功能重组

功能重组（共7篇）

功能重组 篇1

链球菌 (Streptococcus) 为革兰阳性球菌, 可引起包括人在内的多种动物发病。其中, 马链球菌可引起马腺疫, 吸入或摄入机体后进入扁桃体进行繁殖, 吸引大量的嗜中性粒细胞到感染的组织, 却不能完全吞噬该致病菌, 进而进入下颌的淋巴结形成肿胀和炎症。现证实, 马链球菌表面具有多种重要毒力因子, 其中M蛋白可与Ig G结合纤维蛋白原, 掩盖细菌表面C3b的结合位点, 从而抑制替代通路中C3激活和经典的C5激活通路而表现出抗吞噬功能[1]。透明质酸酶也是一个重要的毒力因子, 它主要通过阻断吞噬细胞的受体与结合在细菌表面起调理作用的C3b接触而发挥作用。J.Alber等[2]发现, 马链球菌超抗原基因 (see L和see M) 与兽疫链球菌超抗原基因 (sze L和sze M) 序列高度同源。近年来还发现, 马链球菌能分泌一种小蛋白多肽, 可以结合补体调节因子H, 它作为一个辅助因子介导C3的激活和C3转化酶的形成来调节补体的替代激活通路[3]。研究通过筛选马链球菌CF32基因组3~8 kb随机文库, 鉴定出一个新蛋白, 经序列分析比较命名为Ig G内切酶蛋白 (Ide E) , 并对克隆表达产物 (Ide E) 进行功能分析。

1 材料

1.1 菌株和质粒

马链球菌 (Streptococcus equi) CF32、基因文库及康复血清, 由John Timoney教授提供;大肠杆菌 (E.coli) BL21 (DE3) 、p ET载体、大肠杆菌XL-1 MRF’、SOLR和辅助噬菌体 (Helper phage) , 购自Novagen生物工程公司;LB培养基、CNA培养基及THB+2%酵母浸出液培养基, 购自Invitrogen公司。

1.2 工具酶和化学试剂

PvuⅡ、XholⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA连接酶、Taq酶, 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;邻苯二胺 (OPD) 和4-氯-1-奈酚, 购自Promega公司;BCA、生物素 (Biotin) 及Percoll试剂盒, 购自Pierce公司;过氧化物酶标记亲和素 (Avidin) 和荧光标记链霉亲和素 (Streptavidin) , 购自Promega公司;硝酸纤维膜、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G和过氧化物酶标记Protein G, 均购自普博欣生物公司。

2 方法

2.1 阳性克隆的筛选及纯化

参照参考文献[4]进行, 将滴定好的基因组文库接种在一个大的平皿上过夜, 把浸泡有0.025 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 的醋酸纤维素膜贴在平皿表面, 37℃作用2~4 h (使噬菌体表达的融合蛋白吸附到膜上) ;取下硝酸纤维素膜, 用TBST洗3次后, 加入4%的脱脂奶粉封闭30 min;依次加入马链球菌康复血清 (1∶500) 和辣根过氧化物酶标记Protein G (1∶4 000) 分别作用2 h;每步之间用TBST洗3次, 加入新配制的过氧化氢处理的4-氯-1-奈酚显色;根据膜上显色斑点, 选择平皿上的阳性噬菌体克隆, 将每个噬菌体克隆用大肠杆菌XL-1MRF’按上述方法进一步纯化, 直至硝酸纤维素膜上的斑点都出现一致颜色, 选择其中之一用于拯救质粒。

2.2 阳性克隆质粒的拯救

拯救方法按Helper phage试剂盒提供的方法并参照参考文献[4]进行。

2.3 质粒的酶切鉴定及测序

将获得的质粒用PvuⅡ酶切鉴定, 确定插入片段的大小, 测序并比较序列确定开放阅读框架 (ORF) 。

2.4 PCR扩增

以F1 5'-GCCCTCGAGAGAAAGGGTTATATG-3'、F2 5'-CGATCCTTAGCTCAGTTTCTGCC-3'为引物 (下画线部分为XhoⅠ和Bam HⅠ酶切位点) , 以拯救的质粒为模板进行PCR扩增。反应条件:94℃预变性3 min;92℃变性1 min, 57℃退火30 s, 72℃延伸66 s, 共30个循环;72℃延伸10 min。

2.5 Ide E基因PCR产物的连接转化

由于PCR产物的两端含有酶切位点, 将PCR产物及p ET15b用XhoⅠ和Bam HⅠ酶切后回收, 按载体与片段为1∶3的比例进行连接, 转化感受态细胞。

2.6 重组质粒的筛选与鉴定

挑取转化子若干个, 在3 m L LB液体培养基中培养12~16 h;质粒小抽提后经1%凝胶电泳, 根据DNA分子质量的大小, 初步筛选阳性质粒;然后取初步筛选的阳性质粒进行XhoⅠ和Bam HⅠ酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳分析, 进一步筛选阳性质粒;将重组质粒进行PCR反应, 比较PCR产物与酶切产物的大小。

2.7 Ide E蛋白的表达

将鉴定为阳性的重组质粒载体转化至BL21 (DE3) , 在1 mmol/L IPTG诱导下表达, 收集菌体。

2.8 表达蛋白的纯化及Western-blot分析

采用Talon试剂盒提纯重组蛋白, 纯化的蛋白加等量上样缓冲液, 100℃作用5 min;SDS-PAGE电泳后染色观察;Western-blot方法参照2.1方法进行, 蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。

2.9 Ide E阳性血清的制备

取2只健康白兔 (购自天津市奥臣实验动物有限公司) , 用100μg重组蛋白辅以氢氧化铝佐剂皮下免疫接种, 接种后14天和28天各加强免疫1次, 于第1次接种后35天采血分离血清。

2.1 0 Ide E降解免疫球蛋白的分析

分别取重组Ide E 1μg与0.5μg、1μg、2μg、4μg Ig G在PBS中37℃作用过夜, SDS-PAGE观察。

2.1 1 重组Ide E的Biotin标记

按Biotin试剂盒说明书进行。

2.1 2 Biotin标记的重组Ide E与嗜中性粒细胞结合试验

嗜中性粒细胞的分离按Percoll试剂盒说明书进行, 新分离的嗜中性粒细胞经计数后, 取2×106个与3μg Biotin标记的Ide E在200μL PBS中于37℃作用1 h;之后将嗜中性粒细胞用PBS洗3次, 在4℃条件下与荧光标记的Streptavidin作用30 min, 用流式细胞仪检测。

2.1 3 Ide E抗吞噬作用的检测

按参考文献[3]进行, 首先对分离的嗜中性粒细胞进行计数 (2×106个) , 将培养至对数生长期的CF32计数后 (1×107cfu) 用Se M特异性兔阳性抗体调理处理, 加入不同浓度重组Ide E, 然后于37℃与分离的嗜中性粒细胞作用1 h (总体积1 m L) ;放在冰上终止反应, 取100μL涂在CNA血液平板上培养过夜, 计数。

3 结果

3.1 Ide E基因的序列特征

通过筛选CF32基因组文库, 有3个与康复血清出现较强反应, 其中有1个克隆表达大约40 ku的蛋白。对拯救的质粒进行测序发现, 这2个克隆含有相同的开放阅读框架 (ORF) , 其含有1 101个核苷酸, 共编码367个氨基酸, 成熟的蛋白分子质量为39.6 ku, 序列分析比较发现Ide E与马链球菌兽疫链球菌Ig G分解酶和Ig G内切酶关系最为密切, 与白细胞C3b受体Mac (CD11b) 和人产脓链球菌免疫球蛋白分解酶具有同源性, 见图1。

3.2 抗吞噬蛋白基因的扩增结果

根据已知的抗吞噬蛋白基因序列设计了PCR扩增引物F1和F2, 并进行PCR扩增, 结果表明, 扩增的片段大小与预期相符。

3.3 重组表达质粒p ET15b-Ide E的构建及鉴定结果

将获得的PCR产物及p ET15b在37℃用限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ酶切4 h;经胶回收试剂盒回收后采用T4 DNA连接酶连接, 转化感受态细胞;挑取生长的部分菌落加入20μL去离子水煮10 min;4 000 r/min离心5 min;取上清液用F1和F2作PCR扩增重组质粒中的插入片段;挑取PCR阳性菌落, 摇菌过夜提取质粒, 用XhoⅠ和Bam HⅠ进行酶切鉴定, 得到预期的约为1 kb的片段, 由此得到含有目的片段的重组质粒, 命名为p ET15b-Ide E。

3.4 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot分析结果

将p ET15b-Ide E质粒转化表达载体, 经1 mmol/L IPTG诱导后, 表达产物经Talon纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE分析, 得到特定的目的蛋白条带, 约39.6 ku, 与预计的分子质量相符。证实该蛋白与阳性血清反应, 见图2。

M1, M2.蛋白Marker;1.纯化Ide E的Western-blot结果;2.纯化抗吞噬蛋白的SDS-PAGE检测结果。

3.5 Biotin标记的Ide E与嗜中性粒细胞结合检测结果

与对照组相比, 标记的Ide E与嗜中性粒细胞结合后荧光强度明显增强, 见图3。

3.6 Ide E降解Ig G及抗吞噬作用结果

试验中以相同的Ide E与不同剂量的Ig G相互作用, 经SDS-PAGE分析发现, 该蛋白没有呈现出降解Ig G的作用;将不同浓度的重组Ide E添加在嗜中性粒细胞与链球菌的混合液中, 结果见图4。

由图4可见, 重组Ide E对嗜中性粒细胞具有剂量依赖性杀菌抑制活性。

4 讨论

链球菌具有很强大的抵抗吞噬活性, 因此研究抗吞噬机制始终是各种链球菌研究的热点之一。本研究首次通过筛选基因文库鉴定出马链球菌一个新毒力因子Ide E, 并且成功地克隆表达该蛋白。通过分析基因库发现, 该蛋白与马链球菌兽疫链球菌Ig G分解酶和Ig G内切酶关系最为密切, 与白细胞C3b受体Mac和人产脓链球菌免疫球蛋白分解酶具有同源性, 但是Ide E没有呈现降解Ig G作用, 可能是由于进化过程中某些氨基酸的改变引起的。Mac-1作为i C3b的受体, 是内皮细胞整合素家族黏附素分子, 在嗜中性粒细胞活性氧杀伤中起重要的调节作用。有学者发现, 人嗜中性粒细胞Mac-1与Fc受体 (CD16) 在结构与功能上关系密切, 人产脓链球菌Mac能阻碍抗体和补体与其受体的结合, 进而抑制细菌的吞噬作用。本研究结果表明:Ide E也具有杀菌抑制活性, 并且呈现剂量依赖性;Biotin标记的Ide E可结合到嗜中性粒细胞上, 阻止抗体/补体与嗜中性粒细胞的结合, 从而呈现抗吞噬活性。

摘要：为了研究链球菌的分子发病机制, 试验筛选了马链球菌随机基因组文库, 得到1个阳性克隆, 对拯救质粒进行测序, 确定插入片段编码成熟蛋白阅读框架的分子质量为39.6 ku, 经序列分析确定为IgG内切酶蛋白 (IdeE) , 与白细胞C3b受体Mac (CD11b) 具有同源性, 设计特异性引物PCR扩增该基因, 并对该蛋白进行克隆表达和功能分析。结果表明:该蛋白不能分解IgG, 但可以结合嗜中性粒细胞, 呈现剂量依赖性抗吞噬活性。

关键词：马链球菌,IgG内切酶蛋白,功能分析

参考文献

[1]AGNISWAMY J, LEI B, MUSSER J M, et al.Insight of host immune evasion mediated by two variants of group a Streptococcus Mac protein[J].J Biol Chem, 2004, 279 (50) :52789-52796.

[2]ALBER J, EL-SAYED ESTOEPANGESTIE A, LMMLER S C, et al.Dissemination of the superantigen encoding genes seeL, seeM, szeL and szeM in Streptococcus equi subsp.equi and Streptococcus equi subsp.ooepidemicus[J].Vet Microbiol, 2005, 109:135-141.

[3]BOSCHWITZ J S, TIMONEY J F.Characterization of the antiphagocytic properties of fibrinogen for Streptococcus equi subsp.equi[J].Microb Pathog, 1994, 17:121-129.

[4]VERMA A, ARTIUSHIN S, MATSUNAGA J, et al.LruA and LruB, novel lipoproteins of pathogenic leptospira interrogans associated with equine recurrent uveitis[J].Infect Immun, 2005, 73 (11) :7259-7266.

功能重组 篇2

1 基于渠道功能视角的渠道模式定义

对于新的渠道模式的定义, 学术界还没有统一的认识, 因此, 在讨论问题之前, 本文将对相关的渠道模式进行界定, 以此使研究能够在统一的语言环境下进行, 避免不必要的误解。

营销渠道是指产品或服务转移所经过的路径, 由参与产品或服务转移活动以使产品或服务便于使用或消费的所有组织构成[1]。从根本上来讲, 渠道的任务是使产品从生产者转移到消费者的整个过程顺畅、安全、高效, 最大限度地消除或缩小产品供应与消费需求之间在时间、地点、产品品种和数量上存在的差异[2]。因此, 渠道完成的主要功能流程包括:实体流、所有权流、促销流、洽谈流、融资流、风险流、订货流、付款流和信息流等流程。

本文依据渠道成员包括制造商和零售商承担功能流程的不同, 对渠道模式进行了划分。无论是网上还是网下, 均将渠道模式分为:自营渠道、传统渠道模式和店中店模式。

(1) 自营渠道, 是指制造商 (代理商) 通过租赁 (购买) 柜台、店铺或者自建网站的方式, 销售自己生产的产品。在这种情况下, 制造商需要完成渠道功能的所有流程, 包括实体流、所有权流、促销流等, 要么零售商只收取租金而不承担任何渠道功能, 要么完全不存在零售商。

现实中, 依旧存在很多自营渠道。实体店方面, 例如国内的大型家电企业格力、海尔, 厨卫生产商华帝, 知名酒厂茅台等, 均在一定程度上选择自营渠道这一模式, 尤其在二、三线城市中, 自营渠道的应用更为广泛。

(2) 传统渠道模式, 是指零售商买断制造商 (代理商) 的产品, 在自己的店铺进行销售, 而销售的相关功能流程零售商需要全部承担, 由此产生的利润或亏损也完全由零售商承担。在传统模式下, 制造商不需要承担库存产生的相关风险, 但其可能也无法准确、及时地获得消费者的相关信息。

如今, 传统渠道模式的应用处于相对弱势的地位。在实体店方面, 除大型超市以外 (除沃尔玛外大部分超市也开始应用店中店模式) , 更多的是一些中小型的零售商在采用这一模式销售产品;而网络上, 包括京东、新蛋等一些老牌的网络零售商均采用这一渠道模式为主要运营方式。

(3) 店中店模式, 是一种由制造商 (代理商) 和零售商通过渠道功能重新组合、分配而形成的一种新的渠道合作模式。在该模式下, 制造商在零售商的店内或网络零售商的平台上开店进行销售, 同时, 零售商的收益来自于制造商的销售额提成, 而制造商则拥有商品销售的大部分自主权, 包括库存的管理、最终销售的定价权、店内员工的雇佣和培训以及提供店内的其他服务[3]。零售商为制造商提供经营场地以及相应的综合管理 (促销、店面、卫生、安全、环境等) , 监督制造商销售的商品或销售人员等服务[4]。

近年来, 这一模式已经得到了众多国际知名企业的应用, 例如, 梅西百货、布鲁明代百货公司、内曼·马库斯百货公司等零售商, 以及香奈儿、雅诗兰黛、兰蔻、魅可、迪奥、拉尔夫劳伦、卡尔文克莱因、DKNY、Kenneth Cole、路易威登、Thomas Pink、BCBG、吉尔桑达等大量的生产制造企业。而在国内零售业中, 店中店模式几乎完全替代了传统模式, 占据了主导性地位。绝大部分的生产制造企业与零售商的合作模式均为店中店模式, 该模式在百货业的销售额中占比高达80%以上, 甚至在有的百货公司销售额占比高达92%[5]。同时, 在家电连锁企业、超市中, 店中店模式也是零售商与制造企业采用的主要合作模式之一。

在网络渠道中, 天猫 (淘宝商城) 中的店铺绝大部分是属于店中店这一渠道模式的。在天猫中销售产品的店铺, 拥有销售的大部分自主权, 但同时也要接受天猫的监督, 包括店铺的产品质量 (真伪) 、服务质量等。正是因为天猫的监督, 消费者对于天猫上的产品更加信任, 从而促进了天猫上店铺的销售。正因为渠道模式选择的正确, 天猫在整个网络零售市场中的份额一直高居榜首 (来自艾瑞咨询的数据显示, 今年一、二季度天猫的销售额在网购市场上的占比高达50%左右) , 以至于在最近京东商城也宣布允许厂商 (代理商) 进驻, 在其平台上销售产品。

2 不同渠道模式的优缺点分析

根据三种渠道模式的定义以及在实际中的使用情况, 本文对它们的优缺点进行了总结, 如表1所示。

由表1可以看出, 有别于前两种渠道模式, 在店中店模式下, 渠道的功能将由制造商和零售商共同承担, 根据网上网下销售的特点, 渠道成员承担的渠道功能也有所不同。在实体店中, 零售商更多地承担了现场监督的作用, 包括辅助制造商监督店面、促销以及销售人员的工作情况, 而之前由零售商承担的库存管理、定价等功能则改为由制造商承担。零售商由此将从繁杂的渠道管理工作中抽身, 将更多的精力用于卖场的管理上。同时, 制造商则拥有了销售的更大自主权, 可以制定更加合理的零售价格;能够根据自身产品的特点, 提供特色化的服务;并且通过直接接触消费者, 快速准确地获得消费者的需求信息, 进一步地改善自身产品以满足消费者的需求。在网络中, 除上述店中店的优势以外, 由于网购的特殊性, 消费者对卖家的信任度较低、一直是阻碍网购发展的一个重要因素。因此, 网络零售商 (如天猫) 则更多地承担了第三方公证、监督者的作用, 包括提供第三方认证、第三方支付以及产品退换货的监督等责任。通过网络零售商提供的这些服务, 能够较大程度地消除消费者在网购过程中的不确定性感知, 增强消费者对网络卖家的信任程度, 从而提高了制造商 (代理商) 和网络零售商的收益。综上所述, 可以看到无论是线上还是线下, 店中店模式在本质上是一种渠道功能的重组, 制造商和零售商分别承担各自擅长且需要承担的渠道功能, 进而提高了渠道成员和渠道整体的效率。

3 店中店模式的适用范围及其未来的发展方向

在未来很长一段时间内, 自营模式、传统渠道模式以及店中店模式将共同存在、互为补充。上述三种渠道模式存在各自不同的优缺点, 制造商与零售商应根据销售地区的实际情况, 结合自身产品的特点, 选择适合的渠道模式。

首先, 在一、二线城市, 因为大型零售商的大量存在, 对于高端品牌的制造商应该更多地选择店中店模式与零售商合作, 这样有利于制造商通过自主定价控制销售价格, 这也是百货业店中店模式占据主导地位的原因。

其次, 对于那些库存成本较大, 面对的消费者需求不确定性较高的制造商而言, 店中店模式同样是一种更加有利的选择, 因此在超市的三鲜品类上, 可以看到其主要的经营方式同样是店中店模式。

最后, 网购市场中, 店中店模式同样具有其他模式不可比拟的优势, 网络零售商作为第三方监督者的作用, 能够降低消费者的风险感知, 增加消费者对网购产品的信任, 而传统的网络零售模式则很难实现上述目标。因此, 未来渠道模式的发展将是进一步对渠道功能的重组和细化, 制造商和零售商不同于自营渠道和传统渠道中的功能划分那样简单, 他们需要根据市场的环境、产品的特点、社会的发展, 根据各自的能力承担不同的渠道功能, 进而演化出更加适应现实的渠道模式。

摘要：本文从渠道的流通功能角度, 探讨了不同渠道模式下, 制造商和零售商所需要承担的不同渠道功能;并且分别在实体渠道和网络渠道中, 分析了传统渠道模式、自营渠道以及店中店模式下, 渠道成员各自所承担的渠道功能及不同渠道模式的优缺点;进而在此基础上, 探讨了零售业中网上和网下店中店模式如此流行的主要原因;最后, 给出店中店模式的适用情况和未来渠道变革的可能方向。

关键词：渠道模式,流通功能,渠道变革,店中店模式

参考文献

[1]Coughlan, A., Anderson, E., Stern, L.W.and El-Ansary, A.I.Marketing Channels (6th Edn.) , Beijing:Tsinghua University Press, 2000.

[2]庄贵军, 周筱莲, 王桂林.营销渠道管理[M].北京大学出版社, 2004.

[3]Jerath K, Zhang ZJ.Store Within a Store[J].Journal of Marketing Research, 2010, 47 (4) .

[4]李飞.中国百货店:联营, 还是自营[J].中国零售研究, 2010 (01) .

重组与人血白蛋白功能一致性分析 篇3

HSA注射液主要用于临床急症的治疗, 比如失血性外伤、烧伤、休克、脑水肿、肾水肿及肝硬化等。同时, 它也用于治疗慢性消耗性疾病、营养不良或药物导致的低蛋白血症[4]。我国目前主要使用血源制剂, 受血源短缺的影响, HSA注射液供不应求。利用基因工程制备大量重组白蛋白 (recombinant human serum albumin, r HSA) 替代血源制剂是一个有效的解决方法, 也是未来的发展方向。

虽然理论上r HSA与HSA是一样的, 但使用r HSA替代HSA用于临床治疗前, 尚需对二者的生物一致性进行验证, 包括结构一致性和功能一致性验证。本课题组前期已利用籽晶技术成功生长了r HSA与HSA的高质量晶体, 并利用X-射线单晶衍射技术解析了r HSA与HSA的三维结构, 对其结构一致性进行了对比分析。结果表明, r HSA与HSA的结构相似性可达99%, 二者的三维结构实质上是一致的。

本研究利用盐酸阿霉素 (adriamycin hydrochloride, ADR) [5]与嘌呤霉素氨基核苷 (puromycin aminonucleoside, PAN) [6]分别构建肾功能障碍型与高腹水型低蛋白血症大鼠模型, 通过r HSA与HSA治疗作用验证二者的功能一致性。结果表明, 与HSA相比, r HSA有相似或更好的治疗效果, r HSA与HSA治疗均能明显增加ADR或PAN模型大鼠的日平均尿量, 改善大鼠异常生化指标, 改善大鼠肝肾功能, 减少大鼠腹水量, 降低大鼠死亡率, 本研究结果为r HSA替代HSA用于临床治疗与其他应用提供了科学依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

r HSA由华北制药集团有限责任公司新药研发中心利用大规模发酵技术在毕赤酵母表达体系中高效表达并纯化, HSA购自上海阿拉巴马药业有限公司 (Alburaas Pharmaceutical Ltd., Shanghai, China) , ADR购自深圳万乐药业有限公司 (Wanle Pharmaceutical Ltd., Shenzhen, China) , PAN购自美国Sigma公司 (Sigma-Aldrich Corporation, America) , 所有试剂和药品均未进行进一步纯化直接用于实验研究。

清洁级SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心 (Laboratory Animal Center, Fourth Military Medical University, Xi'an, China) 。本研究严格按照实验动物福利与使用指南 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, America) [7]的要求设计实验和使用实验动物, 本研究实验方案由第四军医大学实验动物福利与伦理委员会批准实施 (Laboratory Animal Welfare&Ethics Committee of Fourth Military Medical University, Permit Number:12021) 。实验过程满足所有实验动物福利要求, 并尽可能减少动物痛苦。实验结束后, 所有实验动物禁食过夜, 自由饮水, 使用乙醚麻醉, 采用颈椎脱臼法处死, 自腹主动脉抽血检测生化指标。

大鼠体重为190~210 g, 采用标准条件饲养:全价颗粒饲料单笼饲养, 饲养室温度为 (24±2) ℃, 相对湿度为40%~60%, 每天12 h光照。大鼠购回先饲养3 d适应环境后, 选择健康无孕大鼠 (雌雄各半) 作为实验动物。

1.2 分组方法

大鼠饲养3 d适应环境后, 选择健康大鼠144只, 随机将其分成12组, 每组12只大鼠, 雌雄各半, 雌性无孕。其中6组用于ADR模型实验, 6组用于PAN模型实验。6组分别包括空白组、模型组, HSA治疗组, 以及3个不同剂量的r HSA治疗组。空白组大鼠, 既不构建病理模型, 也不使用药物治疗, 仅注射等剂量生理盐水作为阴性对照组;模型组大鼠, 只使用ADR或PAN构建低蛋白血症病理模型, 而不使用药物进行治疗, 仅注射等剂量生理盐水作为阳性对照组;HSA治疗组大鼠, 先使用ADR或PAN构建病理模型, 再使用HSA (1 000 mg/kg) 进行治疗;3个r HSA治疗组大鼠, 先使用ADR或PAN构建病理模型, 再使用不同剂量的r HSA (500 mg/kg, 1 000 mg/kg与2 000 mg/kg) 进行治疗。

1.3 病理模型构建

(1) ADR模型构建

6组大鼠使用ADR造模。第一天, 模型组和4个治疗组大鼠使用ADR (7.5 mg/kg) 尾静脉注射一次构建肾功能障碍型低蛋白血症模型[5]。空白组大鼠注射等剂量生理盐水作为阴性对照。

(2) PAN模型构建

6组大鼠使用PAN造模。自第一天开始, 模型组和4个治疗组大鼠使用PAN[4 mg/ (rat·d) ]连续尾静脉注射5 d构建高腹水型低蛋白血症模型[6]。空白组大鼠注射等剂量生理盐水作为阴性对照。

1.4 治疗方案

预实验结果表明, 使用剂量为1 000 mg/kg或2 000 mg/kg r HSA治疗即可取得明显治疗效果。实验大鼠体重均为190~210 g, 且PAN可诱导大鼠产生明显腹水, 影响按体重给药剂量。因此, 本研究均按照大鼠体重为200 g给药:HSA治疗组剂量为1 000 mg/kg (200 mg/rat) ;3个不同剂量的r HSA治疗组的剂量为500 mg/kg (100 mg/rat) , 1 000 mg/kg (200 mg/rat) 与2 000 mg/kg (400 mg/rat) 。

(1) ADR模型。ADR模型大鼠自第8天开始治疗, HSA治疗组和3个不同剂量r HSA治疗组分别按照各自给药剂量每天分2次, 即每6小时尾静脉注射HSA或r HSA, 连续治疗7 d。空白组与模型组大鼠分别注射等剂量生理盐水作为阴性对照与阳性对照。

(2) PAN模型。PAN模型大鼠自第6天开始治疗, HSA治疗组和3个不同剂量r HSA治疗组分别按照各自给药剂量每天分2次, 即每6小时尾静脉注射HSA或r HSA, 连续治疗3 d。空白组与模型组分别注射等剂量生理盐水作为阴性对照与阳性对照。

1.5 治疗评估参数

所有大鼠均在标准条件下单笼饲养 (苏州市苏杭科技器材有限公司, 苏州) , 每天2次观察与检测大鼠死亡情况与日常状况, 如体重、进食量、24 h尿量 (8∶00~20∶00, 20∶00~8∶00) 等。

实验结束后, 所有大鼠禁食过夜, 自由饮水, ADR模型大鼠于第16天早晨, PAN模型大鼠于第10天早晨, 使用乙醚麻醉后采用颈椎脱臼法处死, 自腹主动脉抽血, 使用小动物全自动生化分析仪 (400 PLUS, Roche Ltd., Swizerland) 检测如下生化指标:血清白蛋白 (serum albumin, ALB) , 血清总蛋白 (total protein, TP) , 谷丙转氨酶 (glutamic-pyruvic transaminase, ALT) , 谷草转氨酶 (glutamic oxalacetic transaminase, AST) 与尿素氮 (urea nitrogen, BUN) 。此外, PAN模型组大鼠抽取腹水并检测腹水量。

1.6 统计学方法

本研究采用t检验分别分析每个治疗组与模型组两组间差异的显著性, 计量资料用±s表示, 当P<0.05时, 为差异具有统计学意义。

2 结果

空白组大鼠在实验期间状态正常, 模型组与4个治疗组大鼠使用ADR或PAN构建低蛋白血症模型后, 表现出进食减少、自主活动减少、闭目休息, 立毛或脱毛等症状, 检测发现大鼠尿量减少, 生化指标异常。4个治疗组使用r HSA或HSA治疗后, 大鼠日平均尿量增加, 异常生化指标改善, 腹水量减少, 死亡率降低。结果显示, 与HSA治疗组相比, r HSA治疗组具有相似或较好治疗效果。

2.1 死亡率

ADR造模后, 空白组没有大鼠死亡, 模型组12只大鼠中有5只死亡, 4个治疗组中均各有1只大鼠死亡。结果表明, r HSA与HSA对ADR诱导的肾功能障碍型低蛋白血症模型大鼠具有相似的治疗效果, 能明显降低大鼠死亡率。

PAN造模后, 6组均无大鼠死亡。

2.2 体重

r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠体重均无明显影响, 见图1。6组ADR模型与6组PAN模型大鼠体重变化趋势相似。空白组大鼠体重缓慢增长, 模型组大鼠体重逐渐降低, 4个治疗组大鼠在造模后体重有所下降, 使用r HSA或HSA治疗后体重有所增加。t检验结果显示, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠体重均无明显差异 (P>0.05, x軃±s, n1=7, n2=11 (ADR model) 或n=12 (PAN model) 。

注: (A) ADR模型; (B) PAN模型。r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠体重均无明显影响, t检验分析结果显示, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠体重均无明显差异 (P>0.05, ±s, n1=7, n2=11 (ADR model) 或n=12 (PAN model) ) 。

2.3 日平均摄食量

r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠日平均摄食量均无明显影响, 见图2。图2A中, ADR造模后, 空白组大鼠日平均摄食量缓慢增长, 模型组大鼠日平均摄食量缓慢下降, 4个治疗组大鼠在造模后日平均摄食量有所下降, 使用r HSA或HSA治疗后日平均摄食量有所增加。图2B中, PAN造模后, 空白组大鼠日平均摄食量缓慢增长, 模型组与4个治疗组大鼠在构建模型后日平均摄食量有所下降, 使用r HSA或HSA治疗后日平均摄食量有所增加。t检验结果显示, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均摄食量均无明显差异[P>0.05, x軃±s, n1=7, n2=11 (ADR model) 或n=12 (PAN model) ]。

注: (A) ADR模型; (B) PAN模型。r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠日平均摄食量均无明显影响, t检验结果表明, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均摄食量均无明显差异[P>0.05, ±s, n1=7, n2=11 (ADR model) 或n=12 (PAN model) ]。

2.4 日平均尿量

ADR或PAN造模后, 大鼠日平均尿量均明显降低, r HSA或HSA治疗均能明显增加其日平均尿量 (图3) 。

图3A中, ADR造模后, 空白组大鼠日平均尿量保持稳定, 模型组大鼠日平均尿量从造模前的15 m L降至实验结束时的3 m L。使用r HSA或HSA治疗1 d后, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均尿量下降趋势减缓。治疗5 d后, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均尿量均明显上升。治疗7 d后, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均尿量显著增加, 基本恢复正常水平。t检验结果显示, 与模型组相比, 2 000 mg/kg r HSA治疗组大鼠日平均尿量差异极显著 (P<0.01, x軃±s, n1=7, n2=11) , 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA治疗组, HSA治疗组差异显著 (P<0.05, x軃±s, n1=7, n2=11) 。结果显示, 1 000 mg/kg r HSA治疗对ADR模型大鼠日平均尿量改善与1 000 mg/kg HSA相当, 而500 mg/kg与2 000 mg/kg r HSA的治疗效果优于HSA。

图3B中, PAN造模后, 空白组大鼠日平均尿量保持稳定, 模型组大鼠日平均尿量从造模前的15 m L降至实验结束时的7 m L。使用r HSA或HSA治疗1 d后, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均尿量下降趋势减缓。治疗3 d后, 与模型组相比, 4个治疗组大鼠日平均尿量明显增加, 基本恢复正常水平。t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA治疗组差异显著 (P<0.05, x軃±s, n=12) , 2 000 mg/kg r HSA, 1 000 mg/kg HSA治疗组差异不明显 (P>0.05, x軃±s, n=12) 。结果显示, 2 000 mg/kg r HSA治疗对PAN模型大鼠日平均尿量改善与1 000 mg/kg HSA相当, 而500 mg/kg与1 000 mg/kg r HSA的治疗效果优于HSA。

注: (A) ADR模型; (B) PAN模型。r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠日平均尿量具有明显改善作用。图3A中的ADR模型, t检验结果显示, 与模型组相比, 2 000 mg/kg r HSA治疗组差异极显著 (P<0.01, ±s, n1=7, n2=11) , 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA治疗组, HSA治疗组差异显著 (P<0.05, ±s, n1=7, n2=11) 。图3B中的PAN模型, t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA治疗组差异显著 (P<0.05, ±s, n=12) , 2 000 mg/kg r HSA, 1 000 mg/kg HSA治疗组差异不明显 (P>0.05, ±s, n=12) 。

2.5 生化指标

ADR或PAN造模可损伤大鼠肝功能, 使其生化指标发生异常, 大鼠出现ALB与TP下降, ALT、AST与BUN升高。使用r HSA与HSA治疗后可不同程度改善大鼠异常生化指标, 如图4所示。

图4A中, ADR模型大鼠使用r HSA或HSA治疗后, 其异常生化指标有所改善。对于ALB与TP, 1 000 mg/kg与2 000 mg/kg r HSA治疗效果与HSA相似, 而500 mg/kg r HSA治疗效果比HSA略差。对于AST, 3个不同剂量r HSA治疗效果均优于HSA。对于ALT与BUN, r HSA与HSA治疗效果相似。t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA对AST改善差异显著 (P<0.05, x軃±s, n=12) , 2 000 mg/kg r HSA, HSA对AST改善差异不明显 (P>0.05, x軃±s, n=12) , 对于ALB, TP, ALT与BUN的改善, 与模型组相比, 4个治疗组差异均不明显 (P>0.05, x軃±s, n=12) 。

图4B中, PAN模型大鼠使用r HSA或HSA治疗后, 其异常生化指标有所改善。对于ALB与TP, 1 000 mg/kg与2 000 mg/kg r HSA治疗效果与HSA相似, 而500 mg/kg r HSA治疗效果比HSA略差。对于AST, 3个不同剂量的r HSA治疗效果均优于HSA。对于ALT, 1 000 mg/kg与2 000 mg/kg r HSA治疗效果与HSA相似, 而500 mg/kg r HSA治疗效果比HSA略差。对于BUN, 3个不同剂量的r HSA与HSA治疗效果相似。t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA对AST改善差异显著 (P<0.05, x軃±s, n=12) , 2 000 mg/kg r HSA, HSA对AST改善差异不显著 (P>0.05, x軃±s, n=12) , 对于ALB, TP, ALT与BUN的改善, 与模型组相比, 4个治疗组差异均不明显 (P>0.05, x軃±s, n=12) 。

2.6 腹水

PAN造模能诱导大鼠产生严重腹水, r HSA与HSA治疗可明显减少腹水量, 如图5所示。

PAN造模后, 空白组大鼠无腹水, 模型组大鼠约有3 m L腹水, 使用2 000 mg/kg r HSA与1 000 mg/kg HSA治疗后, 腹水明显减少至约1.8 m L, 而500 mg/kg与1 000 mg/kg r HSA治疗对大鼠腹水无明显影响。t检验结果显示, 与模型组相比, 4个治疗组均无明显差异 (P>0.05, x軃±s, n=12) 。

PAN造模可导致大鼠肝肾损伤, 导致大鼠发生严重腹水。r HSA与HSA治疗能明显改善其肝肾功能, 减少大鼠腹水量。结果显示, 2 000 mg/kg r HSA与1 000 mg/kg HSA治疗效果相似, 说明r HSA能替代HSA用于治疗PAN诱导产生的腹水, 但是可能需要增加剂量。

3 讨论

HSA注射液主要用于临床急症和低蛋白血症的治疗。国外已有重组白蛋白制剂上市, 而我国目前主要使用血源制剂, 受血源短缺的影响而供不应求。利用基因工程制备大量r HSA替代血源制剂是一个有效的解决方法, 也是未来的发展方向。华北制药集团有限责任公司利用大规模发酵技术在毕赤酵母表达体系中高效表达了r HSA, 表达量已接近国际先进水平, 有望成为我国首家上市重组白蛋白制剂的制药公司。

注: (A) ADR模型; (B) PAN模型。r HSA或HSA治疗对ADR或PAN模型大鼠异常生化指标具有相似改善作用。图4A中的ADR模型, t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 2 000 mg/kg r HSA对AST的改善差异显著 (P<0.05, ±s, n1=7, n2=11) , 1 000 mg/kg r HSA, HSA对AST改善差异不明显 (P>0.05, ±s, n1=7, n2=11) , 对ALB, TP, ALT与BUN的改善, 与模型组相比, 4个治疗组差异均不明显 (P>0.05, ±s, n1=7, n2=11) ;图4B中的PAN模型, t检验结果显示, 与模型组相比, 500 mg/kg, 1 000 mg/kg r HSA对AST的改善差异显著 (P<0.05, ±s, n=12) , 2 000 mg/kg r HSA, HSA对AST改善差异不显著 (P>0.05, ±s, n=12) , 对于ALB, TP, ALT与BUN的改善, 与模型组相比, 4个治疗组差异均不明显 (P>0.05, ±s, n=12) 。

注:2 000 mg/kg r HSA与1 000 mg/kg HSA治疗效果相似;其他2个剂量r HSA对大鼠腹水均无明显影响。t检验结果显示, 与模型组相比, 4个治疗组均无明显差异 (P>0.05, ±s, n=12) 。

虽然理论上r HSA与HSA是一样的, 但使用r HSA替代HSA用于临床治疗前, 尚需对二者的生物一致性进行验证, 包括结构一致性与功能一致性验证。本课题组前期研究结果表明, r HSA与HSA的结构相似性可达99%, 二者的三维结构实质上是一致的。本研究利用ADR或PAN构建大鼠低蛋白质血症模型, 通过r HSA与HSA治疗作用验证二者的功能一致性。研究表明, 与HSA相比, r HSA具有相似或更好的治疗效果, r HSA或HSA治疗均能明显增加ADR或PAN诱导的低蛋白血症大鼠日平均尿量, 改善大鼠异常生化指标, 改善其肝肾功能, 减少其腹水量, 降低大鼠死亡率。本研究结果为r HSA替代HSA用于临床治疗或其他用途提供了科学依据和理论支持。

大鼠的日平均尿量与生化指标是反映大鼠肝肾功能的重要指标。ADR是含醌的蒽环抗生素, 广谱抗肿瘤药物, 具有强烈的细胞毒性和肝肾毒性。ADR造模后, 导致大鼠日平均尿量显著下降, 生化指标异常, 大鼠死亡率增加。说明ADR造模严重损伤了大鼠的肝肾功能, 甚至造成致命性损伤。PAN是一种蛋白质合成抑制剂, 具有一定肝肾毒性。PAN造模后, 导致大鼠日平均尿量明显下降, 生化指标异常, 大鼠发生严重腹水, 但大鼠无一死亡。说明与ADR相比, PAN毒性相对较小, 虽然PAN造模对大鼠的肝肾功能造成一定损伤, 但未对大鼠造成致命性损伤。

使用r HSA或HSA治疗后, 大鼠日平均尿量显著增加, 异常生化指标改善, 腹水减少, 死亡率明显下降, 说明r HSA与HSA具有相似的治疗效果, 二者均能通过补充外源白蛋白, 修复ADR或PAN导致的大鼠肝肾损伤, 增加日平均尿量, 改善大鼠异常生化指标, 减少腹水, 降低大鼠死亡率。本研究结果为r HSA替代HSA用于临床治疗或其他用途提供了科学依据和理论支持。

结构决定功能。虽然研究结果表明r HSA与HSA治疗作用相似, 但毕竟不完全一致。课题组前期研究发现r HSA与HSA三维结构相似性可达99%, 毕竟还有差异, 也许三维结构的细微差异是导致r HSA与HSA功能差异的原因。

摘要：目的 通过对本研究构建的两种低蛋白血症模型SD大鼠的治疗作用, 探讨重组白蛋白 (rHSA) 与人血白蛋白 (HSA) 在功能方面是否存在差异, 为rHSA替代HSA用于临床治疗与其他应用提供科学依据和理论支持。方法 本研究利用阿霉素与嘌呤霉素分别构建肾功能障碍型与高腹水型低蛋白血症大鼠模型, 通过rHSA与HSA的治疗作用验证二者的功能一致性。结果 与HSA相比, rHSA具有相似或更好的治疗效果, 二者均能明显增加阿霉素或嘌呤霉素模型大鼠的日平均尿量, 改善大鼠异常生化指标, 改善大鼠肝肾功能, 减少大鼠腹水量, 降低大鼠死亡率。结论 与HSA相比, rHSA有相似或更好的治疗效果, 有能力替代HSA用于临床治疗或其他应用, 本研究结果为rHSA的应用提供了科学依据和理论支持。

关键词：重组白蛋白,人血白蛋白,低蛋白质血症,大鼠

参考文献

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功能重组 篇4

人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene 4, ECRG4)是重要的食管癌相关的新基因[5,6]。我们发现,人食管癌相关基因4的基因表达的下降在食管鳞状细胞癌的发生中具有非常重要的地位。目前,人食管癌相关基因4蛋白的生物学抑制肿瘤生长的功能还不清楚。我们的初期研究结果表明,人食管癌相关基因4是食管癌的候选抑癌基因,人食管癌相关基因4蛋白是食管癌预后的标志物。人食管癌相关基因4可以通过参与炎症反应的中心通路,并且下调炎症产物环氧化酶-2的表达来发挥其抑制肿瘤细胞生长的功能[7,8,9]。Mori等[10] 研究进一步证实了我们的结论。

以往的研究表明,人食管癌相关基因4是肿瘤相关抑癌基因,人食管癌相关基因4的表达过量能够抑制肿瘤细胞的生长增殖[7]。然而,关于人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位和抗肿瘤增殖功能国内还未见报道。本实验中,我们检测人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位,同时进一步研究纯化的重组人食管癌相关基因4蛋白的体外抑癌功能,研究重组人食管癌相关基因4蛋白能否成为未来的食管癌的生物治疗药物。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

我们采用人的食管癌细胞系EC9706和NEC,和动物的永生化细胞株HEK293。实验细胞细胞培养利用含有10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素的RPMI1640培养基,培养条件为37 ℃和5% CO2 的饱和湿度培养箱。实验用的DMEM培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素等试剂都购买于美国Gibco公司。医学科学院肿瘤研究所自己研制了抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体[7]。羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位

1)内源性:将EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中,等到肿瘤细胞生长到符合条件,采用即时准备的4%多聚甲醛固定肿瘤细胞10 min。PBS溶液冲洗三次。0.2% triton X-100细胞通透化处理10 min。PBS溶液冲洗三次。再利用即时准备的2%BSA封闭30 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时稀释的抗人食管癌相关基因4蛋白的多克隆抗体,在温箱中放置1 h。PBS洗三遍,5 min/次。加入荧光标记的二抗,室温孵育45 min。PBS溶液冲洗三次。然后我们再加入即时准备的0.5 μg/ml的DAPI溶液染色15 min。PBS溶液冲洗三次。最后我们加入即时准备的20 μl 封片剂封片,冰箱中备用。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。DAPI(蓝色)染细胞核。2)外源性:我们利用NEC肿瘤细胞转染标记了绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4的基因质粒,表达出了伴随有绿色荧光蛋白的人食管癌相关基因4蛋白。具体步骤为将 EC9706肿瘤细胞接种到准备好的培养皿中,等到肿瘤细胞生长到符合条件,参照LipofectminTM2000试剂盒的说明分别转染pEGFP-N1-ECRG4及空载质粒。2 d后扔掉肿瘤细胞培养基,PBS溶液冲洗三次,取出玻片,然后用4%的多聚甲醛固定肿瘤细胞30 min。PBS溶液冲洗三次,然后在玻片上加入一定的甘油缓冲液(将NaHCO3 3.7 g和 Na2CO3 0.6 g溶于100 ml去离子水中,用NaOH调pH至9.5,加入等量的甘油,充分混合),盖在载玻片上,封片,防止气泡产生。荧光照相装置利用激光共聚焦显微镜拍照定位。

1.3 分泌蛋白的检测

计数瞬转后培养24 h的EC9706/pcDNA3.1 和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4 细胞,然后我们扔掉肿瘤细胞培养基,然后肿瘤细胞离心15 min,然后我们用滤膜过滤肿瘤细胞培养液,滤过液Heto FD3(Heto-Holten, Denmark) 浓缩。

1.4 MTT肿瘤细胞抑制实验

将一定数量的EC9706肿瘤细胞接种到细胞培养板中,然后利用PBS溶液冲洗肿瘤细胞培养孔三次,然后我们用相应的浓度的重组人食管癌相关基因4蛋白溶液处理肿瘤细胞,并设立对照实验组, 肿瘤细胞再继续培养48 h,检测时我们每孔加入即时配制的MTT溶液15 μl,然后肿瘤细胞再培养4 h,最后我们扔掉肿瘤细胞培养液,每孔中再加入DMSO溶液150 μl,混匀溶液,最后我们利用酶标仪测定溶液吸光度值。

1.5 统计学方法

使用SPSS 11.0 软件进行实验的统计分析,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人食管癌相关基因4蛋白的定位

1)内源性:利用免疫荧光染色的方法证实内源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位是位于细胞中的细胞质部位。2)外源性:利用绿色荧光蛋白标记人食管癌相关基因4蛋白的方法证实,外源性表达的人食管癌相关基因4蛋白的定位也位于细胞中的细胞质部位。

2.2 人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白

利用 Western blot 的检测方法证实,人食管癌相关基因4蛋白是分泌性蛋白。

2.3 重组人食管癌相关基因4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖

利用 MTT检测的方法证实,重组人食管癌相关基因4蛋白能够在细胞培养液中抑制肿瘤细胞的生长增殖(P< 0.05)。

3 讨论

人食管癌相关基因4是与食管癌发生发展相关的重要的新基因,因此研究人食管癌相关基因4蛋白的生物学功能将具有重要的意义。研究结果表明内源性和外源性人食管癌相关基因4蛋白都定位于细胞质。而生物信息学分析提示,组成人食管癌相关基因4蛋白的148个氨基酸中,1-31个氨基酸为信号肽,是重要的分泌性蛋白质。本研究中,我们利用 Western blot 的检测方法证实,人食管癌相关基因4蛋白的确是分泌性蛋白质。而且,研究中我们进一步通过优化条件表达和纯化出大量可溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白。实验结果表明,我们表达和纯化的水溶性的重组人食管癌相关基因4蛋白具有体外抑制肿瘤细胞增殖的生物学功能活性,为进一步研究人食管癌相关基因4蛋白的晶体结构和独特的抗肿瘤生物学功能创造了有利条件。

更重要的是,纯化的水溶性重组人食管癌相关基因4蛋白可以作为食管癌的潜在治疗药物,值得进一步深入的进行体内抗癌作用和抗癌作用机理研究。我们的结果首次证明了人食管癌相关基因4蛋白是分泌蛋白。目前,我们正在进一步深入的研究人食管癌相关基因4蛋白的体内外抑癌功能和作用机理,阐明其在食管癌发生中的作用。

摘要：目的 探讨人食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene4,ECRG4)蛋白的亚细胞定位和重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。方法 用激光扫描共聚焦显微镜成像法和Western blot方法检测ECRG4蛋白的定位;用MTT方法检测纯化的重组ECRG4蛋白的体外抑癌功能。结果 激光扫描共聚焦显微镜成像显示,内源性和外源性ECRG4蛋白主要定位在细胞质。Western blot方法在细胞无血清培养液中检测到ECRG4蛋白存在,提示ECRG4蛋白是分泌蛋白。纯化的重组ECRG4蛋白可以体外抑制EC9706细胞的增殖,抑制率随着ECRG4蛋白浓度增加而升高,成剂量-效应关系(P<0.05)。结论 重组人ECRG4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖,可以作为ESCC的潜在治疗药物。

关键词：人食管癌相关基因4,重组蛋白,抑癌基因,分泌蛋白

参考文献

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功能重组 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2011年4月-2013年5月收治的100例急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者作为观察对象, 其中男72例, 女28例, 年龄35~74岁, 平均年龄61.5岁。心功能Killip分级:Ⅱ级63例, Ⅲ级29例, Ⅳ级8例。将所有患者随机分为研究组和对照组, 每组50例, 两组患者在性别、年龄和心功能分级上的差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2纳入及排除标准

患者具有典型的心绞痛症状, 且发作时间超过0.5h;心电图发现至少有2个相邻导联ST段抬高>0.1mV (肢导) 或0.2mV (胸导) ;肌酸激酶同工酶水平高于正常范围上限2倍以上, 肌钙蛋白现阳性, 且动态演变出现。本文排除75岁以上, 合并严重肾脏、呼吸系统疾病和恶性肿瘤, 有既往急慢性心衰和心肌梗死病史以及有药物使用禁忌证的患者。

1.3 治疗方法

两组患者均行一般常规治疗, 卧床休息, 控制钠摄入, 同时服用利尿药、血管紧张素转化酶抑制剂、强心药、抗凝药、β-受体抑制剂等心血管药物, 对呼吸困难患者可适当吸氧, 维持体内水电解质平衡。研究组在此基础上行重组人脑利钠肽治疗, 首次负荷剂量1.5μg/kg静脉注射, 然后维持剂量0.007 5~0.01μg/ (kg·min) 静脉滴注, 共用3d。

1.4超声心电图检查

两组患者在治疗前和治疗1年后, 采用彩色多普勒超声分别测定左室射血分数 (LVEF) 、左室舒张末期内径 (LVEDD) 和左心房内径 (LAD) 三项指标, 仪器型号为飞利浦iE33超声心动图仪, 探头频率1~5MHz, 所有检查均由专业心脏超声医师操作。

1.5 疗效评价和随访

治疗2周后对患者进行疗效评价:患者心功能提升2级或以上为显效, 提升1级为有效, 未能提升达到1级为无效, 降低或死亡为恶化, 总有效为显效和有效之和。本文对所有患者进行治疗后1~2年的随访, 随访主要记录患者的不良心脏事件发生情况, 并及时救治。

1.6 统计学方法

本文的临床数据采用SPSS19.0软件处理分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间比较采用t检验, 计数资料的组间比较采用χ2检验, 以P<0.05表征数据之间的差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效与不良心脏事件发生情况比较

2周后, 研究组和对照组患者的治疗总有效率分别为94%和76%, 两组患者治疗效果的差异具有显著性 (P<0.05) , 见表1。随访记录显示, 研究组和对照组患者的不良心脏事件发生率分别为18%和44%, 两组间的差异同样存在显著性 (P<0.05) , 见表2。

注:P<0.05。

2.2 超声心电图指标比较

两组患者治疗前的LVEF、LVEDD和LAD 3项指标间的差异均无显著性 (P>0.05) , 而治疗1年后复查以上3项指标的差异则具有显著性 (P<0.05) , 见表3, 说明研究组治疗较对照组对心脏功能的改善更为明显。

注:P<0.05。

3 讨论

急性心肌梗死是心肌重构, 是导致心衰的常见原因, 其病理机制主要是冠状动脉急性闭塞, 短时间内导致心肌细胞不可逆性凋亡, 激发体内应激反应和代偿机制, 导致心缩能力下降, 心室扩张, 出现心衰[2]。脑利钠肽由心室分泌, 是一种内源性激素, 具有扩张血管, 降低心脏前后负荷, 增加心输出量的功能, 而无直接的正性肌力作用。心衰发生时, 内源性脑利钠肽虽能够维持代偿期的心脏功能, 但在失代偿期则无法对抗肾素-血管紧张素-醛固酮 (RAAS) 系统激活带来的不良影响。

因此, 补充外源性脑利钠肽不仅能降低心脏前后负荷, 改善血液流变性指标, 缓解肺水肿、呼吸困难等病症, 还能够抑制RAAS系统激活, 延缓心脏重塑作用, 降低患者的病死率[3]。本文结果显示, 重组人脑利钠肽可在2周迅速起效, 其疗效优于传统治疗方式。在随访过程与1年后的复查中, 其不良心脏事件发生率较低, 超声心电图指标有明显改善, 提示重组人脑利钠肽治疗急性心肌梗死合并泵功能衰竭导致的心肌重构, 能够显著改善心脏功能, 降低心脏损伤, 对心脏有良好的保护作用。

综上, 重组人脑利钠肽对急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者心肌重构具有良好的抑制效果, 可提高临床疗效, 改善患者预后, 减低心血管不良事件发生情况, 具有良好的临床推广价值。

摘要：目的:探讨重组人脑利钠肽对急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者心肌重构的影响。方法:将我院收治的100例急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者随机分为研究组和对照组各50例, 对照组行常规治疗, 研究组在此基础上采用重组人脑利钠肽治疗。对比两组患者的临床疗效、不良心脏事件发生率和超声心电图各指标。结果:研究组患者的治疗总有效率、不良心脏事件发生率和治疗1年后超声心电图的3项指标均显著优于对照组 (P<0.05) 。结论:重组人脑利钠肽对急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者心肌重构具有良好的抑制效果, 可提高临床疗效, 改善患者预后, 减低心血管不良事件发生情况, 具有良好的临床推广价值。

关键词：重组人脑利钠肽,急性心肌梗死,泵功能衰竭,心肌重构

参考文献

[1]唐学弘.重组人脑利钠肽对急性心肌梗死合并泵功能衰竭患者心肌重构的影响[J].现代中西医结合杂志, 2014, 23 (10) :1092-1093.

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功能重组 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性调查分析2011年1月~2014年6月我院收治的140例再生障碍性贫血并感染患者资料。入选标准:①符合《内科学》中关于AA的临床诊断标准[4];②由临床症状、病理检查等确诊;③无精神疾病史。排除标准:①对免疫抑制剂或激素过敏者;②合并有高血压、糖尿病等其他非感染性疾病者;③有严重肝肾功能障碍者;④妊娠及哺乳期妇女。将140例患者按治疗方式分为实验组(72例)和对照组(68例),实验组男43例,女29例;年龄23~49岁,平均(32.6±7.8)岁;上呼吸道感染19例,肺部感染14例,口腔黏膜感染13例,胃肠道感染12例,败血症14例。对照组男41例,女27例;年龄21~46岁,平均(31.8±7.6)岁;上呼吸道感染17例,肺部感染12例,口腔黏膜感染13例,胃肠道感染11例,败血症15例。两组性别、年龄、感染情况比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 治疗方法

两组患者均采用营养支持、抗感染等常规对症治疗。对照组采用环孢霉素(天津市中央药业有限公司,批准文号:20093879)治疗,5 mg/kg,2次/d,维持血药浓度为150~300 mg/m L,持续外周血细胞计数升高达平台期后逐渐减量;泼尼松龙片(上海信谊药厂有限公司,批准文号:20150906)每天1 mg/m L,连续治疗15 d后逐渐减量,至1个月后停用。实验组采用刺激因子联合环孢霉素治疗,给予rh G-CSF5(上海三维生物技术有限公司,批准文号:20150629),每天5μg/kg,同时服用环孢霉素,5 mg/kg,2次/d,连续治疗3个月。

1.3 观察指标和判断标准

外周血象及T细胞亚群变化分别于治疗前和治疗后3个月进行检测,血常规检查采集2 m L静脉血,用EDTA管抗凝,T细胞亚群检查采用流式细胞仪。

比较两组感染相关死亡率、克隆性演变发生率,其中,克隆性演变包括骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋白尿及急性髓系白血病等。

临床疗效根据1987年第四届全国再障学术会议修订的《再生障碍性贫血诊断标准与疗效标准》[5]。基本治愈:贫血、出血等临床症状完全消失,白细胞(WBC)水平达到4×109/L左右,血小板(PLT)达80×109/L,随访1年以上没有复发者;②显效:临床症状显著改善,PLT比治疗前有明显增加,WBC达3.5×109/L,随访3个月病情稳定或继续进步者;③有效:出血及贫血症状明显好转且基本稳定,在不输血情况下血红蛋白(Hb)较治疗前1个月增长30 g/L以上,并维持3个月不变;④无效:临床症状未见明显好转或加重。总有效=基本治愈+显效+有效。两组均在治疗1年后评定疗效。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验;等级资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗1年后临床疗效比较

实验组总有效率为95.83%,对照组总有效率为76.47%,实验组明显优于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2 两组感染相关死亡率比较

治疗后实验组感染相关死亡率为4.17%,对照组感染相关死亡率为14.71%,实验组低于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 两组克隆性演变发生率比较

治疗后实验组克隆性演变发生率为9.72%,对照组克隆性演变发生率为2.94%,实验组高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 两组外周血象及T细胞亚群变化比较

治疗前两组外周血WBC、PLT、Hb及T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+水平差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后两组WBC、PLT、Hb较治疗前升高,T细胞亚群CD3+、CD4+较治疗前下降,而CD8+较治疗前显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组治疗后WBC、PLT、Hb、CD8+水平明显高于对照组,CD3+、CD4+明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3 讨论

AA是恶性血液疾病常见的类型之一,AA的发病机制较复杂,主要与以下三点有关:①“种子”学说[6],即骨骼中造血干细胞缺陷;②“土壤”学说[7],即骨髓造血微环境出现异常;③“虫子”学说[8],即机体的免疫功能异常。其中,免疫功能异常被临床认为是AA主要的发病机制,因此,目前临床多采用免疫抑制疗法(immuno suppressive therapy,IST)和造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)作为最佳的治疗方法,但由于HSCT费用较高及来源困难等,使得IST成为临床主要的治疗手段[9,10]。

注:与治疗前比较,*P<0.05;与对照组治疗后比较,#P<0.05;WBC:白细胞计数;PLC:血小板计数;Hb:血红蛋白

抗胸腺球蛋白主要是通过T淋巴细胞促进造血干细胞生长,增强造血生长因子的敏感性[11]。环孢霉素A属免疫抑制剂,主要通过抑制T淋巴细胞的增殖,从而降低γ干扰素(IFN-)及白介素-2(IL-2)的产生[12]。采用rh G-CSF联合环孢霉素治疗,较单一采用环孢霉素治疗效果更为显著,可加强T淋巴细胞毒性,最大程度提高药物疗效,对AA的临床治疗效果具有极为重要的作用[13]。但是由于AA患者具有中性粒细胞缺乏的特点,因而机体自身抵抗力低下,极易发生感染[14]。因此,感染发生后,应在短时间内及时控制感染,以促进造血功能恢复,是AA治疗的关键。

rh G-CSF是一种造血生长因子,能有效促进造血干细胞的增殖、分化及成熟,从而促进骨髓造血功能恢复[15,16]。本研究显示,rh G-CSF具有以下几点作用机制:①促进中性粒细胞释放花生四烯酸及白细胞碱性磷酸酶,从而产生中性粒细胞超氧阴离子;②刺激中性粒细胞增殖和分化,从而增强成熟粒细胞吞噬作用;③增加白细胞数量的同时,增加白细胞的黏附性,发挥抗感染作用。故rh G-CSF对AA并感染患者的治疗具有极为重要的意义[17]。相关研究认为,将rh G-CSF应用于AA合并感染患者治疗中不仅效果显著,同时安全性和可行性也较好[18,19]。

本研究结果显示,实验组总有效率明显高于对照组,表明rh G-CSF联合免疫抑制法较单一采用免疫抑制法治疗效果显著。实验组感染相关死亡率低于对照组,但两组比较无显著差异(P>0.05),这可能与样本量较小有关。rh G-CSF具有一定的不良反应,本研究显示,实验组克隆演变发生率高于对照组,两组比较无显著差异(P>0.05),说明本研究结果不支持rh G-CSF与免疫抑制法联用时增加克隆性疾病发生率的观点。另外在本研究中,治疗后,实验组外周血象WBC、PLT、Hb升高幅度优于对照组,且T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+改善幅度优于对照组,与相关研究结果一致[20,21]。进一步表明,rh G-CSF联合环孢霉素较单独采用环孢霉素治疗效果更为显著,更能有效提高AA并感染患者的免疫力,这可能与rh G-CSF加快造血功能恢复有关。

功能重组 篇7

1 材料与方法

1.1 试验动物30 只清洁级雄性成年SD大鼠,经Morris水迷宫筛选合格后,根据随机数字表法分为5组:假手术组、2VO组、2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组,每组6只。血管性痴呆模型的建立参照相关文献造模［４］。

1.2 鼻腔给药按照文献方法鼻腔给药法［４］。10%水合氯醛将大鼠麻醉,仰卧固定于立体定位仪上,将头部后仰70℃。用聚氯乙烯软管(外径1.0mm,内径0.5 mm)插入大鼠鼻孔约2 cm,软管外端接1 mL注射器,约半小时内将150 U/125μL rhEPO缓慢地交替推入大鼠的鼻孔,给药完毕后拔除软管,保持以上姿势30 min,以免药物流失。

1.3 测试指标Morris水迷宫学习记忆功能测评。定位航行实验测量大鼠学习能力。空间探索实验测量大鼠保存记忆的能力。脑组织切片,脑组织HE染色。1.4 统计学处理采用软件SPSS 22.0分析,定量资料描述采用均数±标准差(x ±s)表示,采用两因素重复测量方差分析,多组间的两两比较采用LSD法。检验水准均为0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 定位航行实验逃避潜伏期数值越小提示大鼠学习能力越强。造模前5组大鼠平均逃避潜伏期差异无统计学意义(P >0.05),造模后假手术组与其余4组差异均有统计学意义(P <0.05),而余4组差异无统计学意义,提示造模成功。用药结束后2VO+rhE-PO组逃避潜伏期明显低于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490 组,且差异均有统计学意义(P <0.05);2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组差异有统计学意义(P <0.05),2VO+rhEPO组与假手术组相比平均逃避潜伏期差异无统计学意义。详见表1。

2.1.2 空间探索实验该实验撤除平台后,以大鼠穿越原平台位置的次数判断记忆能力,穿越次数越多记忆能力越好。2VO+rhEPO组穿越平台次数明显多于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组,且差异均有统计学意义(P <0.05),2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组穿越平台次数差异均有统计学意义(P <0.05)。详见表2。

2.3 病理形态学检查结果光学显微镜观察HE病理切片细胞形态学变化,假手术组:海马CA1 区神经元呈圆形、椭圆形,排列基本整齐,细胞数量较多,核浆比值大,核仁明显;2VO+rhEPO组:海马CA1区细胞排列尚整齐,胞体形态大多呈圆形、椭圆形,细胞数量较多,偶见少量细胞胞体变小,胞质深染,核固缩,核深染,核溶解;2VO组:海马CA1区细胞排列稀疏、紊乱,神经元细胞较正常组较少,胞体明显缩小,部分胞核固缩,核深染,核仁消失;2VO+rhEPO+AG490组:海马CA1区的细胞排列紊乱,可见部分胞体变小,胞核固缩,核仁消失,胞浆稀疏;2VO+AG490 组:海马CA1区的细胞稀疏,排列紊乱,胞体变小,胞核固缩,可见核仁消失,胞浆深染,细胞改变与2VO组相似。

3 讨论

3.1 rhEPO在脑血管病中的研究现状rhEPO对急性脑缺血有神经保护作用,而关于rhEPO在长期脑缺血中的作用研究尚少。周彦慧等［７］研究表明,rhEPO对长期脑缺血大鼠中具有神经保护作用,但其具体作用机制尚不清楚。推测鼻腔给予rhEPO诱导STAT3的激活,伴随着相关抗凋亡因子bcl-2、bcl-xl表达的上调和凋亡细胞的减少,AG490 通过抑制rhEPO诱导的STAT3激活上游因子JAK活化,伴随着bcl-2、bcl-xl表达的下调和Caspase-3,Bax表达的上调最终起到促凋亡作用。本实验意在证实rhEPO是长期脑灌注不足大鼠神经保护可能的机制之一,并采用JAK/STAT通路特异性抑制剂AG490 进行干预,观察rhEPO改善长期脑灌注不足大鼠认知功能是否与激活JAK/STAT通路有关。

3.2 海马神经元的结构变化海马直接参与信息的贮存和处理,海马神经元的存活数量能直接反映海马对信息的处理、加工和储存能力［８］。各种研究发现血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元存在不同程度的凋亡现象,提示海马神经元的丢失可能是血管性痴呆发生的病理基础［９］。 本次实验HE病理切片染色示:2VO+rhEPO组海马CA1区神经细胞排列相对整齐,形态接近正常,细胞数量较多,2VO组海马CA1区细胞排列疏松、紊乱,细胞数量较少,可见部分胞体萎缩,核深染,核固缩,核深染;2VO+rhEPO+AG490 组、2VO+AG490组海马CA1区细胞形态与2VO组相近;说明鼻腔给予rhEPO能改善长期脑灌注不足大鼠的细胞形态学变化,可能与激活JAK2/STAT3通路发挥神经保护作用有关,且其作用可以被AG490抑制。

3.3 认知功能判断的实验选择Morris水迷宫实验是经典的检测动物行为学实验之一,2014年诺贝尔生理学或医学奖发现了人脑中的“内置GPS(global posi-tioning system)”定位系统,即大脑海马区中存在一类锥体神经元即位置细胞(Place ceU)。当动物行走到某个特定位置时,相对应的一些特定Place cell激活,当行走到另一位置时,又有相应的其他Place cell激活,这使大脑能够将特定的信息与相应空间位置联系起来,即形成了空间位置记忆。在大脑的内嗅皮质存在另一关键组成细胞即网格细胞(Grid cell),正是Grid cell将空间位置进行相应的坐标标记,才实现动物的精确定位及路径寻找,实现内置GPS的功能［１０］。因此,更加肯定了本实验采用Morris水迷宫行为学检测大鼠的认知功能。在此实验中,定位航行实验结果提示鼻腔给予rhEPO可改善血管性痴呆大鼠的学习能力,其效果可以被阻断剂AG490阻断。空间探索实验结果提示鼻腔给予rhEPO可能改善长期脑灌注不足大鼠的记忆能力,其效果可以被阻断剂AG4 9 0抑制。

本研究结果证实,rhEPO可以改善长期脑灌注不足大鼠认知功能,其机制可能是通过激活JAK/STAT信号转导途径减少神经元的凋亡来实现的,后期需要探讨rhEPO给药剂量及脑缺血不同时间点研究JAK2/STAT3通路的激活情况。

参考文献

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