组织工程关节软骨

组织工程关节软骨（精选4篇）

组织工程关节软骨 篇1

摘要：关节软骨属于无血管的组织,炎症的反应是由软骨细胞、滑膜组织分泌的细胞因子所介导。关节软骨损伤后自身修复能力有限,损伤后的修复成为临床急需解决的问题。因此,关节软骨损伤修复成为研究者和临床工作者的研究热点,本文就目前关节软骨组织工程研究进展作一综述。种子细胞、支架和细胞因子是关节软骨组织工程的三大要素,三者必须协调发展和互利。现阶段组织工程方法修复关节软骨损伤的研究已取得很大进展,组织工程修复关节软骨损伤这项技术已成功应用于临床,取得了明显的效果。随着新材料的不断研发,新的组织工程软骨修复材料将兼顾材料学和生物学的需要,使其更接近机体自身组织生物学特性,使关节软骨损伤修复取得突破性进展。

关键词：关节软骨,组织工程关节软骨,种子细胞,支架,细胞因子

0.引言

关节软骨为覆盖关节表面的一层光亮的结缔组织,富有弹性,摩擦系数小,能吸收关节间的振荡,是机体重要的力学器官之一[1]。

关节软骨内无血管、神经及淋巴液供应,对创伤、炎症的反应是由软骨细胞、滑膜组织分泌的细胞因子所介导。关节软骨内含有多种细胞因子,而且关节软骨细胞能自分泌多种细胞因子,在促进软骨细胞增生、分化、凋亡或引起基质降解中起着重要的调节作用。

一直以来大家都认为关节软骨损伤不可修复,对于软骨损伤的治疗只采取口服药物,任关节软骨继续磨损直至需要进行关节置换。但随着新技术的发展,尤其是组织工程技术的发展,现在可以采用病人的细胞复合一些支架做为软骨的补片来修补损伤的软骨。

组织工程修复关节软骨损伤这项技术的问世,已经打破了“关节软骨一旦损伤,不可恢复”这一传统观念,为患者带来了福音。

种子细胞、支架材料以及细胞因子是组织工程研究的主要内容,具体到软骨组织工程,其基本方法是提取自体或异体软骨细胞或软骨前体细胞[2,3]。经体外扩增后,吸附于一种生物相容性好并可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质上,该材料可以为软骨细胞提供适合其生存的三维空间,有利于软骨细胞获得足够的营养物质,使软骨细胞按预制形态的三维支架生长,然后将这种软骨细胞-生物材料复合体移植入体内病损部位,在生物支架降解的过程中,种植的软骨细胞继续增殖并分泌软骨基质,最终形成新的具有原来特殊形态和一定功能的软骨组织。

1.种子细胞

种子细胞是组织工程的重要因素之一,包括软骨细胞和干细胞。软骨细胞则包括自体软骨细胞和同种异体软骨细胞,胚胎软骨细胞;干细胞主要包括骨髓间充质干细胞[4]、脂肪干细胞、胚胎干细胞、脐血干细胞、外周血干细胞等。种子细胞的选择多种多样,各有利弊。

1.1自体软骨细胞:自体软骨细胞是最好的软骨组织工程细胞来源,但来源有限,多采用关节镜检或关节穿刺取关节非负重区软骨,容易引起关节损伤,且随着年龄的增长,软骨细胞增殖速度减慢。因此,研究者尝试改变软骨细胞的培养环境,生物反应器应用于软骨细胞培养初步解决了这一关键问题。生物反应器能够提供细胞生长黏附材料,还方便施加物理学影响,为细胞生长、分化提供适宜微环境,又解决了营养物质和代谢产物的更换等问题,更有利于组织工程软骨的培养[5],使软骨细胞实现其在体外大规模培养并促进有关生长因子的分泌。2000年,Smith等[6]发现间断和持续压力作用于软骨细胞4 h后,Ⅱ型胶原等成分分泌明显提高。Falsafi等[7]发现软骨细胞在体外微重力环境培养可迅速增殖,呈高密度聚集,形成较大的软骨组织样结构。

1.2同种异体软骨细胞:当软骨缺损深至软骨下骨或者缺损面积较大时,患者自身无法提供足够的自体软骨细胞时,则需要同种异体软骨细胞。Aubin等[8]应用新鲜异体骨软骨移植治疗了72例股骨髁远端的软骨损伤,其中60例获得了平均10年的长期随访,结果有85%的患者移植体存活,关节功能良好。

同种异体软骨细胞修复软骨损伤技术已经发展至第四代。第一代技术是用自体骨膜将软骨缺损处缝合,再注入体外培养细胞。该技术的缺点在于需重新开切口取骨膜,容易造成手术切口较大或存在两个切口。第二代技术相比较较第一代技术其优点在于无需取骨膜,直接使用生物胶原膜覆盖,手术时间短,而且无需开第二个切口。但一、二代技术都存在无法有效控制注入细胞悬液浓度及弥补组织修补缺损厚度等问题。第三代技术将细胞锚定在生物胶原膜上,解决了前两代技术的细胞悬液流失的缺点。第四代技术研发了一种与正常软骨空间结构完全一样厚度的新型支架。该技术选择同种异体软骨,将关节软骨制成匀浆,然后进行脱细胞处理,得到了与天然软骨细胞外基质类似的二型胶原及其他细胞外基质成份做为支架的材料,该技术修复的软骨更接近于正常软骨。但新鲜的异体骨软骨细胞不易获得。

1.3胚胎软骨细胞:具有较低的抗原性和较强的增殖能力,有报道以其作为种子细胞修复关节软骨缺损获得了良好的效果,没有引起明显免疫排斥反应,修复组织也未见明显退变,可能是进行异体软骨组织工程构建的较好种子细胞,但其来源及其伴随的伦理问题是限制其应用的最大问题。

1.4骨髓间充质干细胞:是干细胞家族的重要成员,能定向诱导分化为软骨细胞,由于来源广泛,创伤小,易分离、培养、扩增。其作为种子细胞和免疫调节细胞在组织工程、器官移植、治疗免疫排斥和自身免疫性疾病,以及组织器官损伤疾病的领域中具有十分广阔的应用前景[9]。但是由于其受年龄限制,且存在致瘤风险,在一定程度上限制了临床应用[10]。

1.5脂肪干细胞:不仅与骨髓间充质干细胞(MSCs)具有相同的干细胞表面标志,也具有向骨、软骨、脂肪、肌肉和神经等细胞分化的能力[11~13]。体外扩增有稳定的细胞倍增时间以及较低的细胞老化水平,易获取,且不受年龄限制,无致瘤风险等优势,使脂肪干细胞成为骨组织工程种子细胞的研究热点之一,在组织工程领域研究应用广泛[14]。但其诱导向软骨分化具体机制尚不清楚,不同个体、不同部位的脂肪间充质干细胞的分化能力有明显差别原因尚不清楚,这些问题[15~17]还有待于进一步研究。

1.6胚胎干细胞:属于全能干细胞,具有多向分化潜能,能大量增殖并保持未分化状态。Kramer等[18]报道胚胎干细胞在BMP-2和BMP-4作用下分化为软骨,证实了胚胎干细胞作为种子细胞的可行性,但是其分化调控机制尚待进一步阐明。目前对于如何控制体外培养不分化或者体外定向分化为软骨细胞成为科研工作者亟待解决的问题,也因此制约着胚胎干细胞的临床应用。

无论是干细胞还是软骨细胞移植,如何保持细胞悬液在损伤部位的有效浓度是研究目标之一。多年来研究者主要通过研究新的细胞传递方式,维持细胞浓度。陈加荣等[19]利用超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞,利用磁力靶向将干细胞定位在关节腔内;杨建华等[20]将干细胞与藻酸盐凝胶介质构建成一个含有软骨细胞外基质的凝胶三维空间体系,将复合体植入裸鼠皮下异位构建组织工程软骨。然而,最新研究表明,由于归巢作用[21,22]的存在,可以将注入的细胞锚定在待修复部位,有效控制细胞悬液在损伤部位的有效浓度,从而达到修复缺损关节的目的。

目前关于干细胞的研究在很多方面取得了突破性的进展,但是在干细胞研究中仍有很多未知的领域需要不断探索。例如,干细胞分化调控的分子机制目前还没有完全清楚,是否具有形成复杂器官的能力,一系列的伦理学和社会学问题,在干细胞的应用研究中致瘤性风险[23~26]等,是干细胞临床应用亟待解决的问题。

2.支架材料

支架材料是种子细胞与细胞因子参与修复软骨所必须的载体,为种子细胞提供了附着、增殖、分化和代谢的场所,也为细胞质分泌和旁分泌的细胞因子提供了暂时的附着点。

近年来,生物支架材料是构建组织工程软骨的研究热点之一。一些具有特殊功能的支架进入研究者的视野,逐步代替了传统的天然生物支架材料和合成支架材料。如复合支架材料、可注射的支架材料[27,28](氧化海藻酸钠微球注射用的间充质干细胞(GMSCs))、药物定向释放支架材料[29]、仿生纳米支架材料[30](羟基磷灰石/氧化钇稳定氧化锆支架)等。这些支架材料具有特殊的理化性质和功能,可以促进软骨细胞的粘附分化,从而形成更符合生理状态的组织工程软骨。

天然生物材料主要包括:胶原、纤维蛋白、明胶、壳聚糖、蚕丝蛋白、琼脂、糖胺多糖、藻酸盐类等。优点:生物相容性和弱抗原性良好,且材料本身含有特殊的氨基酸序列,有利于识别细胞表面黏附分子,并能维持细胞的分化状态。缺陷:是力学性能较差,降解速度快,难以大量制备,不同批次质量差异波动较大,且因其来自于天然生物体,故尚存在传播疾病的风险。

人工合成材料:人工合成高分子材料的微结构,机械性能及材料的降解时间等都可以预先设计和调控,目前常用的主要有聚乙烯醇、聚乳酸、磷酸二钙、聚乙丙酯、聚氨酯、聚乙烯氧化物、聚N-异丙基丙烯酰氨。优点:有良好的生物相容性,可降解性。缺陷:亲水性不够,对细胞的黏附性较弱,降解产物偏酸性可引起炎症反应,并且价格昂贵[31,32]。

复合材料:研究热点,即将两种或两种以上具有互补特征的生物相容性可降解材料,按一定比例和方式组合,可设计出结构与性能的三维材料,以弥补单用人工合成或天然生物材料的缺陷。目前复合材料有胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合支架、胶原-聚乳乙醇酸复合支架,聚乳酸-聚羟基乙酸聚磷酸钙纤维-胶原复合支架,聚己酸内酯/壳聚糖材料等。优点:克服了单一材料的缺点,又使其具有高机械强度、可降解、易加工制备及亲水性良好、细胞相容性较佳。

近年来,智能化软骨组织工程支架材料[33]的研究成为热点,利用工程学方法将有特定信号识别功能的生物分子与现有的材料结合成新一代有特定修复功能的三维支架上,使其兼具生物和人工合成材料的优点,即所谓“智能”材料。理想的智能材料应具有很强的生物活性,能对环境中的物理、化学和力学刺激性做出响应,从而控制细胞的黏附、增殖和分化等生物学行为。智能软骨化材料的问世,将会大大促进软骨组织工程领域的研究进程。

3.细胞因子

从干细胞到软骨细胞的分化过程,直至关节软骨的形成,需要众多因子共同刺激,而且正常关节软骨中细胞代谢的维持也需要这些细胞因子的参与。细胞生长因子对软骨细胞的增殖、分化以及基因表达起着至关重要的作用。这些因子主要是由间充质细胞、血管内皮细胞及血小板等通过自分泌和旁分泌而来。

在软骨缺损的治疗过程中,采用适宜的方法,适时适量地引入特定的生长因子,有助于软骨缺损的修复与重建。目前,将生长因子运用于组织工程技术的方法主要有两种:(1)生长因子直接附和到支架上或者在支架构建后再与其复合;(2)在支架上移植能分泌生长因子的细胞,包括自然状态下分泌生长因子的细胞和基因工程化细胞。

3.1转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)

TGF-β是具有多种功能的多肽生长因子。广泛存在于骨与血小板中,具有调节细胞的生长、分化、凋亡和细胞外基质的合成等多种生物学效应。也是当前最强的细胞促生长因子[34]。目前,在人体中已发现了5种类型的TGF-β,即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5。其中TGF-β1在软骨损伤修复中的作用较为重要。

TGF-β1通过两种途径促进软骨损伤修复:(1)发挥软骨诱导作用,促进肝细胞分化软骨;(2)促进软骨细胞合成蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,维持软骨细胞表型[35]。

TGF-β不仅能够调节骨、软骨细胞生长分化,还调节其他细胞因子在软骨中的表达与作用[36]。如TGF-β能增强碱性成纤维细胞生成因子(fibroblast growth factor,FGF)促软骨细胞胶原和蛋白多糖的合成作用。TGF-β和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)协同作用可使培养的大鼠关节软骨细胞DNA合成提高10.4倍;Dounchis等[37]发现TGF-β能刺激体外培养的骨膜细胞分化为软骨细胞,并表达Ⅱ型胶原。推测TGF-β3可以通过两种途径促进软骨损伤修复:既发挥软骨诱导作用,促进干细胞分化为软骨,同时又促进软骨特异性基质的合成,如Ⅱ型胶原、蛋白多糖。

3.2胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)

IGF结构与胰岛素同源,受生长激素调节[38]。IGF是最早发现具有软骨生成作用的生长因子之一。正常关节软骨中IGF起着维持软骨细胞代谢稳态的作用,保持着体外蛋白多糖合成和分解的平衡。IGF-1具有促进关节软骨修复、促进软骨细胞增殖、维持软骨表型稳定、诱导间充质干细胞向软骨组织分化等作用[39]。

3.3血管内皮生长因子(VEGF)

在目前已知的生长因子中,血管内皮生长因子是诱导血管再生能力最强的生长因子,而且在软骨修复的过程中,血管内皮生长因子同样也起着非常重要的调节作用[40]。

3.4肝细胞生长因子(HGF)

肝细胞生长因子是20世纪六七十年代发现的一种能刺激肝细胞增殖的物质。能刺激软骨细胞迁移、增殖和蛋白多糖合成,在生理和病理上调控软骨生长[41]。

如何检测特定生长因子的水平,生长因子与愈合环境之间的相互作用,以及生长因子对修复细胞分化调控机制等还需要进一步阐明,以便更好地利用生长因子,确保在最佳时间以最佳剂量应用于软骨缺损的修复过程,为明确关节病变提供依据。

4.临床及其他方面的应用

在临床应用方面,自体软骨细胞移植自1987年报道以来,至今已成功应用于临床20余年,是目前最成熟的修复软骨损伤的细胞治疗方法[42]。至今全球已开展了超过20万例病人的软骨细胞治疗[43,44],效果明显,有效率达70~85%,6~11年随访结果表明自体软骨细胞移植的疗效稳定。尤其是中国人民解放军总医院第四代组织工程软骨技术运用,最长随访8年病例证明临床运用效果显著,彻底打破了关节软骨损伤不可以修复这一“定论”。

Heymer等[45]应用聚乳酸胶原纤维支架复合人骨髓间充质干细胞修复全层软骨缺损,3周后即可观察到Ⅰ型胶原纤维层形成,且纤维层的上1/3可见细胞分布均匀并明显向软骨细胞分化,其细胞外基质中富含蛋白多糖和Ⅱ型胶原,RT-PCR分析有软骨形成,说明聚乳酸胶原纤维支架具有修复软骨组织缺损的功能。

周晓中等[46]将骨髓基质干细胞分别种植于聚羟基乙酸和羟基磷灰石支架后共同培养,生物胶粘连两种支架-细胞复合物形成骨髓基质干细胞-聚羟基乙酸-羟基磷灰石复合体,并植入兔膝关节修复关节软骨。实验结果显示术后20周,实验组可见缺损处修复组织似透明软骨样,表面光滑。

Wakitani等[47]采用体外培养的兔自体骨髓间充质干细胞修复关节软骨全层缺损后,组织学评分发现术后3个月内缺损被软骨组织所修复。

Liu等[48]和Zhou等[49]分别通过Ⅰ型胶原和聚羟基乙酸羟基磷灰石双向支架复合骨髓间充质干细胞用于软骨组织工程均取得了满意的效果。

5.展望及存在的问题

关节软骨组织工程的研究主要集中于种子细胞和生物支架两个关键因素上。种子细胞包括各种来源的干细胞和软骨细胞。种子细胞经过多年的研究,已经取得了巨大的突破,一些种子细胞已直接用于细胞治疗。目前,种子细胞的研究重点在于如何促进细胞在支架上的三维生长,如何维持细胞的表型,如何保持细胞悬液在损伤部位的有效浓度,从而形成具有生物学功能的组织。支架材料的研究重点在于如何修饰、复合、研发出生物相容性好,力学适应能力强,更接近生理状态的理想材料。

细胞生长因子是治疗各种原因导致的软骨损伤的有效手段,但仍存在许多问题亟待解决:在诱导过程中生长因子需要用多久?最适宜的浓度是多少?以及如何控制此浓度保持不变?这些不确定的因素限制了生长因子在软骨分化中的应用[50]。

组织工程修复关节软骨损伤这项技术已成功应用于临床,效果较好。随着不同种子细胞来源及培养技术的提高,以及各种新型支架材料的研制与开发,相信在不久的将来,关节软骨损伤将会得到更有效的治疗。

组织工程关节软骨 篇2

关键词：关节软骨,软骨下骨,骨缺损,骨移植,骨水泥

四肢良性骨肿瘤,尤其骨巨细胞瘤,以膝关节周围长骨的骨端或干骺端最为常见,且软骨下骨常有不同程度的受累和破坏。目前,临床上针对良性骨肿瘤手术治疗方式主要包括病灶切除术和病灶刮除术[1,2]。病灶切除术切除肿瘤较彻底、局部复发率低,但存在手术创伤较大、术后骨不连发生率高等缺点[3]。相对病灶切除术而言,病灶刮除术虽然复发率较高,但具有降低术后并发症、保留相邻关节功能等优点[4,5]。同时为降低肿瘤局部复发的发生率,将肿瘤病灶刮除至正常骨质后,再用磨钻沿瘤腔各方向扩充1 ~ 2 cm[6,7],导致在行关节周围肿瘤病灶刮除术时常伴随部分软骨下骨缺损。临床上针对病灶刮除后的骨缺损常通过骨移植或骨水泥进行修复。本实验拟以膝关节周围良性骨肿瘤为例,通过动物实验建立膝关节周围良性骨肿瘤行病灶刮除后关节软骨下骨缺损的动物模型,应用自体髂骨、骨水泥、骨水泥联合自体髂骨修复骨缺损,术后4 周取造模侧胫骨平台关节软骨进行大体观察、HE染色组织学观察,观察关节软骨的早期组织形态学改变。从而为临床上关节周围的良性骨肿瘤行病灶刮除术后早期预防关节软骨的损伤、保留邻近关节功能、植入物的选取等,提供理论依据和新的有效方法。

1 资料与方法

1.1实验动物及材料

本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核( 伦理审批号: IACUC20150423-04) ,32只新西兰大白兔由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供( 许可证号: SCXK( 新) 2011-0001) ,体重2. 5 ~ 3. 0 kg,雌雄不限。实验在新疆医科大学动物实验中心完成。实验动物随机分为4 组,每组8 只。复合饲料喂养( 饲料由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供) ,饲养温度20 ~25℃ ,湿度65% 。组织病理切片染色由新疆医科大学第一附属医院病理科完成,丙烯酸树脂骨水泥由天津市合成材料工业研究所有限公司提供。

1.2实验方法

戊巴比妥钠( 30 ~ 50 mg / kg) 麻醉后,手术区域备皮、消毒、铺无菌单,右后肢胫骨内侧髁距胫骨平台关节面约5 mm处用装有克氏针的电钻开一0. 5 cm × 1. 0 cm的骨窗,然后可用刮勺刮除及磨钻打磨直到软骨下骨表面光滑亮洁肉眼看不见骨凹陷为止。填充不同的材料修复骨缺损,其中新鲜自体髂骨组标记为A组,骨水泥组标记为B组,关节软骨与骨水泥间铺部分自体髂骨组标记为C组,D组不植入任何材料,作为空白对照组。充填确实后,缝合切口,石膏外固定膝关节保持屈曲60°位4 周。术后常规给予青霉素80 万单位/ 只,1 d 2 次肌肉注射,连用3 d,预防感染。各组动物均于术后4 周处死,取造模侧胫骨关节软骨进行大体观察,HE染色组织学观察。

1. 3 观察指标

1.3.1大体观察

关节软骨表面是否光滑,关节面色泽,关节软骨面有无塌陷、溃疡及骨赘形成等。

1.3.2 HE组织学观察

造模侧胫骨平台处关节软骨行常规固定,脱钙,石蜡包埋,切片,HE染色,在光学显微镜下观察。依据骨关节炎组织病理学分级评分Mankin法中的结构、细胞、异染性及潮线的完整性进行关节软骨的病理评分[8]。其中1 ~5 分为早期,6 ~9 分为中期,10 ~14 分为晚期。

1.4统计学处理

病理学Mankin评分采用SPSS 19. 0 统计分析,统计描述用( ± s) 表示。若各组数据服从正态分布以及方差齐性等特点,采用完全随机设计资料的方差分析; 若各组数据不服从正态分布以及方差齐性等特点,采用MannWhitney U秩和检验。以P < 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1大体观察

a) A组与正常关节软骨接近,关节软骨表面光滑平整,浅蓝白色,无裂纹、糜烂及溃疡形成; B组关节软骨表面粗糙,苍白或灰黄色,滑膜增生,部分有骨赘及软骨塌陷; C组关节软骨表面光滑,发黄,滑膜增生,无骨赘及软骨塌陷; D组关节软骨表面光滑,颜色较A组稍深,基本与A组相似。

2.2 HE染色组织学观察

A组表层光滑、平整,软骨细胞分布均匀,序列整齐,层次清楚,部分有软骨细胞减少,潮线完整,基质染色正常,Mankin评分为( 0. 875 ± 1. 642) 分( 见图1) ; B组软骨表层不平整,偶见浅层裂隙,可见软骨表层纤维化,簇集的软骨细胞增加,基质染色中度减少,潮线不规则,Mankin评分为( 6. 875 ± 0. 991) 分( 见图2) ; C组软骨表层清楚,软骨细胞减少,偶见软骨表层纤维化,基质染色轻度减少,潮线正常,Mankin评分为( 3. 250 ± 2. 053) 分( 见图3) ;D组表层光滑、平整,软骨细胞分布均匀,序列整齐,层次清楚,细胞数量稍减少,偶有簇集软骨细胞,潮线完整,基质染色部分轻度减少,Mankin评分为( 1. 500 ± 2. 138) 分( 见图4) 。由于本文A、B、C、D四组数据明显不服从正态分布以及方差齐性等特点,故使用Mann-Whitney U秩和检验的方法来检验各组之间的得分是否存在显著性差异。自体骨组与空白对照组间Mankin评分差异无统计学意义,骨水泥与骨水泥联合自体骨间及骨水泥与空白对照组间Mankin评分差异有统计学意义。

图 3 骨水泥联合自体骨术 术后 4 周 HE 染色( HE，×20)

图 4 空白对照组术后 4 周HE 染色( HE，× 20)

Kolmogorov -Smirnov正态性检验,A组: 检验统计量为0. 453,P = 0. 000; B组: 检验统计量0. 300,P = 0. 032; C组:检验统计量0. 393,P = 0. 001; D组: 检验统计量0. 384,P =0. 001; 在5% 的显著性水平下,A、B、C、D四组数据的分布形态均不服从正态性假定。

方差同质性检验,Levene统计: 2. 883; df1: 3; df2: 28; 显著性: 0. 053。Levene方差同质性检验统计量为2. 883,显著性P值为0. 053。故在5% 的显著性水平下认为A、B、C、D四组数据的方差是相等的。

术后4 周各组病理学Mankin评分比较,A组为( 0. 875± 1. 642) 分,B组( 6. 875 ± 0. 991 ) 分,C组( 3. 250 ± 2. 053 )分,D组( 1. 500 ± 2. 138) 分。A组与B组比较,Z = - 3. 480,P1= 0. 000; A组与C组比较,Z = - 2. 284,P2= 0. 038; A组与D组比较,Z = - 0. 640,P3= 0. 645; B组与C组相比较,Z= - 3. 320,P4= 0. 000; 故在5% 的显著水平下,与自体骨组比较,P2> 0. 05,P3> 0. 05; 与骨水泥组比较,P1< 0. 01,P4<0. 01。

3 讨论

软骨下骨对关节软骨起着支撑的作用,其完整性与否决定着关节面的平滑及关节功能。若软骨下骨破坏严重,关节面会失去软骨下骨的支撑而发生关节面塌陷、骨折、关节退变等[9]。故邻近关节的良性骨肿瘤在行病灶刮除术时,若刮除大量软骨下骨,将会明显增加关节软骨退变发生率。大量研究认为,关节软骨退变的发生与软骨下骨缺损的面积大小、厚度、术后固定时间等有关。Chen等[10]研究发现,若软骨下骨破坏面积与整个软骨下骨面积的比值超过40% ,则术后关节软骨退变的发生率将明显增加。Flanigan等[11]进一步研究结果表明,当股骨远端软骨下骨缺损面积小于0. 97cm2时不会发生关节软骨面塌陷,若单纯位于外侧髁的软骨下骨缺损面积大于1. 61 cm2及单纯位于内侧髁的软骨下骨的缺损面积大于1. 99 cm2,将造成股骨内侧或外侧髁关节软骨面的塌陷。李建军等[12]研究兔膝关节软骨下自体骨移植后不同固定时间对软骨的影响,结果表明术后固定4 周关节软骨退变的发生率较固定2 周及8 周明显降低。王振宇等[13]从分子生物学方面进一步证明关节软骨的退变与术后固定的时间有关。本研究中各组均有一定比例的动物发生关节软骨退变,进一步证实了软骨下骨缺损对关节软骨的影响,至于各组退变程度及退变发生率的不同可能与填充物的不同、术后动物的活动度不同等有关。同时,本研究中术后自体骨组与空白对照组关节软骨退变的发生率较低( 25% ) ,可能与术后石膏外固定限制关节活动有关,至于骨水泥( 100% ) 及骨水泥联合自体骨组( 75% ) 的发生率较高,可能与骨水泥的作用有关。

目前,临床上修复关节周围良性骨肿瘤病灶刮除后软骨下骨缺损的方式主要包括骨移植或骨水泥,但不同修复材料对关节软骨的影响有所相同。既往研究认为骨水泥具有聚合产热杀灭残留肿瘤细胞、降低术后局部复发率和并发症等作用[14,15]。但近年来大量临床报道认为骨水泥在治疗邻近关节良性骨肿瘤的同时会损伤关节软骨[16,17],关节软骨损伤的主要原因可能是骨水泥凝聚时产生高温灼伤及力学负荷的异常等。Radev等[18]进一步对骨水泥对关节软骨的潜在热损伤进行了有限元分析,结果表明骨水泥与软骨间保留的软骨下骨厚度超过2 mm或超过3 mm的松质骨隔离即能避免热损伤。同时有相关学者[7,18,19]研究发现,在关节软骨和骨水泥间植入一层厚1 ~ 2 cm的自体颗粒可以减少软骨退变的发生率。Cao等[7]通过对膝关节周围骨巨细胞瘤刮除后填充骨水泥对关节软骨影响的临床研究,结果表明膝关节周围骨巨细胞瘤刮除后填充骨水泥会增加关节软骨的损伤,联合软骨下植骨可以延缓或减少该损伤。Xu等[20]研究膝关节周围骨巨细胞瘤软骨下骨移植物对关节的影响,发现单纯骨水泥组继发关节软骨退变的发生率是56. 5% ,而单纯自体骨组下降至29. 4% 。本实验中骨水泥组关节软骨退变的发生率为100% ,自体骨联合骨水泥组的发生率为75% ,单纯自体骨的发生率为25% ,与前期的临床结论一致。然而有少部分学者认为填充骨水泥后不会引起关节软骨退变[20,21,22],认为可能的原因是: a) 骨水泥可保持软骨平台的稳定,保持关节面受力的平衡; b) 关节软骨的营养主要是由滑膜供应,只要滑膜保持完整,软骨的营养保持正常,软骨不会发生退变; c) 组织的血液供应状态对高温的扩散起重要作用,组织加热后,局部血管扩张,血流加速而散热,很快降低了组织温度,从而降低了高温对关节软骨的灼伤。但以上观点大多是临床报道,缺乏相应的实验依据支持。通过本实验结果我们发现在软骨下骨缺损程度相同的情况下,填充骨水泥早期可加重关节软骨的损伤,加重关节软骨的退变,但是若在关节软骨与骨水泥之间填充部分自体骨会减轻或延缓骨水泥对关节软骨的损伤。同时我们认为软骨下填充部分自体骨可减轻骨水泥对关节软骨损伤的原因可能是: a) 软骨下填充部分松质骨,起到一定的隔离作用,避免骨水泥与软骨的直接接触,从而减少高温对软骨的灼伤; b) 骨水泥为不可吸收物质,无诱导成骨能力,不能与周围组织相融合,同时因其本身的刚性强度,势必削弱关节对应力的吸收,导致行走过程中损伤关节软骨,但是在关节软骨与骨水泥之间填充部分自体骨,可以起到与周围组织相融合的作用,从而避免关节应力的异常,降低关节软骨损伤的发生率。

组织工程关节软骨 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

海藻酸钠、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Sigma,USA),明胶(河北衡水市绿岛明胶有限公司),H-DMEM培养液(Gibco,USA),胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养

4周龄新西兰兔(解放军总医院实验动物中心),耳缘静脉注射空气处死。无菌条件下取兔双耳廓软骨,剥去皮肤及软骨膜,将软骨剪碎,PBS液(含青霉素200U/ml,链霉素200mg/ml)漂洗3遍后,用2.5g/LⅡ型胶原酶在37℃摇床中消化11～13h,滤网过滤后,1 000r/min离心5min,弃上清,用无血清DMEM培养基漂洗3遍后,移入培养瓶中,加入含10%FBS的DMEM培养液置细胞培养箱中常规培养。收集3代前软骨细胞备用。

1.2.2 细胞-基质混合材料的制备

将4%海藻酸钠与20%明胶溶液高温间歇灭菌后,按体积比1∶1与软骨细胞充分混合均匀[2],细胞终密度为3.0×107/ml[3]。

1.2.3 软骨组织前体的组装

组装过程采用清华大学机械系激光快速成形中心研制的细胞三维受控组装机Ⅰ代(图1)完成。将细胞-基质混合物放入4℃冰箱预交联15～20min后,取0.5ml注入容积为1ml的喷腔内。采用步进电机驱动柱塞挤出的成形方法,成形室温度在6～15℃之间时,将材料喷出在载有灭菌玻璃底板的三维微动平台后拉成线状,在具有层片信息的CAD模型直接驱动下,形成不同的层面。不同的层面之间再层层交错叠加粘接[4],形成10mm×10mm×5mm大小,孔径为500μm,孔隙率达90%以上的三维结构体(图2),即软骨组织前体。最后用无菌的2%CaCl2溶液交联5min,再用PBS溶液冲洗3遍,DMEM培养液冲洗1遍后,置六孔板中,用高糖DMEM培养液常规体外培养,隔天换液并定期观察。1.2.4取材与观察分别在体外培养1、2、3、4周时取材做冷冻切片(5μm),进行HE及甲苯胺蓝染色,观察组装的软骨组织前体内的细胞生长及成熟情况。

2 结果

2.1 大体观察

刚组装成形的软骨组织前体为半透明状(图3),台盼蓝染色表明细胞存活率达90%以上,细胞在结构体内呈透亮圆球形均匀分布。体外培养1d后观察:细胞在结构体内增殖、迁移并聚集成团,可见处于分裂相的细胞。结构体孔隙四周的软骨细胞分裂、聚集尤其明显,可能是因为孔隙四周的细胞与培养液充分接触的原因。从水凝胶支架材料中游离出的细胞在培养板底部贴壁伸展呈多角形或椭圆形。随着细胞的增殖,结构体的透明度降低,体外培养4周时,结构体呈淡黄色。倒置显微镜下观察,结构体内的细胞多以细胞聚集团的形式充斥于结构体内。结构体的弹性增强,而强度明显减弱,结构体的孔隙有变圆变小的趋势,可能是由于水凝胶支架在培养液中的溶胀引起的。

2.2 组织学观察

软骨组织前体体外培养1周,HE染色显示有软骨组织形成,甲苯胺蓝染色显示有少量软骨基质形成(图4)。体外培养4周,HE染色显示软骨细胞位于陷窝中并有软骨基质形成(图5),甲苯胺蓝染色显示有大量软骨基质形成(图6)。

3 讨论

20世纪末,出现了细胞间接受控组装技术,即在已成形支架上种植细胞的组织工程[5]。近年来,基于细胞直接三维受控组装技术构建器官的研究成为热点[2,6]。本实验就是采用这种三维受控组装技术寻求构建组织工程软骨的新方法。与传统的组织工程技术相比,此种技术有3个显著优点:(1)细胞在支架材料中均匀分布。传统的组织工程,细胞只能在支架表面黏附生长,很难进入支架材料的内部;近年来出现的可注射软骨组织工程,虽能做到细胞的均匀分布,却无法兼顾到支架的三维多孔及高孔隙率。(2)制造复杂形状方面柔性高。通过模型软件设计和修改参数,可构建出更大更厚的软骨组织前体及复杂精细的形状。(3)结构体的孔隙尺寸和相互贯通性可以得到很好的控制,有利于细胞营养和新陈代谢物质的交换。通过设计和调整喷头,可以实现多种细胞的定点排布[5]。

海藻酸钠和明胶均属水凝胶类基质材料。水凝胶材料的温敏性,海藻酸钠与二价Ca离子交换形成三维多孔支架结构的特性,令其是应用三维受控组装的理想支架材料。

本实验结果表明,由细胞直接三维受控组装技术构建的软骨组织前体在体外培养可达4周甚至更长时间,且保持细胞活力与软骨细胞表型,细胞增殖显著,在本实验植入结构体中的细胞量并不大(3.0×107/ml)的情况下,在体外培养4周时,即有大量软骨基质形成并可见软骨陷窝。说明细胞直接三维受控组装技术是一种很具潜力的构建组织工程化软骨的技术,为将来的软骨组织缺损修复提供了新途径。但也有不足之处,即所构建的软骨结构体强度较弱,这个问题的解决可从增强支架材料和寻找更有效的交联剂、交联方法入手。

参考文献

[1]Lanza RP,Langer R,Vcanti JP.Principle of tissue engi-neering[M]//Nerem RM.The challenge of limitating na-ture.2nd ed.San Diego:Academic Press,2000:9-15.

[2]Yan YN,Wang XH.Fabrication of viable tissue-engineeredconstructs with 3D cell-assembly technique[J].Biomateri-als,2005,26(2):5864-5871.

[3]Paige KT,Cima LG,Yaremchuk MJ,et al.De novo carti-lage generation using calcium alginate-chondrocyte con-structs[J].Plast Reconstr Surg,1996,97(1):168-178.

[4]刘海霞,颜永年,王小红,等.肝细胞的三维受控组装[J].清华大学学报(自然科学版),2005,45(8):1009-1011.

[5]颜永年,刘海霞,熊卓,等.细胞直接受控组装技术的实现与研究进展[J].科学通报,2005,50(11):1159-1160.

组织工程关节软骨 篇4

1 资料与方法

1.1 临床资料

本组报道100例患者, 其中男性47例, 女性53例, 患者年龄在20～60岁之间, 平均年龄在39岁。创伤引起的软骨缺失患者62例, 剥离性骨软骨炎患者28例, 其他不明原因患者10例。100例患者中临床表现有膝关节疼痛患者78例, 肿胀39例, 弹响患者12例。关节镜下观察, 本组患者100例, 均有股骨髁负重区的软骨缺损, 缺损范围在1～3.5cm2。其中股骨内髁软骨损伤有59例, 而股骨外髁软骨损伤34例, 股骨内外髁软骨同时损伤只有7例。

1.2 试验方法

本组报道100例患者均在关节镜下其非负重区的软骨面上用专用器械凿取圆柱状骨软骨, 移植至软骨缺损部位以修复缺损。术前患者取仰卧位, 采用的方法是持续硬膜外麻醉阻滞。首先在髌骨下方前内外侧关节镜常规入路, 然后进行关节镜全面检查, 且膝关节半月板、交叉韧带损伤等病变在完成骨软骨移植后再进行处理。对患侧的缺损部位区域进行清创, 先准确测量缺损部位的大小, 对切取骨软骨圆柱的大小和数量有一个大概的认识。通常将股骨内髁的后上方非负重和患肢同侧股骨髁滑车边缘作为骨软骨的供区选择, 一般情况不切取股骨髁间前缘非负重区的骨软骨。切取的骨软骨圆柱之间的间隙为1～2mm, 高度>10mm均可以作为移植物使用。在移植物植入受区之前, 先用与移植物相同口径的测深棒对骨孔进行测深和扩张, 然后将其移植入受区的骨孔, 并使受区的关节面保持平整。供区的骨孔可用受区取出的相应大小的骨条填塞。患者术后均用石膏托固定关节, 并向移植侧施加压力, 4周后拿去石膏。术后的第1天即可开始功能锻炼, 4周后拆除石膏进行CPM功能锻炼, 术后8周内膝关节在非负重状态下进行功能锻炼, 使膝关节活动范围超过90°, 之后可借助双拐在负重的情况下锻炼8周, 最后用单拐负重锻炼6个月。6个月时进行MRI检查。

2 结果

本组患者均获得术后随访, 随访时间为7～20个月。根据BrittbergPeterson评分:包括13个项目, 每项0～10分, 0为无症状, 10分为症状很严重的静息痛;1～9分分别为:活动时疼痛;关节绞锁, 跛行;行走困难;跑步困难;下蹲困难;爬楼梯困难;关节肿胀;关节疼痛;关节僵硬;屈膝痛;关节不稳定。计算总分, 最低为0分, 表明并无病痛;最高为130分, 表明病情严重未有好转。出院时BrittbergPterson评分在20分以下为治愈, 20～40分为有效, >40分为治疗无效。其中0分89例, 1分10例, 2分1例。

3 讨论

膝关节软骨损伤在临床常较为常见。但是软骨缺损后一般很难通过软骨细胞的增殖进行修复, 因为成熟的软骨细胞不能进行有丝分裂, 在关节软骨内无淋巴管、血管、神经组织的情况下, 关节软骨的自身修复会受到很大的影响[2]。现今修复方法主要有自体或异体骨软骨移植法、微骨折法、自体软骨细培养种植等方法。自体软骨移植治疗股骨髁软骨缺损在关节镜下完成并不简单, 需要术者有丰富的手术经验和熟练的关节镜技术。如果术者经验不足, 可以在应用关节镜辅助下进行小切口开放手术。在实施手术的过程中, 值得注意的是垂直建立受区的移植骨孔和垂直切取骨软骨圆柱的难度, 这也是保证受区软骨面能够平整的关键环节。在不能垂直切取骨软骨圆柱的情况下, 可以使软骨面和圆柱体成一个斜角进行切取, 影响能垂直建立受区匹配, 同时另一个骨软骨移植物的预定骨道还会和其相交通, 这样便不能保证另一个移植物合适长度。同时, 补的骨孔也会存在着相应问题。所以该手术仅适用于软骨缺损范围较小的情况, 一般不能超过6～8个移植物, 另外无法垂直关节钻孔的软骨缺损部位也不能采用这种手术方式, 且该手术不适用于软骨损伤严重的骨关节炎[3]。

本组报道100例患者在经过治疗后, 病情明显好转, 关节活动度也逐渐恢复正常, 用MRI检查后发现移植骨软骨柱位置较好, 其原创伤缺损部位表面平整, 临床效果相当满意满意。关节镜下自体镶嵌式骨软骨移植术因其创伤小, 操作简单, 能保持关节面曲度, 可用于修复关节软骨缺损, 有一定的临床推广应用价值。

参考文献

[1]石仕元.关节镜下自体骨软骨移植修复股骨髁软骨缺损[J].中华创伤杂志, 2007, 11 (23) :863-864.

[2]徐东潭, 臧洪敏, 徐光辉.自体骨软骨移植修复股骨髁关节软骨缺损:应用关节镜治疗的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 47 (11) :9532-9534.