重组病毒载体

重组病毒载体（共7篇）

重组病毒载体 篇1

近年来,疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡,特别是重组病毒载体疫苗的研制,越来越引起人们的广泛关注。重组病毒载体疫苗的种类有很多,如痘病毒活载体疫苗、腺病毒载体疫苗、反转录病毒载体疫苗、不分节段的单股RNA病毒载体疫苗等。这些病毒载体因病毒基因组的复制特点和病毒生物学特性的不同,而适合于不同动物和人类疾病的预防与治疗。

1 痘病毒活载体疫苗

自1982年M.Mackett等[1]用牛痘病毒为载体表达外源基因以来,人们一直在从事重组病毒活载体疫苗的研究。后来B.Moss[2]的实验室完成了标记基因重组痘苗病毒的拯救,使这一即将退出历史舞台的病毒又重新受到科研人员的重视,并成为第一个被广泛用于外源基因表达的载体,但是由于痘苗病毒本身安全性的原因,除了表达伪狂犬病病毒g B基因的重组痘苗病毒曾于20世纪90年代中期获准在欧美国家的野生动物中使用外,其他重组痘苗病毒还处于理论研究阶段,尚未用于动物和人类疾病的预防,但痘苗病毒载体的构建及其分子生物学的研究为其他痘病毒载体的构建提供了丰富的经验。

20世纪80年代后期,人们开始倾向于研究具有宿主特异性的痘病毒载体。禽痘病毒具有严格的宿主范围,可携带较大的外源基因,在哺乳动物体内诱发保护性免疫应答,使得禽痘病毒载体(PFV)的研究越来越受到人们的重视。研究人员把各种禽类病毒的保护性抗原基因,如禽流感病毒(AIV)的HA基因和NP基因、传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因、新城疫病毒(NDV)的HN基因和F基因、马立克病毒(MDV)的g B基因和g C基因、传染性支气管炎病毒(IBV)的S1基因以及脾坏死型禽网状内皮组织增殖症病毒(SNV)的env基因等插入到PFV载体中[3]。1990年,表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒在美国注册;1994年,美国批准生产表达新城疫病毒HN蛋白和F蛋白基因的重组疫苗,这是第一个商业化的活载体疫苗;1995年,美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAX FP-N的商品化。Merial是全球首家研发出表达禽流感H5亚型HA蛋白的禽痘载体疫苗(TROVAC AI H5)的公司,该疫苗在1998年已通过美国农业部(USDA)的认证,而且在墨西哥、萨尔瓦多和危地马拉已卖出超过10亿份的剂量,用于控制高致病性禽流感H5亚型的传播。其他禽类病毒的痘病毒活载体疫苗还处于理论研究状态,尚未见到商品化应用。

由于禽痘病毒在哺乳动物体内产生一过性感染,并能够表达外源蛋白产生保护力,所以也有研究人员将哺乳动物类病毒的保护性基因如口蹄疫病毒(FM-DV)的衣壳蛋白插入到禽痘病毒载体中,构建的重组病毒具有良好的保护性[4]。

以金丝雀痘病毒(ALVAC)作为载体制备疫苗产生的保护力较禽痘病毒作为载体制备的疫苗高。用金丝雀痘病毒载体表达狂犬病糖蛋白G,用于接种非禽动物如犬、猫都产生了很好的保护力,并已被安全用于人的临床试验。Merial公司已经开发了用于预防H3N8亚型马流感病毒[5](EIV)和马西尼罗病毒[6](WNV)的RECOMBITED产品。其预防马流感的疫苗是将欧洲系马流感和美洲系马流感的HA基因分别插入到金丝雀痘病毒载体中,然后将重组病毒混合制成联苗。而预防马西尼罗病毒的疫苗是将马西尼罗病毒的pr M/E基因插入到金丝雀痘病毒载体中。用金丝雀痘病毒表达猫白血病病毒包膜蛋白,接种猫后能够产生良好的保护性,是第一个以痘病毒为载体用于反转录病毒疫苗研究的成功例证。H.Cao等[7]在人类免疫缺陷病毒(HIV)流行的重灾区乌干达进行了重组人类免疫缺陷病毒-金丝雀痘疫苗的Ⅰ期临床研究,结果表明,这种疫苗免疫的乌干达志愿者所产生的不良反应与发达国家人类免疫缺陷病毒阴性志愿者的反应类似,未见严重不良反应发生,但可以使接受者产生保护性的细胞免疫反应。目前,金丝雀痘病毒载体还被用于肿瘤的治疗,N.van Baren等[8]用金丝雀痘病毒表达了肿瘤相关抗原MAGE,免疫癌症病人,结果出现肿瘤特异性的CTL反应,说明这种重组疫苗对治疗肿瘤是有效的。G.J.Ullenhag等[9]用金丝雀痘病毒表达结肠癌肿瘤相关抗原上皮细胞黏附分子(Ep CAM/KSA),然后与低剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)接种结肠癌病人,结果这些病人体内可以检测到强烈的INF-γT淋巴细胞应答,表明ALVAC-KSA有可能成为癌症疫苗的候选疫苗。当然这些疫苗始终处于理论研究阶段,还未真正投入到实际应用当中。

随着新的动物疫病的出现,动物痘病毒如山羊痘病毒也被修饰改造,用于制备活载体疫苗。王芳[10]构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组山羊痘病毒;张强[11]构建了表达口蹄疫病毒P1-2A3C基因的重组山羊痘病毒。这些都为预防像口蹄疫这样的烈性传染病提供了很有意义的参考。

2 疱疹病毒活载体疫苗

疱疹病毒载体的种类有很多,如单纯疱疹病毒(HSV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、伪狂犬疱疹病毒和牛疱疹病毒Ⅰ型等。疱疹病毒作为基因转移载体有许多优点,如疱疹病毒可以实现神经系统的基因投递,在神经细胞中建立无症状的潜伏感染;疱疹病毒可以携带多个基因或较大基因;疱疹病毒已经成功地用于各种细胞的基因投递,如外周血单核细胞、心肌细胞、树突状细胞等,疱疹病毒在癌细胞治疗中也有广泛的应用前景。

单纯疱疹病毒能够形成潜伏感染,利用这一特性将单纯疱疹病毒改造成基因工程载体可以用于基因治疗和神经系统疾病治疗。火鸡疱疹病毒作为活载体疫苗在家禽疾病的研究中取得了一系列进展,火鸡疱疹病毒基因组庞大,容易进行外源基因的插入,如新城疫病毒的HN基因和F基因、马立克病毒的g B基因和传染性法氏囊病毒的VP2基因[12]。这些重组的火鸡疱疹病毒疫苗对病毒攻击都起到一定的保护作用,从而使得火鸡疱疹病毒载体一直受到人们的重视。人们对猪伪狂犬病毒(PRV)的基因组研究较早,已筛选出可以区分出野毒感染和疫苗接种的疫苗株,从而使猪伪狂犬病病毒成为猪病活载体疫苗研究的热点。g D基因缺失的猪伪狂犬病病毒载体不能感染细胞,产生的子代病毒也不具有感染性,但可以表达外源基因以产生免疫保护作用。A.L.Shiau等[13]在g E-/TK-PRV株g D基因位置插入外源基因,筛选到的重组病毒在猪体内没有感染性,大大提高了猪伪狂犬病毒作为疫苗载体的安全性。将人类免疫缺陷病毒gp120和gp41蛋白导入g C基因缺失的猪伪狂犬病病毒,这样通过g C的信号肽序列使外源蛋白得到合理的转运和定位。猪伪狂犬病病毒g G基因缺失载体的研究也比较多,P.Qian等[14]构建了在g G基因序列区插入口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒,注射猪体都检测到了抗猪伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒的抗体。G.Xu等[15]用g G基因缺失的猪伪狂犬病病毒表达日本脑炎病毒(JEV)的NS1蛋白,接种小鼠后能够抵抗猪伪狂犬病病毒强毒的攻击,也获得了对日本脑炎病毒的细胞免疫和体液免疫反应。现在研究人员对Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV1)活载体的研究也比较多,如通过反向蚀斑筛选得到表达口蹄疫病毒的重组Ⅰ型牛疱疹病毒;L.Wang等[16]构建了巨细胞病毒(CMV)、IE启动子、SV40 poly(A)调节表达的Ⅰ型牛疱疹病毒载体,表达了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的E2基因,这使Ⅰ型牛疱疹病毒表达外源基因更简易。Ⅰ型牛疱疹病毒作为活载体能够制备出多价牛呼吸道病毒苗,可以实现一针多防的优点,并且还可以设计成标记疫苗,从而为根除和控制牛的重大疾病提供了广阔前景。

3 腺病毒活载体疫苗

腺病毒载体也是当前广泛用于外源基因表达的病毒载体,其表达的外源基因具有天然蛋白的特性,在基因工程疫苗、基因治疗及肿瘤治疗等领域都有广泛前景。

腺病毒活载体经历了三个发展时期,第一代腺病毒载体是去掉了E1/E3基因表达盒,其优点是阻止病毒DNA的复制和病毒衣壳蛋白的产生[17];第二代腺病毒载体是去掉了E2基因表达盒,这样就减弱了病毒蛋白的表达;第三代腺病毒载体是在构建病毒载体时,除去了某些病毒基因,只保留了ITR和包装信号[18],且在病毒包装过程中需要辅助病毒和合适的互补细胞系。目前,人们已经构建出不同动物的腺病毒载体,如绵羊腺病毒载体、牛腺病毒载体、犬腺病毒载体、猪腺病毒载体和禽腺病毒载体,但这些腺病毒载体在动物传染病疫苗中的应用还不是十分成熟,也未在实际生产中得到广泛应用。由于腺病毒本身的特性,使得腺病毒在人类疾病的预防和治疗中具有广阔的应用前景,腺病毒载体可以用于癌症的基因治疗,癌症的基因治疗主要是通过复制缺陷型载体转运抗癌物质,其中以腺病毒携带P53临床研究最为迅速,全球至少有5个进入Ⅲ期临床试验,其中我国Ad-P53已经上市,成为世界上首个上市的基因治疗药物。腺病毒载体还被广泛用于人类一些遗传疾病的基因治疗,如由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因突变造成的囊性纤维化和因基因缺陷造成的肌肉萎缩症。

4 反转录病毒活载体疫苗

反转录病毒是一类动物RNA病毒。逆转录病毒载体的应用比较广泛,技术相对较为成熟,其携带的外源基因能够整合到细胞基因组中,从而稳定表达,表达时间持久,反转录病毒感染细胞范围广、基因容量较大,但其生物安全性还存在争议。

常用的反转录病毒载体包括来源于哺乳动物C型反转录病毒的小鼠白血病病毒(MLV)和慢病毒(LV)的人免疫缺陷病毒。对哺乳动物的C型反转录病毒序列进行分子加工和修饰,保留了病毒的顺式作用元件,并插入治疗性基因、外源性启动子及抗性基因,构建成重组反转录病毒(RV)载体。20世纪90年代,科研人员成功用反转录病毒载体治疗了腺苷脱氨酶缺陷病,并取得了良好效果;此后,反转录病毒载体更广泛地被应用于遗传性和后天获得性疾病的基因治疗中[19]。反转录病毒载体作为将外源基因导入体细胞的工具,在人类遗传疾病的基因治疗方面得到了广泛应用。近年来,也有研究采用反转录病毒构建载体疫苗,如用劳斯肉瘤病毒构建载体表达H7亚型禽流感病毒的HA基因,免疫鸡后用强毒株H7N7攻击,结果完全获得保护。与反转录病毒载体相比,慢病毒载体的靶细胞范围更广,携带外源基因的能力更强。慢病毒载体中研究较多的是人类免疫缺陷病毒载体,H.Chen等[20]用重组有人因子Ⅸ的慢病毒载体转染小鼠造血干细胞(HSC),并将转染后的小鼠造血干细胞移植入小鼠体内,使得人因子Ⅸ在小鼠血浆中得到持续高效表达,从而有望用于人类B型血友病的基因治疗。研究表明,慢病毒载体还可用于心血管疾病的治疗[21]。

5 不分节段的单股负链RNA病毒载体疫苗

新城疫病毒和水泡性口炎病毒(VSV)都属于不分节段的单股负链RNA病毒,想要以它们为载体构建活载体疫苗,首先要利用反向操作技术得到它们的感染性克隆,然后才能对它们进行分子遗传操作。重组新城疫病毒作为活载体疫苗具有极为突出的优点,首先是新城疫病毒遗传性状比较稳定,毒株间不易发生重组;病毒复制在胞浆内完成,并且不存在DNA阶段,没有整合到宿主细胞基因组的可能;此外,新城疫病毒弱毒苗可以同时诱导全身性体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫,因此重组新城疫病毒疫苗保护效果较好。J.Ge等[22]构建的禽流感、新城疫重组二联活疫苗获得了2007年的国家科技进步二等奖,该活疫苗就是利用反向遗传操作技术将禽流感病毒的保护性基因HA插入到新城疫病毒基因组中,注射鸡体后,禽流感病毒的保护性HA抗原得到表达,同时新城疫病毒保护性抗原也得到表达,从而使鸡体产生针对这两种病毒病的保护力,这为像新城疫、禽流感这样的一类传染病的防治提供了新的思路。

研究表明,减毒的水泡性口炎病毒可作为疫苗表达载体用于传染病的预防。如用表达流感病毒的HA蛋白的重组水泡性口炎病毒免疫小鼠,可以使小鼠抵御致死剂量的流感病毒的攻击。用表达马尔堡病毒(MARV)跨膜蛋白的减毒重组水泡性口炎病毒活疫苗(VSVΔG/MARVGP)免疫非人灵长类动物,可防御致死性马尔堡病毒攻击。用水泡性口炎病毒表达同源丝状病毒属糖蛋白,免疫非人灵长类动物可抵御苏丹埃博拉病毒的攻击[23]。水泡性口炎病毒可以优先在恶性细胞中复制,并且重组水泡性口炎病毒能够增加肿瘤细胞对化学治疗药物和宿主免疫应答的敏感性。因而,水泡性口炎病毒也可用于癌症疾病的治疗。

6 脊髓灰质炎病毒(OPV)活载体疫苗

脊髓灰质炎病毒属于单股正链RNA病毒,脊髓灰质炎病毒减毒株活疫苗是人类历史上应用最成功的疫苗之一。脊髓灰质炎病毒可以诱导全身的体液免疫、细胞免疫和肠道黏膜免疫,从20世纪80年代人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,近年来脊髓灰质炎病毒载体被用于中枢神经系统定点表达外源蛋白,将来有望用于治疗多种神经系统疾病,如表达IL-11可用于治疗脊髓和大脑损伤;表达神经保护性干扰物质可用于灶性脑缺血的治疗;甚至用于治疗帕金森症的神经细胞移植;也可以用脊髓灰质炎病毒载体在神经细胞中表达保护因子以避免神经细胞的死亡,因而该载体的研究受到人们的格外重视。在动物疾病预防方面,用脊髓灰质炎病毒作表达口蹄疫病毒的抗原表位,经免疫攻毒试验证明,重组病毒可以诱导豚鼠产生针对该抗原位点的特异性中和抗体并发生中和作用,从而保护试验动物不受口蹄疫病毒攻击[24]。

7 结束语

病毒活载体疫苗的种类越来越多,应用也越来越广泛。但这并不意味着病毒活载体疫苗已经可以应用到各种动物和人类传染病的预防和治疗当中,就目前而言,商品化的病毒活载体疫苗还比较少。由于病毒本身安全性问题,以及活载体疫苗研制等下游工艺还未完善,大部分还处于理论研究阶段。但是病毒活载体疫苗具有常规灭活疫苗和弱毒苗不可比拟的优势,动物和人类传染病的活载体疫苗必将有美好的应用前景。

重组病毒载体 篇2

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源.采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点.因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节.为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台--Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率.研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的.效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率.因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法.

作 者：杨建岭 顾淑萍 陈臣 王铸钢 许燕 费俭 YANG Jian-Ling GU Shu-Ping CHEN Chen WANG Zhu-Gang XU Yan FEI Jian  作者单位：杨建岭,许燕,YANG Jian-Ling,XU Yan(上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234)

顾淑萍,陈臣,王铸钢,费俭,GU Shu-Ping,CHEN Chen,WANG Zhu-Gang,FEI Jian(上海南方模式生物研究中心,上海,201203)

刊 名：生物工程学报  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(6) 分类号：Q782 关键词：Red/ET重组   基因打靶   载体  

重组病毒载体 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌E.coli克隆株DH5α为本实验室保存。h TERT质粒由南方医科大学细胞生物实验室熊静波教授惠赠;HEK293A以及HEK293细胞购自上海中国科学院细胞库;Glutathione Sepharose 4B亲和纯化系统,Amersham Biosciences;QIAGEN Plasmid Midi Kit(25);QIAGEN Germany;Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、T4 DNA Ligase、Pfu DNA Ligase d NTP,大连宝生物;TRIzol reagent(Cat#15596-026),Invitrogen,Carlsbad,CA;lipofectamine 2000,Invitrogen公司;anti-h TERT一抗,Proteintech公司;抗兔二抗,博奥森公司。

1.2 方法

1.2.1 抽提质粒

氯化钙方法制备大肠杆菌DH5α感受态,制备好的感受态细胞悬液用于转化实验。转化质粒,涂板,克隆,挑克隆,按照TIAN-GEN DP103-02 Plasmid Purification Kit说明书抽提质粒。

1.2.2 质粒的鉴定

利用1.0%琼脂糖凝胶电泳,鉴定质粒分子量。同时把扩增提取的质粒送上海生工生物公司进行测序。并且利用lipofectamine 2000进行质粒转染至成骨细胞中,Western blotting检测h TERT功能。

1.2.3 病毒载体构建

设计h TERT基因引物,扩增出h TERT基因。引物序列上游添加BglⅡ酶切位点,下游添加SalⅠ酶切位点,引物序列:TERT-BglⅡ-F:CGAGCACCAGATCTATGCCGCGCGCTCC CCGCTGC;TERT-SalⅠ-R:GCCAGGCGGTCGACTT AGTCCAGGATGGTCTTGAAG。切胶回收后,用BglⅡSalⅠ双切,连接到用BglⅡ/SalⅠ双切的PIRES2-EGFP载体上。设计两端带attb的引物,扩增出h T ERT-PIRES2-EGFP基因,引物序列:h TER-atb1-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATG CCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGTG;h TER-attb1-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAT TACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCC G,然后切胶回收,纯化,然后BP重组到p DONR222载体,转化到DH5a细胞,摇菌,抽提质粒,然后再LR重组到p Ad腺病毒载体,测序验证,筛选出正确的克隆,再进行病毒包装。

1.2.4 腺病毒包装

制备高浓度p Ad-h TERT,重组质粒p Ad-h TERT Pac I线性化,37℃酶切过夜。采用酚/氯仿抽提法对线性化质粒进行纯化,用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度。线性化质粒转染293A细胞,转染后48 h直至有80%病变(CPE)出现,收集细胞及培养基。用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来,收集上清制备初级病毒液。初级病毒液再扩增。最后采用终点稀释分析法(end-point dilution assay)测病毒滴度。

1.2.5 重组腺病毒质粒的功能检测

重组腺病毒质粒转染细胞,采用没有转染的细胞做为对照组。转染后细胞培养24~72 h。收集细胞总蛋白,用Western blotting检测端粒酶蛋白表达。

1.2.6 腺病毒扩增与纯化

HEK293细胞生长至密度达到90%,加入适量病毒上清转染细胞。3~4 d后收集所有细胞。约500 g转速离心。灭菌PBS重悬沉淀,-20℃/37℃反复冻融3次。4℃下7 000 g离心5 min。采用Cs Cl连续梯度离心纯化。纯化后病毒透析去除Cs Cl,病毒保存于-80℃。

2 结果

2.1 端粒酶质粒

2.1.1 端粒酶质粒琼脂糖凝胶鉴定

提取的h TERT质粒用1.0%琼脂糖凝胶电泳,采用没有质粒的loading-buffer泳道作为空白对照,在8 V/cm恒压条件下,电泳30 min后。结果显示,提取3管质粒都符合端粒酶质粒大小,质粒分子量在5 000~7 000kb之间(见图1)。

2.1.2 质粒测序结果

由于目的基因太长,本测序只测了了701~1 751之间的碱基对(见图2)。测量结果经PUBMED中PLAST分析确定结果符合率达99.96%。

2.1.3 端粒酶质粒转染后端粒酶蛋白的表达

用端粒酶质粒通过脂质体转染成骨细胞后,收集总蛋白,Western blotting检测端粒酶和β-actin表达,结果显示转染端粒酶质粒之后,细胞内端粒酶呈过表达,而正常的成骨细胞中未见明显的端粒酶表达(见图3)。

2.2 腺病毒构建结果

2.2.1 酶切链接电泳

设计引物,扩增出h TERT基因,PCR结果见图4A。酶切链接到PIRES2-EGFP载体上,电泳结果鉴定见图4B。

2.2.2 病毒转染293A细胞结果

线性化重组腺病毒质粒转染293A细胞24 h,发现转染成功的细胞中明显有绿色荧光出现(见图5A),普通光镜下见部分细胞出现病斑变化(见图5B);转染后72 h,见大部分细胞转染成功,明显的绿色荧光聚集(见图5C),普通光镜下见病毒收集前病斑(CPE)改变(见图5D)。

2.2.3 病毒滴度测定结果

重组腺病毒转染293A细胞72 h后收集病毒,病毒浓缩液滴度测定,病毒滴度测定结果显示(见图6),病毒浓缩液滴度为2.1×1012ifu/m L。

2.2.4 重组腺病毒转染后h TERT表达结果

重组腺病毒测定滴度后,用感染复数为50 ifu转染正常成骨细胞,用没有转染的细胞做空白对照,用EGFP病毒做病毒对照,结果发现,在正常成骨细胞中转染h TERT腺病毒之后,h TERT蛋白表达明显,对照组中没有发现明显的h TERT蛋白表达(见图7)。

3 讨论

从h TERT基因检测和h TERT基因转染成骨细胞后功能检测确定本实验已经成功构建了重组腺病毒h TERT基因表达得腺病毒载体。

基因治疗与外源性因子治疗不同的是基因治疗试图将特定的基因导入靶细胞内,导入基因后靶细胞将表达目的基因,并能产生所需要的生长因子,达到治疗目的。所以基因治疗需要良好的载体系统把目的基因导入靶细胞内。理想的基因治疗载体不仅能高效传递目的基因,而且不具有致病性,选择良好的载体系统是治疗成功的关键步骤。载体系统一般分为非病毒与病毒两种。非病毒载体主要包括[7]:(1)脂质体或脂质复合物。是目前使用最为普遍的非病毒载体,用于基因治疗的多为阳离子型脂质体。MORREY等[8]筛选研究17种脂质相关非病毒载体,体外观察细胞的毒性、转染效率以及最适合转染条件后得出结论,LT1(一种组蛋白和脂质复合体)可能成为基因治疗比较好的非病毒载体。(2)裸质粒DNA载体。裸质粒载体缺乏靶向识别的特异性而且很容易被核酸酶降解。也有采用物理方法提高质粒的转染效率,如:电穿孔、基因枪、超声波、激光束以及利用高压原理包括粒子轰击、瞬间注射、机械按摩及动力进样等转导DNA。(3)组蛋白类。需要利用抗体的靶向基因传递系统。(4)阳离子聚合物。如聚乙烯亚胺、聚左旋赖氨酸、富精氨酸蛋白、聚乙二醇以及阳离子共聚体等。非病毒载体的优点在于可以有效避免病毒基因转移的潜在危险,不会引起病原体传播及人体免疫反应。缺点是转基因表达时效较短,细胞毒性较高,转染率较低,并且转基因后难以得到持续表达。

因为病毒更容易侵入人体细胞,影响宿主基因的转录和翻泽,所以病毒载体越来越得到广泛的应用。病毒载体包括可整合入基因组的逆转录型病毒:慢病毒、逆转录病毒等;不整合入基因组的质粒型病毒:腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒等。腺病毒载体的主要缺点是引发机体免疫反应,反应强烈者可以致命[9],LATTERMANN报道[10]注射腺病毒后发生严重的过敏反应;此外腺病毒对中枢神经系统也有明显的毒性作用。与腺病毒比较,腺相关病毒的免疫原性更低。LEVICOFF等[11]对比研究了腺病毒和腺相关病毒基因治疗的安全性,结果发现,腺病毒转染组大多出现了明显的临床、组织学及病理学改变,而腺相关病毒组则未出现明显的副反应。杆状病毒作为一种非复制的基因转染载体,其优点是适合大多数的哺乳动物细胞、容易进行总量调节、无细胞毒性作用,这些优点使它成为基因治疗一个很有潜力的载体。LIU等[12]以杆状病毒为载体,建立起了一种稳定有效的基因表达模型,并且没有发现杆状病毒的细胞毒性作用。慢病毒是以HIV-1(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。MIYAZAKI等[13]成功构建了BMP-2基因慢病毒并转染兔骨髓间充质干细胞,没有发现严重的副反应。慢病毒载体区别于一般的逆转录病毒载体,其优点在于能感染分裂细胞及非分裂细胞,同时保留了整合到宿主染色体上的特点,可转移较大的基因片段、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应,也是近年来研究较多的一种病毒载体[14]。逆转录病毒一般转染分裂细胞(慢病毒既可转染分裂细胞又可转染非分裂细胞),但目前实验中应用较多的为质粒型病毒载体如腺病毒及腺相关病毒载体。

重组病毒载体 篇4

研究发现TRX参与机体多种生物学活性, 并与人类多种疾病有关, 如肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、自身免疫性疾病、心脑等器官缺血再灌注损伤性疾病等[5]。由于TRX具有多种重要的生物学功能, 近年来已成为研究的热点。

有研究表明, TRX基因是非常有前途的用于基因治疗的候选基因, 应用重组TRX治疗的方法取得了令人鼓舞的结果, 但应用的重组蛋白质半衰期短, 需反复给药, 这可能会引起全身或其他部位的不良反应, 同时, 生产大量高质量的重组蛋白质花费巨大, 而采用转基因治疗的方法可能克服上述缺点。因此我们利用腺病毒载体感染效率高、宿主范围广及安全性较好等特点, 构建携带hTRX的腺病毒载体, 为hTRX在医学工程和基因治疗中的应用提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coliJM 109和DL2000marker购自Takara (日本) ;限制性内切酶NotI和SalI酶, CeuI和PeuI酶, T4DNA Ligsae, 购自Promega (美国) ;小量质粒提取试剂盒, LambdaDNA/EcoRI+HindⅢMarker, 3购自哈尔滨宏博生物公司;pGEM-TEasy/TRX重组质粒由哈尔滨医科大学邹宁博士提供;PCR扩增引物P1、P2、P3和P4 (参考序列GeneBankJ04026) 序列分别为P1位于64～81 bp, 序列为5′-ATGGTG-CAGATCGAG-3′, P2位于455～473bp, 序列为:5′-GGCAACTGGTTACTTC-3′, P3序列为5′, -ATCGAGCT-CAGATG-GTGAAGCAGATCGAG-3′ (含SacI酶切位点) , P4序列为:5′-ATCGTCGACG-GCAACTGGTTAT-GTCTTC-3′ (含SalI酶切位点) 。

1.2 方法

1.2.1 pGEM-T Easy/TRX重组质粒的测序:

取PCR扩增鉴定的阳性克隆, 应用T7和SP6引物双向测定TRX序列, 由博亚生物公司完成。

1.2.2 含TRX基因的穿梭质粒构建:

将pGEM-T Easy/TRX (含NotI和SalI酶切位点) 和穿梭质粒pshuttle2分别用NotI和SalI 37℃双酶切后, 回收目的片段, 在4℃下用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM 109, 铺LB平板 (含50μg/mlAmp) , 培养过夜后挑取单个菌落, 转入LB培养液中培养过夜后提取质粒, 进行多聚酶链反应 (PCR) 扩增筛选阳性克隆后双酶切电泳鉴定。

1.2.3 重组腺病毒载体pAdCMV-TRX的构建:重组

质粒pshuttle2-TRX用CeuI和PeuI 37℃双酶切后, 回收带有CMV启动子的TRX基因小片段, 用T4DNA连接酶在4℃下连接E 1、E 3缺失的含有同样酶切位点的Adeno-X病毒DNA过夜, 连接产物转化大肠杆菌JM 109, 铺LB平板 (含50μg/mlAmp) , 培养过夜后挑取单个菌落, 转入LB培养液中培养过夜后提取质粒, 进行PCR扩增筛选阳性克隆后双酶切电泳鉴定。

2 结果

2.1 pGEM-TEasy/TRX重组质粒序列测定

将重组质粒pGEM-TEasy/TRX质粒在博亚公司进行序列测定, 结果与GeneBank序列J04026比较, 序列一致, 测定序列长度为503bp, 其中包括TRXcDNA全长315bp (ATG-TAA) (图1) 。

2.2 含TRX基因穿梭质粒的构建及鉴定

将穿梭质粒pshuttle2 (图2) 和重组质粒pGEM-T Easy/TRX分别经NotI和SalI双酶切后回收目的片段连接, 成功构建出重组质粒pshuttle2-TRX, 用引物P1和P2进行PCR扩增, 在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 可在415bp处见清晰条带 (图3) 。提质粒后用限制性内切酶NotI和SalI酶切鉴定, 在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, NotI单酶切和双酶切获得两条带, SalI单酶切获得一条带 (图4) 。

M:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢMarker, 3;质粒:pshuttle2穿梭质粒

0117-7:pshuttle2/TRXPCR (415bp) ;M:DL2000marker

N:NotI酶切;S:SalI酶切;D:双酶切;M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, ;M:marker

2.3 重组腺病毒pAdCMV-TRX的构建与鉴定

重组质粒pshuttle2-TRX和Adeno-X病毒分别经CeuI和PeuI双酶切后回收的目的片段, 连接产物转化大肠杆菌JM 109, 用引物P3和P4进行PCR扩增筛选阳性克隆后在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 在435bp处出现清晰条带 (图5) , PI-SceI和I-CeuI双酶切重组腺病毒pAdCMV-TRX在1.2%TBE的琼脂糖凝胶上电泳, 在23.1kb和2.0kb处可见清晰条带 (图6) 。成功构建出Tet-Off诱导的重组腺病毒pAdCMV-TRX。

P:pAdCMV-TRX质粒的PCR (435kb) ;M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, 3;M 2:DL2000marker

M 1:LambdaDNA/EcoRI+HindⅢmarker, 3;M 2:DL2000marker;Z:质粒 (32kb) ;D:双酶切 (PI-SceI和I-CeuI) ;S:单酶切

3 讨论

TRX一般都具有一个相同的有氧化还原活性的Cys-Gly-Pro-Cys的氨基酸序列。在其保守的活化区域内含有具备氧化还原活性的二硫巯基和二硫醇, 因此TRX在细胞内具有各种不同的功能[6]。如抗氧化作用、调节细胞生长、抑制凋亡、转录调节作用、辅助因子作用等。因此, TRX与人类许多疾病有关, 如病毒性心肌炎、肿瘤、心脑等器官缺血再灌注损伤性疾病[7]、获得性免疫缺陷综合征、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、神经系统疾病等[8]。为此, 我们进行TRX腺病毒基因重组, 为进一步研究TRX的功能提供平台。

本实验所用的重组质粒pGEM-TEasy/TRX, 在博亚公司进行序列测定, 其测序结果的正确性为下一步实验的顺利进行打下了基础。将TRXcDNA与穿梭质粒pshuttle2连接, 使重组质粒易于转入细胞进行克隆扩增。然后把TRXcDNA克隆至E 1、E 3缺失的Adeno-X病毒中正确构建重组腺病毒pAdCMV-TRX, 为以后TRX基因表达及其功能研究奠定基础。

人们从上世纪50年代开始认识腺病毒[9,10], 到80年代初已开始利用腺病毒重组子作为哺乳动物细胞表达载体。腺病毒DNA不整合到宿主染色体, 只在体外连接, 并在穿梭质粒和腺病毒载体上设计稀有的酶切位点, 避免反向连接及自身环化, 便可保证重组腺病毒载体正确构建。另外, 本实验采用新型腺病毒表达系统即Adeno-XTMTet-Off表达系统, 在腺病毒载体中存在受四环素调控的基因片段, 在四环素诱导下, Adeno-XTMTet-Off表达系统能精确地调控目的基因表达。这样即使是编码细胞毒素的基因或例如肿瘤抑制基因, 细胞因子或激素等这样的蛋白质, 都能被安全地整合在有传染性的腺病毒上然后传染给要表达和研究的靶细胞。通过PCR、双酶切手段鉴定显示我们成功构建了重组腺病毒pAdCMV-TRX, 为下一步将TRX基因克隆进真核细胞表达载体, 收集重组腺病毒pAdCMV-TRX蛋白表达产物, 采用心肌内多点注射或冠状动脉内注射使重组腺病毒载体介导的TRX基因转染心肌细胞保护急性柯萨奇B 3病毒性心肌炎, 观察是否有保护和治疗作用, 观察TRX是否抑制病毒在细胞内的复制, 是否抑制细胞凋亡等奠定了基础。为临床上应用TRX治疗之急。

由于福利院常住人口数量、调查时间等客观条件的限制, 本调查研究存在样本量偏小的局限性, 有待于相关大样本量的调查进一步验证。对社会福利院老年人这一高发病率的特殊弱势群体, 应建立相应的健康体检和健康教育机制, 通过多种途径加强高血压防治知识的普及, 给予积极的社会援助, 纠正不良的生活习惯, 从而提高其生活质量, 改善远期预后。

摘要：目的克隆人硫氧还蛋白 (hTRX) 基因, 并构建含有该目的基因的重组腺病毒载体。方法用内切酶从重组质粒pGEM-TEasy/TRX上切下全长TRX cDNA片段, 与穿梭质粒pshuttle2连接, 形成pshuttle2-TRX重组质粒, 再双酶切pshuttle2-TRX, 将带有CMV启动子的目的片段, 插入Tet-Off诱导的Adeno-X病毒DNA中, 用PCR、双酶切方法进行鉴定。结果对pGEM-T Easy/TRX重组质粒进行序列测定, 测定结果与Gene-Bank序列J04026基本一致, 其中包括TRX cDNA全长。该实验构建出含TRX的穿梭质粒pshuttle2-TRX, 并成功获得Tet-Off诱导的重组腺病毒载体pAdCMV-TRX。结论TRX基因的克隆及其重组腺病毒载体pAdCMV-TRX的成功构建, 为进一步研究TRX生物活性及发病与氧化损伤关系密切的疾病治疗提供新的手段, 如病毒性心肌炎、动脉硬化、心肌病、糖尿病、Alzheimer's病等。

关键词：硫氧还蛋白,腺病毒,基因重组

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重组病毒载体 篇5

1 试验材料

1.1 试验动物

20日龄非免疫海兰褐蛋鸡雏90只,购自八家子养鸡场。

1.2 疫苗

禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型),批号20050619。

1.3 诊断液

禽流感H5抗原,禽流感H5阳性血清,禽流感H5阴性血清,批号20050120,购自哈尔滨兽医研究所。

1.4 试验器材

疫苗接种针为标准的双锋接种针,试验GB/T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术HI方法所需器材。

2 试验方法

2.1 试验分组

将20日龄非免疫海兰褐蛋鸡雏90只随机分为6组,其中,试验组4组,每组20只,分别标记为试验1组、试验2组、试验3组和试验4组;对照组2组,每组5只,分别标记为对照1组和对照2组。

2.2 疫苗稀释

疫苗A稀释液:疫苗稀释按疫苗使用说明书标准操作,用灭菌生理盐水25 ml,稀释500羽/瓶的疫苗1瓶,待用。疫苗B稀释液:疫苗稀释浓度大于疫苗使用说明书规定的标准浓度,用灭菌生理盐水10 ml稀释500羽/瓶的疫苗1瓶,待用。

2.3 接种方法

试验1组:用双锋接种针蘸取疫苗A稀释液,在鸡翅膀内侧三角区翼膜的无羽毛无血管部位垂直刺穿翼膜1次,进针深度以接种针凹槽透过翼膜对面皮肤为准。

试验2组:用与试验1组同型号的双锋接种针,蘸取疫苗B稀释液,在鸡翅膀离翅根最近的关节部位内侧,接种针朝鸡体方向成45度角斜刺1次,接种针的凹槽向上,进针深度以接种针的凹槽进入皮肤为准。

试验3组:用双锋接种针蘸取疫苗B稀释液,接种方法与部位同试验1组。

试验4组:用双锋接种针蘸取疫苗A稀释液,接种方法与部位同试验2组。

对照组:用同型号双锋接种针蘸取灭菌生理盐水,对照1组接种方法同试验1组,对照2组接种方法同试验2组。

2.4 样品采集及采样时间

于接种前采集全血分离血清检测母源抗体。接种后7 d和14 d分别采集全血,分离血清检测禽流感H5免疫抗体。

2.5 检测方法

GB/T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术HI方法。

3 试验结果

禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗不同接种操作方法免疫效果检测结果见表1。

4 小结与讨论

4.1 试验表明,禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗无论是标准浓度还是高于标准浓度稀释,采用翼膜直刺的接种方法禽流感抗体均高于翅关节内侧皮下斜刺的接种方法。不同的接种操作方法对免疫效果有显著的影响。试验1组、试验3组免疫接种后14 d抗体滴度100%在22～27,而试验2组、试验4组免疫接种后14 d抗体滴度100%小于21。另据2005年黑山禽流感疫情期间全省13市用禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗对肉鸡进行紧急免疫时监测抗体的结果,免疫接种后14 d检测1 679只,33%抗体滴度小于21,67%抗体滴度在21～28之间,从另一侧面证明了免疫接种不同操作方法对免疫效果有显著影响。

4.2 本试验使用的禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗,疫苗抗原载体是禽痘病毒。载体禽痘病毒在免疫鸡体内增殖的程度与免疫鸡的禽流感抗体滴度的高低呈正相关性。试验1组、试验3组在翅膀内侧三角区翼膜刺穿1次,此接种部位是双面皮肤,两层皮肤间无肌肉等组织。而试验2组、试验4组在翅关节内侧斜刺1次,这两组的接种部位是一层皮肤,皮下是肌肉、骨或关节韧带等组织。本试验中,4个试验组均用相同刺种针接种1次,试验1组、试验3组被接种的皮肤细胞是试验2组、试验4组被接种的皮肤细胞的2倍。鸡体上禽痘病毒的敏感细胞是皮肤细胞和气管黏膜细胞。禽痘病毒一般经损伤的皮肤和黏膜而感染。禽痘病毒的传播方式是细胞间传播,禽痘病毒在敏感细胞内增殖后,不释放出来,通过细胞间桥直接传播给相邻敏感细胞。试验1组、试验3组的接种方式更符合禽痘病毒的传播方式,疫苗接种采用了疫苗载体病毒自然感染的方式。试验1组、试验3组接种操作的方法,被接种的疫苗敏感细胞是试验2组、试验4组接种方法被接种的疫苗敏感细胞的2倍。

4.3 试验2组接种的疫苗抗原稀释浓度高于试验1组1.5倍,而试验2组在接种后14 d抗体滴度低于21,试验1组组接种后14 d抗体滴度100%达22～27,可能原因是试验2组在关节部位用接种针斜刺接种,此部位皮下是肌肉、骨或关节韧带等组织,肌肉、骨或关节韧带等组织细胞不是疫苗载体禽痘病毒的敏感细胞,疫苗载体不能很好增殖,疫苗抗原就不能得到有效表达。

4.4 试验2组、试验4组禽流感抗体均低于试验1组和试验3组,可能原因是试验2组、试验4组接种时将疫苗接种到皮下其他组织,导致疫苗直接接种到敏感细胞皮肤细胞的量不足;另一方面,如操作中进针深度不够,使疫苗不能有效接种到组织内,疫苗抗原同样不能很好表达。导致试验2组、试验4组的试验鸡实际疫苗接种量不如试验1组、试验3组确实有效。而疫苗的实际接种量直接影响免疫效果。说明只有接种操作方法正确,才能保证接种效果。

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定 篇6

细菌的营养缺陷型是指细菌的某些基因如管家基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应,这些基因突变或缺失后,不能合成相应产物,导致细菌在外界环境中或基本培养基上不能生长,需要补充相应的底物。胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,ThyA)基因编码胸苷酸合成酶,在DNA合成中起关键作用,缺失ThyA基因的菌株在基本培养基上不能生长;染色体整合是一种有效的改造微生物的手段,插入序列、转座子和同源重组是染色体整合的通常形式,其中同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置进行染色体整合[1,2]。

因此,本研究拟利用细菌营养缺陷型互补和同源重组的原理,构建一个可应用于乳酸菌的同源重组载体。利用该同源重组载体可将目的基因整合于消化道共生乳酸菌染色体中,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达,为构建能高效、安全分泌表达外源目的基因的转基因乳酸菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、培养基和生长条件

大肠埃希菌DH5α、乳酸乳球菌MG1363(Lactococcus lactis MG1363)、质粒pMUTIN4[3]由本室保存。DH5α常规培养用LB培养基,37℃振荡培养;乳酸菌常规培养在GM17培养基(M17培养基,0.5%葡萄糖),30℃静止培养。氨苄青霉素在E.coli培养中的浓度为100μg/ml。

1.1.2 主要试剂和材料

高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DL2000 Marker、限制性内切酶均购自大连Takara公司;M17购自Oxoid公司;质粒抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Sigma公司;引物委托上海英俊公司合成。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 L.lactis MG1363基因组DNA的制备及质粒小量提取

参考革兰阳性菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。主要操作如下:收集适量处于对数生长期的乳酸菌细菌沉淀,加入适量溶菌酶,充分酶解后加入适量无水乙醇混匀,将其全部转移至柱中。充分洗涤后用洗脱液将吸附在柱子膜上的DNA洗脱,采用紫外分光光度法测定基因组DNA浓度,-80℃保存,备用。

参考质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒DNA(碱裂解法)。采用紫外分光光度法测定质粒DNA浓度,-80℃保存,备用。

1.2.2 引物设计及目的基因的PCR扩增

1.2.2. 1 引物设计

根据已发表的乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列[4],用软件Primer 5.0设计引物并引入相应的酶切位点,用作重组质粒的多克隆位点(表1)。引物委托上海英俊公司合成。

1.2.2. 2 ThyA基因ATG上游片段(ThyA-up)的PCR扩增与鉴定

PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游1 050 bp片断。PCR反应体系如下:5×PCR PrimerSTARBuffer(Mg2+plus)10μl,dNTP Mixture 4μl,模板2μl,引物各1μl,PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.5μl,补水至50μl。反应条件如下:98℃预变性30 s;98℃10 s,60℃10 s,72℃1 min,共30个循环;72℃延伸5 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段,-80℃保存,备用。

引物加粗斜体部分为酶切位点,下划线部分为引入的酶切位点The overstriking and italic parts of primers were restriction enzyme sites,the underline parts were introduced restriction enzyme sites

1.2.2. 3 ThyA基因终止密码下游片段(ThyA-down)的PCR扩增与鉴定

PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码下游1 010 bp片断,以ThyA-down-F和ThyA-down-R为引物,PCR反应体系、反应条件同“1.2.2.2”。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收纯化目的片段,-80℃保存,备用。

1.2.2. 4 同源重组载体的构建策略与鉴定

(1)纯化后的ThyA-up基因片段与质粒pMUTIN4经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化感受态DH5α,涂布于含氨苄青霉素的LB平板,37℃培养。次日挑取单菌落增菌,提取质粒进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,构建的重组质粒命名为pThyA-up(图1)。(2)重组载体pThyA-up和制备好的PCR片断ThyA-down经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后连接,转化感受态DH5α,涂布于含氨苄青霉素的LB平板,37℃培养。次日挑取单菌落增菌,提取质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,构建的重组质粒命名为pThyA-up-down(图1)。

2 结果

2.1 ThyA-up基因的PCR扩增与鉴定

以乳酸乳球菌基因组为模板,进行PCR扩增,其产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,产物片段约1 050 bp,符合预期片段长度(图2)。

2.2 重组载体pThyA-up的酶切鉴定

将PCR产物ThyA-up基因经胶回收纯化后克隆到质粒pMUTIN4多克隆位点上,对重组载体进行双酶切鉴定(图3)。结果显示,目的片段ThyA-up已成功连接至质粒pMUTIN4多克隆位点上,表明pThyA-up构建成功。

2.3 ThyA-down基因的PCR扩增与鉴定

以乳酸乳球菌基因组为模板,进行PCR扩增,其产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,产物片段约1 010 bp,符合预期片段长度(图4)。

2.4 将PCR产物经胶回收纯化后克隆到重组质粒pThyA-up,对重组载体进行双酶切鉴定(图5)

结果显示,ThyA-down基因已成功连接至重组质粒pThyA-up(pThyA-up-down)。将乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down进一步测序确证,测序结果显示与理疗序列完全一致(测序图略),表明乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down构建成功。

3 讨论

乳酸菌不产生内毒素,表达的外源蛋白无需经过纯化可以直接连同菌体一起服用,被公认为是安全级(generally regarded as safe,GRAS)微生物;其外源基因容量大,刺激细胞免疫能力强,并可诱导产生大量的细胞因子,亦是理想的基因治疗载体;但无论何种类型的载体都必须带有1个或多个有效的筛选标记以确保重组子的筛选;但如果这种带有抗性基因的菌株投放到环境中或人体、动物体内,由于抗性基因有转移的可能,将为相应抗生素的使用带来严重后果,因此其实际应用必然要受到限制[5]。

由此可见,更安全有效的方法就是将目的基因整合至乳酸菌染色体中,让其在乳酸菌中持续表达,同时又避免了抗性基因的引入(但可通过细菌营养互补筛选重组菌株)。因此,本研究利用细菌营养缺陷型互补和同源重组的原理,构建了可应用于乳酸菌的同源重组载体pThyA-up-down,其全长9 900 bp,包括一个来自大肠埃希菌的复制子ColE1,一个报告基因LacZ以及2个筛选标记(selective marker):来自乳酸菌的ThyA基因和能在乳酸菌中进行抗性筛选的红霉素基因(当整合完成的同时,红霉素抗性基因随之丢失)。此外,目的基因与染色体发生重组是一个随机过程,重组效率很低,后期阳性克隆的获得需要大量的筛选工作;而报告基因LacZ的引入,可在培养基上直接挑取蓝色菌落进行鉴定,从而提高筛选效率,并大大简化阳性克隆筛选的过程。

同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置甚至碱基序列位置进行染色体整合。ThyA是一种广泛存在于原核、真核细胞中的管家基因。ThyA基因编码胸苷酸合成酶,在体内DNA合成中起关键作用,ThyA基因缺失导致d TMP从头合成途径受阻,以至于ThyA缺失株不能在体外环境中生长[6,7]。除非在培养基中添加胸腺嘧啶或胸苷,或导入含有完整ThyA基因野生型序列的互补质粒后,才能使其生存。ThyA基因的上述特点使其成为筛选标志基因。

研究证实,在同源重组的染色体整合中,同源片段越长,整合频率越高,通常情况下,只要达到300 bp的同源片段的同源重组是完全可以成功的[8]。因此,本研究扩增了L.lactis MG1363染色体ThyA基因起始密码上游和终止密码下游各约1 000 bp的基因序列作为同源片断,从而提高外源基因在乳酸菌染色体中的整合效率。同时在引物序列中引入6个酶切位点(KpnⅠ、Aor3HⅠ、FseⅠ、BamHⅠ、Sse8387Ⅰ、XhoⅠ),作为同源重组载体的多克隆位点,可根据研究的需要插入不同目的基因在乳酸菌染色体上进行同源重组。pThyA-updown也可携带目的基因在含ThyA基因的其他细菌中进行染色体整合。

在下一步研究中,我们拟利用携外源基因的同源重组载体pThyA-up-down,通过双交叉同源重组,替换乳酸菌基因组中的ThyA基因,实现目的基因在乳酸菌中的整合型表达,而不引入抗药性基因和其他外源基因,使得插入的外源DNA片断最小化,并且不会发生外源基因的水平转移,因此这种乳酸菌同源重组载体具有较高的生物安全性,可望安全有效地应用于相关疾病的防治。

摘要：目的:构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。方法:根据乳酸菌L.lactisMG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。结论:乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。

关键词：乳酸菌,同源重组,ThyA

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重组病毒载体 篇7

关键词：重组人角质细胞生长因子,突变体

角质细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体（KGFR）的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。KGF能特异性作用于上皮细胞，而不作用于成纤维细胞和内皮细胞。试验表明，KGF能加速伤口的重新上皮化[1]、促进角膜上皮损伤修复[2,3,4,5,6]细胞的损伤[7]，且在烧伤、溃疡以及切割伤的修复和再生方面有显著作用[8,9]。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF (KGFdes1-23）具有更高的稳定性和活性。KGF是成纤维细胞生长因子-7的肝素结合性家族的一员[10]。

本试验中重组人角质细胞生长因子（rhKGF），是一种通过DNA重组技术在大肠杆菌生产的重组人源蛋白。为了增加蛋白质的稳定性，在去除了内源性角质细胞生长因子N-端的前23个氨基酸，但不影响KGF对上皮细胞的促有丝分裂活性基础上，对40位游离的半胱氨酸进行丝氨酸突变，以期获得稳定性更好，表达量更高的40位丝氨酸突变截短型角质细胞生长因子[Ser40]rhKGFdest-23突变体蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶，DNA连接试剂盒，质粒小提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，DNA Marker均购自Takara公司；Yeast Extract, Typton均购自OXOID;Pyrobest DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ，T4DNA连接酶，Agarose购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；表达载体pET-22b, hKGF由暨南大学医药生物技术研究开发中心提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKGF1dest23基因片段的合成

设计[Ser40]rh KGF1dest23的两端物，上游引物：5’-GGAATTCCATA TGAGCTATGATTAT-3’（划线部分为NdeⅠ酶切位点）；下游引物：5’-CGGGGATCCTTATCACGTAATGGCC-3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）。以pET22b-[Ser40]rhKGF1为模板扩增[Ser40]rhKGF1dest-23，经94℃变性3min进入循环，然后72℃延伸5min，反应产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。把回收产物命名为[Ser40]rhKGFdest-23。它的5’端有N d eⅠ酶切位点，3’端有B a m HⅠ酶切位点。

1.2.2 重组表达制粒p ET22b-[Ser40]rhKGFdest-23的构建

重组表达质粒pET22b-[Ser40]rhKGF1dest-23用NdeⅠ和BamHⅠ37℃双酶切4h，切胶回收后，在SolutionⅠ连接酶的作用下，16℃连接3h后转入感受态DH5α细胞中，转化菌涂布在含100mg/L Amp平板上，菌落PCR为阳性的克隆菌，测序。

1.2.3 阳性菌落的鉴定

酶切完毕后，用PCR Product Purification Kit V3.0进行回收。挑选几个经菌落PCR鉴定呈阳性的转化子，接种到5mL含100µg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养，50%甘油保种。取适量甘油菌测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。

2 结果

2.1[Ser40]hKGF1dest23 DNA片段的合成，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约为440 bp的DNA片段 (图1) ，与预期DNA片段大小一致，表明已经成功获得[Ser40]rhKGF1dest23基因。

2.2 转化子的阳性鉴定

通过42℃热激法将pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23重组质粒的构建和序列分析，连接产物转入感受态DH5α中，进行菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约440 bp见[Ser40]rhKGF1dest23目地条带，与理论预期值大小基本一致（图2），表明已成功构建重组表达载体，重组表达质粒经北京三博远志生物工程有限公司测序，DNA序列分析确证已成功引入突变，结果与预期相符（图3）。

3 讨论

FGF家族对内皮细胞，成纤维细胞与上皮细胞具有促细胞增殖与分化的功能，而KGF专一性的与上皮细胞的FGFRIIIb型受体特异结合，所以安全性较好。根据《Protein Science》上的基因结构分析，知h-KGF的40位Cys暴露在分子的表面，易氧化，从而引起h-KGF蛋白质结构的不稳定。本实验通过将重组角质细胞生长因子-1暴露在分子表面，易引起蛋白不稳定的第40位半胱氨酸突变为丝氨酸，使其蛋白结构稳定。为下一步的突变体蛋白的稳定性研究奠定基础。

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