重组疫苗（通用8篇）
重组疫苗 篇1
近年来,疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡,特别是重组病毒载体疫苗的研制,越来越引起人们的广泛关注。重组病毒载体疫苗的种类有很多,如痘病毒活载体疫苗、腺病毒载体疫苗、反转录病毒载体疫苗、不分节段的单股RNA病毒载体疫苗等。这些病毒载体因病毒基因组的复制特点和病毒生物学特性的不同,而适合于不同动物和人类疾病的预防与治疗。
1 痘病毒活载体疫苗
自1982年M.Mackett等[1]用牛痘病毒为载体表达外源基因以来,人们一直在从事重组病毒活载体疫苗的研究。后来B.Moss[2]的实验室完成了标记基因重组痘苗病毒的拯救,使这一即将退出历史舞台的病毒又重新受到科研人员的重视,并成为第一个被广泛用于外源基因表达的载体,但是由于痘苗病毒本身安全性的原因,除了表达伪狂犬病病毒g B基因的重组痘苗病毒曾于20世纪90年代中期获准在欧美国家的野生动物中使用外,其他重组痘苗病毒还处于理论研究阶段,尚未用于动物和人类疾病的预防,但痘苗病毒载体的构建及其分子生物学的研究为其他痘病毒载体的构建提供了丰富的经验。
20世纪80年代后期,人们开始倾向于研究具有宿主特异性的痘病毒载体。禽痘病毒具有严格的宿主范围,可携带较大的外源基因,在哺乳动物体内诱发保护性免疫应答,使得禽痘病毒载体(PFV)的研究越来越受到人们的重视。研究人员把各种禽类病毒的保护性抗原基因,如禽流感病毒(AIV)的HA基因和NP基因、传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因、新城疫病毒(NDV)的HN基因和F基因、马立克病毒(MDV)的g B基因和g C基因、传染性支气管炎病毒(IBV)的S1基因以及脾坏死型禽网状内皮组织增殖症病毒(SNV)的env基因等插入到PFV载体中[3]。1990年,表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒在美国注册;1994年,美国批准生产表达新城疫病毒HN蛋白和F蛋白基因的重组疫苗,这是第一个商业化的活载体疫苗;1995年,美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAX FP-N的商品化。Merial是全球首家研发出表达禽流感H5亚型HA蛋白的禽痘载体疫苗(TROVAC AI H5)的公司,该疫苗在1998年已通过美国农业部(USDA)的认证,而且在墨西哥、萨尔瓦多和危地马拉已卖出超过10亿份的剂量,用于控制高致病性禽流感H5亚型的传播。其他禽类病毒的痘病毒活载体疫苗还处于理论研究状态,尚未见到商品化应用。
由于禽痘病毒在哺乳动物体内产生一过性感染,并能够表达外源蛋白产生保护力,所以也有研究人员将哺乳动物类病毒的保护性基因如口蹄疫病毒(FM-DV)的衣壳蛋白插入到禽痘病毒载体中,构建的重组病毒具有良好的保护性[4]。
以金丝雀痘病毒(ALVAC)作为载体制备疫苗产生的保护力较禽痘病毒作为载体制备的疫苗高。用金丝雀痘病毒载体表达狂犬病糖蛋白G,用于接种非禽动物如犬、猫都产生了很好的保护力,并已被安全用于人的临床试验。Merial公司已经开发了用于预防H3N8亚型马流感病毒[5](EIV)和马西尼罗病毒[6](WNV)的RECOMBITED产品。其预防马流感的疫苗是将欧洲系马流感和美洲系马流感的HA基因分别插入到金丝雀痘病毒载体中,然后将重组病毒混合制成联苗。而预防马西尼罗病毒的疫苗是将马西尼罗病毒的pr M/E基因插入到金丝雀痘病毒载体中。用金丝雀痘病毒表达猫白血病病毒包膜蛋白,接种猫后能够产生良好的保护性,是第一个以痘病毒为载体用于反转录病毒疫苗研究的成功例证。H.Cao等[7]在人类免疫缺陷病毒(HIV)流行的重灾区乌干达进行了重组人类免疫缺陷病毒-金丝雀痘疫苗的Ⅰ期临床研究,结果表明,这种疫苗免疫的乌干达志愿者所产生的不良反应与发达国家人类免疫缺陷病毒阴性志愿者的反应类似,未见严重不良反应发生,但可以使接受者产生保护性的细胞免疫反应。目前,金丝雀痘病毒载体还被用于肿瘤的治疗,N.van Baren等[8]用金丝雀痘病毒表达了肿瘤相关抗原MAGE,免疫癌症病人,结果出现肿瘤特异性的CTL反应,说明这种重组疫苗对治疗肿瘤是有效的。G.J.Ullenhag等[9]用金丝雀痘病毒表达结肠癌肿瘤相关抗原上皮细胞黏附分子(Ep CAM/KSA),然后与低剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)接种结肠癌病人,结果这些病人体内可以检测到强烈的INF-γT淋巴细胞应答,表明ALVAC-KSA有可能成为癌症疫苗的候选疫苗。当然这些疫苗始终处于理论研究阶段,还未真正投入到实际应用当中。
随着新的动物疫病的出现,动物痘病毒如山羊痘病毒也被修饰改造,用于制备活载体疫苗。王芳[10]构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组山羊痘病毒;张强[11]构建了表达口蹄疫病毒P1-2A3C基因的重组山羊痘病毒。这些都为预防像口蹄疫这样的烈性传染病提供了很有意义的参考。
2 疱疹病毒活载体疫苗
疱疹病毒载体的种类有很多,如单纯疱疹病毒(HSV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、伪狂犬疱疹病毒和牛疱疹病毒Ⅰ型等。疱疹病毒作为基因转移载体有许多优点,如疱疹病毒可以实现神经系统的基因投递,在神经细胞中建立无症状的潜伏感染;疱疹病毒可以携带多个基因或较大基因;疱疹病毒已经成功地用于各种细胞的基因投递,如外周血单核细胞、心肌细胞、树突状细胞等,疱疹病毒在癌细胞治疗中也有广泛的应用前景。
单纯疱疹病毒能够形成潜伏感染,利用这一特性将单纯疱疹病毒改造成基因工程载体可以用于基因治疗和神经系统疾病治疗。火鸡疱疹病毒作为活载体疫苗在家禽疾病的研究中取得了一系列进展,火鸡疱疹病毒基因组庞大,容易进行外源基因的插入,如新城疫病毒的HN基因和F基因、马立克病毒的g B基因和传染性法氏囊病毒的VP2基因[12]。这些重组的火鸡疱疹病毒疫苗对病毒攻击都起到一定的保护作用,从而使得火鸡疱疹病毒载体一直受到人们的重视。人们对猪伪狂犬病毒(PRV)的基因组研究较早,已筛选出可以区分出野毒感染和疫苗接种的疫苗株,从而使猪伪狂犬病病毒成为猪病活载体疫苗研究的热点。g D基因缺失的猪伪狂犬病病毒载体不能感染细胞,产生的子代病毒也不具有感染性,但可以表达外源基因以产生免疫保护作用。A.L.Shiau等[13]在g E-/TK-PRV株g D基因位置插入外源基因,筛选到的重组病毒在猪体内没有感染性,大大提高了猪伪狂犬病毒作为疫苗载体的安全性。将人类免疫缺陷病毒gp120和gp41蛋白导入g C基因缺失的猪伪狂犬病病毒,这样通过g C的信号肽序列使外源蛋白得到合理的转运和定位。猪伪狂犬病病毒g G基因缺失载体的研究也比较多,P.Qian等[14]构建了在g G基因序列区插入口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒,注射猪体都检测到了抗猪伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒的抗体。G.Xu等[15]用g G基因缺失的猪伪狂犬病病毒表达日本脑炎病毒(JEV)的NS1蛋白,接种小鼠后能够抵抗猪伪狂犬病病毒强毒的攻击,也获得了对日本脑炎病毒的细胞免疫和体液免疫反应。现在研究人员对Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV1)活载体的研究也比较多,如通过反向蚀斑筛选得到表达口蹄疫病毒的重组Ⅰ型牛疱疹病毒;L.Wang等[16]构建了巨细胞病毒(CMV)、IE启动子、SV40 poly(A)调节表达的Ⅰ型牛疱疹病毒载体,表达了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的E2基因,这使Ⅰ型牛疱疹病毒表达外源基因更简易。Ⅰ型牛疱疹病毒作为活载体能够制备出多价牛呼吸道病毒苗,可以实现一针多防的优点,并且还可以设计成标记疫苗,从而为根除和控制牛的重大疾病提供了广阔前景。
3 腺病毒活载体疫苗
腺病毒载体也是当前广泛用于外源基因表达的病毒载体,其表达的外源基因具有天然蛋白的特性,在基因工程疫苗、基因治疗及肿瘤治疗等领域都有广泛前景。
腺病毒活载体经历了三个发展时期,第一代腺病毒载体是去掉了E1/E3基因表达盒,其优点是阻止病毒DNA的复制和病毒衣壳蛋白的产生[17];第二代腺病毒载体是去掉了E2基因表达盒,这样就减弱了病毒蛋白的表达;第三代腺病毒载体是在构建病毒载体时,除去了某些病毒基因,只保留了ITR和包装信号[18],且在病毒包装过程中需要辅助病毒和合适的互补细胞系。目前,人们已经构建出不同动物的腺病毒载体,如绵羊腺病毒载体、牛腺病毒载体、犬腺病毒载体、猪腺病毒载体和禽腺病毒载体,但这些腺病毒载体在动物传染病疫苗中的应用还不是十分成熟,也未在实际生产中得到广泛应用。由于腺病毒本身的特性,使得腺病毒在人类疾病的预防和治疗中具有广阔的应用前景,腺病毒载体可以用于癌症的基因治疗,癌症的基因治疗主要是通过复制缺陷型载体转运抗癌物质,其中以腺病毒携带P53临床研究最为迅速,全球至少有5个进入Ⅲ期临床试验,其中我国Ad-P53已经上市,成为世界上首个上市的基因治疗药物。腺病毒载体还被广泛用于人类一些遗传疾病的基因治疗,如由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因突变造成的囊性纤维化和因基因缺陷造成的肌肉萎缩症。
4 反转录病毒活载体疫苗
反转录病毒是一类动物RNA病毒。逆转录病毒载体的应用比较广泛,技术相对较为成熟,其携带的外源基因能够整合到细胞基因组中,从而稳定表达,表达时间持久,反转录病毒感染细胞范围广、基因容量较大,但其生物安全性还存在争议。
常用的反转录病毒载体包括来源于哺乳动物C型反转录病毒的小鼠白血病病毒(MLV)和慢病毒(LV)的人免疫缺陷病毒。对哺乳动物的C型反转录病毒序列进行分子加工和修饰,保留了病毒的顺式作用元件,并插入治疗性基因、外源性启动子及抗性基因,构建成重组反转录病毒(RV)载体。20世纪90年代,科研人员成功用反转录病毒载体治疗了腺苷脱氨酶缺陷病,并取得了良好效果;此后,反转录病毒载体更广泛地被应用于遗传性和后天获得性疾病的基因治疗中[19]。反转录病毒载体作为将外源基因导入体细胞的工具,在人类遗传疾病的基因治疗方面得到了广泛应用。近年来,也有研究采用反转录病毒构建载体疫苗,如用劳斯肉瘤病毒构建载体表达H7亚型禽流感病毒的HA基因,免疫鸡后用强毒株H7N7攻击,结果完全获得保护。与反转录病毒载体相比,慢病毒载体的靶细胞范围更广,携带外源基因的能力更强。慢病毒载体中研究较多的是人类免疫缺陷病毒载体,H.Chen等[20]用重组有人因子Ⅸ的慢病毒载体转染小鼠造血干细胞(HSC),并将转染后的小鼠造血干细胞移植入小鼠体内,使得人因子Ⅸ在小鼠血浆中得到持续高效表达,从而有望用于人类B型血友病的基因治疗。研究表明,慢病毒载体还可用于心血管疾病的治疗[21]。
5 不分节段的单股负链RNA病毒载体疫苗
新城疫病毒和水泡性口炎病毒(VSV)都属于不分节段的单股负链RNA病毒,想要以它们为载体构建活载体疫苗,首先要利用反向操作技术得到它们的感染性克隆,然后才能对它们进行分子遗传操作。重组新城疫病毒作为活载体疫苗具有极为突出的优点,首先是新城疫病毒遗传性状比较稳定,毒株间不易发生重组;病毒复制在胞浆内完成,并且不存在DNA阶段,没有整合到宿主细胞基因组的可能;此外,新城疫病毒弱毒苗可以同时诱导全身性体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫,因此重组新城疫病毒疫苗保护效果较好。J.Ge等[22]构建的禽流感、新城疫重组二联活疫苗获得了2007年的国家科技进步二等奖,该活疫苗就是利用反向遗传操作技术将禽流感病毒的保护性基因HA插入到新城疫病毒基因组中,注射鸡体后,禽流感病毒的保护性HA抗原得到表达,同时新城疫病毒保护性抗原也得到表达,从而使鸡体产生针对这两种病毒病的保护力,这为像新城疫、禽流感这样的一类传染病的防治提供了新的思路。
研究表明,减毒的水泡性口炎病毒可作为疫苗表达载体用于传染病的预防。如用表达流感病毒的HA蛋白的重组水泡性口炎病毒免疫小鼠,可以使小鼠抵御致死剂量的流感病毒的攻击。用表达马尔堡病毒(MARV)跨膜蛋白的减毒重组水泡性口炎病毒活疫苗(VSVΔG/MARVGP)免疫非人灵长类动物,可防御致死性马尔堡病毒攻击。用水泡性口炎病毒表达同源丝状病毒属糖蛋白,免疫非人灵长类动物可抵御苏丹埃博拉病毒的攻击[23]。水泡性口炎病毒可以优先在恶性细胞中复制,并且重组水泡性口炎病毒能够增加肿瘤细胞对化学治疗药物和宿主免疫应答的敏感性。因而,水泡性口炎病毒也可用于癌症疾病的治疗。
6 脊髓灰质炎病毒(OPV)活载体疫苗
脊髓灰质炎病毒属于单股正链RNA病毒,脊髓灰质炎病毒减毒株活疫苗是人类历史上应用最成功的疫苗之一。脊髓灰质炎病毒可以诱导全身的体液免疫、细胞免疫和肠道黏膜免疫,从20世纪80年代人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,近年来脊髓灰质炎病毒载体被用于中枢神经系统定点表达外源蛋白,将来有望用于治疗多种神经系统疾病,如表达IL-11可用于治疗脊髓和大脑损伤;表达神经保护性干扰物质可用于灶性脑缺血的治疗;甚至用于治疗帕金森症的神经细胞移植;也可以用脊髓灰质炎病毒载体在神经细胞中表达保护因子以避免神经细胞的死亡,因而该载体的研究受到人们的格外重视。在动物疾病预防方面,用脊髓灰质炎病毒作表达口蹄疫病毒的抗原表位,经免疫攻毒试验证明,重组病毒可以诱导豚鼠产生针对该抗原位点的特异性中和抗体并发生中和作用,从而保护试验动物不受口蹄疫病毒攻击[24]。
7 结束语
病毒活载体疫苗的种类越来越多,应用也越来越广泛。但这并不意味着病毒活载体疫苗已经可以应用到各种动物和人类传染病的预防和治疗当中,就目前而言,商品化的病毒活载体疫苗还比较少。由于病毒本身安全性问题,以及活载体疫苗研制等下游工艺还未完善,大部分还处于理论研究阶段。但是病毒活载体疫苗具有常规灭活疫苗和弱毒苗不可比拟的优势,动物和人类传染病的活载体疫苗必将有美好的应用前景。
重组疫苗 篇2
关键词：灭活工艺；病毒浓缩；重组禽流感病毒灭活疫苗
1.禽流感概述及现行工艺讨论
禽流感（AvianInfluenza，AI）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型引起禽发生急性出血性的传染性疾病，以引发呼吸道发病或隐性感染为特点。禽流感病毒依据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原特性，将禽流感病毒分成15种特异的血凝素亚型病毒和9种特异的神经氨酸酶亚型病毒翻。不同禽流感亚型病毒毒力差异很大，同一亚型内不同的毒株及同一毒株感染不同宿主时其毒力也不尽相同。非致病性毒株和低致病力毒株感染后，往往只引起感染动物一些轻微的临诊症状；而高致病力毒株即可引起大于70%以上的感染动物死亡率。禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道症状、消化道症状，死亡率较低；或表现为较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。这种症状上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型决定的。
2.甲醛在禽流感疫苗灭活中的主要问题
目前，在禽流感疫苗生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基（如A，G，u），又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗生产过程中，均采用加大甲醛浓度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成，疫苗产品中残留大量游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生刺激性反应。且在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫动物后抗体水平的产生。
3.材料与方法
3.1实验材料
3.1.1毒株、鸡胚和实验动物
1）毒株重组禽流感病毒H5亚型二价（Re-6株+Re-8株）
2）非免疫鸡
3）SPF鸡
3.1.2主要生物制剂及化学制剂硝酸纤维素膜（NC膜）、膜包、白油（进口佐剂）、司苯-80、吐温-80、硬脂酸铝、甲醛溶液。
3.1.3主要仪器设备 抗原浓缩设备、自动控制全不锈钢乳化罐和灭活罐、纯水系统Milli-QPLUS、漩涡混合仪。
3.2实验方法
3.2.1重组禽流感病毒灭活疫苗原液的制备 选择的重组禽流感病毒H5亚型二价（Re-6株+Re-8株）用灭菌的生理盐水做10-4稀释，接种于发育良好孵化的10～11胚龄健康易感的SPF鸡胚上，每胚0.1mL，置36℃温室内孵育。等待观察，鸡胚接种后，照蛋2次/d，将24h内死胚弃去直至72h后，全部取出置于2～8℃冷却12h。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术除去气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，完成重组禽流感病毒灭活疫苗原液的制备。
3.2.2传统灭活工艺 将无菌检验合格的重组禽流感病毒灭活疫苗原液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。其余病毒原液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2%。
3.2.3新的灭活工艺 将无菌检验合格的重组禽流感病毒灭活疫苗原液混合于一个灭活罐内，吸取数毫升样品用于毒价检测。将待浓缩的病毒原液用连续离心机12000r/min，至少2次，然后将离心处理的病毒原液用0.45um滤膜过滤，以去除病毒液中的杂质和杂蛋白。其余病毒原液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为2%。
3.2.4重组禽流感病毒灭活疫苗原液中甲醛浓度的检测
1）对照品溶液的制备：如被测样品为油乳剂疫苗，取已标定的甲醛溶液适量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5mL于50mL量瓶中，加20%吐温-80乙醇溶液10mL，加水至刻度，摇匀，既得。
2）供试品溶液的制备：油乳剂疫苗用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，用20%吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
3）检验法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10.0mL，乙酰丙酮试液10.0mL，至60℃恒温水浴15min，冷水冷却5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。
3.2.5判定标准表
1）甲醛溶液含量（含40%甲醛）应不超0.2%。甲醛溶液称取量（w甲醛溶液）：0.2579g，甲醛溶液含量：37.10%。
2）对照品溶液吸收度（A对照品）：0.63L
3）吸收度（A供试品）：供试品1为0.22L，供试品2为0.224L。
4）计算公式：甲醛溶液（40%）含量%（g/mL）=0.25×A供试品/A1.0mg
A1.0mg=A对照品×100/W甲醛溶液×1000×甲醛溶液含量
3.2.6重组禽流感病毒灭活疫苗免疫效果的检验 主要用检验用材料：24日龄SPF鸡、禽流感病毒H5亚型二价抗原批号201501来源哈兽研、重组禽流感病毒灭活疫苗（H5亚型二价）
1）检验方法：用24日龄SPF鸡15只，其中10只鸡每只肌肉注射疫苗0.3mL，5只鸡不接种作为对照。接种后21d，分别采血，分离血清，用禽流感病毒H5亚型二价抗原测定HT抗体。
2）判定标准：免疫鸡HT抗体平均滴度（GMP）应≥6log2，对照鸡均应为阴性。
4.结果
最后，传统灭活疫苗产品（按《规程》规定生产）保存15个月后，其效价下降明显，已不能达到《规程》的要求，说明传统灭活疫苗产品保存期仅为12个月，新的灭活疫苗产在保存期18个月后，用其免疫鸡只，其效价仍能达到《规程》要求.试验结果说明，相比于传统灭活工艺的灭活疫苗产品，新的灭活工艺的灭活疫苗产品的保存期有显著的延长。
5.讨论
重组疫苗 篇3
一、材料与方法
1.病毒及乙肝疫苗单纯疱疹病毒Ⅰ型、脊髓灰质炎病毒Ⅰ型均由河北医科大学病原微生物教研室及免疫教研室保存。
乙肝疫苗细胞培养液由华北制药集团金坦生物技术有限公司提供。
2.主要试剂和仪器层析柱XK16/40, 蠕动泵, UV-1 型检测器和REC111 记录仪均为GE公司产品, 所用到的试剂均为分析纯。
3.试验过程。
(1) 层析柱填装按照乙肝疫苗纯化生产所用柱的柱高不变, 柱直径和体积等按比例缩小, 装填Butyl S Sepharose FF介质层析。 柱高15 cm, 柱体积30 ml;装填DEAE Sepharose FF介质层析柱。 柱高24.6 cm, 柱体积52.8 ml。
(2) 层析柱准备层析柱在上样前均用0.5 M氢氧化钠清洗再生, 并用平衡液平衡完毕。 样品已过滤除菌, 缓冲液用中空纤维柱超滤除热源。
(3) 疏水层析采用乙肝疫苗纯化生产中的中间体作为样品, 加入了硫酸铵, 按照100∶1 体积比加入病毒, 混合均匀后取样检测其病毒滴度作为层析纯化前样品对照。 疏水层析用10 m M PB (ph=6.5) +6.5%硫酸铵的平衡液平衡, 然后上样。用10 m M PB (ph=7.0) 洗脱液洗脱, 收集A280>20m AU的目的蛋白峰, 待收峰完毕后, 混合均匀, 用250 度干热灭菌后的吸管取样2 ml以上为层析后样品, 检测其病毒滴度。
(4) 离子层析采用乙肝疫苗纯化生产中的中间体作为样品, 按照100∶1 体积比加入病毒, 混合均匀后取样检测其病毒滴度作为层析纯化前样品对照。 离子柱用20 m M PB (ph=7.0) 的平衡液平衡, 然后上样。 用20 m M+0.15 m M Na Cl PBS (ph=6.5) 洗脱液洗脱, 收集A 280>20 m AU的目的蛋白峰, 待收峰完毕后, 混合均匀, 用250 度干热灭菌后的吸管取样2 ml以上为层析后样品, 检测其病毒滴度。
4.病毒检测采用96 孔微量细胞病变法检测各步骤层析样品的病毒滴度, 经Karber法计算。同时加入阳性对照品 (病毒原液) 、阴性对照品 (未加病毒的中间体产品) 及细胞空白对照, 根据细胞病变的情况作为判定病毒是否存在的指标, 每日观察细胞病变, 72 h初步判定病毒去除效果。
5.病毒去除效果的判定根据公式R=log (V1C1/ V2C2) 计算病毒去除的效力 (R) , 式中V1、V2分别为层析前、后样品体积, C1、C2分别为层析前、后病毒滴度。 R≥4.0log10 表示有效去除/ 灭活病毒, 否则视为无效。
二、试验结果
1.单纯疱疹病毒Ⅰ 型。
单纯疱疹病毒Ⅰ型的去除效果:经Butly S Sepharose FF介质和DEAE Sepharose FF后, 单纯疱疹病毒Ⅰ型滴度分别下降了3.07 log10 和4.12 log10, 合计7.19 log10, 大于要求的4.0 log 10, 表明使用层析能有效去除单纯疱疹病毒Ⅰ型。
2.脊髓灰质炎病毒的去除效果。
脊髓灰质炎病毒的去除效果: 经Butly Sepharose FF介质和DEAE Sepharose FF后, 脊髓灰质炎病毒滴度分别下降了5.07 log10 和3.12 log10, 合计8.19 log10, 大于要求的4.0log10, 表明使用层析能有效去除脊髓灰质炎病毒。
三、讨论
在现代生物制药领域里, 蛋白质的分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键步骤。 柱层析技术以其高效、高纯度的特点, 在蛋白质分离领域里被广泛应用。 常用的柱层析方法主要有亲和层析、疏水层析、离子层析、分子筛层析 (凝胶层析) 和反相层析五大类。
从各种层析基本原理分析, 根据病毒与蛋白质的物理、化学性质不同、分子结构和分子大小不同, 从而把蛋白质与病毒分离开来。 亲和层析是目的蛋白与固相介质发生特异性结合, 病毒流穿固定相, 从而达到去除病毒的目的。 阴离子交换层析是目的蛋白与固定相以离子键相结合, 离子键多的与固定相的结合能力更强, 离子键少的与固定相结合力较弱, 在不同离子强度的洗脱液流动相的洗脱下, 病毒和乙肝疫苗先后被洗脱出来, 从而去除乙肝疫苗中的病毒。 凝胶层析法去除病毒的原理是由于蛋白与病毒的分子大小、 体积不同, 根据病毒与重组乙肝疫苗大小差异, 选用合适孔径的凝胶颗粒, 使乙肝疫苗分子不进入分子筛孔内而从颗粒外面流出, 穿过整个层析介质的速度最快, 体积较小的病毒则进入凝胶颗粒的大孔中, 穿过整个层析介质的流出速度慢, 两种物质先后流出层析柱, 以此去除病毒。 疏水层析是在重组乙肝疫苗溶液中加入高盐, 使蛋白空间结构发生改变, 包裹在蛋白内部的疏水基团暴露出来, 与固定相以疏水键相结合, 病毒流穿, 从而达到去除病毒的目的。
本实验采用疏水层析和阴离子交换层析法去除单纯疱疹病毒Ⅰ型和脊髓灰质炎病毒, 结果显示, 疏水层析能够去除两种病毒, 病毒滴度分别下降3.07 log10 和5.07 log10;阴离子层析能够去除两种病毒, 病毒滴度分别下降4.12 log10和3.12 log10。 在重组乙肝疫苗纯化工艺下, 使用两种柱层析工艺去除病毒, 去除单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒7.19 log10, 去除脊髓灰质炎病毒8.19 log10, 两种指示病毒下降量均超过4.0log10。
综上所述, 本实验结果表明, 重组乙肝疫苗工艺中的两步层析是非常有效的病毒去除/ 灭活步骤。 在生产过程中可有效去除指示病毒 (单纯疱疹病毒Ⅰ型和脊髓灰质炎病毒) 及其所代表的相关病毒。
摘要：目的是对重组乙型肝炎疫苗离子层析病毒去除能力进行验证。方法以单纯疱疹病毒Ⅰ型、脊髓灰质炎病毒为指示病毒, 疏水层析和离子层析对病毒的去除能力。经过Butly S Sepharose FF和DEAE Sepharose FF层析介质层析后, 病毒浓度降低4.0 log10以上。
关键词：乙肝疫苗,疏水层析,离子层析,病毒去除
参考文献
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重组疫苗 篇4
关键词：乙肝疫苗,免疫效果,安全性
病毒性乙型肝炎 (简称乙肝) 是一种严重危害人类健康的传染病, 感染乙肝病毒 (HBV) 除可引起急性肝炎外, 还可导致慢性肝炎、肝硬化甚至转化为原发性肝癌[1]。江西省是乙肝病毒高流行地区, 据调查, 全省1~59岁人群乙肝表面抗原 (HBs Ag) 阳性率为13.12%[2], 而乙肝发病以青壮年为主, 15~49岁占82.37%[3]。接种乙肝疫苗是预防乙肝感染最有效、最经济和简便的方法。目前国内用于成人的乙肝疫苗主要有重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗。通过观察两种国产乙肝疫苗对成人接种后的抗体应答, 探讨适合成人接种的乙肝疫苗种类及不同乙肝疫苗的安全性。
1 对象与方法
1.1 对象
来自南昌市9个公司员工, 纳入调查的标准: (1) 南昌市常住人口, 能够长期随访, 降低失访率; (2) 年龄17~59岁; (3) 未接种过乙肝疫苗、甲乙肝联合疫苗及乙肝免疫球蛋白; (4) 无急慢性乙肝病史, 且接种疫苗前检查HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe及抗-HBc均为阴性; (5) 自愿免费接种乙肝疫苗并同意在接种后采血检测免疫效果; (6) 无乙肝疫苗接种禁忌证。
1.2 方法
1.2.1 调查对象分组
将对象随机分配成2组, 接种人员、检验人员以及参与观察疫苗接种反应的调查者均不知分组情况, 以做到双肓。
1.2.2 疫苗种类及接种
疫苗选择使用华北制药金坦生物技术股份有限公司生产的重组CHO乙肝疫苗和北京天坛生物制品股份有限公司生产的重组酵母乙肝疫苗, 规格单位均为10μg/支, 批号分别为200910A3501和2009040402, 疫苗接种程序为0、1、6个月, 上臂三角肌处接种3针。所使用的疫苗均经过中国药品生物制品检定所批检验合格并在有效期内。1.2.3免疫效果检测第三针乙肝疫苗接种后1个月采集外周静脉血3m L。免疫效果检测使用郑州安图绿科生物工程有限公司的试剂, 检测抗-HBs滴度值, 滴度值≥10m IU/m L为阳性。
1.3 统计学处理
流行病学资料用Epi Data 3.1软件建立数据库, 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析, 均数比较采用t检验, 率的比较采用χ2检验, 等级资料比较采用秩和检验。
2 结果
2.1 调查对象一般情况
此次符合调查要求的对象共152人, 其中接种重组酵母乙肝疫苗的73人, 包括男性38人 (52.05%) , 女性35人 (47.95%) , 平均年龄为37.21岁, 已婚率为95.21%, 平均BMI为24.53kg/m2;接种重组CHO乙肝疫苗的79人, 其中男性43人 (54.43%) , 女性36人 (45.57%) , 平均年龄为36.95岁, 已婚率为95.64%, 平均BMI为24.48 kg/m2, 两组对象性别、平均年龄、已婚率和BMI等方面差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。
2.2 抗-HBs阳转率
接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO乙肝疫苗的抗-HBs阳转率分别为89.04%和91.14%, 差异无统计学意义 (χ2=0.19, P>0.05) 。
2.3 抗-HBs滴度分析
接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO乙肝疫苗的抗-HBs几何平均滴度 (GMT) 分别为202.99m IU/m L和201.98m IU/m L, 差异无统计学意义 (F=1.55, P>0.05) 。
2.4 性别抗-HBs阳转率
接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO疫苗的男性抗-HBs阳转率分别为86.84%和90.70%, 接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO疫苗的女性抗-HBs阳转率分别为91.43%和91.67%, 两种疫苗性别抗-HBs阳转率差异均无统计学意义 (P>0.05) 。同组间不同性别抗-HBs阳转率差异也无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
2.5 BMI指数别抗-HBs阳转率
相同BMI人群无论接种重组酵母乙肝疫苗或接种重组CHO乙肝疫苗的抗-HBs阳转率差异均无统计学意义 (P>0.05) ;但同一组内, 2种疫苗均是肥胖者抗-HBs阳转率最低, 差别有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。
2.6 年龄别抗-HBs阳转率
相同年龄组人群接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO乙肝疫苗的抗-HBs阳转率差异无统计学意义 (P>0.05) , 同组间不同年龄人群的抗-HBs阳转率差异也无统计学意义 (P>0.05) 。见表4。
2.7 疫苗安全性
所有接种对象完成接种后均未发现有严重的全身或局部的不良反应。
3 讨论
目前, 儿童乙肝疫苗接种已纳入扩大国家免疫规划, 所有新生儿均能免费接种乙肝疫苗, 大大阻断了乙肝病毒在小年龄儿童间的传播。但成人乙肝病毒的感染问题日渐突出, 因此, 为成人接种乙肝疫苗对控制乙肝的感染率和发病率都有非常重要的意义。
有研究表明, 乙肝疫苗剂量越高, 保护性抗体阳转率也越高, 且抗体持续时间更长[4], 10μg乙肝疫苗被广泛用于成人接种。目前国内乙肝疫苗主要有重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗两种, 此次通过对成人接种这2种乙肝疫苗后1个月的观察发现, 接种重组酵母乙肝疫苗和接种重组CHO乙肝疫苗的抗-HBs阳转率分别为89.04%和91.14%, 抗-HBs几何平均滴度 (GMT) 分别为202.99m IU/m L和201.98m L U/m L, 均无明显差别, 提示重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗对成人均有较好的免疫效果。
在接种不同种类乙肝疫苗的人群中, 不同性别抗-HBs阳转率无明显差别。虽既往有研究报道女性抗体阳转率较男性高[5], 但此调查结果显示, 同一组内抗-HBs阳转率在男女性别间比较也无明显差别。
观察还发现, 同一体质指数 (BMI) 人群接种不同种类乙肝疫苗后抗-HBs阳转率无明显差别, 但不同BMI人群接种两种疫苗, 抗-HBs阳转率均有明显差别, 肥胖者抗-HBs阳转率最低, 提示肥胖可能是导致乙肝疫苗免疫低应答或无应答的一个影响因素。通过对不同年龄对象的抗-HBs阳转率分析发现, 相同年龄人群接种不同种类乙肝疫苗的抗-HBs阳转率无明显差别, 接种同种疫苗的不同年龄人群抗-HBs阳转率也无明显差别。
参考文献
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重组疫苗 篇5
1 材料与方法
1.1 调查对象
在寿光市采用整群随机抽样方法, 抽取稻田、侯镇、古城3个乡镇一般健康状况良好的20岁以上的居民, 筛查乙型肝炎表面抗原 (HBs Ag) 、乙型肝炎表面抗体 (抗-HBs) 均阴性, 且无乙肝疫苗接种史、无乙肝疫苗接种禁忌症的505人为研究对象, 分为2个组, 分别按0-1-6方案接种10μg不同品种的乙肝疫苗。
1.2 疫苗
华北制药金坦生物技术股份有限公司生产的华北牌重组 (CHO细胞) 乙型肝炎疫苗, 批号200708A3205, 200709A 3102, 200712A3105。大连汉信生物制药有限公司生产的重组 (汉逊酵母) 乙型肝炎疫苗, 批号2007060202, 2007100405。剂量均为10μg。
1.3 检测方法和结果判定
采用潍坊市康华生物技术有限公司生产的乙肝表面抗原胶体金试纸条和乙肝表面抗体胶体金试纸条进行免前抗原和抗体的检测, 依说明书判断。免疫后血样采用北京北方生物制品研究所生产乙型肝炎表面抗体诊断试剂盒 (放射免疫法) 批号20081220进行检测。检测仪器为西安核仪厂XH6020型伽马计数仪。抗-HBs滴度>10MIU/ml判为阳性。
1.4 数据分析资料收集整理后, 采用SPSS软件进行统计分析。
2 结果
2.1 不同种类乙肝疫苗免疫后抗-HBs阳转率和GMT
本次观察接种CHO乙肝疫苗的238人, 接种汉逊酵母疫苗的267人。全程免疫后1个月, CHO乙肝疫苗阳转率为96.2% (229/238) , 抗体几何平均滴度 (GMT) 为414.2 m IU/ml;汉逊乙肝疫苗阳转率为95.9% (256/267) , GMT为383.3 m IU/ml。CHO乙肝疫苗的阳转率 (x2=0.0379, P=0.8457) 和GMT (F=0.363, P=0.547) 均略高于汉逊疫苗, 没有统计学意义。
2.2 年龄对接种后免疫效果的影响
本次观察中, 接种CHO乙肝疫苗的人群年龄分布在20~74岁, 平均年龄为44.8岁;接种汉逊酵母的人群年龄分布在20~53岁, 平均年龄为36.9。在20~岁组中, 两种乙肝疫苗免疫后的阳转率均为100%, 30~岁和40~岁年龄组中, CHO细胞的阳转率高于汉逊酵母疫苗, 但无统计学差异 (30~岁组P=0.2165, 40~岁组P=0.3356) ;50~岁人群接种CHO乙肝疫苗后阳转率为94.44%, 汉逊在此年龄组只检测了3人, 不具有比较意义。60岁以上的人群接种CHO乙肝疫苗后阳转率为87.00%。 (表1)
年龄越小, 抗-HBs GMT越高, 随着年龄的增大, 两种疫苗抗-HBs GMT均依次下降。在20~岁、30~岁和40~岁年龄组中, CHO细胞的抗-HBs GMT高于汉逊酵母疫苗, 但无统计学差异 (20~岁组P=0.1858, 30~岁组P=0.33, 40~岁组P=0.195) ;50~岁人群接种CHO乙肝疫苗后抗-HBs GMT为355.8 m IU/ml, 60岁以上的人群接种CHO乙肝疫苗后抗-HBs GMT GMT达到385.9 m IU/ml。 (表2)
3 讨论
在开展大面积乙肝疫苗免疫接种时如何筛查一直是基层工作面临的问题。本次接种前采用胶体金试纸条对HB-s Ag、抗-HBs进行了检测, 从免疫后定量检测的结果来看, 没有出现表面抗原假阴性, 并且使用方便, 快速, 价格便宜。可在大规模接种中使用试纸条检测[3]。
本研究中10μg乙肝疫苗对成人免疫原性良好, 华北牌CHO乙肝疫苗的阳转率和抗体滴度略高于大连汉逊乙肝疫苗, 无统计学差异, 说明同等剂量免疫效果基本一致[4]。
年龄对乙肝疫苗免疫成功率和抗-HBs GMT均有影响[5,6]。在本次乙肝疫苗群体免疫效果的观察中, CHO疫苗组年龄普遍偏大, 在这种情况下, CHO疫苗组仍表现出较高的抗体阳转率和抗体滴度, 那么在同等年龄分布中群体的免疫效果是否有更明显的优势, 还有待进一步观察。随着生活水平和医疗卫生水平的提高, 人均寿命在不断延长, 且预防保健意识也在增强, 高年龄人群同样有接种的意识和必要性, 但多年来很少研究高龄组的免疫后效果。本此观察接种者的最高年龄达74岁, 使用CHO乙肝疫苗注射后阳转率86.96%, 抗-HBs GMT 385.9 m IU/ml, 可能与CHO乙肝疫苗由哺乳动物细胞表达, 结构均一, 抗原决定簇与天然抗原相似有关[7]。
成人接种乙肝疫苗, 随着年龄的增长, 人体免疫的应答能力在下降。10μg乙肝疫苗免疫后抗-HBs GMT在355.8m IU/ml-551.1 m IU/ml之间, 显著低于龚晓红报道的使用20μg乙肝疫苗免疫成人后的抗-HBs GMT高达5973.84m I-U/ml[4]。基于免疫持久性的考虑, 成人是否需接种大剂量乙肝疫苗有待进一步研究。
参考文献
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[6]章一丰, 陈奇峰.成人20微克重组CHO细胞乙肝疫苗免疫效果分析[J].浙江预防医学, 2007 19 (6) :4-8.
重组疫苗 篇6
国家禽流感参考实验室成功研制出重组禽流感病毒灭活疫苗 (H7亚型, H7N9/PR8株) , 并通过了新兽药评价, 作为应急技术储备。
为进一步做好H7N9流感疫情应对工作, 及时发现、剔除家禽H7N9流感病毒, 保障动物产品质量安全和公共卫生安全, 农业部制定并实施《全国家禽H7N9流感剔除计划》。在科研人员的辛苦努力下, 成功研制出重组禽流感病毒灭活疫苗 (H7亚型, H7N9/PR8株) 。经试验该疫苗安全, 免疫效果良好, 可对H7N9禽流感病毒攻击提供有效保护, 能够100%阻止病毒复制和排泄, 对有效阻断病毒传播、降低病毒高致病力突变风险具有重要意义, 一旦疫病防控需要, 即可马上使用该疫苗对家禽实施免疫, 确保H7N9禽流感可防可控。
重组疫苗 篇7
关键词：禽流感,新城疫,二联活疫苗,免疫途径
为了获得疫苗的最佳免疫效果，笔者对禽流感-新城疫重组二联活疫苗采用注射、点眼滴鼻、饮水、喷雾免疫途径进行了试验。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)，来自哈尔滨维科生物技术开发公司，批准文号：兽药生字(2005) 080012112，批号：200644。(2)新城疫抗原购自国家动物疫病诊断液中心，批号：20060418。(3)禽流感H5抗原购自哈尔滨兽医研究所，批号：20060420。
1.2 方法
1.2.1 试验分组
选择10日龄蛋雏鸡400只，按注射、点眼滴鼻、饮水、喷雾4种免疫方法随机分组，每组100只，分别免疫接种禽流感-新城疫重组二联活疫苗1剂量，免疫当天和免疫后7、14、21、28d分别采血10份，用血凝抑制试验测定新城疫和禽流感H5亚型HI抗体效价，分析实验数据，根据免疫效果，确定鸡群最佳免疫途径。
1.2.2 免疫前采血
鸡群10日龄时，随机抽取10只采血，分离出血清，4℃冰箱保存备用。
1.2.3 免疫方法（1）注射：
取疫苗1瓶, 加生理盐水250ml稀释, 鸡皮下注射0.5ml/只, 免疫1剂量, 共免疫100只。 (2) 点眼滴鼻:取疫苗1瓶, 加生理盐水30ml, 鸡点眼滴鼻各1滴/只, 每滴0.03ml, 免疫1剂量, 共免疫100只。 (3) 饮水:取疫苗1瓶, 将疫苗用5ml生理盐水稀释, 抽取1ml稀释后的疫苗加入生理盐水400ml, 用雏鸡饮水器饮水免疫, 免疫前断水4h, 疫苗2h内饮完, 共免疫100只, 每只免疫1剂量。 (4) 喷雾:取疫苗1瓶, 将疫苗用5ml生理盐水稀释, 抽取1ml稀释后的疫苗, 加入250ml蒸馏水, 将喷雾免疫鸡置于试验喷雾间, 将疫苗喷雾器调到小鸡喷雾档, 在鸡群上方1m处喷雾, 喷雾时间3min。喷雾结束60min, 将喷雾试验鸡放回笼中饲养。共免疫100只, 每只免疫1剂量。
1.2.4 免疫后采血
各免疫组免疫后7、14、21、28d采血。随机抽取各免疫途径组试验鸡10只采血离出血清，4℃冰箱保存备用。
1.2.5 抗体测定方法
将采集的试验鸡血采用血凝抑制试验测定抗体。
2 结果
2.1 抗体测定结果
(1)免疫前抗体测定，试验鸡免疫前当天随机抽取1 0 只鸡采血，用血凝抑制试验测定新城疫、禽流感抗体分别为5～7 log2、5～6 log2。
(2)喷雾、注射、点眼滴鼻、饮水组免疫途径试验鸡，免疫后7、14、21、28d新城疫、禽流感抗体结果见表2～9。
从表2～9免疫测定结果看，试验鸡按照注射、饮水、点眼滴鼻、喷雾免疫途径免疫后14d，点眼滴鼻组试验鸡禽流感H5抗体达到5～6log2，产生的抗体高，比较均匀整齐。其次为喷雾组试验鸡，禽流感抗体达到4～6log2，注射组试验鸡禽流感抗体达到4～5log2，饮水组试验鸡免疫效果差，禽流感抗体达到3～6log2，且整齐度较差。
3结论与分析
从试验结果看，禽流感-新城疫重组二联活疫苗采用不同的免疫途径免疫10日龄雏鸡，点眼滴鼻组试验鸡产生的抗体高，比较整齐，免疫效果最好，免疫后14d新城疫抗体达到6～7log2，禽流感H5抗体达到5～6log2，疫苗的最佳免疫途径是点眼滴鼻，其次是喷雾、注射，饮水免疫效果差。
重组疫苗 篇8
1对象与方法
1. 1对象来源于北京市昌平区某镇2个自然村的18 ~ 45周岁成年人。
1. 2选择标准1在2个自然村居住超过半年以上的居民, 能够长期随访; 2年龄在18 ~ 45周岁之间; 3未接种过乙肝疫苗、甲乙肝联合疫苗及乙肝免疫球蛋白; 4无急慢性乙肝病史; 5自愿免费接种乙肝疫苗并同意在接种后采血进行免疫效果检测; 6无乙肝疫苗接种禁忌证。
1. 3初筛及分组对符合要求的初筛对象, 首先采集每人血样3 ml, 利用雅培I 2000化学发光方法检测“乙肝五项”指标, 判断标准为: HBs Ag S/N值>12为阳性抗-HBs≥10 m U/ml为阳性; 抗-HBc抑制率≥50% 为阳性; HBe Ag S/CO值≥1为阳性; 抗-HBe S/CO值> 1. 000为阴性, S /CO值≤1. 000为阳性。对每名采血对象开展问卷调查, 内容主要包括个体基本情况、疫苗接种及免疫反应主要影响因素等。血清学检查和问卷调查合格者作为研究对象。在每个调查点内采用随机数字表的方法将初筛合格的研究对象随机分配到10和20 μg两个剂量组。研究对象以及参与观察疫苗接种反应的调查者均不知分组情况, 设专人掌握接种对象分组, 以做到双盲。
1. 4疫苗本研究使用的疫苗为华北制药金坛生物制品有限公司生产的CHO乙肝疫苗, 剂量为10和20 μg两种, 批号分别为A20070531、A20070522。疫苗均经过中国药品生物制品检定所检定合格。
1. 5免疫程序及接种途径疫苗接种程序为0、1、6个月 ( 0-1-6) , 在上臂三角肌处接种3针。
1. 6接种后免疫效果评价研究对象全程接种乙肝疫苗后1个月采集血样 ( 3 m1) 进行抗- HBs滴度检测, 评价免疫效果。
1. 7质量控制主要包括: 1现场调查质控措施: 通过优选调查员并进行岗前培训、抽查复核调查结果、减少失访等措施控制问卷调查质量; 2采血质控措施: 由有资质的专业技术人员采血, 采血过程中避免溶血, 规范血样保存和运送; 3使用条码: 每名对象自始至终使用统一的条码, 避免混淆; 4实验室检测质控: 人员分工明确, 应用盲法平行样、质控血清等措施保证检测质量; 5统计分析质量控制: 采取数据预审核、双录入建库、逻辑查错等多项措施保证数据录入质量。
1. 8统计方法流行病学调查资料经过审核后以Epi Data 3. 1软件建立数据库进行数据录入, 应用SPSS 13. 0软件进行统计学分析, 阳转率的比较采用 χ2检验, 组间抗-HBs几何平均滴度 ( GMT) 组间计量资料比较采用F检验, 检验水准为α = 0. 05。
2结果
2. 1基本情况初筛408人, 筛查出222名 ( 男性107人, 女性115人) 合格研究对象, 随机分成两组: 10 μg组114人, 20 μg组108人。
2. 2两组间均衡性比较两组间性别、民族、婚姻状况差异无统计学意义 ( P > 0. 05) 。见表1。
2. 3抗-HBs的阳转率和低/ 无应答率10 μg组的抗-HBs的阳转率为89. 47% , 20 μg组的为99. 07% 。两种剂量阳转率差异有统计学意义 ( P < 0. 05) 。10 μg组低/无应答率为39. 47% , 20 μg组为13. 89% 。两种剂量低/无应答率差异有统计学意义 ( P < 0. 01) 。见表2。
2. 4抗-HBs的滴度水平分析10 μg组抗-HB s ( GMT) 为134. 57 m U/ml, 20 μg组为921. 11 m U/ml, 差异有统计学意义 ( P < 0. 01) 。抗体滴度离散趋势分析表明, 10 μg剂量组第25百分位数 ( P25) 为42. 79 m U / ml, P75为746. 03 m U/ml, 四分位数间距为703. 24 m U / ml; 20 μg剂量组P25为323. 43 m U/ml, P75为4 663. 16 m U / ml, 四分位数间距为4 339. 73 m U / ml。 见表3。
2. 5不良反应情况为评价CHO乙肝疫苗的安全性, 对每名接种对象在接种后24、48、72 h内, 跟踪随访不良反应发生情况, 调查内容包括局部反应和全身反应。在所观察的222名研究对象中无不良反应报告。
3讨论
3. 1开展成人接种乙肝疫苗, 提高人群免疫水平针对我国目前的乙肝感染现状, 在健康人群中大力开展乙肝防治健康教育, 使越来越多的健康人群接种乙肝疫苗, 对降低我国人群乙肝患病率, 提高我国的人口健康素质有着十分重要的意义。乙肝疫苗的效果可表现为多方面: 阻断HBV慢性持续感染、预防急性肝炎、减少HBV的亚临床感染和传播机会, 另外, 还可降低肝癌风险和肝癌发病率[5]。因此, 除做好新生儿乙肝疫苗的预防接种外, 在高危人群中接种乙肝疫苗, 对于预防和控制乙肝感染意义更大[6]。同时, 探讨乙肝疫苗对成年人和高危人群的免疫策略及其模式, 观察成年人免疫效果, 对我国降低全人群乙肝发病率和死亡率具有十分重要意义[2]。
3. 2评价两种剂量国产CHO乙肝疫苗免疫效果, 为成人免疫提供可靠的科学依据为更好地评价2种剂量的乙肝疫苗免疫效果, 在选择研究对象时先将研究对象分层, 再按照随机化的原则进行分组, 保证两个剂量组间的性别、民族、婚姻状况等方面具有很好的可比性。结果显示: 20 μg CHO乙肝疫苗成人免疫效果优于10 μg, 是较为理想的接种剂量。此次调查为乙肝疫苗对成人的接种提供了较佳剂量, 为成人免疫提供可靠的科学依据。
3. 3国产CHO乙肝疫苗在成人中应用还需长时间观察免疫效果近年来, 关于新生儿使用CHO乙肝疫苗的免疫随访较多, 结果显示, 免疫后1年的抗- HBs阳性率和有效阳性率均达到90% 左右, 随免疫时间的延长, 各项指标呈逐年下降趋势, 免疫5年后, 抗- HBs阳性率降至53. 3%[7-9]。表明CHO乙肝疫苗相对基因重组乙肝疫苗同样有较好的近期保护作用[10]。 本研究为乙肝疫苗全程免疫后1个月的观察结果, 对于这两种剂量的疫苗接种成人后, 在细胞免疫、保护性抗体的持续时间和消长方面有待于进一步研究。
参考文献
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