破骨细胞生成

破骨细胞生成（精选5篇）

破骨细胞生成 篇1

由于近年来环境问题和食品安全问题日趋严重, 而引起肿瘤发生率不断攀升, 前列腺癌 (prostatecancer, PCa) 就是泌尿系统常见的恶性肿瘤, 而且其平均发病年龄不断下降。临床研究发现, 骨骼是前列腺癌发生远处转移较常见的器官, 前列腺癌骨转移率比较高。因此, 对于前列腺癌骨转移早期诊断显得尤为重要[1]。全身骨扫描是目前用于诊断和监测前列腺癌患者骨转移的主要方法, 其灵敏度高, 能一次全身显像, 比传统的X线检查更容易发现病变所在, 但骨扫描价格昂贵且特异性不高, 对病人和医护人员有一定的放射损伤[2]。为了更好的研究前列腺癌骨转移的诊断方法, 本研究通过测定血清破骨细胞分化因子 (osteoclast differentiation factor, ODF) 及生成抑制因子 (osteo-clastogenesis inhibitory factor, OCIF) 来进一步探讨用于诊断前列腺癌患者的骨转移方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010 年1 月~2011 年12 月在我院治疗的患者共114 例, 其中61 例经ECT全身骨扫描, 并经骨穿刺病理活检确诊为前列腺癌骨转移患者作为观察组, 年龄43~77 岁, 平均 (48.54±6.08) 岁;其余53 例为非骨转移患者作为对照组, 年龄41~83 岁, 平均 (45.83±3.72) 岁。两组患者均无心、肝、肺和肾等疾病并且患者肝肾功能正常, 无前列腺疾病史。

1.2 血浆ODF和OCIF检测方法

所有受检者接受治疗前清晨空腹采静脉血, 离心后取血浆, 于-20℃保存。ELISA法测定血浆ODF和OCIF, 按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。血清ODF和OCIF表达水平等计量资料采用 (±s) 描述。不同年龄、雌激素受体状态的患者间血清ODF和OCIF的比较, 以及骨转移组和无骨转移组的ODF和OCIF表达水平的比较均采用t检验;骨转移组、无骨转移组和健康对照组间血清ODF和OCIF表达水平以及不同癌灶大小、骨转移程度、骨痛程度患者间的ODF和OCIF表达水平的比较采用方差分析, 进一步两两比较采用LSD-t检验;采用pearson相关分析评价指标间的关联性。P <0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 前列腺癌骨转移组和非骨转移组血清ODF和OCIF浓度

骨转移组患者血清ODF和OCIF分别为 (31.35±5.34) 和 (42.12±9.04) ng/L, 明显高于非骨转移组的 (8.42±1.73) 和 (9.84±2.15) ng/L, 差异有显著性 (P <0.01) 。见图1。

2.2 ODF和OCIF在前列腺癌骨转移中的诊断价值

依据ODF和OCIF ELISA结果及前列癌骨转移的诊断结果, 建立ODF和OCIF用于肺癌骨转移的受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve, 简称ROC曲线) 。ODF和OCIF诊断前列癌骨转移时ROC曲线下面积 (AUC) 分别为0.92 和0.88 (95% CI为0.86~0.98 和0.78~0.96) 。ODF诊断前列癌骨转移的灵敏度、特异度分别为91.42%和87.35%;OCIF诊断前列癌骨转移的灵敏度、特异度分别87.51%和85.37%, 具有很好的诊断价值。见图2。

2.3 ODF和OCIF与骨转移部位数量的关系

检测在不同转移部位ODF和OCIF的浓度, ODF随骨转移部位数量增加而明显升高, OCIF随骨转移部位数量增加而明显降低, 差异有显著性 (P<0.05) , 见图3。

2.4 血清ODF和OCIF水平对骨转移的预测作用

114 例无骨转移患者随访8~13 个月, 应用ECT、X线、CT和MRI等影像学检查对骨转移重新评估。先后有42 例在随访过程中新发现骨转移病灶。新发骨转移组和骨转移组血清ODF和OCIF浓度均显著高于非骨转移组, 差异有显著性 (P <0.01) ;新发骨转移组血清ODF和OCIF浓度与骨转移组比较, 两组间差异无显著性 (P >0.05) 。见图4。

3 讨论

前列腺癌发病比较隐匿, 常以骨转移症状为最早、最常见的就诊原因。研究发现超过70.00%的进展期前列腺癌有骨转移, 死于前列腺癌的患者中尸体解剖发现85.00% ~100.00% 合并骨转移 (bone metastasis) [3,4]。因此, 有无骨转移对患者的临床分期、治疗方案的选择及预后判断有重要的参考价值。ODF又称骨保护素配体 (OPGL) 和NF-β 受体激活子配体 (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RNAKL) , 主要由成骨细胞表达, 通过旁分泌方式与破骨细胞前体或破骨细胞表面的RANK结合, 促进破骨细胞的生成和活化。敲除ODF基因的小鼠表现为破骨细胞的生成障碍, 证实了ODF在破骨细胞生成中是不可或缺的关键因子[5,6]。破骨细胞生长抑制因子 (osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF) 是一个可溶性破骨细胞抑制因子, 属于肿瘤坏死因子受体家族[7]。OCIF抑制骨吸收, 负面调节骨成熟、骨分化、骨活性和存活[8]。

本研究结果表明骨转移组前列腺癌患者血清中ODF和OCIF含量与骨转移显著相关, 转移患者血清ODF和OCIF含量明显高于非转移组患者 (P <0.01) 。采用ROC曲线分析ODF和OCIF在前列腺癌骨转移中的诊断价值, 结果表明ODF和OCIF诊断前列腺癌骨转移的AUC分别为0.924 和0.883, 诊断准确度较高。ODF和OCIF对诊断前列腺癌骨转移有较高的灵敏度、特异度。本研究结果揭示ODF和OCIF有潜力作为诊断前列腺癌骨转移的血清标记物。国内赵雪志等[9]研究表明前列腺癌骨转移患者血清中OCIF浓度明显高于非骨转移组, 和本研究结果基本一致。目前用于检测骨转移的方法主要是影像学手段, 如X线、ECT、CT等, 但是X线只能发现直径≥1~2 cm和局部脱钙量≥30%~50%的骨转移病灶, 其灵敏度较低[10]。ECT可虽能较早发现骨损害, 但特异度低, 存在反跳现象, 短时间内不能区分是治疗有效还是骨转移进展[11]。而CT和MRI扫描成本高, 不适合用于骨转移的监测和随访。

前列腺癌骨转移的方式大多是溶骨性, 超过半数的患者会出现多部位骨转移。结果表明ODF与骨转移程度呈正相关, 而OCIF与骨转移程度呈负相关, 差异有显著性 (P <0.05) , 提示血清ODF和OCIF水平与骨转移程度具有相关性。ODF浓度的升高提示破骨细胞的活性增加, 而OCIF浓度下降则提示成骨细胞合成能力的下降, 破骨细胞的活性增加和成骨细胞合成能力的下降可导致溶骨能力大于成骨能力, 骨质进一步溶解破坏。因此, ODF表达增高或OCIF表达的下降都有助于骨吸收的增加, 产生骨损害, 在病情监测方面具有重要的临床意义。

本研究表明, 新发骨转移组血清ODF和OCIF浓度与骨转移组比较差别不大, 新发骨转移组和初诊骨转移组血清中ODF和OCIF含量均显著高于非骨转移组。说明血清中ODF和OCIF含量的升高早于影像学的阳性发现, 可用前列腺癌骨转移的早期识别与预测。

总之, ODF和OCIF可作为诊断前列腺癌骨转移的一项参考指标, 并有利于前列腺癌骨转移的早期发现, 有助于患者病情判断, 但ODF和OCIF最终能否成为一种有效的前列腺癌骨转移的筛查和诊断指标, 还需要进行大样本的研究来证实。

参考文献

[1]STUR GE J, CALEY MP, WAXMAN J.Bone metastasis in prostate cancer:emerging therapeutic strategies[J].Nature Reviews Clinical Oncology, 2011, 8 (6) :357-368.

[2]LECOUVET FE, SIMON M, TOMBAL B, et al.Whole-body MRI (WB-MRI) versus axial skeleton MRI (AS-MRI) to detect and measure bone metastases in prostate cancer (PCa) [J].European Radiology, 2010, 20 (12) :2973-2982.

[3]DE BONO JS, LOGOTHETIS CJ, MOLINA A, et al.Abiraterone and increased survival in metastatic prostate cancer[J].New England Journal of Medicine, 2011, 364 (21) :1995-2005.

[4]NΦRGAARD M, JENSEN AΦ, JACOBSEN JB, et al.Skeletal related events, bone metastasis and survival of prostate cancer:a population based cohort study in Denmark (1999 to 2007) [J].The Journal of Urology, 2010, 184 (1) :162-167.

[5]LEIBBRANDT A, PENNINGER JM.RANKL/RANK as key factors for osteoclast development and bone loss in arthropathies[M]//Molecular Mechanisms of Spondyloarthropathies.Springer New York, 2009:100-113.

[6]LEIBBRANDT A, PENNINGER JM.RANKL/RANK as key factors for osteoclast development and bone loss in arthropathies[M]//Molecular Mechanisms of Spondyloarthropathies.Springer New York, 2009:100-113.

[7]TA HM, NGUYEN GTT, JIN HM, et al.Structure-based development of a receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) inhibitor peptide and molecular basis for osteopetrosis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107 (47) :20281-20286.

[8]YASUI T, KADONO Y, NAKAMURA M, et al.Regulation of RANKL-induced osteoclastogenesis by TGF-βthrough molecular interaction between Smad3 and Traf6[J].Journal of Bone and Mineral Research, 2011, 26 (7) :1447-1456.

[9]赵雪志, 李纲, 王振杰, 等.前列腺癌, 前列腺增生症患者血清骨保护素测定的临床价值[J].现代泌尿外科杂志, 2011, 16 (5) :443-445.[9]ZHAO XZ, LI G, WANG ZJ, et al.The clinical value of serum concentration of osteoprotegerin in prostatic carcinoma and hyperplasia[J].Journal of Modern Urology, 2011, 16 (5) :443-445.Chinese

[10]DINTER DJ, NEFF WK, KLAUS J, et al.Comparison of whole-body MR imaging and conventional X-ray examination in patients with multiple myeloma and implications for therapy[J].Annals of Hematology, 2009, 88 (5) :457-464.

[11]FELLNER M, BAUM RP, KUB??EK V, et al.PET/CT imaging of osteoblastic bone metastases with 68 Ga-bisphosphonates:first human study[J].European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2010, 37 (4) :834-834.

破骨细胞生成 篇2

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株 (北京军事医学科学院) ;RANKL (Biovision, 美国) ;PGE2、l, 25- (OH) 2Vit D3、TRAP染色试剂盒 (Sigma, 美国) ;α-MEM培养基、胎牛血清 (FBS) (Hyclone, 美国) ;兔抗鼠Atp6v0d2多克隆抗体 (ABCAM, 英国) ;新生SPF级BALB/c小鼠 (北京维通利华实验动物公司) 。

1.2 共培养体系及实验分组

胰酶消化法培养小鼠颅骨OB[7];取第3代细胞制备细胞爬片, 应用试剂盒进行碱性磷酸酶 (ALP) 染色。将RAW264.7细胞用50 ng/ml RANKL处理48 h, 使之向OC前体分化。将第3代OB (4×103个/孔) 与RAW264.7细胞 (1×103个/孔) 混合接种于48孔板;每孔加入10-6mol/L PGE2和10-8mol/L, 1, 25- (OH) 2Vit D3, 并用10%FBS的α-MEM完全培养基37℃、5%CO2下培养。细胞分为2组:对照组和ZOL处理组;后者于共培养第3天加入5×10-7mol/L ZOL处理24 h;然后继续培养。

1.3 OC生成及功能检测

抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色:于共培养第7天收获细胞爬片, 按试剂盒说明进行染色, 显微镜下观察。400倍下随机选取5个视野, 计数每视野中TRAP染色阳性细胞 (细胞核≥3个) 数目, 取平均值。

吸收陷窝检测:于第7天收获牙本质磨片, 扫描电镜 (SEM) 观察。每磨片上随机选取5个视野 (500倍) , Med6.0图像分析系统测量5个视野吸收陷窝数目及陷窝面积, 取平均值。

1.4 Atp6v0d2基因表达检测

Real-time PCR:共培养第5d, Trizol提取细胞总RNA, 逆转录合成c DNA。引物为:GAPDH上游5'-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3', 下游5'-TCCACCAC-CCTGTTGCTGTA-3';Atp6v0d2上游5'-TAAGCAAG-AAGACAGGGAG-3', 下游5'-GACAGCGTCAAACAAAG G-3'。c DNA扩增后在Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪上进行检测。反应条件为:95℃, 15 s;60℃, 40 s;72℃, 15 s;共50个循环。系统自动读取Ct值, 并计算出待测基因与管家基因GAPDH比较的ΔCt值, 以及与对照组ΔCt值比较的ΔΔCt, 进而计算出样品的相对浓度。每组细胞取3孔标本进行检测。

免疫荧光化学检测:于共培养第5天检测, 方法见文献[3]。兔抗鼠Atp6v0d2多克隆抗体为一抗, FITC荧光标记的羊抗兔Ig G为二抗, Hoechst复染细胞核, 激光共聚焦显微镜 (LSCM) 下观察;每组随机选取6个细胞, 测量细胞FITC的平均荧光强度。

Western blot检测:共培养第5天, 提取细胞总蛋白, 测定蛋白浓度, 煮沸变性5 min, 凝胶电泳并转膜, 5%BSA室温封闭2 h, 兔抗鼠Atp6v0d2和GADPH多克隆一抗孵育过夜。二抗室温1 h, DAB显色1 min;GAPDH为对照。Image J分析软件检测膜上条带的灰度值。

1.5 统计学分析

原始数据用Excel 2003建立数据库, 结果用±s表示;SPSS 13.0统计软件对数据进行两独立样本的t检验;P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 OB-OC共培养体系

胰酶消化法所获小鼠OB以长梭形、多角形为主;ALP染色阳性。第3代OB与RAW264.7细胞共培养, 可以形成TRAP阳性、具有骨吸收功能的多核OC (图1A) 。

2.2 ZOL对OC生成及骨吸收功能的影响

细胞共培养至第7天, 2组均形成TRAP染色阳性多核破骨细胞 (图1A、B) , 但ZOL组所形成的OC数量显著少于对照组 (P<0.01) (表1) , 体积也较小;提示ZOL可显著抑制共培养体系中OC的生成。

牙本质磨片SEM检测见图1C、D, 吸收陷窝计数及面积见表1。SEM下2组牙本质磨片上均有不同程度的吸收陷窝;但2组比较, 对照组吸收陷窝数目较多, 陷窝面积较大;而ZOL组吸收陷窝数目较少, 面积较小 (P<0.01) ;提示ZOL可显著抑制共培养体系中OC骨吸收功能。

A、C:对照组;B、D:ZOL组

(n=5, ±s)

注:ZOL组与对照组比较, P<0.01

2.3 Real-time PCR检测结果

对照组和ZOL组Atp6v0d2基因mRNA平均相对浓度分别为 (1.006±0.132) 和 (0.357±0.097) ;ZOL组显著低于对照组 (P<0.01) ;提示ZOL可显著抑制Atp6v0d2 mRNA水平。

2.4 免疫荧光化学检测结果

LSCM检测见图2。Atp6v0d2在ZOL组和对照组细胞胞质及胞核内均呈阳性表达, 荧光强度分别为 (25.56±6.59) 和 (62.80±11.30) , ZOL组显著弱于对照组 (P<0.01) 。

2.5 Western-blot检测结果

2组细胞Atp6v0d2蛋白表达条带见图3。ZOL组蛋白灰度值较对照组明显下降, 经测量灰度值下降了38.35%。

3 讨论

破骨细胞 (OC) 是体内唯一具有骨吸收功能的多核巨细胞, 与成骨细胞 (OB) 一起参与骨代谢平衡。骨质疏松等许多骨吸收性疾病都与OC活性异常有关[2,3]。OC由骨髓内单核巨噬细胞谱系分化而来, 其分化成熟需经历3个阶段: (1) 单核巨噬细胞前体分化成TRAP及降钙素受体阳性的OC前体; (2) 单核OC前体相互融合, 形成多核OC;但缺乏皱褶缘, 没有骨吸收功能; (3) 非功能性OC在RANKL、TNFα、LPS等因子刺激下活化, 获得骨吸收活性[8]。上述阶段中任何干扰因素都会导致OC分化、细胞融合及骨吸收功能发生异常。

(FITC-Hoechst, ×600)

OC介导的骨吸收依赖于其皱褶缘上空泡性AT-Pase质子泵 (V-ATPase) , 向吸收陷窝内输送H+, 维持较低的p H值。V-ATPases至少含13个亚基, 并且许多亚基还存在不同的异构体, 呈细胞、组织特异性表达[9]。人和小鼠体内V-ATPase V0 d亚基有d1、d2两个异构体, 且均在OC中表达;其中Atp6v0d2在OC中表达更高, 说明其对OC至关重要[10]。研究表明, OC分化早期敲除Atp6v0d2, 会严重影响OC融合;而在晚期敲除, 对OC融合无影响, 但可严重抑制细胞外基质的酸化及骨吸收;提示该基因对OC融合及骨吸收发挥着重要作用[3]。Atp6v0d2基因敲除的小鼠表现出骨量显著增加, 也是因OC融合障碍所致[11]。

本研究中, 我们首先将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用RANKL处理48 h, 使之向OC前体分化;然后将其与OB共培养48 h。此时, 在相差显微镜下观察, 部分细胞开始聚集, 趋于融合, 但尚无多核细胞形成;提示这些细胞处于细胞融合前期阶段。此时用ZOL处理, 将不会对OC早期分化产生影响, 而只会作用于细胞融合及成熟活化阶段。结果表明, ZOL处理使TRAP阳性多核OC的数目和体积均显著低于对照组, 骨吸收功能也受到明显抑制;同时, ZOL组Atp6v0d2基因mRNA水平较对照组下降了64.9%, 蛋白下降了38.35%。上述结果提示, Atp6v0d2表达下调抑制了OC前体的细胞融合, 阻碍了多核OC的生成;从而在ZOL诱发的OC生成抑制中发挥着重要作用。需要指出的是, ZOL处理组仍有功能性多核OC生成, 可能的原因有: (1) ZOL处理时间较短 (24 h) , 作用有限; (2) ZOL处理前及处理后部分前体细胞已经 (或再次) 启动了细胞融合过程。

细胞融合是破骨细胞多核化的重要步骤, 对破骨细胞成熟至关重要。研究表明, 除Atp6v0d2外, 树突状细胞跨膜蛋白 (DC-STAMP) 同样参与了OC前体的融合;而这2个分子均受上游分子NFATc1 (nuclear factor of activated T cell type c1) 的调节[8,12]。NFATc1是NFAT家族的转录因子, 参与许多OC分化及功能基因的表达调控。NFATc1直接结合到Atp6v0d2和DC-STAMP启动子区域, 激活基因表达。在无RANKL条件下, 基因重组NFATc1同样可以通过激活Atp6v0d2和DC-STAMP基因表达, 诱发OC细胞融合, 形成多核OC;而用环胞菌素A使NFATc1失活, 则使Atp6v0d2和DC-STAMP表达下调, OC融合受到抑制[8]。我们前期研究也显示, 阿伦膦酸盐可以显著下调NFATc1基因表达, 抑制OC生成;这可能与NFATc1介导的Atp6v0d2和DC-STAMP表达抑制有关 (待发表) 。

本研究表明, 在体外OB-OC共培养体系中, 唑来膦酸可显著抑制破骨细胞生成及骨吸收功能, 并使Atp6v0d2基因表达显著下调;唑来膦酸的上述作用可能部分与其对Atp6v0d2介导的细胞融合障碍有关。

摘要：目的:研究唑来膦酸 (ZOL) 对破骨细胞 (OC) 生成的影响, 探讨Atp6v0d2基因在其中发挥的作用。方法:应用小鼠颅骨成骨细胞 (OB) 与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7建立共培养体系。细胞分为对照组和ZOL处理组 (ZOL处理24 h) 。在不同时间点收获细胞, 检测Atp6v0d2基因表达、OC生成和骨吸收情况。结果:ZOL组TRAP染色阳性多核OC和骨吸收陷窝显著少于对照组 (P<0.01) ;Atp6v0d2基因表达在ZOL组显著下降 (P<0.01) 。结论:ZOL可显著抑制OB与RAW264.7共培养体系中OC生成和骨吸收功能, 下调Atp6v0d2基因表达。

关键词：唑来膦酸,破骨细胞生成,空泡型质子泵ATPase V0 d2亚基,抗酒石酸酸性磷酸酶

参考文献

[1]Edwards JR, Weivoda MM.Osteoclasts:Malefactors of disease and targets for treatment[J].Discov Med, 2012, 13 (70) :201-210.

[2]Kim T, Ha HI, Kim N, et al.Adrm1 interacts with Atp6v0d2 and regulates osteoclast differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun, 2009, 390 (3) :585-590.

[3]Wu H, Xu G, Li YP.Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption[J].J Bone Miner Res, 2009, 24 (5) :871-885.

[4]Piper PK Jr, Gruntmanis U.Management of osteoporosis in the aging male:Focus on zoledronic acid[J].Clin Interv Aging, 2009, 4:289-303.

[5]董伟, 戚孟春, 梁永强, 等.共培养体系中阿仑膦酸钠对破骨细胞相关基因表达的影响[J].实用口腔医学杂志, 2012, 28 (6) :682-685.

[6]刘强, 董伟, 戚孟春, 等.阿仑膦酸盐对破骨细胞生成的抑制及钙离子激动剂的拮抗效应[J].实用口腔医学杂志, 2012, 28 (2) :182-186.

[7]戚孟春, 胡静, 邹淑娟, 等.大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变[J].华西口腔医学杂志, 2005, 23 (2) :110-112.

[8]Kim K, Lee SH, Ha Kim J, et al.NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP) [J].Mol Endocrinol, 2008, 22 (1) :176-185.

[9]Zhang Z, Zheng Y, Mazon H, et al.Structure of the yeast vacuolar ATPase[J].J Biol Chem, 2008, 283 (51) :35983-35995.

[10]Cipriano DJ, Wang Y, Bond S, et al.Structure and regulation of the vacuolar ATPases[J].Biochim Biophys Acta, 2008, 1777 (7-8) :599-604.

[11]Lee SH, Rho J, Jeong D, et al.v-ATPase V0 subunit d2-deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation[J].Nat Med, 2006, 12 (12) :1403-1409.

破骨细胞生成 篇3

1 成骨细胞 (OB)

1.1 OB在骨组织工程学中的作用

OB是骨形成的主要功能细胞, 负责骨基质的合成、分泌和矿化。OB在维持骨架中起着至关重要的作用。OB负责着骨基质的沉积和对OC的调节。在分化期间, OB有活跃的分泌功能, 能合成和分泌骨基质中的多种有机成分, 包括Ⅰ型胶原蛋白、蛋白多糖、骨钙蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白等;还分泌胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ、成纤维细胞生长因子、白细胞介素-1和前列腺素等, 他们对骨生长均有重要作用;此外, 还分泌破骨细胞刺激因子、前胶原酶和纤溶酶原激活剂, 他们能促进骨的吸收。

1.2 影响OB的因素

1.2.1 正性因素

(1) 降钙素:刺激IGF-1、c-fos、Ⅰ型胶原和骨钙素m RNA表达, 刺激OB增殖和分化; (2) 性激素:能够刺激OB, 促进骨的形成; (3) 胰岛素样生长因子 (IGF) :可刺激OB的增殖和分化并作用于OB和OB前体, 促进骨骼的更新; (4) 骨形态发生蛋白 (BMP) :可刺激原代OB或从骨组织中分离出的其他类型细胞分化为OB; (5) 转移生长因子-β (TGF-β) :刺激非转化的OB的DNA合成及细胞增殖。

1.2.2 负性因素

(1) 皮质类固醇:长期给予超量可以抑制OB的形成和功能。适当剂量能减少前成骨细胞转化为OB, 使骨量减少; (2) 糖皮质激素:导致成熟的具有分泌功能的OB和支撑OC产生的OB的数目减少。

1.2.3 双重作用因素

(1) 瘦素 (leptin) :它可以作用于中枢神经细胞来削弱OB的活动, 或者直接结合于OB表面受体来促进骨的发育的作用; (2) 血小板衍生生长因子 (PDEF) :能显著促进OB的增殖, 却部分抑制OB的分化。

2 破骨细胞 (OC)

2.1 OC在骨组织工程学中的作用

破骨细胞是一种巨大的多核细胞, 起源于骨髓中的造血干细胞。破骨细胞接触到骨基质, 开始活化, 细胞骨架发生重组、细胞极性开始形成并出现骨吸收特异性的膜区域。由于破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成处于动态平衡过程, 使骨组织不断更新, 因此维持了骨骼的硬度与弹性。除此之外, 影响成骨细胞的活性, 介导干细胞从骨髓到血液循环的迁移, 也是破骨细胞的重要骨生理功能。

2.2 影响OC的因素:

2.2.1 正性因素

(1) TNF:促进T细胞产生M-CSF并刺激OB和其他细胞分泌RANKL, 进而促进OC分化; (2) 1, 25- (OH) 2D3:维生素的D3不能直接作用于成熟的破骨细胞, 但可以诱导成骨细胞生成IL-1和IL-6促进骨吸收。

2.2.2 负性因素

(1) 降钙素:降钙素能够明显抑制破骨细胞活性, 减少骨吸收, 广泛应用于治疗骨质疏松疾病; (2) 雌激素:通过TGF-β、成骨细胞分泌产物、和ERKs磷酸化等途径的介导, 促进破骨细胞的凋亡, 亦能够通过促进OPG的产生和抑制C-MSF及TNF的产生来抑制OC产生。另外, 雌激素也能通过抑制c-JNK的表达和、c-JUN的活性以及AP-1和启动子的结合来抑制RANKL诱导OC的产生; (3) OPG:成骨细胞分泌的骨保护素 (OPG) , 是一种可溶性TNF受体家族成员, 也是RANKL的受体, 能与RANKL特异性结合, 进而抑制破骨细胞的形成、活性和存活; (4) IL-4:能通过抑制Ik B的磷酸化来抑制NF-κB的核转位, 进而抑制NF-κB的DNA结合活性, 从而完全抑制OC形成; (5) INF-γ:通过促进TRAF6的降解来抑制OC; (6) MLAA:RANKL诱导的OC前体细胞分泌的MLAA被认为是抑制OC形成的一种自身反馈调节机制。

2.2.3 双重作用因素

(1) TGF-β:低溶度TGF-β促进OC分化, 而高溶度则反过来抑制其分化; (2) PG:在不同的培养系中, 对于破骨细胞的形成和骨吸收具有促进或抑制的作用。

3 OB和OC的相互作用

OB与OC的相互作用从分子生物学层面来说, 是驾于两种细胞跨膜蛋白的接触之上的。两者的相互作用从细胞水平层面来说分为内、外部因素:

3.1 内部因素

(1) OB有通过在前破骨细胞表面的受体激活子RANKL调节骨吸收、分化和融合的作用。同时, 成骨细胞分泌一种可溶的骨保护素 (OPG) 通过与RANKL结合阻断RANK/RANKL交互作用, 从而妨碍破骨细胞分化和激活。因此, RANKL和OPG的平衡又决定了破骨细胞的形成和功能。

(2) 在骨吸收阶段, OB分泌的MCP-1 (单核细胞趋化蛋白-1) 等趋化因子可以刺激OC前体募集, 促使OC活化。

(3) OB能够释放骨钙素, 胎球蛋白-A, 胶原蛋白I型等化学诱导因子, 这些因子在骨形成过程中沉积于骨基质中, 并能促进OC融合并包埋于骨基质中。

(4) 骨吸收到骨形成过程中有一个过渡阶段, 即OC诱导OB活化促进骨形成过程, 在此过程中OC分泌偶联因子是OB活化的关键。

(5) 伴随着骨吸收, OC溶解骨质并释放转化生长因子-B, 骨形态发生蛋白 (骨形成蛋白) 和胰岛素样生长因子 (IGF) -Ⅱ等细胞因子, 从而激活OB。

3.2 外界因素

(1) 皮质类固醇:长期给予超过生理剂量的皮质类固醇能够增加OC的活性和数量, 又可以抑制OB的形成和功能。适当剂量可降低前成骨细胞对骨胶原的合成, 还能减少前成骨细胞转化为OB, 使骨量减少, 增加发生骨质疏松性骨折的概率。

(2) 甲状旁腺激素:由甲状旁腺主细胞和嗜酸性细胞合成, 通过PKA和PKC信号转导通路介导来对OB和OC的功能进行调节, 在骨代谢中具有促进骨形成和骨吸收的双重作用。

(3) IL-1:能促进OB分泌RANKL, 促进OC形成。

(4) M-CSF:T细胞产生的M-CSF, 一方面刺激OB和其他细胞分泌RANKL, 进而促进OC分化。另一方面, M-CSF可以通过激活破骨细胞内的信号传导通路, 使成骨细胞的数目增多, 说明了M-CSF使破骨细胞增殖而激活的信号传导通路间接影响了成骨细胞。

(5) FGFs:在特定的浓度范围内, FGFs能够促进OB和OC的生成和增殖。但在另一浓度范围内, FGFs起到抑制作用。

破骨细胞生成 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄不分雌雄的昆明 (KM) 小鼠, 无特定病原体 (SPF) 级, 由广东省中医院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器

葛根素 (阿拉丁公司, 批号:CAS3681-99-0) ;α-MEM培养基、胎牛血清和青链霉素 (美国, Hyclone公司) ;BCA蛋白质定量测定试剂盒 (美国, Thermo公司) ;微管相关蛋白1轻链3 (LC3) 、酸化核糖体蛋白 (ps6) 、蛋白激酶B (Akt) 、磷酸化Akt (p-Akt) 和p62蛋白的单克隆抗体 (美国, CST公司) ;HRP标记羊抗兔Ig G (武汉博士德生物科技有限公司) ;电泳仪和湿转印仪 (美国, Bio-Rad公司) ;BNA-311/ (2323) CO2细胞培养箱 (美国, Espec公司) 。

1.3 细胞提取、培养及给药方法

用原代培养破骨细胞的方式, 采用骨髓干细胞定向分化的方法。将2月龄的KM小鼠断颈处死后用75%医用乙醇消毒, 在无菌条件下取出小鼠的股骨与胫骨, 用2 m L注射器抽出骨髓液, 过滤后, 按1×106细胞/孔的密度接种于24孔培养板中。在初级培养液 (含10%胎牛血清和10%青链霉素的α-MEM培养液) 中加入巨噬细胞集落刺激因子 (20 ng/ml) , 置于37℃恒温、5%CO2浓度的培养箱中培养。24 h后换成次级培养液 (含10%胎牛血清、10%青链霉素、20 ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/ml的核因子κB受体活化因子配体的α-MEM培养液) , 继续在上述培养箱中培养, 每2天换一次新鲜的次级培养液, 并依据细胞形态、抗酒石酸盐磷酸酶染色法等方法鉴定出已分化的破骨细胞。将培养出的破骨细胞随机分为4组:第1组为对照组, 换液时不加入Pur;第2组为低剂量Pur组, 按10μg/L浓度加入Pur;第3组为中剂量的Pur组, 按10μg/L浓度加入Pur;第4组为高剂量的Pur组, 按100μg/L浓度加入Pur。继续培养7 d后裂解细胞提取相关蛋白。

1.4 蛋白质印迹法 (Western-blot) 检测相关蛋白的表达

采用Western-Blot检测不同浓度Pur组和对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Akt、p-Akt和p-s6的蛋白表达。提取各组细胞总蛋白, 先用BCA (2, 2-联喹啉-4, 4-二甲酸二钠) 法进行蛋白定量测定。加入上样缓冲液, 在95℃下变性10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 电泳, 转膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h后, 分别加入LC3、p62、Akt、p-Akt和p-s6单克隆抗体, 在4℃环境下过夜, 接着用TBST缓冲液洗膜3次, 10 min/次, 加入二抗, 在室温下孵育2 h, 再次用TB-ST缓冲液洗膜。将得到的膜与电化学发光 (ECL) 试剂充分反应后, 曝光于X线胶片上, 显影、定影、扫描后进行图像分析。应用Image-Pro Plus 6.0软件对各个特异性条带进行累计吸光度检测, 最后以积分吸光度值 (IOD) 来表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用One-Way ANOVA检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度Pur组和对照组破骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白的Western-blot检测结果

与对照组比较, 不同浓度Pur组LC3Ⅱ/Ⅰ比值均升高, 且浓度越高, 比值越大, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见图1~2。采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 作为实验操作的标准化内参, 不同浓度Pur组和对照组相比, p62蛋白的消耗均增多, 且10μg/L与100μg/L Pur组比对照组的p62/GAPDH比值小, 差异有统计学意义 (P=0.019、0.036) 。见图3~4。

注:与对照组比较, **P<0.01

注:与对照组比较, *P<0.05

2.2 不同浓度Pur组和对照组破骨细胞Akt-m TOR信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p-s6蛋白的Western-blot检测结果

不同浓度Pur组的p-Akt/Akt比值与对照组相比均降低, 差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见图5~6。不同浓度Pur组的p-s6均受到明显抑制 (P<0.01) ;对p-s6蛋白进行Western-blot检测时, 同样使用GAPDH作为实验操作的标准化内参, 不同浓度Pur组的p-s6/GAPDH比值与对照组相比均较小, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图7~8。

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01

3 讨论

破骨细胞是一种广泛存在于骨组织的高度分化多核巨细胞, 其细胞足体固定在骨质表面, 能发挥骨吸收功能。破骨细胞和成骨细胞在正常人体的骨质中处于一种动态平衡状态, 一旦出现失衡, 将会导致相应的骨病, 常见的是骨质疏松症。骨质疏松症是一种以骨量低下, 骨微结构损坏, 导致骨脆性增加, 易发生骨折为特征的全身性骨病, 为临床上常见的骨代谢病, 主要由于破骨细胞的吸收增加和成骨细胞功能衰减导致的骨组织退行性变, 因此治疗上主要从如何抑制骨吸收和促进骨生成方面考虑[9,10,11,12]。越来越多的文献表明, 在骨组织及各类骨细胞发育成熟过程中, 甚至在骨类疾病中发现自噬现象, 其通过调节自噬来影响, 甚至可以改变骨组织中成骨细胞、破骨细胞和骨细胞之间的平衡, 从而改善骨类疾病的预后, 这已成为当前研究的热点[13]。细胞自噬是一位比利时科学家在1963年的溶酶体国际会议上首次提出的, 是细胞内主要的降解系统, 通过将细胞质内大分子物质包裹并传递到溶酶体中进行降解, 产生氨基酸和能量, 维持细胞内外物质与能量平衡, 这对细胞内环境的稳态和细胞生存至关重要[14], 能在细胞质中形成双层膜囊泡, 将坏死的细胞器 (线粒体、内质网等) 或长半衰期蛋白包裹, 形成自噬小体, 再将其运送至溶酶体, 将小体内容物水解消化, 再释放至细胞质内循环使用[15]。Pur能有效抑制破骨细胞的骨吸收功能[16], 能够使破骨细胞的自噬作用加强, 但其具体机制尚缺乏相关研究。

本研究通过观察Pur对破骨细胞自噬相关蛋白 (LC3和p62蛋白) 和Akt-m TOR信号通路相关蛋白 (Akt、p-Akt和p-s6蛋白) 表达的影响, 证实Pur能有效促进破骨细胞内的自噬相关蛋白的表达, 并发现Akt-m TOR信号通路对该自噬变化有重要作用。LC3是哺乳动物自噬相关基因8 (ATG8) 的同源物, 当自噬激活时, LC3被剪切为LC3Ⅰ, 然后被激活进而转化为LC3Ⅱ, 而后者是自噬泡膜的重要组成部分, 因此, LC3Ⅱ/Ⅰ在一定程度上能代表自噬的激活程度[17]。p62 (SQSTM1) 是自噬活性的标记蛋白, 反映自噬泡的清除速率, 该蛋白表达增高则提示自噬流受抑制[18]。Akt-m TOR通路是调节细胞代谢和凋亡的一种重要通路, 而Akt蛋白在这条通路中起十分重要的作用[19]。Akt蛋白可以在多种酶和转录因子的作用下活化, 从而发挥调节细胞的生理功能。Akt蛋白磷酸化后成为p-Akt蛋白, 通过复杂的反应后可以阻止部分调控蛋白的负调控, 进而激活蛋白翻译, 加快细胞生长而发挥抗凋亡作用。有研究结果显示, p-Akt蛋白表达水平高, 则凋亡细胞数少, p-Akt蛋白表达水平低, 则凋亡细胞数多[20];所以Akt蛋白和p-Akt蛋白是Aktm TOR通路的重要调节蛋白。p-s6蛋白是Akt-m TOR通路活化的效应蛋白, 对p-s6蛋白的测量可以在很大程度上了解Akt-m TOR通路的激活情况。本研究中不同浓度Pur组较空白对照组均表现出LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高, 而且随着Pur浓度的增高, 其比值也相应升高, 差异有统计学意义, 与此同时, 10μg/L和100μg/L Pur组的p62蛋白与空白对照组比较, 其消耗明显增加, 因此认为, Pur有可能通过促进自噬表达的水平而抑制破骨细胞的活性。通过检测Pur对破骨细胞Aktm TOR信号通路相关蛋白表达的影响发现, 不同浓度Pur组与对照组相比, 细胞的Akt蛋白和p-Akt蛋白的表达均有不同程度下降, 而代表Akt-m TOR通路活化程度的p-s6蛋白表达减少, 说明Pur对Akt-m TOR信号通路的相关蛋白具有抑制作用, 这可能是Pur诱导自噬细胞激活的关键信号通路之一。

破骨细胞生成 篇5

1材料

1.1细胞

小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264. 7( 由中国医学科学院基础医学研究所细胞库提供) ,加入含10% 的胎牛血清、1% 双抗和谷氨酰胺的高糖( dulbecco's modified eagle's medium,DMEM) 培养基,置于5% CO2,37℃培养箱中常规培养。细胞生长至80% ~ 90% 融合后进行传代,2 ~ 3天传代1次。

1. 2试剂

胎牛血清,高糖DMEM培养基( 美国GIBCO公司) ; 小鼠重组可溶性核因子 κB受体活化因子配体( soluble receptor activator of nuclear factor k B lig- and,sRANKL) ( 英国Peprotech公司) ; 3-( 4,5-二甲基噻唑-2) -2,5二苯基四氮唑溴盐( 3-[4,5-dimeth- ylthiazol-2-yl ]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT) 、甲苯胺蓝、多聚赖氨酸、抗酒石酸酸性磷酸酶( tartrate resistant acid phosphatase,TRAP) 染色试剂盒( 美国Sigma公司) ; W1( 广州康和药业有限公司提供) ; 牛骨片( 北京荣志海达生物科技有限公司) ; 小鼠肿瘤坏死因子 α ( tumor necrosis factor, TNF-α) 放射免疫试剂盒( 北京普尔伟业生物科技有限公司) 。

1. 3仪器

CO2培养箱( 上海力申科学仪器有限公司, HF151UV) ; 生物安全柜( 上海力申科学仪器有限公司,HFsafe-TE1200) ; 全自动酶标仪( Thermo公司,MK3型) 。

2方法

2. 1药物制备

地乌三萜皂苷W1由广州康和药业有限公司提供。化学名称为: 3-O-α-L-吡喃鼠李糖( 1→2) -β-D- 吡喃葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖( 1 → 4) -β-D-吡喃葡萄糖-( 1 → 6 ) -β-D-吡喃葡萄糖苷。 纯度为99. 40% 。

2. 2玻片与骨片的预处理

将直径为8 mm的48孔板专用细胞爬片,充分清洗,高压灭菌,超净台内多聚赖氨酸包被。将由牛股骨皮质部分制成的直径6 mm的骨片,保存于4℃ 下70% 乙醇中,实验前先将骨片或包被过的细胞爬片置于培养板中,加入培养基冲洗3遍,孵育过夜,然后弃去旧液,接种细胞。

2. 3 W1对破骨细胞生成的影响

将对数生长期RAW264. 7细胞消化,制备单细胞悬液,以5 ×103个/孔的密度接种于预置有细胞爬片的48孔板中,每孔0. 5 ml培养基,除空白对照组外, 其它组均加入50 ng/ml RANKL诱导,给药组同时加入W1使其浓度分别为0. 0625、0. 125、0. 25 μg /ml, 每组3个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中孵育培养,每2天换液1次,换液同时更换培养液中的诱导因子及药物。诱导培养7天,用PBS冲洗细胞爬片3次,然后用4% 多聚甲醛固定15分钟,去离子水冲洗2遍,加入按照说明书配制的TRAP染液, 37℃ 水浴孵育30分钟,光镜下观察到含3个胞核以上且呈TRAP染色阳性的多核巨噬细胞为破骨细胞,计算阳性细胞平均值。

2. 4 W1对骨吸收陷窝形成的影响

将对数生长期RAW264. 7细胞消化,制备单细胞悬液,以2 × 103个/孔的密度接种于置有牛骨片的96孔板中,除正常对照组外,其它组均加入50 ng / ml RANKL诱导,给药组同时加入W1使其浓度分别为0. 0625、0. 125、0. 25 μg /ml,每组3复孔。 隔天换1次液,各组细胞置37℃、5% CO2培养箱中孵育培养7天。第7天取出骨片,用0. 25 mol/L NH4OH溶液超声洗涤10分钟 × 3次,蒸馏水冲洗, 梯度酒精( 80% ,90% ,95% ,100% I,100% II) 脱水,每个梯度3分钟。室温1% 甲苯胺蓝染色8分钟左右。 蒸馏水冲洗,光镜下观察,用Image Pro Plus软件分析整张骨片上骨陷窝的数量及面积百分比。将牛骨片超声清洗干净后,烘干、装台( 粘胶) 、表面真空离子喷金,扫描电子显微镜下观察并摄像。

2. 5放射免疫法检测W1对TNF-α 表达的影响

将对数生长期RAW264. 7细胞消化制备单细胞悬液,以1 × 104个/孔接种于96孔培养板,待细胞长满80% ,加入含0. 1% 胎牛血清( fetal calf ser- um,FBS) 的培养基,静息24小时后,除正常对照组外,其它组均加入50 ng /ml RANKL诱导,给药组同时加入W1使其浓度分别为0. 0625、0. 125、 0. 25 μg / ml,培养24小时,收集细胞上清液,按碘［I125］-肿瘤坏死因子放射免疫试剂盒说明步骤进行TNF-α 含量测定,γ 放免计数仪直接给出检测数值。

2. 6MTT法检测W1对RAW264. 7细胞毒性的影响

将对数生长期RAW264. 7细胞消化,制备单细胞悬液,以1 × 104个/孔接种于96孔板,每孔200 μl,培养过夜。 除正常对照组外,其它组均加入50 ng /ml RANKL诱导,给药组同时加入W1使其浓度分别为0. 0625、0. 125、0. 25 μg /ml。培养24小时后,每孔加入MTT( 5 mg /ml) 10 μl,反应4小时后,小心吸去培养液,每孔加入150 μl二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO) ,震荡10分钟充分溶解,酶标仪在492 nm波长检测吸光度值。

2. 7统计学处理

采用SPSS 17. 0数据分析软件对实验数据进行统计分析处理,实验数据用(  ± s) 表示,采用单因素方差分析做组间数据分析,P < 0. 05为组间具有显著性差异。

3结果

3. 1 W1对破骨细胞生成的影响

诱导培养7天后进行TRAP染色,与空白对照组相比,RANKL组出现多个体积较大、胞浆呈玫红色的多核细胞( 核≥3个) ( P < 0. 001) ; 与RANKL组相比,在不同浓度的W1作用下,破骨细胞数量均明显降低( P < 0. 01) ,说明W1具有明显的抑制RANKL诱导的RAW264. 7细胞形成破骨细胞的能力,见图1及表1。

注: 与空白对照组比较,aP < 0. 001; 与RANKL组比较,bP < 0. 01

3. 2 W1对骨吸收陷窝形成的影响

药物作用7天后,骨片经甲苯胺蓝染色,光镜下可见蓝紫色圆形、椭圆形或不规则形,大小不一,边界清晰的吸收陷窝; 扫描电镜下观察,骨吸收陷窝的变化趋势与光镜结果一致,同一标本可清楚识别形态相似的骨吸收陷窝。RANKL组可见较大面积的骨吸收陷窝形成; 与RANKL组相比,0. 0625、 0. 125、0. 25 μg / ml的W1均可显著抑制骨吸收陷窝形成,减少骨吸收陷窝面积( P < 0. 01,P < 0. 001, P < 0. 001) ,说明W1具有明显的抑制RANKL诱导的RAW264. 7细胞形成破骨细胞的能力,见图2、图3及表2。

注: 与RANKL组比较,aP < 0. 01,bP < 0. 001

3. 3 W1对RANKL诱导RAW264. 7细胞TNF-α 表达的影响

RANKL组TNF-α 水平较空白对照组显著升高( P < 0. 01) ,说明RANKL诱导可显著提高TNF-α 在RAW264. 7细胞中的分泌水平; 0. 0625、0. 125、 0. 25 μg / ml的W1均可显著降低由RANKL诱导的TNF-α 在RAW264. 7培养上清中的异常高表达( P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01) ,说明W1可显著抑制RAW264. 7细胞分泌TNF-α,见表3。

注: 与空白对照组比较,aP < 0. 01; 与RANKL组比较,bP < 0. 05,cP < 0. 01

3. 4 W1对RAW264. 7细胞毒性的影响

MTT比色法所测各组吸光度值间接反映活细胞数量。结果显示,在有/无RANKL诱导的情况下,W1在所观察的浓度范围内,对RAW264. 7均不具有明显的增殖抑制作用,无细胞毒作用,见表4、表5。

4讨论

破骨细胞在骨破坏中所起的关键作用已被研究所证实［4］。作为体内唯一具有骨破坏能力的细胞,破骨细胞来源于单核/巨噬细胞系的造血前体细胞,并由这些前体细胞经分化、融合而成终末多核巨细胞［5］。RAW264. 7细胞是小鼠源性破骨前体细胞,目前,通过RANKL诱导RAW264. 7细胞获得成熟破骨细胞是公认的体外研究破骨细胞分化的经典体系［6-7］。该细胞体系不仅表达巨噬细胞集落刺激因子( macrophage-colony stimulating factor, M-CSF) ,还表达原癌基因c-fms( the proto-oncogene fms,c-fms) 癌基因受体( c-fms receptor) 和核因子 κB受体活化因子( receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANK ) ,这也解释了RAW264. 7只需要RANKL诱导就能生成破骨细胞的原因［8-9］。本研究利用RANKL诱导RAW264. 7细胞向成熟破骨细胞分化方法,观察到在RANKL诱导下,RAW264. 7细胞由类圆形单核细胞逐渐转变为胞体较大、边缘不整齐、周围有刷状缘( 褶皱) 和伪足的多核细胞,且在诱导的第7天左右多核细胞数量达到高峰,经TRAP染色可见多量胞浆成玫红色的多核( 核≥3个) TRAP阳性细胞,提示了本实验条件下,破骨细胞在体外的诱导分化成功。当给予不同浓度的W1干预后,TRAP阳性细胞数目均显著减少,提示了W1可抑制破骨细胞的分化。

破骨细胞形态和功能成熟是两个相对独立的阶段,功能成熟的破骨细胞可黏附于骨的表面并迁移造成不规则、波状的哈氏陷窝,形成骨侵蚀［10］,因此通过骨片上的陷窝面积反映破骨细胞的骨吸收活性,是目前定量评定体外培养破骨细胞活性的可靠方法之一［11］。本实验发现RANKL诱导培养7天后,牛骨片经甲苯胺蓝染色,光镜下可见圆形、椭圆形、串珠形、腊肠形或不规则形等呈蓝紫色异染的陷窝,散在分布,边界清晰,大小不一; 扫描电镜下观察,骨吸收陷窝的变化趋势与光镜结果一致,同一标本可清楚识别形态相似的骨吸收陷窝,边界轮廓清晰,陷窝底部粗糙,纤维纹路清晰可见,表明了本实验条件下所诱导形成的破骨细胞具有骨吸收功能。当给予不同浓度的W1干预后,骨吸收陷窝面积和数量显著减少,提示了W1可抑制破骨细胞的骨吸收功能。