神经抑制（通用4篇）
神经抑制 篇1
下丘 (inferior cilliculus IC) 是哺乳动物皮质下主要的听信息整合中枢, 它接受来自不同低位听觉脑干核团的上行投射和来自听皮质下行的直接和间接投射, 此外, IC还接受IC内中间神经元的局部内在平行输入。所有IC内汇聚性输入与IC形成的联系既有兴奋性的也有抑制性的, 它们在IC中进行整合, 决定着下丘神经元对声信号的处理。神经抑制作用主要由GABA能和Glycine能神经元介导, 通过影响IC神经元声反应的基本特性, 使得神经元的反应表现出多样性和易变性, 从而适合于加工复杂多变的声信息。神经抑制在下丘神经元声信号加工中的作用可表现在以下几个方面:
1对频率调谐的作用
频率调谐是听神经元的基本特性之一, 而频率调谐曲线 (FTC) 的宽窄反映了听神经元的频率选择性。用双声刺激可分别获得神经元的兴奋和抑制性FTC。GABA能和Glycine能抑制能显著锐化IC神经元的兴奋性FTC, 当向IC神经元分别离子电泳导入GABAA受体阻断剂Bicuculine (Bic) 和Glycine能受体阻断剂Strychnine (Stry) 去抑制后, 可观察到IC神经元的兴奋性FTC被不同程度的拓宽, 抑制性FTC被部分或完全消除。研究还发现解除抑制对IC神经元FTC的影响程度随声强度的不同而异, 即对FTC阈上10 dB内影响很小或无影响, 而对较高声强度部分的FTC影响较大, 表明神经抑制更多的是作用于兴奋性FTC的上部, 通过锐化兴奋性FTC上部使得神经元对较高声强的频率编码更清晰, 从而定形FT的范围和FTC的形状。
2对放电率的作用
分别导入GABA和Glycine对听神经元的放电率均有一定的抑制作用, 大部分IC神经元的放电率表现出呈剂量依赖性减少。反之, 电泳导入Bic和Stry后神经元的发放率显著增加, 反应幅度增大。IC神经元的强度——放电率函数一般分为单调型、饱和型和非单调型。导入Bic后可使相当部分神经元的强度-放电率函数由非单调型转换为单调型或饱和型, 也说明神经抑制更多的是影响高声强度下的反应。此外, 神经元的不同发放模式也可能是继兴奋性反应后的神经抑制所致。导入Bic能使某些相位型和相位爆发型模式转变为持续发放型, 因此, 可认为相位型和相位爆发型代表的是下丘内兴奋和抑制相互作用的结果, 而持续型则可能是以接受兴奋性输入占绝对优势的结果。可见, 神经抑制像“雕刻刀”一样雕琢神经元的发放模式和发放率。
3对时相信号反应的作用
3.1串声刺激
IC神经元对不同脉冲重复率 (pulses repetition rate PRR) 声刺激表现出不同的反应特性。一般来说, IC神经元均能对较低PRR产生跟随反应, 而对高PRR的反应则各有差异。有的神经元有较好的跟随反应特性, 而有的则较差。Bic除能易化神经元反应外, 还能提高部分神经元对PRR的跟随能力, 使其在较高的PRR下也能对每一脉冲产生发放。Lu等认为, 随着PRR的增加, 神经元跟随反应降低与神经元的恢复周期有关。神经元恢复周期作为一种重要属性, 主要由兴奋后的不应期和神经元接受的抑制性输入所决定的, 有研究表明, Bic去GABA能抑制后能提高大部分IC神经元的兴奋性, 缩短恢复周期。因此, 可认为IC神经元跟随PRR的能力受神经抑制的“阀门”样调制。
3.2正弦调幅 (SAM) 声刺激
IC神经元对SAM声刺激反应的锁相能力表现出随调制频率的增加而降低。Pollak等人发现, 对低调制频率产生锁相反应的神经元, 阻断神经抑制后, 其中90%以上神经元的锁相反应特性极少改变, 调制频率范围也一般不变;不对任何SAM刺激产生锁相反应的神经元, 阻断抑制后, 其中大部分神经元可变为对低调制频率 (﹤250 Hz) 的SAM呈锁相反应, 但对高调制频率SAM仍不反应。由此可见, 那些只对低调制频率的SAM产生锁相反应的IC神经元, 并不完全是由神经抑制掩盖了锁相的兴奋性输入所致, 这与神经元对不同PRR反应的结果明显不同, 表明IC神经元在加工声时间信息方面可能存在更为复杂的机制。
4对时程调谐的作用
神经元对声时程的调谐可用来作为辨别有生物学意义声的有效过滤器。有些IC神经元只对某一特定的时程声信号反应, 如只对短时程声反应, 其反应与声时程对应的函数关系分别定义为带通型和短通型, 这两类特殊神经元被称为时程调谐神经元。Bic和Stry能不同程度地消除或拓宽部分神经元的时程调谐, 使之能对较长或对任何时程声都产生强烈的发放。
产生时程调谐的机制与兴奋性和抑制性输入的持续时间、相对强度和到达IC的时间有关。已对此提出了不同的解释, Casseday认为时程调谐的机制包括三个部分:即与声刺激开始相关的持续性抑制输入, 与声刺激开始和结束相关的短暂性兴奋输入。当两个兴奋性事件在时间上发生重合时神经元产生发放;兴奋性输入的起始时间滞后于抑制性输入的起始, 即抑制性输入出现在兴奋性输入之前, 或是与之重合, 并以持续较长时间来消除在非最佳时段到来的兴奋性输入, 但这一解释只适用于off反应的时程调谐神经元。Fuzessery对短通型onset反应的神经元提出了反重合机制 (anti-coincidence) , 认为在神经元接受到与声刺激开始相关的兴奋性和抑制性输入时, 只有当抑制性输入与迟到的兴奋性输入不重合时, 神经元才会反应。尽管确切机制还有待进一步研究, 但神经抑制在IC神经元声时程调谐过程中的关键作用是勿庸置疑的。
摘要：下丘是中枢听觉系统声信号处理的重要中继站, 它接受来自上、下行, 平行及核团内的纤维投射, 其中抑制性的输入影响着下丘神经元对声信号的加工, 神经抑制作用表现在下丘神经元的多种声反应特性中。
关键词：神经抑制,声信号加工,下丘
参考文献
[1]Jen PHS, Sun XD, Chen QC.An electrophysiological study of neural pathways for corticofugallyinhibited neuronsinthe central nucleus of the inferior colliculus of the big brown bat, Eptesicus fuscus[J].Exp Brain Res, 2001, 137:292-302.
[2]E Salda?a, MFeliciano, EJ Mugnaini.Distribution of descend-ing projections frompri mary auditory neocortex toinferior collic-ulus mi mics the topography of intracollicular projections[J].J Comp Neurol, 1996, 371:15-40
[3]Oliver DL, Winer JA, Beckius GE, Saint Marie RL.Morphology of GABAergic neurons in the inferior colliculus of the cat[J].J Comp Neurol, 1994, 340:27-42.
[4]Lu Y, Jen PHS.GABAergic and glycinergic neural inhibition in excitatory frequency tuning of bat inferior colloculus neurons[J].Exp Brain Res, 2001, 141:331-339.
[5]Yang L, Pollak GD, Resler C.GABAergic circuits sharpen tun-ing curves and modify response propertiesin the mustache bat in-ferior colliculus[J].J Neurophysiol, 1992, 68:1760-1774.
[6]Le Beau FE.Mal mierca, MS.Rees.AIontophoresisin vivo dem-onstrates a key role for GABA (A) and glycinergic inhibition in shaping frequency response areas in the inferior colliculus of guinea pig[J].J Neurosci, 2001.
[7]周晓明, 冯瑞本, 孙心德.Bicuculline对小鼠中脑下丘听神经元反应特性的影响[J].动物学杂志, 2001, 36:26-30.
[8]Fuzessery ZM, Hall JC.Role of GABAin shapingfrequency tun-ing and creating FMsweep selectivity in inferior colliculus[J].J Neurophysiol, 1996.
[9]Le Beau FE, Rees A, Mal mierca MS.Contribution of GABA-and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal re-sponse properties of neurons in the inferior colliculus[J].J Neu-rophysiol, 1996.
[10]栾瑞红, Jen PHS, 孙心德.GABA能抑制调制大棕蝠下丘听神经元时间编码模式[J].生物物理学报, 2002.
神经抑制 篇2
关键词：水杨酸钠,电压门控钾通道,螺旋神经节神经元,膜片钳技术
阿司匹林是目前临床广泛使用的药物之一, 其主要代谢产物及药理成分是乙酰水杨酸, 具解热、镇痛、抗风湿等效果。它具有多种不良并发症, 如耳鸣、听力下降等。耳鸣是一种以幻听为特点的听觉障碍, 其发病率在我国逐年增高, 严重影响人们的日常生活。螺旋神经节神经元是听觉系统的第一级神经元, 与听觉的产生关系十分密切, 它的功能障碍往往严重影响听觉的产生。水杨酸钠可导致耳鸣的发生, 这可能与水杨酸钠导致的神经兴奋性及神经同步增强有关。而电压门控钾通道的开放与神经兴奋地去极化关系密切[1]。本研究通过全细胞膜片钳技术记录水杨酸钠引起的螺旋神经节神经元电压门控钾通道电流改变, 来阐述其两者间的关系。
1 材料与方法
1.1 SGN培养
选用新生1-3天的Wistar大鼠 (SPF级别, 由广西医科大学动物实验中心提供) , 断头, 暴露耳蜗, 分离螺旋管并置于37℃0.25%胰蛋白酶中消化10min, 10%胎牛血清终止消化, 分离杂质后种植于多聚赖氨酸包被过得35mm培养皿中, 放入37℃5%CO2培养箱中培养。
1.2 全细胞膜片钳记录技术
以硬质无芯玻璃毛胚管, 拉制成阻抗为4～6MΩ的电极备用。细胞外液 (mmol/L) :NaCl 150, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 2, D-Glucose 10, HEPES 10, TTX 0.3μmol/L用NaOH调节pH值到7.4;细胞内液 (mmol/L) :KCl 120, NaCl 30, MgCl2 1, CaCl2 0.5, EGTA 5, HEPES 10, 用KOH调节pH值到7.2。显微镜下选择胞体大、遮光性好、表面光滑、轴突长度超过胞体轴长的螺旋神经节神经元作为实验细胞。采用EPC-10膜片钳放大器 (HEKA公司, 德国) 、Pulse8.0软件记录、分析。使用ALA微量加药系统对封接细胞进行单细胞给药。
1.3 分组方法
实验细胞分为两组, 第一组为对照组, 急性分离培养28h后进行实验;第二组为水杨酸钠1mmol/L组, 急性分离培养24h后, 换含水杨酸钠1mmol/L培养基继续培养4h后进行实验。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0软件及Sigmaplot 11.0软件分析数据。计量资料以
2 结果
2.1 SGN的形态
细胞经培育24h后已完全贴壁, 新生轴突长度超过胞体轴长, 细胞状态符合膜片钳记录要求 (见图1) 。
2.2 水杨酸钠浓度依赖
电极与细胞形成高阻封接 (>1GΩ) 后, 行快电容补偿 (>80%) , 快速负压破膜, 钳制膜电压至-70mV并行慢电容补偿 (>70%) , 形成全细胞记录模式。施以+40mV, 持续250ms的脉冲刺激, 分别给予含10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L水杨酸钠 (见图2) , 可知随着水杨酸钠浓度增加, Ik降低, 成浓度依赖, 所以我们选用浓度为1mmol/L水杨酸钠。
2.3 水杨酸钠对电压门控钾通道的抑制作用
同上, 形成全细胞记录模式, 施以-70到+40mV, 持续250ms, 跃阶为10mV的脉冲刺激 (如图3) 。
2.4 将每个细胞的平均电流 (由Pulse8.0获得) 除以各自的膜电容, 得到电流密度。
以各组的电流密度均值及标准差与对应的膜电位作图 (见图4) , 既是电流密度-膜电位曲线图。对照组及1mmol/L水杨酸钠组在膜电压40mV时, 其电流密度分别为 (300.617±8.68677) pA/pF、 (133.1328±16.55684) pA/pF差异有统计学意义 (n=8, t=25.336, P=0.000) 。
2.5 稳态激活曲线:
将对照组及1mmol/L水杨酸钠组电流密度归一化后, 与膜电位作图, 经Boltzmann公式进行拟合 (见图5) , 获得对照组及1mmol/L水杨酸钠组的半激活电压分别为 (12.3276±1.2201) mV、 (1.7391±1.6146) mV (n=8, t=14.7986, P=0.000) , 斜率分别为16.4754±0.8352、17.2850±1.1872 (n=8, t=1.5775, P=0.1370) , 1mmol/L水杨酸钠组半激活电压与对照组间差异有统计学意义, 既水杨酸钠可导致Ik激活曲线向左移动10.5885mV, 而其斜率组间差异无统计学意义。
3 讨论
耳蜗螺旋神经节分为Ⅰ型双极神经元和Ⅱ型假单极神经元, 而Ⅰ型神经元约占95%左右[1], 数个Ⅰ型神经元与一个内毛细胞形成突触, 在大鼠中目前还未见发现Ⅱ型神经元的报道[2], 几乎所有的有关听神经电生理的数据都来自支配内毛细胞的Ⅰ型神经元。水杨酸钠并不改变内毛细胞[3], 所以水杨酸钠导致的耳鸣及听力下降可能与SGN密切相关。一组分布靠近的电压门控钾通道可能与某个特定的声音编码频率有关[4]。因此水杨酸钠导致钾通道的改变直接导致SGN对声音编码错误甚至SGN的凋亡, 导致耳鸣及听力下降。本实验结果显示, 水杨酸可以抑制螺旋神经节神经元电压门控钾通道的电流峰值, 其抑制强弱与水杨酸浓度呈正相关。水杨酸还可以改变电压门控钾通道半激活电压, 使其激活曲线向超级化方向移动, 既导致电压门控钾通道激活阈值降低, 更易于激活, 产生动作电位, 导致兴奋毒性[5,6]。这可能与水杨酸钠导致的耳鸣及听力下降有关[7]。
参考文献
[1]刘铤.内耳病[M].北京:人民卫生出版社, 2006:51.
[2]付勇, 丁大连.大鼠耳蜗器官培养及其组织学检查技术[J].中国耳鼻咽喉头颈外科, 2009, 11:604-607.
[3]Kimitsuki T, Kakazu Y.Salicylate-induced morphological changes of isolated inner hair cells and outer hair cells from guinea-pig cochlea[J].Auris Nasus Larynx, 2009, 36 (2) :152-156.
[4]Adamson CL, Reid MA.Firing features and potassium channel content of murine spiral ganglion neurons vary with cochlear location[J].The Journal of comparative neurology, 2002, 447 (4) :331-350.
[5]刘砚星, 李学佩, 刘俊秀, 等.水杨酸钠对大鼠下丘神经元钾通道的抑制作用[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2005, 40 (11) :835-839.
[6]刘砚星, 李学佩, 张海林, 等.水杨酸钠对大鼠颞皮层神经元延迟整流钾通道的抑制作用[J].中国药理学通报, 2011, 27 (4) :482-486.
神经抑制 篇3
1 材料与方法
1.1 试剂与药品
一抗 (兔抗鼠HIF-1α、Bax、Bcl-2) 和二抗 (即用型SABC试剂盒) 及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。2ME2系美国Cayman公司提供, 由于2ME2是脂溶性粉末物质, 本实验采用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解后, 用PBS稀释使有毒物质DMSO的浓度降为5%, 制成2ME2溶液。
1.2 动物分组及模型制备
120只清洁级、封闭群、新生7 d龄Wistar大鼠, 体重11 g～15 g, 雌雄不限, 购自山西医科大学生理实验室动物房。随机分成假手术组 (Sham组, n=8) 、缺氧缺血模型组 (HIBD组, n=56) 、2ME2干预组 (2ME2组, n=56) 。后两组根据处死时间不同又分为7个亚组:3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d, 每亚组各8只。Sham组给予麻醉后切开颈部皮肤, 游离左侧颈总动脉后缝合皮肤;HIBD组给予麻醉后切开颈部皮肤, 结扎左侧颈总动脉, 缝合皮肤后休息90 min, 置于缺氧仓中 (含8%氧气) 2 h。2ME2组同HIBD组制作HIBD模型, 各亚组在缺血缺氧后10 min给予一次性腹腔注射2ME2溶液 (其中2ME2的含量为15 mg/kg) 。Sham组、HIBD组仅给予等量的DMSO+PBS。
1.3 标本的制备
各组分别在模型制备后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和7 d处死各组动物, 断头取左侧脑组织, 10%多聚甲醛室温固定24 h, 切块, 石蜡包埋后, 连续做冠状切片。
1.4 HE染色
常规石蜡切片→二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→苏木素、伊红染色→二甲苯透明→中性树胶封片→显微镜下观察。
1.5 免疫组化
1.5.1 HIF-1α的检测
切片常规脱蜡至蒸馏水, 至3%H2O2, 室温孵育15 min, 枸橼酸缓冲液高压热修复2 min, 降温至室温, PBS液洗, 加HIF-1α的一抗 (1∶150) , 湿盒置于4 ℃冰箱内过夜, 复温至室温, PBS液洗, 加二抗, 湿盒置于37 ℃恒温箱内孵育15 min, PBS液洗, DAB显色剂显色, 自来水中终止, 苏木素复染, 脱水, 透明, 中性树胶封片。阴性对照切片用PBS液代替一抗, 余步骤相同。
1.5.2 Bax、Bcl-2的检测
用Bax、Bcl-2的一抗代替HIF-1α的一抗, 稀释浓度热修复时间及余步骤与HIF-1α的检测相同。
1.6 TUNEL计数细胞凋亡
严格按照试剂盒提供的实验步骤操作。
1.7 图像分析
采用BI-2000医学图像分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 进行图像采集与分析, 在相同光亮强度和放大倍数 (10×40) 条件下统计阳性细胞平均灰度值 (无单位) , 平均灰度值越高, 阳性表达越弱, 而平均灰度值越低, 阳性表达越强。每只鼠3张片子, 每张片子取4个视野, 求其均数进行比较和分析。TUNEL计数:高倍镜下 (×400) 在缺血侧皮质区随机选取10个非重叠视野, 计数500个细胞, 计算阳性率即凋亡指数 (AI) =阳性细胞数/观察细胞数×100%。
1.8 统计学处理
应用SPSS 13.0统计学软件, 数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 组织病理学观察 (HE染色)
Sham组各时间点脑组织结构层次清晰, 细胞排列整齐、形态正常, 核仁清楚。HIBD组神经细胞水肿、坏死, 胞体溶解, 胞浆淡染, 核固缩、碎裂、溶解及胶质细胞增生明显。2ME2组各时间点脑组织病理变化较HIBD组明显减轻, 细胞排列尚规则, 可见斑点状神经元变性、坏死。
2.2 各指标的表达情况 (免疫组化)
2.2.1 HIF-1α的免疫组化染色
光镜下观察:HIF-1α阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积, 阳性细胞表达主要见于大脑皮层和海马, 阳性着色在细胞核和细胞质均可见。阴性对照切片中HIF-1α的免疫反应产物较其他两组明显减少。HIF-1α在Sham组表达微弱;在HIBD组于HIBD后3 h增强, 12 h达高峰, 之后下降, 至7 d时表达最低, 但仍高于Sham组 (P<0.05) ;2ME2组的表达趋势和HIBD组相同, 但表达水平降低 (P<0.05) 。详见表1。
2.2.2 Bax的表达
光镜下观察:Bax阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积, 阳性细胞表达主要见于大脑皮层和海马, 阳性着色主要位于神经元胞浆。阴性对照切片中免疫反应产物明显减少。 Bax在Sham组各时间点低水平表达;在HIBD组, 于HIBD后3 h即明显增强, 至24 h达高峰, 之后降低, 但始终高于Sham组 (P<0.05) ;2ME2组各时间点Bax的表达趋势先降低后升高, 24 h表达最低, 各时间点表达水平较HIBD组明显降低 (P<0.05) 。详见表2。
2.2.3 Bcl-2的表达
Bcl-2阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积, 阳性细胞表达主要见于大脑皮层和海马, 阳性着色主要位于神经元胞浆。阴性对照切片中免疫反应产物明显减少。Bcl-2在Sham组各时间点呈低水平表达;在HIBD组于HIBD后3 h增强, 至24 h达高峰, 之后降低, 但始终高于Sham组 (P<0.05) ;2ME2组各时间点的表达趋势同HIBD组, 表达量升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表3。
2.2.4 Bax/Bcl-2灰度值的比值
Sham组为1.08±0.54;HIBD组3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d各亚组为0.83±0.07、0.82±0.07、0.82±0.05、0.85±0.09、0.89±0.06、0.91±0.06、0.98±0.07;2ME2组各亚组的比值为 0.96±0.08、1.07±0.13、1.27±0.14、1.68±0.14、1.27±0.17、1.27±0.14、1.23±0.25。与Sham组比较, HIBD组各个时间点的Bax/Bcl-2平均灰度值比值均低, 即表达量比值高, 即脑组织的损伤较Sham组重。2ME2组各时间点的Bax/Bcl-2平均灰度值比值较HIBD组均高, 即表达量比值较低, 提示脑组织的损伤较HIBD组减轻。与Sham组比较, 12 h之前, 2ME2组平均灰度值比值较低, 而之后较高, 表明12 h之内仍表现为对脑组织的损伤作用, 12 h之后则表现为保护作用。
2.3 脑细胞凋亡情况
TUNEL阳性细胞呈深褐色, 主要见于大脑皮层和海马区。HIBD组的脑细胞凋亡最多, 2ME2组较之明显减少, Sham组凋亡细胞少见。详见表4。
3 讨 论
HIF-1对维持机体的氧平衡有重要作用, 由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成, 其中HIF-1α亚基在缺氧诱导的细胞凋亡中起关键作用[5]。本实验结果显示, HIF-1α的表达在缺氧缺血先升高后降低, 考虑与复氧后泛素系统的活性恢复、HIF-1α降解增加有关。有关HIF-1α在缺氧缺血性脑损伤中究竟是促进还是抑制细胞凋亡, 目前尚存在争议。
Bax在未成熟脑中呈高表达, Bax依赖性的细胞凋亡机制在未成熟脑中占明显优势[6]。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡的调节中发挥关键作用[7]。本实验选用的指标Bax和 Bcl-2分别是Bcl-2家族蛋白中促凋亡和抗凋亡的重要成员, 参与Bax依赖性的细胞凋亡机制。
2ME2是雌激素的正常代谢产物, 存在于人体的血液与尿液中, 是一种有效的缺氧诱导因子- 1α阻滞剂, 且专一的影响H IF-1α亚基, 并没有影响HIF-1β或其他转录因子[8]。本研究结果显示, 应用2ME2抑制HIF-1α后, HIF-1α在HIBD后的表达明显降低, 促进凋亡的蛋白Bax的表达明显降低, 抑制凋亡的蛋白Bcl-2的表达明显升高, 引起Bax/Bcl-2表达量比值降低, 最终脑细胞凋亡明显减少, 脑损伤减轻, 表明HIF-1α的过度表达对缺氧缺血性脑损伤是有害的, 这与Helton等[9]和Chang等[4]的结果是一致的。Helton和Chang等分别通过特异性的敲除脑组织的HIF-1α基因和使用川芎嗪抑制HIF-1α后发现缺氧缺血性脑损伤减轻。另外Calvert等[10]指出高压氧和正常氧治疗后, HIF-1α的表达较非治疗组均降低, 而脑损伤减轻, 也可以从一个侧面反映HIF-1α的过度表达对HIBD是有害的。
然而也有报告如Baranova等[11]认为神经元特异性的失活HIF-1α会增加短暂局灶性脑缺血损伤, HIF-1α整体上来说介导的是一个有益的反应。有意义的是Baranova等[11]研究证实, 对野生型小鼠MCAO (大脑中动脉缺血) 6 h～12 h后缺氧缺血区的促凋亡基因BNIP3和NIX在mRNA 和蛋白水平均上升, 在缺氧缺血急性期 (<12 h) HIF-1α促进细胞凋亡。这和本研究的结果是相同的。因此, 推测 2ME2发挥神经保护作用的机制是它在缺氧缺血早期抑制HIF-1α表达从而减少此时的促凋亡基因的表达。然而, 2ME2的其他性质已报告, 如抗新血管生成和改变炎症反应等, 这些性质本身也可以减轻缺氧缺血性脑损伤。本实验尚不能肯定2ME2的神经保护作用是通过抑制HIF-1α表达产生的, 尚待进一步的研究证实。
另有报告, 如Sheldon等[12]采用Cre/Lox技术使前脑主要的神经元特异性的失活HIF-1α, 认为HIF-1α缺失会增加新生儿缺氧缺血性脑损伤。但是这个模型中小鼠在缺氧环境中仅仅暴露30 min, 产生的是中度的脑损伤, 这与本实验缺氧程度、动物种类及模型制备等是不同的。目前有研究指出, HIF-1α在缺氧缺血性脑损伤中发挥促进和抑制凋亡的双重作用, 可能由于缺氧缺血持续的时间[13]及程度不同引起所调节的靶基因不同产生的。轻、中度缺氧时, HIF-1α的复合物稳定, 引起VEGF、EPO等具有神经保护作用的靶基因表达[14]。但在严重或持续缺氧时, HIF-1α使细胞内的p53、BNIP3等水平增高, 导致神经毒性[15]。另外, HIF-1α究竟是发挥哪种作用, 还依赖于病理刺激的类型[16]及涉及反应的细胞类型[17]等。
综上所述, HIF-1α在缺氧缺血性脑损伤究竟是发挥促进还是抑制脑细胞凋亡的作用, 和众多因素有关。本研究表明缺氧缺血后HIF-1α的过度表达对HIBD是有害的。2ME2通过降低急性期HIF-1α的表达, 使促凋亡蛋白Bax的表达降低, 抑凋亡蛋白Bcl-2的表达升高, Bax/ Bcl-2表达量比值降低, 改善脑损伤。HIF-1α的抑制剂给新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗带来新的希望。
摘要：目的 探讨缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 及其抑制剂2-甲氧基雌二醇 (2ME2) 对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时神经细胞凋亡的影响。方法 将120只新生7d龄Wistar大鼠随机分为假手术组 (Sham组, n=8) 、缺氧缺血模型组 (HIBD组, n=56) 、2ME2干预组 (2ME2组, n=56) , 后两组采用Rice法建立模型后, 根据断头取脑的时间不同又分为3h、6h、12h、24h、48h、72h和7d7个亚组。应用HE染色观察脑组织的病理变化, 免疫组化技术检测HIF-1α、Bax、Bcl-2的表达, TUNEL法计数脑细胞凋亡。结果 HE染色显示2ME2干预后脑组织的损伤减轻;免疫组化显示:HIF-1α在HIBD组于模型制备后3h升高, 12h达高峰, 之后下降, 2ME2组表达趋势和HIBD组相同, 表达水平显著下降。与HIBD组比较, 2ME2组各时间点的Bcl-2表达显著升高, Bax表达显著降低, TUNEL标记的阳性细胞数明显减少。结论 在新生大鼠缺氧缺血急性期使用2ME2抑制HIF-1α的表达, 引起Bax/Bcl-2表达量比值降低, 凋亡细胞数目减少, 改善脑损伤。
神经抑制 篇4
依赖性受体Unc5H家族在无配体Netrin-1作用下可指引细胞走向凋亡, 起到条件性肿瘤抑制基因的作用。既往研究证明Unc5H4基因在低危神经母细胞瘤中表达明显高于其在高危NB中的表达水平, 且高Unc5H4表达与NB患儿长期生存相关[2]。而P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因, 在所有恶性肿瘤中50%以上会出现P53基因的突变, 说明P53基因的改变可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。本实验观察应用si RNA沉默P53表达及P53缺失的NB细胞系中转染P53表达后, 在DNA损伤时Unc5H4的表达与P53的关系, 从而探讨依赖性受体Unc5H4的表达及诱导凋亡与P53之间的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞与试剂
人神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE细胞株 (中国科学院上海细胞库) ;p SUPER-P53质粒 (Oligo Engine) ;pc DNA3.1-P 53质粒 (Santa) ;ADR (浙江海正药业) ;RPMI 1640及DMEM培养基 (美国Gibco公司) ;胎牛血清 (奥地利PAA Laboratories公司) ;Lipofectamine 2000转染试剂 (Invitrogen) ;G418 (美国Gibco公司) ;抗P53抗体 (DO-1, Onco gene Research Products) ;抗Unc5H4抗体 (Santa Cruz, CA, USA) 。
1.2 仪器
二氧化碳 (CO2) 培养箱 (SHEL, 美国) ;超净工作台 (苏州安泰公司) ;超低温冰箱 (Forma Scientific, 美国) ;倒置相差显微镜 (Olympus) ;PCR热循环仪 (美国Applied Biosystems公司) ;低温高速离心机 (美国Beckman公司) ;微量加样器 (Eppendorf, 德国) ;细胞培养瓶及培养板 (Corning) 。
1.3 方法
1.3.1 SH-SY5Y及SK-N-BE细胞复苏与传代培养
将-80℃冻存的细胞株取出, 37~40℃水域融化, 将细胞悬液移至15 m L离心管中, 分别将SH-SY5Y细胞及SK-N-BE细胞加入无血清的RP-MI及DMEM培养基中, 离心清洗1次, 将细胞分别加入含10%胎牛血清的培养基于37℃、5%CO2培养箱中传代培养, 待细胞汇合率达到80%以上时用胰蛋白酶进行消化传代, 以稳定生长的第3~5代细胞制备细胞悬液。
1.3.2 质粒转染
用Lipofectamine 2000试剂进行质粒转染, 具体操作依照Lipofectamine 2000试剂盒附带操作规程进行。
1.3.3 沉默P53基因的稳定细胞系的建立SH-SY5Y
细胞分别转染空质粒 (p SUPER) 和抑制P53表达的质粒 (p SUPER-P53) 。转染48 h后, 用含终浓度500μg/m L G418的新鲜培养基换液后, 培养14 d, 挑取抗G418的细胞克隆继续培养, 挑选一个阳性克隆, 继续培养。
1.3.4 实验分组及处理
在对照组和稳定沉默P53基因的SH-SY5Y细胞中以时间依赖模式 (0 h和24h) 给予ADR刺激, 并在m RNA和蛋白水平检测P53和Unc5H4的表达。在P53缺失的SK-N-BE细胞中外源转入P53基因表达, 以时间依赖模式 (0、12和24 h) 检测P53和Unc5H4在m RNA和蛋白水平的表达。
1.3.5 RT-PCR参照试剂盒使用方法
通过RNessy Mini Kit提取总RNA, 并用随机引物和Super Script逆转录酶得到c DNA。经PCR扩增的第1链来检测目的基因的表达水平。引物及PCR条件见附表。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后, 用溴乙锭显色。
1.3.6 蛋白质印迹按时间依赖模式收获细胞
细胞经冷冻1 h PBS液清洗后在SDS细胞裂解液中裂解, 再用蛋白检测染液测定蛋白浓度, 等量蛋白质含量 (30~50μg) 的细胞裂解液加样于7.5%SDS聚丙烯酰胺, 电泳分离后转移至PVDF膜, 用含0.3%脱脂牛奶的TBS封闭非特异吸附, 分别加入抗P53抗体 (DO-1) 及抗Unc5H4抗体, 抗体室温作用1 h, 洗膜, 并用相应二抗作用, 在ECL系统显色。
2 结果
2.1 沉默P53基因表达后DNA损伤未能诱导Unc5H4表达
应用si RNA沉默P53表达的SH-SY5Y稳定细胞克隆中, 采用时间依赖性模式进行ADR诱导DNA损伤, 24 h未检测到Unc5H4的表达, 而含P53正常表达的对照组在24 h时间点可在m RNA及蛋白水平诱导Unc5H4的表达。见图1。
2.2 P53基因表达重建后可诱导内源性Unc5H4的表达
在P53缺失状态的SK-N-BE细胞中转染P53基因, 于转染后0、12和24 h时间点检测P53及Unc5H4表达。而随着P53表达的重建, 可诱导内源性Unc5H4基因在m RNA及蛋白水平的表达。见图2。
应用si RNA-P53质粒及G418筛选技术, 在SH-SY5Y细胞中建立P53沉默的稳定细胞, 沉默P53基因表达后DNA损伤未能诱导Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达, 而对照组应用ADR作用24 h时能够诱导Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达。
在SK-N-BE细胞中转染1.0μg pc DNA3.1-P53质粒, 于0、12及24 h时间点检测P53及Unc5H4的表达。随着P53表达的重建, 可诱导出内源性Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达。
3 讨论
肿瘤的发生、发展是细胞失去控制, 无限积累的过程, 包括细胞的异常增殖和凋亡受抑。P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因, 在所有恶性肿瘤中50%以上会出现P53基因的突变, 说明P53基因的改变可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。P53介导的细胞信号传导途径在调节细胞正常生命活动中起着非常重要的作用, 它与细胞内其他信号传导通路间的联系十分复杂, LEVINE等学者提出了“P53基因网络”的概念[3]。已知P53凋亡途径包括线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径[4]。随着研究的不断进展, 新型P53通路不断被发现。
依赖性受体Unc5H家族在神经系统发育过程中对轴突的延伸、神经元的迁移等起着至关重要的作用[5]。Unc5H家族成员在特异性配体Netrin-1存在时, 向细胞传达有关分化、增殖及游走等正向信号, 而当缺乏Netrin-1表达时, 指引细胞走向凋亡, 从而发挥条件性肿瘤抑制基因的作用[6]。既往研究证明Unc5H4基因在低危NB中表达明显高于其在高危NB中的表达水平, 且高Unc5H4表达与NB患儿长期生存相关[2], 且Unc5H4能够抑制NB细胞的迁移和侵袭, 并诱导NB细胞凋亡[7]。
本研究为进一步研究条件性肿瘤抑制基因Unc5H4与P53的关系, 在含有野生型P53的人NB细胞系SH-SY5Y细胞中, 应用si RNA技术建立沉默P53基因表达的稳定细胞, 以时间依赖模式在有/无ADR刺激下检测内源性Unc5H4的表达情况, 发现沉默P53基因表达后, 与对照组相比, DNA损伤未能诱导Unc5H4的表达。笔者在P53缺失型的人NB细胞系SK-N-BE细胞中转染P53质粒, 以时间依赖模式在有/无ADR刺激下检测Unc5H4的表达情况, 发现恢复P53基因的表达后, DNA损伤能够在m RNA及蛋白水平诱导Unc5H4的表达, 从而证明Unc5H4在无配体作用下的促凋亡作用是依赖P53的正常功能完成的, Unc5H4是P53的新型调控基因。为进一步解释NB的发生、发展机制及筛选有效的NB预后标志物和靶向治疗提供依据。
参考文献
[1]MARIS JM, HOGARTY MD, BAGATELL R, et al.Neuroblastoma[J].Lancet, 2007, 369 (9579) :2106-2120.
[2]WANG H, LI JT, HAO LC, et al.Expression and effect of Unc5D gene in high and low risk neuroblastoma[J].Journal of China Medical University, 2009, 38 (3) :225-226, 233.
[3]LEVINE AJ.The evolution of the p53 family of genes[J].Cell cycle, 2012, 15 (2) :214-215.
[4]ARAKAWA H.p53, apoptosis and axon-guidance molecules[J].Cell Death Differ, 2005, 12 (8) :1057-1065.
[5]THIBERT C, TEILLET MA, LAPOINTE F, et al.Inhibition of neuroepithelial patched-induced apoptosis by sonic hedgehog[J].Science, 2003, 301 (5634) :843-846.
[6]MATSUNAGA E, CHEDOTAL A.Repulsive guidance molecule/neogenin:a novel ligand receptor system playing multiple roles in neural development[J].Dev Growth Differ, 2004, 46 (6) :481-486.