邦生物工程有限公司[1,2,3,4,5,6,7,8];新城疫抗体快速检测卡,购自某生物科技有限公司;待检血清40份(每份3~4 m L,分离血清置-20℃条件下备用),来源于福州永泰、闽清、连江、闽侯、罗源等5个县,均从消毒过的翅静脉采集。

1.2试验方法

参照《新城疫诊断技术(GBT 16550-2008)》,具体如下。

1.2.1 HI试验方法。采用微量血凝抑制试验。具体包括:①1%红细胞制备。采取3只无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液,放入离心管中,加入PBS(4倍体积)混匀,2 000 r/min条件下离心8 min,将血浆和白细胞层去掉,重复以上过程,反复洗涤3次,最后吸取压积红细胞用生理盐水(或PBS)配成1%悬液,保存在4℃条件下,待用。②HA试验。取96孔V形微量反应板,用微量移液器吸取0.025 m L/孔PBS加在1~12孔。在第1孔中加入0.025 m L病毒悬液,吹打3次并充分混匀。将第1孔中混匀后的病毒液吸取0.025m L加到第2孔[3,4,5],混匀,再吸取第2孔的混匀液0.025 m L加入到第3孔,依次倍比稀释到第11孔,最后从第11孔吸取0.025 m L弃之,第12孔设为PBS对照。再加PBS 0.025m L/孔。加入1%鸡红细胞悬液0.025 m L/孔。振荡混匀反应混合液,20~25℃下静置40 min后观察结果。如果环境温度太高,放置于4℃条件下静置60 min,PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果[3,4]。③四单位抗原的配置。以血凝试验正确结果判定,以完全凝集的病原最大稀释度的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)配置四单位抗原。④HI试验。根据血凝试验结果配置4个血凝单位(4HAU)抗原,以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位,4HAU的配置方法如下[3,5,6,7]:假设抗原的血凝滴度为1∶256,则4HAU抗原的稀释倍数是1∶64。稀释时,取抗原1 m L加到63 m LPBS中即为4HAU抗原。取96孔V形微量反应板用移液器在第1孔~第11孔各加入PBS0.025 m L。第12孔加入PBS 0.05 m L。在第1孔加入待检血清0.025 m L,充分混匀后移出0.025 m L至第2孔,依次类推,倍比稀释至第10孔,第10孔弃去0.025 m L,第11孔为阳性对照,第12孔为PBS对照[3]。在第1孔~第11孔各加入0.025 m L含4HAU抗原,轻叩反应板,使反应物混合均匀,20~25℃条件下静置不少于30 min,4℃条件下静置不少于60 min。加入1%红细胞悬液0.025 m L/孔,轻晃摇匀后,20~25℃条件下静置约40 min,如果环境温度太高,在4℃条件下静置60 min[4,5,6,7],当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。

1.2.2快速检测法检验方法。具体包括:①采血0.5~1.0m L,1 000转/min,离心3 min分离血清。也可4℃静置过夜,使血清自然析出。②在检测卡的加样孔内加入1滴待检血液样品。③用装有稀释液的滴瓶滴加2滴稀释液到加样孔。④等待10 min判断结果,15 min后的结果无效。

1.3待检样品的检测

利用2种方法对40份HI滴度不同的样品(其中27份阳性血清样品和13份阴性血清样品)进行检测,并进行相关性分析。

2结果与分析

HI法检测为阳性的鸭血清样品中检测板法的阳性检出率为二者的阳性符合率[3],HI法检测为阴性的鸭血清样品中检测板法的阴性检出率为二者的阴性符合率,2种检测方法同为阴性或阳性的血清样品数占总检测样品数的比率为二者的总体符合率。

按照新城疫病毒抗体快速检测卡说明书,用检测板方法与HI法分别对40份常规血清样品进行检测,结果如表1所示。可以看出,检测板和HI 2种方法的阳性符合率为92.59%,阴性符合率为84.62%,阴阳性总体符合率90%(36/40)。

由表2可以看出,检测板的敏感滴度在5~6之间,抗体滴度4和5为临界点滴度4为阴性,滴度5为阳性。

注:抗体滴度≥4判定为阳性。

3结论与讨论

本文采用检测板法和血凝抑制试验(HI)对福州永泰、闽清、连江、闽侯、罗源等5个县种鸭的40份散鸭血清检测了新城疫抗体,检测显示各鸭场的抗体水平不尽相同。研究得出检测板法和HI法2种方法检测ND抗体效价的符合率较高,阳性符合率、阴性符合率分别为92.59%、84.62%,总体符合率为90%,表明这2种检测方法有一定相关性,这与陈福勇等[1]、张国中[2]等用ELISA、间接ELISA和HI方法测定ND抗体的符合率有一定的差距,这与ELISA、间接ELISA比HI敏感有关。检测板的敏感滴度在5~6之间,这样的抗体滴度水平在临床上还具有一定的保护力,可为生产上的ND免疫接种提供参考,同时因为检测板法的局限性,检测卡仅供筛查,所以在临床上不作为确诊的依据。

综上所述,检测板快速诊断技术,不需要特殊设备和试剂,方便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观[3,4],可保存试验结果等,大有取代传统ELISA等检测方法的趋势,广泛适应于兽医诊断。对中小规模养殖户来说,掌握检测板快速诊断技术,可以快速检测鸭新城疫抗体,实时监测本场鸭新城疫病免疫状况。

参考文献

[1]陈福勇,吴玉萍,曹红,等.间接ELISA法与HI法检测鸡新城疫抗体相关性[J].动物医学进展,2004,25(3):88-90.

[2]张国中,胡旭东,秦春芝,等.间接ELISA与HI检测鸡新城疫病毒抗体的相关性分析[J].中国家禽,2007(4):14-16.

[3]赵森.中药制剂“毒瘟清”对白羽肉鸡和海兰褐壳蛋鸡生产性能及免疫功能的影响[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2013.

[4]姚春阳.应用沈氏免疫增强剂拮抗氟苯尼考对鸡免疫抑制作用的研究[D].长春:吉林大学,2013.

[5]宋倩倩.犬H5N2亚型流感病毒的致病和传播特性实验研究[D].泰安:山东农业大学,2013.

[6]雷莉辉,乔立东,关文怡,等.ELISA法与HI法检测鸡新城疫抗体的比较[J].山东畜牧兽医,2014(4):9.

[7]李芳.鹿寨县布鲁氏菌病的监测结果简报[J].广西畜牧兽医,2012(1):56.

[8]范志刚.商品代白羽肉鸡母源抗体消长水平的检测[J].新疆畜牧业,2010(9):27-29.

铰接板法计算桥梁荷载 篇2

由于施工的特点,构造设计的不同,钢筋混凝土和预应力混凝土梁式桥可能采用不同类型的横向结构。为使荷载横向分布的计算能更好适用各种类型的结构特性,则需要按不同的横向结构简化模型来计算。目前常采用的几种横向分布计算方法有:杠杆原理法、偏心压力法、横向铰接板法、横向刚接梁法和比拟正交异性板法。对于现浇混凝土纵向企口缝连接的装配式板桥及仅在翼缘板间用焊接钢板或伸出交叉钢筋连接的无中间横隔梁的装配式桥,因为块件间横向具有连接构造,但其连接刚性较薄弱。对于此类问题拟定了横向铰接板现浇理论来计算荷载横向分布系数。

1 计算原理

正文各层次标题一律用阿拉伯数字连续编码,并左顶格书写,序码之后空一个汉字间距接写标题,如下列格式所示。

1.1 基本思想

铰接板法是计算梁桥主梁荷载横向分布的方法之一。它属于梁系法的范畴,把桥跨结构从纵向沿主梁连接处切开,划分为各个主梁单元,而横梁的抗弯刚度则均摊在桥面上,主梁间用混凝土铰缝连在一起的桥面系。各主梁单元间只能传递剪力而不能传递弯矩。翼缘板的连接处切开以后,每个切口处有一个主要赘余力即剪力,从而取得基本结构,由力法求解。

1.2 基本假定

把桥梁跨中的实际车辆荷载用半波正弦荷载undefined代替。为方便研究荷载横向分布,设p0 =1直接采用单位正弦荷载并在跨中取单位长度来分析。各根板梁的挠曲线将是半波正弦曲线,它们所分配到的荷载也具有不同峰值的半波正弦荷载。

1.3 公式推导

对于具有n条板梁组成的桥梁,具有(n-1)条铰缝。荷载p=1作用在第i块板梁上,节点处只有剪力gk,将每一铰缝切开形成基本体系,利用两相邻板块在铰接缝处的竖向相对位移为零的变形协调条件求解。

对于图1的基本体系,可以列出(n-1)个正则方程,可由下式表达。

δk,k·gk+δk,k+1·gk+Δkp=0 k=1 (1)

δk,k-1·gk-1+δk,k·gk+δk,k+1·gk+1+Δkp=0

k=2,…,n-2 (2)

δk,k-1·gk-1+δk,k·gk+Δkp=0 k=n-1 (3)

式中 δk,k-1,δk,k,δk,k+1为柔度系数,即为铰接缝;

k为内力作用单位正弦铰接力,在铰接;

k为处引起的竖向相对位移;

Δkp为外荷载p=1在铰接缝k引起的竖向位移。

由此可知正则方程的矩阵形式:

[δ]{g}+{Δ}=0 (4)

(1)计算正则方程的系数。

取代表梁板上左边铰缝内作用单位正弦铰接力的典型情况分析。由于横向板近乎刚性,偏心的单位正弦铰接力可以用一个中心作用荷载和一个正弦分布扭矩代替,如图2。

设中心作用荷载在板跨中央产生的挠度ω,扭矩引起的跨中扭转角ϕ。由此板左侧产生的总挠度为ω+b/2·ϕ,右侧产生的挠度为ω-b/2·ϕ。ω,ϕ可有undefined和undefined计算得出,式中:E,G分别为结构材料的弹性模量和剪切模量;I,Ip分别为板的抗弯惯矩和抗扭惯矩。

由“力法”知识可以求出p=1作用下在第i号板上时相应的柔度系数。

δ11=δ22=…δkk=…=δn-1,n-1=2(ω+b/2·ϕ)

δ12=δ23=…δk,k-1=δk,k+1=…=δn,n-1=-(ω-b/2·ϕ)

由此得到柔度系数矩阵[δ]。

由图3计算系数{Δ}。

undefined

注:当i=1时,无Δi-1项;

当i=n-1时,无Δi项。

(2)计算竖向荷载。

由图1,根据力的平衡原理,可得出分配到各版块的竖向荷载峰值pij,即为

undefined

2 结 论

检测板法 篇3

1.1 仪器

STAR全自动加样处理机, KUBOTA-4000平板离心机, 上海无相微型振荡器, 帝肯SUNRISE酶标仪, ITWELL实验室软件, 96孔U型板, 手工加样器。

1.2 试剂

国家批准使用的反定血型试剂 (上海血液生物医药有限责任公司-国食药监械准字2011第3400169号) 。

1.3 操作方法

1.3.1 加样品 (STAR加样)

1.3.1.1在STAR软件上添加了XF1-48、XF49-96、O细胞检测加样程序的编辑, 包括板的布局SA、SB位置从上到下重复一次的液体SAMPLE的加样, 编号分别为1-48、49-96、1-96, 加样量设定为40μl (血清和血球试剂) , 无预稀释液体的加入, 无对照空加入, 质控手工加入。

1.3.1.2进行加样通道1000μl容量的核查, 保证AB、O三种血球凝集实验所需标本量的添加在整个1000μl允许范围内。

1.3.1.3定义实验微板顺序, 分别将反定型三块微板定义为XF年月日01、XF年月日02、XF年月日03。

1.3.2加试剂

用手工加样器在第一、第二 (1-48、49-96) 块板上手工加入等量的A、B血球试剂, 在第三 (1-96) 块板上手工加入等量的O血球试剂。

1.3.3离心

KUBOTA-4000离心机有试管和微板两种离心轴, 在进行此种血型操作时需要用微板离心轴进行血型微板的离心。KUBOTA-4000离心机设定1000转/min, 离心时间为2min。血型微板要加盖后进行离心以防止外溅。

1.3.4振荡

振荡悬浮温度37℃, 1000r/min, 振荡2min取出静置5~10min。

1.3.5 判读

借助ITSWELL实验室软件进行判读。读取规则为主波长620nm;振动强度为弱;振动时间为1秒;4.3.4.5临界值公式:A球=0.8, B球=0.8;临界值A球=0.8, B球=0.8;表达式阳性 (+) , 阴性 (-) , 灰区或无效。

2 结果

试验具体结果见实验记录见表1。

此检测方法实现了自动化加样, 避免了人为差错的发生, 同时实现了仪器判读结果, 保存了原始质料;此方法尤其适合批量标本处理, 节省了操作时间;满足实验室要求, 符合确认标准;在此方法实际应用过程中0090913005199的标本一例正反定型不符, 正定型结果为O型, 经肉眼观察AB两侧均无凝集。反定型判读结果为AB型, 经肉眼观察AB两侧均无凝集。

3 处理

疑为该标本正反定型不符, 于是同时进行微板及纸片和试管三种方式同时手工复核, 结果反定型仍为AB型, 报省血液中心血型参比实验室检测, 反定型结果判定为O型。

4 讨论

根据卫生部关于印发《血站技术操作规程 (2012版) 》的通知中明确规定卫医政发[2012]1号4.11.2血型检测方法:血型筛查常用方法有平板法和微板法、血型鉴定常用试管法和微板法。按照试剂说明书和《全国临床检验操作规程》 (第3版) 的规定进行具体操作和质量控制。附录E提供了建立微板法, 可供实验室自行建立微板法时参考。

若出现2.4情况可从以下方面进行原因的排查。首先是操作者, 是否有操作不当的环节造成结果的偏差。其次是机器, 运行是否正常, 是否在有效的校准期内。第三是物料, 试剂是否在有效期内, 试剂的保存是否符合要求, 微板是否刷洗干净, 在微孔板内是否有少量残留的水蒸气, 提供用于判读的微板厂家是否具有相应的资质, 其产品是否合格。第四是操作方法, 是否存在缺陷。最后是实验环境, 温度、湿度是否达到相应的要求。从上述的人、机、法、环都满足实验要求的情况下, 最有可能导致问题出现的原因则是物料。而在物料中, 微板厂家具有相应资质, 微板涮洗洁净并进行了干燥处理, 最有可能导致问题出现的原因则是反定型试剂在有效期末 (购置的反定型试剂有效期为2个月) , 造成部分反定型试剂的血球出现离心后溶血现象。

由此可得到结论, 本室使用的反定型鉴定方法是标准方法, 可以常规用于血液检测。出现血型正反定型不符时, 从上述方面找出原因, 尤其在试剂使用有效期末, 可手工配制血球试剂或有新批号血球试剂进行比对实验, 以减免类似差错的发生。

摘要：保证反定型微板法在实际工作中顺利进行, 并不断总结出血型误判的原因, 以便在血型鉴定中引起重视, 保证检测结果准确判读, 提高输血安全系数。

关键词：反定型,微板法,血型误判,血型鉴定

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部.血站技术操作规程·卫医政发 (2012) 1号[S].北京, 2012.

检测板法 篇4

叶酸常用的检测方法有比色法[4]、薄层层析法[5]、同位素放射免疫法[6]、色谱法[7]、微生物法等[8,9]。在我国的食品标准中,微生物法是检测食品中叶酸含量的主要方法。尤其是在传统的微生物法基础上微量化和简便化发展的微孔板法备受青睐[10]。但是由于乳粉的基质比较复杂,使用微孔板法进行叶酸检验时,前处理条件对实验结果的影响显著。本文通过考察微孔板法中提取温度、提取时间和离心转速等前处理条件对实验结果的影响,寻找最优的前处理条件,以利于保证测定结果准确可靠。

仪器与试剂仪器电子天平(梅特勒PL2002)、酶标仪(Multiskan Mk3型)、生化培养箱(PHX-330H)、数显恒温水浴锅(HH-4)、p H计(Mettler Toledo FE20)、台式高速冷冻离心机(湘仪H1850R)。

试剂包被有鼠李糖杆菌的微孔板、叶酸培养基、叶酸标准品、叶酸缓冲液、无菌水。以上试剂均来自Vita Fast Folic Acid定量检测试剂盒

磷酸盐缓冲液(0.05mol/L,p H7.2):将7.8g磷酸二氢钠(广州化学试剂厂)加入1L去离子水中,调节p H至7.2,缓冲液需要当天制备。

实验样品含定量叶酸的标准乳粉(中国检验检疫科学研究院测试评价中心),该乳粉标称含量为:126.0μg/100g。

实验方法标准曲线配制以无菌水为稀释液,按表1方法配置标准曲线溶液。

注:标准曲线中已经包含样品乳粉提取液在无菌离心管中加入离子水溶解的稀释倍数(1:40)。

单因素试验方法提取温度。准确称取1.0000g±0.0005g样品,将其加入50m L无菌离心管中,加入30m L磷酸盐缓冲液,混匀,再用磷酸盐缓冲液补至40m L。分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中提取30min,前3min每1min混匀一次,后每5min混匀一次(确保离心管密封),快速冷却至30℃以下。在10000r/min下离心15min,然后在1.2m L无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

提取时间。准确称取1.0000g±0.0005g样品,将其加入50m L无菌离心管中,加入30m L磷酸盐缓冲液,混匀,再用磷酸盐缓冲液补至40m L。分别在100℃水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min,前3min每1min混匀一次,后每5min混匀一次(确保离心管密封),快速冷却至30℃以下。在10000r/min下离心15min,然后在1.2m L无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

离心转速。准确称取1.0000g±0.0005g样品,将其加入50m L无菌离心管中,加入30m L磷酸盐缓冲液,混匀,再用磷酸盐缓冲液补至40m L。在100℃水浴中提取30min,前3min每1min混匀一次,后每5min混匀一次(确保离心管密封),然后快速冷却至30℃以下。分别在4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min、12000r/min下离心15min,然后在1.2m L无菌深孔板中对上清液进一步稀释。

检测方法在包被有鼠李糖杆菌的微孔板中加入叶酸培养基150μL,摇晃微孔板,使包被菌充分溶解在培养基中,再加入150μL标准曲线溶液或待测样品,每样3孔,作3次平行,用粘合箔盖住微孔条,用手将粘合箔平压,使其充分封闭微孔板条,保证粘合箔和微孔的封闭性。37℃避光孵育48h。充分混匀培养物,使用酶标仪在波长为630nm下测量OD值。以3孔OD值的平均值为该样品的OD值,代入标准曲线计算得出该样品的叶酸含量。取3次平行的结果为该处理方法的最终结果。计算其与标示值的绝对差值△x,△x越小,表明结果越接近真值,该处理方式较合理。

结果与讨论标准曲线以叶酸含量为横坐标,OD值为纵坐标,采用4次多项式回归的方法,得到标准曲线如图1所示。相关系数R2=0.9981,线性关系良好。

提取温度在不同温度下提取叶酸30min,10000r/min离心处理后,所得叶酸结果如表3所示。从结果可以看出,随着提取温度的升高,△x也减小,水浴温度达到沸水浴(100℃)时,△x最小,提示沸水浴可能是最适合的水浴条件。

提取时间在沸水浴中以不同时间提取叶酸,然后经10000r/min离心处理后,所得叶酸结果如表4所示。实验结果表明,随着提取时间的延长,△x减小,在10min至30min间下降明显,30min后,△x下降趋缓。说明在沸水浴,离心转速10000r/min下,水浴处理30min以上即可获得较理想的实验效果。

离心转速在100℃下水浴30min后,以不同的离心转速处理样品液,所得叶酸结果如表5所示。实验结果表明,随着离心转速的提高,△x减小,在4000r/min到10000r/min间降幅明显,转速超过10000r/min后,△x基本不变,说明离心转速越高,越有利于叶酸的检测。

从整体来看,无论采用哪种处理条件,用微孔板法测定乳粉中的叶酸含量,△x均为正数,即检测结果偏高。其可能原因是微孔板法测定乳粉中叶酸含量的实质是比浊测定,利用的是叶酸作为鼠李糖杆菌生长的必需营养素,鼠李糖杆菌生长繁殖速度与叶酸含量成正相关,表现为体系的浊度与叶酸含量成正相关的关系[11]。乳粉溶液是一种复杂的胶体分散体系,无机盐在水中以溶解状态存在,蛋白质以胶体状态悬浮在溶液中,脂肪形成乳浊液分散于乳中[12]。因此乳粉溶液本身存在较强的基质干扰。消除基质干扰的主要方法是沉淀体系中的大分子尤其是蛋白质等。温度提高和离心速率的提高都有利于体系中乳蛋白的沉淀[13]。此外,叶酸溶于热水有一交换平衡过程,本实验结果表明,40m L反应体积大约需时为30min,30min后该交换基本达到平衡。离心转速的提高不仅可以进一步沉淀蛋白质等物质,还能使脂肪等成分上浮,脱离牛奶本体,使离心后的清液更接近于溶液,让培养后的OD值更直观地表现为微生物的生长情况。