抗微生物活性（共10篇）
抗微生物活性 篇1
云芝 (trametelversiolorpilat) 又称彩纹云芝、杂色云芝、多色云芝、白边黑色云芝等, 民间俗称多色云芝、树蛾、千层蘑、云蘑等, 日本则称其为瓦茸, 隶属于担子菌亚门多孔菌科栓菌属。云芝多糖是一种新型的绿色、高效、环保的免疫增强剂, 能激活T细胞、B细胞、Mφ细胞、NK细胞等免疫细胞活性, 具有吞噬、清除老化细胞和异物以及病原体的作用, 能促进IL-1、IL-2、TNF-α、INF-γ、NO等生成, 调节机体抗体和补体的形成。试验主要研究云芝多糖的体外抗微生物的特性, 为今后正确使用该多糖提供试验依据。
1 材料
云芝多糖 (CVP) 、SPF雏鸡和SPF受精蛋 (吉林正业生物制品厂提供) 、新城疫Clone-30弱毒苗和鸡新城疫病毒强毒, 均由吉林正业生物制品厂监察室提供。
2 方法
2.1 云芝多糖的体外抗菌作用研究
2.1.1 云芝多糖的制备
用灭菌纯化水配成0.1%0.5%和1%浓度, 用0.45μm微孔滤膜过滤除菌。
2.1.2菌种
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门杆菌和绿脓杆菌均由吉林正业生物制品厂提供。先将菌种接种在适宜的培养基内, 37℃培养24h, 使菌种复壮, 将复壮的细菌配成浓度为1×106CFU/mL。
2.1.3 培养基
普通琼脂培养基, 按试验室常规方法制备, 冰箱保存。
2.1.4 操作方法
取内径为90mm的灭菌瓶皿若干依次编号, 然后在超净工作台上往瓶皿中加入溶化的营养琼脂20mL, 待琼脂冷却凝固后向每个瓶皿倒入约5mL细菌悬液混匀。待琼脂表面干燥后, 在每个瓶皿中等距离地放置4只牛津杯, 并在每只杯中用加样器加入相应的多糖溶液0.2mL。最后放在37℃的培养箱中培养24h, 用游标卡尺测量抑菌环的直径, 并评定其抑菌效果。
2.2 云芝多糖的体外抗病毒研究
2.2.1 云芝多糖的制备
用灭菌纯化水将云芝多糖配成浓度用微孔滤膜过滤除菌。
2.2.2 鸡胚及处理
参考王世若等的方法进行。选择健康SPF受精蛋, 在孵化器中37℃、50%湿度下孵育, 翻转鸡胚, 2次/d, 至12天胚龄时取鸡胚, 把新城疫病毒及药物接种到尿囊腔中。
2.2.3 对病毒的直接灭活作用
将不同浓度的多糖溶液与病毒等量混合, 37℃作用2h后接种鸡胚, 接种量为0.2mL/胚。
2.2.4 对病毒的治疗作用
先将病毒以0.1mL/胚的剂量接种至鸡胚内, 4h后再以0.1mL/胚接种多糖液。每个处理均接种3个鸡胚, 37℃孵育3d, 4℃过夜后收获尿囊液进行血凝试验, 测定病毒效价。
2.2.5病毒效价测定及判断方法
在塑料板内用生理盐水将尿囊液按1∶2稀释, 再倍比稀释为1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256和1∶512共8个浓度梯度。每孔加入0.5%的鸡红细胞悬液, 摇匀, 静置45min后观察, 根据血细胞凝集程度的不同进行判断。以“++”为终点, 即观察到红细胞在孔底形成1个环, 四周有小凝集块, 以此为标准测定血凝滴度。设生理盐水对照组, 各组收取的尿囊液均以血凝效价平均值反映病毒在鸡胚中的增殖情况。
3 结果
3.1 不同浓度云芝多糖对4种细菌的抑菌效果 (见表1)
注:直径>6mm表示圈内无细菌生长, 直径<6mm表示圈内有细菌生长。
由表1可见, 云芝多糖在0.1%浓度下对4种细菌均无抑菌作用, 在0.5%浓度下对大肠杆菌具有一定的抑菌作用, 在1%浓度下对大肠杆菌和沙门杆菌具有一定的抑菌作用。
3.2 云芝多糖的体外抗病毒效果 (见表2)
结果判断:多糖试验组血凝效价比病毒对照组高4倍以上时, 说明多糖对病毒增殖有抑制作用。
注:同行数据肩注字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表2可以看出, 接种鸡胚所用的病毒对照组血凝效价为1∶384。多糖试验组血凝效价若低于1∶96表明对病毒增殖有抑制作用, 可见在低浓度 (20mg/mL) 下, 云芝多糖对病毒基本无作用。云芝多糖在500mg/mL时对新城疫病毒有一定的抑制作用, 使血凝效价显著降低。
4 讨论
(1) 云芝多糖对某些细菌确有抑制作用, 这与郭志明、施为红的研究结果一致, 他们发现复方和单方云芝在体外对双歧杆菌有显著而稳定的刺激增生效果, 且对常见致病菌有抑制作用, 但作用效果与云芝多糖的浓度和细菌种类有关。邓文龙等的研究表明, 云芝胞内多糖小鼠腹腔连续注射3～4d可明显增强小鼠对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、宋氏痢疾杆菌及绿脓杆菌感染的非特异抵抗力。关于多糖的抑菌机制, 多数人认为可能与多糖的pH值有关, 云芝多糖呈酸性, 不利于细菌的生长。
(2) 在低浓度 (20mg/mL) 下, 云芝多糖对病毒基本无作用。云芝多糖在500mg/mL时对新城疫病毒有一定的抑制作用, 使血凝滴度显著降低, 这与Shand报道的一致。同时, 陈鸿珊等进行云芝胞内多糖小鼠口服或腹腔注射, 发现可显著保护流感病毒静脉感染所致死亡和肝脏病理损伤, 每次口服最小有效量500mg/kg即有效;腹腔注射50～200mg/kg有效, 多次给药无效。每次腹腔注射100mg/kg对小鼠疤疹病毒静脉注射所致死亡和肝病变有23.8%～28.6%的保护作用。每次胞内多糖腹腔注射50mg/kg, 可促进小鼠肝枯否氏细胞的吞噬功能, 防止静脉注射流感病毒和疱疹病毒所引起的枯否氏细胞吞噬功能抑制。对于多糖抗病毒的机制, 一般认为多糖能激活机体免疫系统, 激活巨噬细胞、NK细胞, 使其吞噬能力增强, 促进淋巴细胞分泌干扰素以及IL-1、IL-2等细胞因子, 激活补体活性, 促进病毒抗体提前产生, 从而发挥抗病毒作用。多糖还可直接与病毒结合, 使病毒结构破坏, 起到直接灭活的作用。
抗微生物活性 篇2
关键词：烟草普通花叶病毒（TMV）；放线菌；抗病毒活性；分子鉴定
中图分类号： Q435.72 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0100-03
收稿日期：2013-11-12
基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2012]2257号、黔科合J字[2011]2336号）。
作者简介：曹毅（1982—），男，云南会泽人，硕士，助理研究员，从事微生物和植物保护研究。E-mail：yicao1001@163.com。烟草普通花叶病毒病（tobacco mosaic virus，TMV）严重威胁烟草的品质和产量，给烟草生产和烟草种植者造成了严重的经济损失。由于植物病毒对寄主细胞的绝对寄生性、植物缺乏完整的免疫系统以及病毒传播方式的多样性，目前尚无有效的防治措施和药剂。由烟草病毒病造成的经济损失已超过真菌引起的病害，成为烟草生产上威胁最大的一类病害[1]。长期以来，人们使用有机或无机化合物进行植株病毒病防治，不仅防效甚微[2]，也容易带来农药污染。安全可靠、环境友好的生物源农药成为病毒防治药剂的研究热点。与植物源、动物源农药相比，微生物源农药具有资源丰富、成本低、效果稳定和易商品化等特点[3-4]，是公认的无公害农药。近年来国内外大量研究表明，许多细菌[5]、真菌[6]和大型真菌[7]的代谢产物具有良好的抗植物病毒活性，为防治植物病毒病开辟了新的途径。
放线菌是一类极具经济价值和广泛应用前景的微生物资源，因其丰富的代谢产物，已被广泛应用于工业、农业和医学领域。放线菌来源的抗病毒活性物质如宁南霉素（ningnanmycin）、嘧肽霉素（cytosinpeptidemycin）、全霉素（holomycin）等对植物病毒病具有一定的治疗效果[5]。由于病毒侵染危害植物的作用机理复杂以及植物病毒学研究方法受到一些因素制约等原因，其研究开发还处于初级阶段，目前我国登记生产的微生物源抗植物病毒剂还很少。因此，不断挖掘有生物活性的放线菌资源，开发有自主知识产权、对环境友好且高效的抗病毒剂，具有重要的社会、生态和经济意义[8]。
本研究对前期从云南、贵州、河南等全国主要植烟区健康烟草根际土壤分离纯化的放线菌进行发酵产物抗病毒活性筛选，通过16S rDNA序列和系统发育分析对具有抗病毒活性的菌株进行分类地位的确定，以期为抗病毒放线菌资源的筛选和绿色农业的发展提供基础。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1放线菌菌株供试的47株放线菌均采集、分离自田间健康烟草根际土壤。
1.1.2烤烟品种TMV枯斑寄主烟草Coker 176、系统侵染寄主烟草K326，由贵州省烟草科学研究院良种繁育中心提供。
1.1.3供试毒源供试病毒为纯化的TMV，试验前繁殖保存于烟草K326。
1.1.4培养基高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g、KH2PO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌 20 min 后备用。
黄豆粉培养基：黄豆粉 25 g、酵母浸膏 5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨2 g、可溶性淀粉 10 g、CaCO3 0.5 g，蒸馏水定容至1 L，调节pH值至7.2，121 ℃ 灭菌 30 min。
1.1.5主要试剂16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit、DL2000 DNA Marker、Premix Ex Taq购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1放线菌发酵产物的制备供试菌株接种于高氏1号培养基，28 ℃培养箱中活化培养4 d，用直径5 mm的打孔器打取菌株生长良好的菌饼，接种于装有100 mL高氏1号液体培养基的250 mL三角瓶中，每瓶6块；28 ℃、180 r/min振荡培养4 d后按5%的接种量接种于发酵培养基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培养7 d后，无菌条件下吸取发酵产物于灭菌离心管中8 000 r/min离心15 min，收集菌株发酵上清液，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2寄主培养和病毒接种供试烟草按常规育苗规程进行培育管理，7～8张叶时用于病毒接种。取新鲜感染TMV的病叶置于灭菌研钵中加适量金刚砂研磨匀浆，加入0.01 mol/L pH值7.2的磷酸缓冲液，离心后取上清液，配制40倍液的病毒汁液（40 mL/g病叶）。接种前喷洒适量金刚砂于叶片表面，用配置的病毒汁液进行常规摩擦接种，接种2 min后用清水喷雾冲洗叶面，于25 ℃无虫温室内进行。
1.2.3抗TMV活性菌株的筛选初筛：取长势一致的K326每2株分为1组，病毒汁液摩擦接种后，分别在接种后的第2、4、6 天喷洒20%的待测放线菌发酵上清液，设置阴性空白对照（病毒接种后喷洒20%的未接菌发酵培养液）、阳性发病对照（病毒接种后喷洒灭菌蒸馏水）。第10天开始观察记录发病情况，每组2株的心叶脉明、轻微花叶，或上部不超过 1/3 叶片花叶以及2株中只有1株出现1/3～1/2叶片花叶或少许变形或主侧脉坏死，植株矮化为正常株高的2/3以上的记录菌株号，保留备用。2株都出现1/2～2/3叶片花叶或变形或主侧脉坏死或全株叶片花叶或严重变形或坏死，病株明显矮化的则放弃。
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复筛：将初筛保留的菌株发酵液与等量TMV病叶汁液混合，室温放置30 min后，以发酵培养基与病毒汁液混合为阳性对照，采用半叶枯斑法[9]接种4～5叶期的TMV枯斑寄主烤烟Coker 176，左半叶接种对照，右半叶接种经发酵液处理的TMV病叶汁液。每个处理4～5张叶，重复3次。接种5～7 d后记录枯斑数，计算病毒抑制率：
抑制率=（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数×100%。
1.2.4活性菌株的分子鉴定对具有抗TMV活性的菌株进行分子生物学鉴定，菌株基因组DNA的小量提取参照Li等的方法[10]进行。PCR引物为细菌16S rRNA序列通用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），参照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京诺赛基因组中心有限公司进行测序。
1.2.5菌株系统发育分析通过NCBI网站上的BLAST程序将测定的序列与GenBank中的序列比较，从GenBank中获取和试验菌株相近种的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1软件构建进化树[11]。
2结果与分析
2.1抗TMV放线菌的筛选
将前期分离保存的47株放线菌活化后进行摇瓶发酵，收集47份发酵正常、无杂菌污染发酵上清液分别进行初筛试验，结果表明：大部分放线菌发酵上清液无抗TMV作用，喷洒后的植株第10天逐渐表现叶脉间褪绿、叶片畸变、严重系统花叶至叶片坏死或矮化、或死亡，而其中6株放线菌发酵上清液处理植株未出现发病症状或仅表现较轻微的斑驳或系统花叶，具有一定的抗病毒TMV作用。将初筛的6株放线菌发酵上清液在Coker 176上进行半叶枯斑法复筛验证，枯斑抑制率的结果见表1。从表1可以看出，菌株F187、F349、F417发酵上清液对TMV具有明显钝化作用，发酵上清液与TMV作用30 min后，抑制率分别为57.18%、60.27%、70.19%，菌株F370、F350-2、F251的抑制作用相对较差。
3结论与讨论
由TMV导致的烟草花叶病毒是烟草生产中的一类主要病害[12]，其在病叶残体和土壤中可以存活数年，有很强的抗逆性。据调查，贵州移栽期烟苗的TMV平均带毒率可达202%[13]，可见其对贵州省烟草生产具有较大的潜在危害。从微生物资源中筛选抗植物病毒病物質已成为病毒病防治研究的热点，利用放线菌的抗病毒活性物制备新农药是未来无
公害农药的主要发展方向[13]。目前人们已发现链霉菌中多个种如诺尔斯链霉菌西昌变种（Strepcomces noursei var. xichangensis）、不吸水链霉菌辽宁变种（Streptomyces ahygroscopicus var. Liaoningensis）等放线菌产生的抗生素及非抗生素类物质对植物病毒病具有一定的治疗效果[14-15]。本研究中的放线菌均采集、分离自烟草根际土壤，烟草根际特有的环境可能使得菌株具有独特的代谢方式而产生具有特殊活性的代谢产物。本研究筛选的3株放线菌发酵上清液表现了明显的体外抗TMV活性，具有进一步研究和开发的价值。
本研究的主要目的在于筛选具有抗TMV活性的放线菌，笔者只对菌株发酵上清液的抗TMV活性进行了初步研究，其菌体是否具有活性还未研究；研究中采用了适合大多数放线菌的发酵培养基及发酵条件进行发酵，而培养基种类及成分、放线菌菌龄、接种量、摇培时间及转速等对发酵液活性都有一定影响，今后可对活性放线菌的发酵条件进行优化，对活性物质的种类开展深入研究，同时结合基因工程菌的手段和方法，进一步挖掘、探索其在抗植物病毒上的开发应用潜力。
致谢：云南农业大学李应萍同学参加了病毒接种和枯斑数统计工作，在此一并致谢。
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抗微生物活性 篇3
红树林作为一种特殊的植物群落,是热带、亚热带海区潮间带特有的高等植物,为耐盐、常绿灌木或乔木,红树林沉积物具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富等特征,其微生物资源既丰富又不失特色。主要类群为细菌、真菌、放线菌、微型藻类等。在热带红树林中,微生物的组成大致为:细菌和真菌占微生物资源总量的91%,藻类和原生动物分别占7%和2%[1,2]。红树林所具有的丰富的真菌资源[3]是红树林微生物资源的主要类群,目前已分离鉴定的红树林真菌超过280种,成为海洋真菌的第二大类群[4]。
中国是茶叶的故乡,福建是中国主要产茶区。茶树病害种类繁多,可造成茶叶减产、品质下降。若茶园不合理用药,还会导致农药残留超标,污染环境,影响消费者健康,严重阻碍茶叶出口。发现新的微生物农药是实施茶树病害综合治理的关键方法。
福建漳江口红树林国家级自然保护区位于福建省漳州市云霄县漳江入海口,地理位置为东经117°24′07″~117°30′00″,北纬23°53′45″~23°56′00″,为福建省最重要的湿地生态系统类型的国家级自然保护区。李元跃,吴文林[5]曾对福建漳江口红树林植物,野生动物,水生生物以及微生物多样性进行研究,并提出保护措施。本研究对福建漳江口红树林国家级自然保护区红树林沉积物可培养丝状真菌进行了分离鉴定和多样性分析,并进行抗茶叶病原真菌的活性筛选,为发现新的红树林微生物资源、开发新型抗茶叶病害用微生物农药提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 海洋沉积物样品来源
样品来源:自福建漳江口红树林国家级自然保护区入口处,每隔1公里用50mL无菌离心管采集红树林底部海水沉积物约50g,共采集20个位点的样品。
1.2 培养基
① LB培养基:胰蛋白胨10g,牛肉膏3g,NaCl5g,加水定容至1 000mL,121℃高压灭菌20min。
②马铃薯葡萄糖培养基(PDA):取马铃薯200g(去皮)切成小块,加水约500mL煮沸30min,4~6层纱布过滤,取滤液,加20g葡萄糖,熔化,用蒸馏水定容至1 000 mL。半人工海水马铃薯葡萄糖培养基则用人工海水定容并使人工海水的终浓度为50%。固体培养基则加入1.5% 的琼脂。121℃ 高压灭菌20min。
③察氏培养基(CZA):硝酸钠(NaNO3)3.0g,磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g,氯化钾(KCl)0.5g,硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01g,葡萄糖30.0g,琼脂15.0g,加水定容至1 000mL,121℃高压灭菌20 min。半人工海水察氏培养基则用人工海水定容并使人工海水的终浓度为50%。
1.3 茶叶病原真菌来源
茶叶轮斑病Pestalotiopsis theae LH13;茶叶炭疽病Colletotrichum gloeosporioides LH30;茶叶溃疡病Neofusicoccumsp LH107均为本实验室前期从厦门无公害茶园茶树病叶分离鉴定并保存。
1.4 海洋真菌菌株分离与保存
采用平板涂布法分离沉积物真菌。将采集到的1g样品中加入10mL灭菌海水,振荡混匀即得匀浆。以上匀浆作10-1、10-2、10-3、10-4倍的梯度稀释。用无菌移液器吸取0.2mL不同稀释倍数的稀释液移至平板培养基上,然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻地均匀涂布在整个平板上。平板培养基为包含50μg·mL-1氯霉素和50μg·mL-1链霉素的半人工海水PDA和查氏培养基。在28℃培养3~10天直至菌落长出,经过至少三次纯化获得纯菌落。在2mL冷冻小管中加入1mL真菌保种液,挑取纯化好的真菌的菌丝或孢子放入其中,混匀,并置于液氮或-80℃低温冰箱中保种。
1.5 海洋真菌总DNA提取
采用CTAB法提取真菌DNA,取菌体至EP管(盖上管底即可),将EP管放入液氮中冻半小时,裂解液于65℃水浴预热,取出冷冻的菌体,每管加入400μL裂解液(NaCl 1.4mol·L-1,CTAB(W/V)2%,Tris·Cl 100mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1),65℃水浴振荡摇床45~60min。加入等体积酚-氯仿-异戊醇(pH=8.0),充分混匀,13 000rpm离心30min,将上层水相转移入新管,上清加入0.7倍体积异戊醇,于4℃ 静置30 min,13 000rpm离心15min,去上清,沉淀用70% 乙醇洗涤2 次,20μL无菌水溶解,-20℃保存备用。
1.6 海洋真菌ITS扩增及测序
采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[6]扩增ITS和5.8SrDNA。反应在50μL体系中进行,体系含有10×buffer 5μL,MgCl22mmol·L-1,dNTPs 400 μmol·L-1,ITS5 10 pmol,ITS4 10pmol,DNA模板2μL(约50~200ng),Taq聚合酶4U和ddH2O 23.2μL。反应程序为:95℃预变性4min,进入循环,95℃ 变性1.5 min,52℃ 退火1.5min,72℃延伸1.5min,36个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存。用吸附柱式PCR产物回收试剂盒(OMEGA公司)纯化PCR产物,纯化的PCR产物在华大基因公司测序。
1.7 系统进化和种群多样性分析
测得的序列去除载体后用BLASTn跟NCBI数据库中的序列进行比对。把ITS同源性≥98%的序列归为一个种系型(Nilsson等报道子囊菌ITS序列的种间差异为1.96%[7]),每种种系型选择一个序列作为代表用Clustal X软件(version 1.83,http://www.clustal.org/download/current/)进行完全比对。然后用MEGA软件(Molecular Evolu-tionary Genetics Analysis,http://www.megasoft-ware.net/index.html,version 3.1[8])邻位加入法(neighbor-joining method,NJ)建立系统进化树,同时使用1000次重复的自展分析(bootstrap analysis)来检验系统发育树的可信度。
1.8 红树林真菌粗提物的提取
从活化的真菌平板上取菌丝块或孢子分别接种于半人工海水液体PDB培养基中,于28℃、180rpm振荡培养7d。真菌培养物用真空抽滤或者7 300rpm离心10min,取上清,等体积乙酸乙酯萃取三次,上层有机相在45℃真空浓缩仪中减压浓缩至干,加DMSO溶解至浓度为100μg·μL-1,4℃密封保存备用。
1.9 红树林真菌粗提物抗茶叶致病真菌活性检测
采用平板对滞法进行活性筛选,将茶叶致病真菌琼脂圆片接种于PDA平板中央,作为指示菌,其外侧贴上无菌的滤纸片,并在每个滤纸片上加100μg的真菌粗提物,相同体积的溶剂DMSO作为阴性对照,置于25℃培养箱培养,待指示菌长满皿或长过滤纸片后观察抑菌圈的大小。
2 结果和分析
2.1 红树林沉积物真菌分子鉴定和多样性分析
本次实验共分离得到135株真菌,对其ITS序列分析,并以同源性98%为界进行归类,发现这135株真菌可归为40个种系型,具体信息详见表1和表2。
将测序得到的ITS序列提交到GenBank,得到的序列号为KT336505~KT336545,M28(KT336532)序列过短,本文将其删除。将这些ITS序列与其相似菌株建立系统进化树,如图1所示。
系统进化分析显示从红树林沉积物中分离的这些真菌属于三个门:子囊菌门、担子菌门和接合菌门。子囊菌门真菌占据红树林沉积物真菌群落的绝大部分(87.5%),而担子菌门占5%,接合菌门占7.5%。子囊菌分属6 个目,即散囊菌目(Eurotiales),煤炱目(Capnodiales),格孢腔目(Pleosporales),Microas-cales,肉座菌目(Hypocreales),酵母菌目(Saccharo-mycetales),担子菌门包括两个目,即外担菌目(Ex-obasidiales)和银耳目(Tremellales),接合菌门仅有毛霉菌目(Mucorales)(表1和图1)。
红树林沉积物真菌共分离到40株真菌,分别属于17个属(表2)。其中青霉属(25%)为优势菌,其他较多的是木霉属(15%)、曲霉属(10%)和镰刀属(10%),这与李元跃,吴文林[5]研究福建漳江口红树林生物多样性中丝状真菌优势属为青霉属、木霉属、曲霉属结果基本一致。以上结果表明,红树林沉积物真菌具有丰富的多样性。
注:此系统进化树是建立在ITS序列(转录间隔区,Internal Transcribed Spacer)基础上用邻位加入法(neighbor-joining)途径建立的。使用1 000次重复的自展分析(bootstrap analysis)时的可信度值在每个节点处标明。GenBank序列号在参考序列括号中标明。标尺短线代表5%的序列差异。Dipodascus albidus(DAU40081)被用作外群[9]Note:The tree was constructed using neighbor-joining approach based on ITS region with Dipodascus albidus(DAU40081)as outgroup.Percentage bootstrap values of 1 000replicates are given at each node.GenBank accession numbers are indicated in parentheses behind the representatives.The scale bar represents 5%sequence divergence
2.2 红树林沉积物真菌代谢物生物活性研究
2.2.1 抗茶叶致病真菌的活性筛选
将红树林沉积物真菌发酵后获得乙酸乙酯的粗提物,用平板对滞法筛选出抗茶叶致病真菌的活性菌株(表3),发现40株待筛红树林沉积物真菌有17株(占42.5%)的代谢产物具有抗真菌活性。活性菌中抑制Pestalotiopsis theae LH13的真菌15株,抑制Colletotrichum gloeosporioides LH30的真菌12株,抑制Neofusicoccum sp.LH107 的真菌8 株。其中菌株M06和M07对三种茶叶致病菌均有较强活性,菌株M10、M21、M23和M27对Pestalotiopsis theae LH13 活性强,M10、M19、M22 对Colletotri-chum gloeosporioides LH30 活性较强,M11 对Neofusicoccumsp.LH107 活性较强。结果表明,红树林沉积物真菌蕴藏着丰富的抗真菌活性物质产生菌且具有针对性,是开发抗真菌药物的潜在资源。
2.2.2 沉积物真菌抗菌活性菌株属的分布
从表2和3可以看出,红树林沉积物真菌具抗真菌活性的菌株分布在6个属中,分别是青霉属(7株)、木霉属(3株)、镰孢属(2株)、枝孢属(2株)、白地霉属(2株)和球腔菌属(1株)。由此可见,红树林沉积物真菌抗菌活性菌株的种属分布具有多样性。
注:+:5mm≤抑菌圈直径<10mm;++:10mm≤抑菌圈直径<15mm;+++:抑菌圈直径≥15mm。Notes:+:5mm≤Diameter(Inhibition Zone)<10mm;++:10mm≤Diameter(Inhibition Zone)<15 mm;+++:Diameter(Inhibition Zone)≥15mm
3 讨论
3.1 红树林沉积物真菌的多样性
红树林沉积物真菌物种多样性较高,但目前对该区域内真菌的物种组成结构、地理分布和生境特征等的系统研究较少。从1967年开始,Kohlmeyer开展红树林海洋真菌资源和生态学研究工作,是世界上发现和报道红树林海洋真菌比较多的真菌学家之一[10]。Sarma等[11]列举了在鸡笼答(Rhizo-phoraapiculata)不同基质上的61 种红树林海洋真菌,其中有19种是从红树林沉积物中分离得到的。Mantle等[12]在潮间带沉积物分离Amorosia litto-ralis。国内研究较少,徐婧[13]在中国广东湛江高桥红树林滩涂的淤泥中分离获得274个菌株,鉴定得到20属39种,其中Talaromyces helicus为中国新记录种。
印度学者研究了西海岸红树根际内生菌的多样性,发现这些真菌包括了海水、淡水和土壤的各种真菌类型。红树林生境微生物的真菌类群中,子囊菌属为优势菌,半知菌其次。而在红树林土壤丝状真菌中,以半知菌占大多数,子囊菌和接合菌较少,鞭毛菌则更稀少,没有担子菌[14]。
红树林植物区系多样性、群落年龄、群落周围陆栖树种及微生境的差异都会造成各个红树林区沉积物真菌多样性的差异[15]。林鹏,张瑜斌等[16]研究表明九龙江口红树林丝状真菌以半知菌占有绝对优势,木霉、曲霉和青霉是最常见的属。但在不同地域的红树林沉积物丝状真菌中,常见属会有所差异,在夏威夷的欧湖岛红树林,木霉是最常见的属,其次是青霉、镰孢菌和曲霉[17]。在印度西孟加拉的红树林曲霉最多,青霉、毛霉次之[18],而在东非Inhaca岛的红树林,曲霉和青霉最多[19]。
本文从红树林沉积物中共分离到分属子囊菌门、担子菌门和接合菌门的40种真菌,分别属于17个属。本研究结果表明,福建漳江口红树林国家级自然保护区红树林沉积物真菌物种多样性丰富程度较高。
3.2 红树林沉积物真菌代谢物的生物活性分析
叶枯病、叶斑病、叶腐病是茶树叶片常见病害种类。为防治茶树病害,人们已经从红树林沉积物真菌中寻找新的活性物质。Albaugh等[20]在我国深圳近海沉积的红树木上分离获得一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL-15G256,在其代谢物中发现了一种新的作用于真菌细菌壁合成新靶位的脂肽类抗真菌物质15G256γ,可在温室实验中抑制真菌类植物病害的发生,并能抑制人的真菌病菌;李淑彬等[21]从100多株分离自中国南海海底沉积物与海水样品中的海洋霉菌筛选到30多株对致病真菌白色假丝酵母,植物病原真菌镰刀菌等具有明显抑制作用的海洋霉菌。
抗微生物活性 篇4
关键词 海洋微生物；研究方法；生物活性；存在问题
中图分类号 S9 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)051-0203-01
随着人口的不断增长，自然资源也逐渐匮乏，陆地上的资源毕竟有限，所以研究海洋资源势在必行，海洋微生物活性物质越来越受到人们的关注。海洋环境有着同陆地环境截然不同的多样性，还有很多未知的领域等着我们去开发和利用。海洋微生物可以作为活性物质的新来源，受到人们的高度重视。
1 海洋微生物活性物质的主要研究方法
狭义上的海洋微生物就是海洋细菌。人类最早开始研究海洋细菌是在1838年。后发现海洋微生物有杀菌的作用，有些海洋微生物具有降解环境污染物，修复生态系统的功能，还有的微生物可导致细菌性病害的发生，我们应该扬长避短，充分发挥海洋微生物对人类有益处的特性。
目前研究海洋微生物的主要方法是活性物质的分离筛选法。这种方法又包括高通量筛选、BIA筛选法等。
高通量筛选法比较适合海洋微生物天然活性物质的研究。在选择研究方法的时候，要综合考虑海洋微生物的来源和种类的不同，以及不同微生物生长环境的不同。具有特殊活性的微生物采自海洋不同的区域，通常是在大量的微生物菌株样品中筛选出需要活性物质，在这一过程中通常自动化高通量药物筛选方法，或者快速分子筛选法，以便提高筛选工作的效率，同时又能保证质量。这种方法在世界范围内应用甚广。美国和日本的公司都曾利用此方法培养和找到了很多能够用于制造药物的活性物质，并有效运用到了实践中去。我国也建立了相关实验室，利用此方法开展了多项活性菌株的分级组合筛选工作，并取得了一定的成果。中国海洋大学实验室研究人员通过实践还发现如果将机制单一的活性筛选模型与简易初筛模型综合使用来进行活性菌株的分级组合筛选，研究成本更加低廉，工作效率也会进一步提高，而且实际利用价值也非常可观。
BIA筛选法具有独特的筛选机制，所以优势不容小觑，其广发应用在海洋微生物抗肿瘤物质的分级组合筛选中。它的理论基础是遗传学方法论，在筛选过程中检测出β半乳糖苷酶的存在就能够初步判定所选的样品中是否有抗肿瘤DNA细胞的物质。
海洋是具有丰富性的化合物的世界，扩大对海洋微生物的研究是整个人类的历史使命和长久性课题。海洋微生物的活性物质的研究涉及的领域比较广泛，包括基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等，不断加强海洋微生物活性物质研究同各个领域之间研究，可以不断创新海洋微生物的研究和分离方法。另外，提高海洋微生物活性物质开发研究的实际产业转化率，能够降低产业生产成本，也实现了将海洋微生物的研究成果与大众分享的目的，也实现了经济效益和社会效益高度统一。
2 海洋微生物的重要生物活性
基于以上研究方法，我们主要探究的海洋微生物的重要生物活性包括有抗肿瘤活性、抗菌活性、酶活性、酶抑制剂活性、降解修复活性等。
海洋微生物中是很多抗肿瘤药物的主要来源，人们也曾对海绵体进行了细致的研究，发现海绵能够产生很多种抗菌和抗肿瘤活性的物质。海绵中有很多组成复杂的微生物群落，其中的抗癌物质大部分源于海绵中长期共生共栖的细菌群。海洋放线菌中也存在很多抗肿瘤活性物质，这些放线菌的生存环境的总体特征是高盐度、高压、低营养以及低温，这样严酷的环境造就了放射菌独特的代谢方式，也使得它能够具有抗肿瘤的活性。另外海洋真菌中也存在着抗肿瘤活性物质。
海洋微生物的抗菌活性是很多陆地生物所不具备的。对海洋微生物抗菌性能的研究可以缓解新类型抗生素紧缺的压力，为抗生素的持续研发提供了条件。多种海洋微生物中均有抗菌物质的存在，它们对人体病原性念珠菌有着一定的抑制作用。
酶活性的发现是近几十年的科学研究成果。技术的进步促使人类发现了海洋微生物能够产生新型生物酶，并对其进行了深入研究。人们已经可以从海洋细菌、放线菌、真菌中分离出酶制剂，很多都具有特殊的生物活性，同时具有工业化开发的潜力。生活中的应用实例也屡见不鲜。比如加酶洗涤剂的生产就充分利用了地衣芽孢杆菌，先将其生产为碱性蛋白酶，然后与洗涤剂混合生成。还有一种去污性很强的碱性蛋白酶是从海洋船蛆腺体内的共生细菌中提取的，在高温度环境中的去污能力更强，这被普遍应用与工业清洁领域。脂肪酶产生于冷海水区域中的微生物，耐低温性比较显著。
酶抑制剂活性的发现也为人类的生活与生产带来了很多便利。利用它制成的酶抑制剂不仅有助于对酶的结构和反应机理的进一步研究，还可以将其用于药理学领域的研究。陆地环境中就很难提取这种酶制剂，所以海洋微生物的酶抑制活性的研究就成为酶抑制剂的重要来源。
降解修复活性主要表现在真菌的石油降解力方面。石油开采业的不断发展使得海洋的石油污染情况也比较严重，利用海洋微生物降解石油中的烃类物质具有良好的经济效益和环境效益。微生物对污染物的降解和对海洋环境的修复具有其独特的优越性，而且应用广泛。大部分海洋细菌和真菌都具有很强的降解能力，有些真菌的菌丝具有与石油聚集成团的特性，所以在对石油进行生物降解之后再利用这一特性可以将剩余的菌丝和石油同时清除，效果显著。当然，石油降解菌的种类不同，对石油中的烃类的降解程度也会有所不同。将多种海洋降解真菌混合培养使用，可以显著提高石油降解速率，比单一的降解菌的降解能力高出很多倍。大部分的海洋真菌的石油降解能力不会受到石油浓度的影响，只有很小一部分真菌降解能力会随着石油浓度的增大而
减弱。
3 海洋微生物活性物质研究中存在的问题
我国海洋微生物活性研究领域取得一定的进展，但目前还存在不少亟待解决的问题。近些年来，我国通过革新研究方法，发现了不少具有明确生物活性的新化合物种类，并广泛应用于制药和生物领域，取得了明显的效果。但是各个领域的发展不平衡，尤其是污染物降解方面的研究和实践与世界先进水平相比还有一
定的距离。我国的海洋资源的开发利用空间还很大，未来的开发中更加需要高端技术的投入，这样才能保证资源利用效率的最大化。同时，我们要注意加快海洋微生物活性物质的科研成果转化为产业和经济效益的速度，切实将科学技术的优势转化为经济优势和社会优势。另外，我国的海洋资源开发利用的项目的相关制度法规还不够完善，自主创新意识和创新能力还需要进一步加强，只有先做好制度与法规定保障，才能提高人们科研的积极性，也才能为专项研究提供良好的社会基础条件。
4 总结
综上所述，海洋微生物活性物质的研究越来越受到人们的重视，这不仅是由于现存资源的短缺而向海洋领域进一步发掘可供人们利用的资源，还因为人类更加重视自己的生活环境和工作环境的生态化和环保化。海洋微生物的科学合理地应用，有助于我们人类社会的可持续发展，未来海洋微生物的将会更广泛地应用到前沿技术，以降低海洋微生物研发的成本，努力使经济效益与环境效益和谐统一起来。
参考文献
[1]张亚鸱,朱伟明,顾谦群等.源干海洋真菌抗肿瘤活性物质的研究进展[J].中国海洋药物杂志,2006.
[2]温占波,裴月湖,田黎.海洋真菌药用活性物质研究进展[J].海洋科学进展,2004.
[3]胡萍,王雪青.海洋微生物抗菌物质的研究进展[J].食品科学,2004.
[4]倪志华,张玉明,刘龙,马玻.海洋微生物活性产物及研究方法[J].安徽农业科学,2006.
陈醋体外抗栓及溶栓活性的研究 篇5
关键词：陈醋,抗栓,溶栓,醋酸活性
醋在我国饮食文化中占有重要地位,它既是传统食品调味品,同时又药食同用。在古代就有很多关于醋的生理功能记载,《本草纲目》中记载:醋能“消肿痛,散水气,杀邪毒,理诸药”;清代王士雄《随息居饮食谱》较深刻地归纳食醋的保健功效是“开胃、养肝、强筋、暖骨、醒酒、消食、下气、辟邪、解鱼蟹鳞介诸毒”。现代研究认为,醋可清除自由基、降血压、防癌、预防骨质疏松,抑菌、杀菌,并对心肌梗塞、动脉硬化、高血压等疾病有良好的疗效。
血栓及相关疾病如脑缺血、高血压、冠心病及动脉粥样硬化等已成为危害人类健康的第一杀手。现在人们普遍认为,膳食中的功能性成分对于人体健康有重要作用。最新研究表明,醋能改善血液的流变性,具有很好的生物调节功能。但是关于醋对于血栓形成的防治作用还没有被人们认识到。
陈醋是我国四大名醋之一,在我国北方非常流行。小杂粮是传统的保健食品,近年来发现小杂粮具有丰富的功能性成分,陈醋主要是以高粱为主的小杂粮为原料经特殊工艺酿造而成的。笔者评价了陈醋的体外抗栓及溶栓活性,并对其中的生理活性物质进行了初步探索。
1 材料与试剂
1.1 试验材料
陈醋(黑苦荞醋、黑燕麦醋、黑高粱醋、黑小麦醋、黑小米醋,山西汾阳紫苑微生物开发利用研究所生产)、牛纤维蛋白原(中国药品生物制品检定所生产,98mg可凝蛋白/支)、凝血酶原(中国药品生物制品检定所生产,每支210Bp)、琼脂糖(电泳用,10g,浙江温州洞头县蓝鸟海藻生物制品厂生产)、圆片超滤平膜(截留分子量为5 000和30 000,上海摩速科学器材有限公司生产)。
1.2 试验仪器
pH计(ZD-2型自动电位滴定仪,上海精密科学仪器有限公司出品)、紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司出品)、FD-1真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司出品)、TDL-5型离心机(上海安亭科学仪器厂出品)。
2 试验方法
2.1 醋样酸度的测定
参照GB/T 5009.41-1996滴定法:食醋中酸的主要成分是乙酸,含有少量其他有机酸,用NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.05moL/L]滴定,以酸度计测定,pH值为8.2时为滴定终点,结果以乙酸含量表示。
2.2 醋样的超滤
将原醋样置于3 000rpm的离心机中,离心25min,取上清液,使其依次通过截留分子量为5 000和30 000孔径的超滤膜,将醋样分为分子量小于5 000、5 000~30 000、大于30 000三部分。分离后的这些样品真空冷冻干燥48h,即得干燥醋样。
2.3 抗栓活性的测定
(1)原醋抗栓活性测定。取醋样5mL(空白对照中不加)于小型试管中,依次加入10U/mL的凝血酶原20mL、Tris-HC缓冲液0.66mL(空白对照中加0.67mL)、0.2%的牛纤维蛋白原溶液0.3mL,迅速摇匀,静置,开始计时。每隔2~3s缓慢倾斜试管1次,记录试管中混合液完全凝固,即液面不动所需的时间。每个醋样做10个重复。用相应酸度的醋酸和经NaOH中和后的醋样重复上述操作。结果用混合液完全凝固所需的时间表示。
(2)超滤醋样不同片段抗栓活性的测定。将不同分子量段(小于5 000、5 000~30 000、大于30 000)的3种干燥醋样(黑燕麦醋、黑苦荞醋、黑高粱醋)加蒸馏水配制成浓度为0.15g/mL的溶液。以20mL配好的醋样代替5mL原醋样重复上述操作。
2.4 纤溶活性的测定
制作纤溶平板:称取适量琼脂糖,加蒸馏水配成0.8%的溶液。将配好的溶液置于80℃水浴锅中加热溶解。完全溶解后,将其冷却至55℃左右,量取16mL倒入直径为9cm的培养皿中,迅速加入81mg/11.6mL牛纤维蛋白原0.8mL,120U/19.2mL凝血酶原0.53mL,摇匀,置于4℃冰箱中放置20min后取出,即制得纤溶平板。
取2个纤溶平板,每个平板中间隔90°打孔,分别加具有与黑小麦醋相同酸度的醋酸(后简称醋酸)和另外3种原醋(空白对照中加经NaOH中和后的醋样)各2mL,置于37℃恒温培养箱中16h后取出,观察是否出现溶纤圈。结果用最大溶纤圈半径表示。
另取2个纤溶平板,置于80℃烘箱,30min后取出,使其自然冷却,重复上述操作,观察能否出现溶纤圈。
3 结果与分析
3.1 醋的酸度
醋样酸度的测定结果见图1。由图1可知,各醋样的酸度依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋,其中,酸度最强的是黑小麦醋,其酸度为7.25;米醋作为对照,酸度最弱,为3.7;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的酸度分别为7.01、6.67、5.21和4.22。可见,陈醋中有机酸含量明显高于一般米醋。
3.2 抗栓活性
原醋抗栓活性的测定结果见图2。由图2可知:试验中所用的所有醋样均能明显地延长凝块形成时间,黑小麦醋作用最强,在10.7min时混合液才完全凝固;米醋作为对照醋样,其作用最弱,需4.4min;空白对照需1.8min;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋中形成凝块所需的时间分别为9.7min、9.2min、8.3min和7.6min。当用相应酸度的醋酸作对照时,其凝固所需的时间与原醋样大致相同;而当用中和后的醋样作对照时,其凝固时间与空白大致相同。
超滤醋样不同片段的抗栓活性测定结果见图3。由图3可知,陈醋中除醋酸外的其他成分亦能明显地延长凝块形成时间,其中,黑苦荞醋由大到小的3个分子量段的醋样完全凝固所需的时间依次为50.8min、31.7min、17.9min;黑高粱醋依次为42.4min、26.7min、15.7min;黑燕麦醋依次为34.0min、21.7min、13.9min;空白完全凝固所需的时间为1.8min。由此可知,对于同种醋样,分子量越大,作用效果越明显;对于同分子量段的不同种醋样,其作用强弱依次为黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋。
由原醋抗栓活性的测定结果可知,陈醋的抗栓作用明显优于对照米醋;本研究所用的所有醋样的抗栓作用与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间具有显著相关性(r=0.915 0,P<0.05),考虑到中和后醋样的测定结果,笔者认为,醋酸是陈醋中主要抗栓物质,醋酸的作用可能在于其对凝血酶的抑制活性;而通过干燥醋样的抗栓试验,能很明显地看到除醋酸外,陈醋中还有其他成分有很强的抗栓作用。
3.3 纤溶活性
原醋纤溶活性的测定结果见图4。由图4可知,陈醋有很强的纤溶活性,其中黑小麦醋作用最强,其最大溶纤圈的半径为2.5cm;米醋作为对照醋样,最大溶纤圈的半径为1.5cm;醋酸(即与黑小麦醋相同酸度的醋酸)的最大溶纤圈半径仅为1.0cm;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的最大溶纤圈半径分别为2.4cm、2.1cm、1.9cm和1.8cm;陈醋所形成的溶纤圈的半径大小依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋>醋酸,其作用强度分别相当于0.243U、0.229U、0.187U、0.167U、0.154U、0.114U、0.053U的标准尿激酶活性;中和后的醋样周围均未观察到溶纤圈,同时在加热过的平板中,每种醋样周围亦未出现溶纤圈。
由原醋纤溶活性的测定结果可知,陈醋的纤溶活性明显优于对照米醋;参照原醋样酸度的测定结果可知,陈醋的溶纤活性与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间亦具有显著相关性(r=0.959 2,P<0.01);对比黑小麦醋和经NaOH调节的与黑小麦醋有相同酸度的醋酸测定结果表明,陈醋中还有其他物质有溶纤活性;根据中和后醋样的对照结果可知,陈醋中起溶纤作用的物质主要是醋酸;根据加热平板的对照结果可进一步推测,醋酸能激活纤溶酶原,进而使其发挥纤溶作用。
4 讨论
机体血管内血栓形成是引发高血压、心肌梗死、脑缺血、动脉粥样硬化等诸多疾病的主要病理因素。无论是氧自由基等化学诱因,还是缺氧等物理诱因,内皮细胞损伤及其凝血与溶栓机能失调是血栓形成的主要机制。血液凝固涉及到一系列复杂的生物化学过程,这一过程有2个主要环节:一是血浆中凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶;二是血浆中的纤维蛋白原肽A(FA)和B(FB)形成单位(αβγ)2后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体,不稳定的纤维蛋白多聚体在Ca2+等的作用下交联成稳定纤维蛋白多聚体,这就是血栓的主要基质。在人类血液纤溶系统中,起中心作用的是纤溶酶及其酶原分子。
抗微生物活性 篇6
复方土槿皮霜剂是由四川畜牧科学研究院养兔研究所根据多年的临床实际工作经验总结出来的, 处方主要由君药土槿皮和臣药黄柏等按照一定配比制成, 本试验从科学角度验证该药物的体外抑菌情况, 为开发动物皮肤外用抗真菌霜剂提供试验依据。
1 材料
1.1 菌种
须癣毛癣菌、红色毛癣菌标准株, 均购自中国药品生物制品检定所。
1.2 培养基
液体沙式培养基 (液体SDA) 、固体沙式培养基 (固体SDA) , 自配。
1.3 药品
复方土槿皮霜剂, 由四川畜牧科学研究院养兔研究所提供。
1.4 主要仪器
隔水式恒温培养箱, 上海妖进医疗器械厂生产;超净工作台 (型号为SW-CJ-IF) , 苏州泰安空气技术有限公司生产; 高压湿热灭菌锅 (型号为mlS-3020) , SANYO (三洋) 公司生产;振荡培养箱 (型号为HZQ-F16) , 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产。
2 方法
2.1 培养基的制备
2.1.1 液体沙式培养基的配制
用电子天平称取蛋白胨5 g、麦芽糖20 g, 放入500 mL锥形容量瓶中;用量筒取一定量 (约占总量的1/2) 纯化水倒入容量瓶中, 放在有石棉网的电炉上小火加热, 并用玻璃棒搅拌, 以防液体溢出;待各种药品完全溶解后停止加热, 补足水分;用5%NaOH或5%HCl溶液将培养基的pH值调至5.4;调好pH值后加棉塞或试管帽, 再包上1层防潮纸, 用棉绳系好, 115 ℃高压灭菌20 min;倒入经过灭菌的锥形瓶中, 在标签纸上标明培养基名称、制备组别、姓名、日期等, 备用。
2.1.2 固体沙式培养基的配制
在液体沙式培养基的基础上加1.5%～2.0%琼脂粉即得到固体沙式培养基, 放入高压蒸气灭菌锅中, 115 ℃灭菌20 min, 在标签纸上标明培养基名称、制备组别、姓名、日期等, 备用。
2.2 菌液的准备
在超净工作台上, 将液体沙式培养基分装入小试管中, 用烧灼过的接种环将2种菌分别转接到对应的液体沙式培养基中;做好标记, 置于35 ℃培养箱中振荡培养3～7 d, 确认接种成功后用液体沙式培养基作一定的稀释, 备用。
菌液浓度的测定:采用麦氏比浊法测定菌液浓度, 用0.25%氯化钡0.2 mL, 1%硫酸9.8 mL配制成麦氏单位为0.5的标准溶液;轻摇标准试管, 以无菌操作技术将待测定的液体培养物加到与标准管相同直径 (大小) 的无菌试管中;以无菌操作技术向待测定试管中加入无菌生理盐水, 直到浊度与标准试管的浊度相同。
2.3 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌的体外抑菌试验
2.3.1 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC) 的测定
采用二倍稀释法, 取灭菌的试管 (每种药物11支) , 编号排列在试管架上;每支试管中先加入相应的无菌液体沙式培养基2.0 mL, 然后向第1号管加入灭菌的复方土槿皮霜剂溶液2.0 mL, 混匀后取出2.0 mL放入第2支试管中, 依次类推, 直到第9号管取出2.0 mL弃去, 使药液稀释度为1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256, 1∶512, 将复方土槿皮霜剂溶液稀释成6.25, 3.125, 1.562 5, 0.781, 0.391, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024 5 mg/mL, 共9个浓度梯度;第10号管不加药物作为阳性对照管, 以便观察培养基是否适合细菌的生长;第11号管加受试药液2.0 mL, 取出2.0 mL而弃去, 不加真菌以便观察受试药物是否被污染, 作为阴性对照管;取准备好的菌液0.1 mL加入1～10号管中, 第11号管不加, 混匀后将11支试管一起放入35 ℃恒温培养箱中培养72 h, 观察结果, 重复3次试验。结果判定, 试管内有絮状物生长, 则表示有细菌生长, 透明则表示无细菌生长, 以3次重复试验无细菌生长的最小药液浓度的平均值作为该药的最小抑菌浓度, 具体操作方法见表1。将未见絮状生长的试管混匀, 用棉签沾取试管内液体, 涂抹于固体沙式培养基上, 抹匀后放于35 ℃恒温培养箱中培养72 h, 观察是否有菌落生长, 重复3次试验, 以3次重复试验无菌落生长的最小药物浓度的平均值为该药物的最小杀菌浓度。
2.3.2 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定
方法同2.3.1, 但是复方土槿皮霜剂溶液的浓度依次为105, 52.5, 26.25, 13.125, 6.563 , 3.281 , 1.641, 0.82 , 0.41 mg/mL (依次对应1～9号管) 。
3 结果与分析
3.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定结果
3.1.1 对须癣毛癣菌最小抑菌浓度及最小杀菌浓度的测定
结果见表2。
注:“+”表示有细菌生长, “-”表示无细菌生长。
由表2可以看出, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌的最小抑菌浓度为第5号管的浓度, 由试验方案浓度可知第5号管的浓度为0.391 mg/mL。同样可得, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌的最小杀菌浓度为第3号管的浓度, 由试验方案浓度可知第3号管的浓度为1.562 5 mg/mL。由试验结果可知, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌有显著的抑制作用。
3.1.2 对红色毛癣菌最小抑菌浓度及最小杀菌浓度的测定
结果见表3。
注:“+”表示有细菌生长, “-”表示无细菌生长。
由表3可以看出, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌的最小抑菌浓度为第7号管的浓度, 由试验方案浓度可知第7号管的浓度为1.641 mg/mL。同样可得, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌的最小杀菌浓度为第5号管的浓度, 由试验方案浓度可知第5号管的浓度为6.563 mg/mL。由试验结果可知, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌有显著的抑制作用。
4 讨论
随着人们生活水平的不断提高, 各种经济动物的皮张制品已进入人们的日常生活当中, 人类健康需求意识、药品安全性、人畜共患疾病等问题也受到普遍关注, 无公害优质的畜产品生产已成为畜牧业发展的必然趋势[3]。近年来, 毛用动物皮肤真菌病的发病率日渐上升, 严重制约了毛皮生产的发展, 而且目前在临床工作中由于抗生素的不合理使用, 临床耐药菌株不断增加, 使细菌的耐药性成为治疗的棘手问题[4]。药品在使用中产生的残留、抗性和微生物再猖獗的问题, 引起人们对其高度重视和重新评价。面对这一严峻现状, 我国是中药大国, 提取中药中的有效成分应用于临床治疗感染病菌有着极大的应用前景, 有研究表明, 单一的中药抑菌作用较弱, 与复方中药的协同作用相比, 复方中药表现出较强抑菌作用[5]。因此, 提取中药中有效的抑菌成分, 并利用与药物的协同作用来增强抗菌效果充分显示其独特的优势, 不失为中药制剂领域中的一个重要分支[6]。
动物皮肤真菌病传播快, 病情顽固且复杂, 难以根治, 并可传染给人, 引起人类发病。饶静等[7]用6种常用抗真菌的西药治疗由石膏样毛癣菌和红色毛癣菌引起的兔皮肤真菌病, 其效果都不理想, 主要问题是用药周期长、治疗成本高、临床疗效缓慢, 且所用药物只能缓解基本症状, 停药后容易复发和难以根治等多种情况。传统治疗为西药治疗, 常用西药有灰黄霉素、特比萘芬和阿莫罗芬等, 西药存在较大的不良反应, 并且容易产生耐药性, 而中药表现出不良反应小、来源广、价格低、较少出现耐药性等优势, 近年来抗皮肤真菌中药的研发越来越受到广大学者的关注。因此, 开发价格适中、临床使用方便、安全性高和符合我国畜牧业发展实际需要的抗皮肤真菌病的新药具有良好的发展前景。
应用体外抑菌试验可以很直接地表现药物对病原菌的抑制作用。本试验采用二倍稀释法定量评价复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌的抑制作用, 其结果重复性好, 准确性高。本试验结果显示:复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌都有明显的抑制作用, 该制剂对须癣毛癣菌的抑菌效果显著, 其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为0.391 mg/mL和1.562 5 mg/mL;对红色毛癣菌的抑菌效果相对较弱, 其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为1.641 mg/mL和6.563 mg/mL。
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抗微生物活性 篇7
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
肺癌A549细胞购自美国ATCC细胞库, 辛伐他汀为北京双鹭药业股份有限公司生产 (国药准字H20058534) , DMEM低糖培养基、胎牛血清购自英韦创津公司, CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自联科生物科技有限公司, 细胞凋亡检测试剂盒购自北京碧云天生物科技技术有限公司, 葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 、天冬酰胺酶12 (Caspase-12) 和GAPDH内参抗体为美国RD公司产品。全自动生化分析仪为日立HICTHI-7080, 细胞培养箱购自美国热电技术公司, FACSC alibur流式细胞仪美国B-D公司产品, 电泳仪为美国Bio Rad公司产品。
1.2 细胞毒实验
将肺癌A549细胞接种到96孔板中, 每孔2500个细胞, 每孔加入180μL DMEM培养液 (含10%胎牛血清) , 并设立空白对照, 加入100、50、25、12.5、6.25和3.125μmol/L对倍稀释的辛伐他汀20μL, 每个浓度重复6个复孔, 5%二氧化碳条件下培养48 h, 每孔加入20μL CCK-8, 540 nm波长处测定吸光度值的变化。细胞生长抑制率= (1-各药物组的吸光度值/空白对照组的吸光度值) ×100%。
1.3 细胞凋亡的流式细胞仪分析
细胞凋亡的检测使用流式细胞仪检测, 将肺癌A549细胞接种到96孔板中, 每孔0.5×106个细胞, 每孔加入0、20和40μmol/L的辛伐他汀, 48 h后, 收集细胞, Annexin V和PI各5μL避光双染细胞, 30 min, 流式细胞仪检测Annexin V阳性和Annexin V/PI双阳性的凋亡细胞, 各组重复实验5次计算平均值。
1.4 蛋白免疫印迹 (Western blot) 分析
将肺癌A549细胞接种到96孔板中, 每孔0.5×106个细胞, 每孔加入0、20和40μmol/L的辛伐他汀, 48 h后, 收集细胞, 加入100μL细胞裂解液, 提取总蛋白, SDS-PAGE胶电泳, 电转移蛋白至PVDF膜, 加入特异性的一抗 (1∶1 000稀释) 和HRP标记的二抗 (1∶5 000稀释) , 分别孵育8 h和2 h, 电泳条带使用化学发光和X-ray曝光显示。
1.5 统计分析
应用SPSS 16.0统计软件处理数据, 连续性资料以 (±s) 表示, 两样本均数比较用t检验, 多组间均数比较用方差分析, P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 辛伐他汀对肺癌A549细胞的细胞毒作用
细胞毒实验结果显示辛伐他汀可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖, 从表1数据可以计算出辛伐他汀对肺癌A549细胞的IC50值 (18.94±3.64) μmol/L。
2.2 辛伐他汀对肺癌A549细胞的致凋亡作用
0、20和40μmol/L的辛伐他汀作用肺癌A549细胞48 h后, 细胞凋亡率分别为 (2.24±0.67) %、 (30.16±6.54) %和 (52.821±11.23) %, 各组之间差异具有显著性 (P<0.01) , 其中40μmol/L组细胞凋亡率显著高于20μmol/L组 (P<0.01) , 20μmol/L组细胞凋亡率又显著高于0μmol/L空白对照组 (P<0.01) 。见表2和图1。
2.3 辛伐他汀对肺癌A549细胞GRP78和Cas-pase-12蛋白表达的变化
从图2可见20和40μmol/L辛伐他汀处理肺癌A549细胞后, 与对照比较GRP78出现显著的升高, Caspase-12蛋白出现了剪切带, 上述结果提示了辛伐他汀处理肺癌A549细胞后激活了内质网压力通路。
A:对照组;B:20μmol/L的辛伐他汀;C:40μmol/L的辛伐他汀
注:1) 与0μmol/L组比较, P<0.01;2) 与20μmol/L组比较, P<0.01
1:对照组;2:20μmol/L的辛伐他汀;3:40μmol/L的辛伐他汀
3 讨论
肺癌是癌症相关死亡的最常见原因, 虽然近年来分子靶向化疗药物如EGFR靶向抑制剂的临床运用使治疗取得了一些进展, 但肺癌的5年存活率并没有显著的改善, 一部分患者就诊时已属晚期或发生转移, 失去手术治疗的机会, 化学药物治疗就成为主要的治疗方法[4]。流行病学研究显示使用他汀类药物超过6个月可使癌症风险降低14.00%~28.00%, 即使停药后6个月内癌症风险仍可降低22.00%, 一项结直肠癌的病例对照研究中发现使用他汀类药物超过5年可使结直肠癌的风险降低50%, 另有研究发现他汀类药物能使食管癌风险降低34%, 前列腺癌的风险降低7%, 大量的临床统计资料显示使用他汀类药物使癌症的风险降低, 显示其抗肿瘤的潜力和前景[5,6]。CCK-8细胞增殖实验是检测细胞生长抑制的实验, 根据CCK-8的变化可以从吸光度值中表现出来, 检测到细胞的生长情况, 本研究使用这一方法显示辛伐他汀对肺癌细胞亦有显著的细胞毒活性, 与刘冰等[7]的研究结果相一致, 但辛伐他汀对肺癌的机制目前还不清楚。因此, 本研究进一步探讨了辛伐他汀抗肺癌的作用机制。
内质网是真核细胞中重要的细胞器, 在调节膜蛋白、分泌蛋白的折叠与加工方面具有重要的作用[8]。GRP78是热休克蛋白70家族的成员之一, 为内质网分子伴侣重链结合蛋白, GRP78激活自身磷酸化后可以进一步激活Ca2+依赖的钙蛋白酶 (calpain) , 活化的calpain再剪切定位于ER膜上的procaspase-12释放出caspase-12[9], caspase-12是ERS凋亡的关键分子, caspase-12可以活化Caspase-9, 最终激活Caspase-3, 产生一系列的级联反应, 引起细胞凋亡, 可见GRP78和caspase-12是内质网应激凋亡途径中的关键调节分子[10]。本研究显示了辛伐他汀处理肺癌A549细胞后可以引起GRP78蛋白的表达上调, 以及随后caspase-12蛋白的剪切, 上述结果提示了内质网应激凋亡同路的激活。
综上所述, 本研究显示了辛伐他汀对肺癌具有致凋亡作用, 激活内质网应激凋亡途径可能是其主要的作用机制。
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抗微生物活性 篇8
1 材料与方法
1.1 药材与试剂
玉簪花购自通辽市蒙药股份有限公司;角叉菜胶 (Sigma公司, 批号127H1227) ;阿司匹林 (贵州信邦药业有限公司, 批号110114) ;其他试剂均为分析纯。
1.2 动物
昆明种小鼠, 雌雄兼用, 体重18~24g;Wistar大鼠, 雌雄兼用, 体重180~200g, 由吉林大学实验动物饲养中心提供 (许可证号:SCXK- (2011-0004) ) 。
1.3 仪器
电子调温电热套 (天津市秦斯特仪器有限公司, 98-1B型) ;旋转蒸发仪 (EYEL4, OSB-2100) ;循环水式多用真空泵 (河南郑州长城科工贸有限公司, SHZ-Ⅲ) ;电子天平 (上海仪器有限公司, YP1201N) , 精密电子天平 (日本岛津, AUW220D) ;足趾容积测量仪 (中西远大科技有限公司, HZ905-ZH-YLS-7B) 。
2 方法
2.1 玉簪花不同溶剂萃取物制备
将玉簪花的干燥花切断粉碎后过20目筛, 倍量95%乙醇加热回流提取3次, 合并滤液, 减压回收溶剂, 加适量水溶解后, 依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有机溶剂层颜色较浅, 减压回收溶剂, 分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的浓缩浸膏, 低温保存备用。
2.2 玉簪花不同溶剂萃取物实验用剂量确定
根据前期急性毒性实验结果, 得出玉簪花石油醚部位的半数致死量 (LD50) 为3.95g·kg-1, 换算成干燥药材剂量为119.7g·kg-1;正丁醇部位的LD50为8.04g·kg-1, 换算成干燥药材剂量为120g·kg-1;乙酸乙酯部位的最大耐受量为3.5g·kg-1, 换算成干燥药材剂量为87.5g·kg-1。本实验使用的玉簪花三个萃取部位, 在换算成干燥药材量时均相等 (12g·kg-1) 的剂量下, 研究其对急性炎症动物模型的影响。
2.3 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验[5]
取小鼠72只, 雌雄各半, 按体重随机分为6组, 即模型对照组、阿司匹林组、玉簪花石油醚萃取物组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组和清喉利咽颗粒组, 每组12只。连续灌胃给予不同药物10天, 末次给药1h后, 将二甲苯均匀涂抹于小鼠右侧耳壳正反两面 (每只25μL) 后脱颈椎处死, 沿耳廓剪下两耳, 于同一部位用打孔器 (8~9mm) 打下耳片, 电子天平称重。以两耳重量之差为肿胀度, 按公式计算耳肿胀率及肿胀抑制率。肿胀率 (%) = (肿胀耳重量—对照耳重量) /对照耳重量×100%;肿胀抑制率 (%) = (对照组平均肿胀率—给药组平均肿胀率) /对照组平均肿胀率×100%。
2.4 角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验[6]
取大鼠60只, 雌雄各半, 按体重随机分为6组, 即模型对照组、阿司匹林组、玉簪花石油醚萃取物组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组和清喉利咽颗粒组, 每组10只。各组连续灌胃给予不同药物10天, 末次给药1h后, 同时测量其正常右后足跖容积, 于大鼠右后足跖掌心向踝关节方向进针, 每只皮下注射1%角叉菜胶0.1mL致炎。然后分别于0.5、1、2、3、4、5、6h测定其右后足跖容积, 计算肿胀率并比较组间差异性。肿胀率 (%) = (致炎后足跖容积—致炎前的足跖容积) /致炎前的足跖容积×100%。
2.5 统计学处理
采用SPSS19.0统计分析软件处理, 实验数据用平均值±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用t检验, 两组以上比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验
致炎30min后, 各组小鼠右耳均可见高度红肿。玉簪花的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位可显著减轻二甲苯致炎小鼠的耳廓肿胀度 (P<0.05, P<0.05) , 石油醚萃取部位则作用不显著 (P>0.05) , 提示乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位有抑制急性炎症的作用, 但其抑制作用较阿司匹林弱 (P<0.01) 。结果见表1。
注:与模型对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。
3.2 角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验
致炎1h后, 各组大鼠右后足均可见红肿, 各组的肿胀度及抑制率结果见表2。实验结果表明, 乙酸乙酯萃取部位在造模后2、3、4h足跖肿胀率均显著低于模型对照组 (P<0.01, P<0.01, P<0.05) ;正丁醇萃取部位在造模后3、4h足跖肿胀率极显著低于模型对照组 (P<0.01, P<0.05) ;石油醚萃取部位则作用不显著 (P>0.05) , 提示乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位有抑制急性炎症的作用, 但抑制效果低于阿司匹林组 (1、2、3、4、5h均表现出很好的抗炎效果, P<0.01) 。
(±s)
注:与模型对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。
4 讨论
炎症是机体组织对损伤因子引起局部损伤的防御反应, 在炎症的早期, 血管受到炎症介质的刺激而扩张, 导致血管内皮间隙扩大、血管壁通透性增加以及血浆内液体渗出到组织间隙等, 并随着渗出的增加, 造成组织肿胀。因此, 炎性渗出和组织肿胀是炎症早期的重要特征。
急性炎症发病快、持续时间短, 一般仅几天到1个月, 主要表现为渗出性病变;慢性炎症持续时间较长, 有时可达数月至数年, 常伴有增生性病变。急性炎症模型常以致炎剂二甲苯诱发小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶致大鼠足跖肿胀等实验验证药物的抗炎作用。化学致炎剂二甲苯可引起组胺激肽、纤维蛋白溶解酶等炎性介质释放, 进而引起局部毛细血管通透性增加及炎症细胞浸润, 最终引发耳部急性渗出性炎性水肿[7];具有刺激性的角叉菜胶注入大鼠足跖后, 可使大鼠的足跖局部毛细血管充血、水肿, 引发足跖体积增加, 同时伴有红、肿、热、痛等症状[8]。
玉簪花具有清热、解毒、利咽喉、止咳等功效, 临床上多用于治疗急慢性咽炎、肺热、毒热、咽喉肿痛和音哑。本实验研究表明, 玉簪花的乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位可显著减轻二甲苯致炎小鼠的耳廓肿胀度 (P<0.05, P<0.05) 和由角叉菜胶作用3、4h后引起的大鼠足跖肿胀度 (P<0.01, P<0.05) , 石油醚萃取部位则作用不显著 (P>0.05) 。提示其乙酸乙酯部位和正丁醇部位有抑制急性炎症的作用, 为玉簪花抗炎活性部位。该研究为今后玉簪花植物中具有抗炎活性单体的研究开发奠定了理论和实验基础, 而其抗炎的机制有待进一步研究。
摘要：目的:从蒙药玉簪花的不同萃取部位筛选出活性部位。方法:采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验模型、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验模型对蒙药玉簪花不同萃取部位进行抗炎活性考察。结果:玉簪花的乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位可显著减轻二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀度 (P<0.05, P<0.05) 及角叉菜胶作用3、4h后引起的大鼠足肿胀度 (P<0.01, P<0.05) 。结论:蒙药玉簪花乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位有抑制急性炎症的作用, 可能是玉簪花抗炎的活性部位。
关键词：玉簪花,蒙药,抗炎作用,耳廓肿胀,足跖肿胀
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抗微生物活性 篇9
关键词：雷竹；土壤微生物；土壤酶活性
中图分类号：S154.3；S795.7 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2016）03-0011-05
雷竹Phyllostachys praecon是我国特有的优质笋用竹种，适应性强，笋体味美、产量高、效益好。从1994年开始崇阳县从浙江临安市与安吉县引种雷竹，现已经成为华中地区规模最大的雷竹生产基地。雷竹在正常情况下3月份出笋，如果采用适宜的覆盖方式、覆盖厚度与覆盖材料对雷竹林地进行覆盖，可以将出笋期提前至春节前。通过林地覆盖生产技术措施，可提高单位面积产值与经济效益，增加竹农收入，丰富民众春节菜品。
本文以林地覆盖雷竹林分为试验材料，分析雷竹林地覆盖对土壤微生物及土壤酶活性所产生的影响，为雷竹林分的早产、高产、稳产与高效，提高单位面积经济效益提供试验依据，为了雷竹林分可持续经营提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
试验林位于崇阳29°12′～29°41′。亚热带季风气候，日照充足，常年基本雨热同季，无霜期长，四季分明。年平均气温17.3℃，1月平均气温4.8℃，7月平均气温29.0℃，极端最高温度41.5℃，极端最低温-14.9℃，≥10℃生物学有效积温6085℃。平均年降水量1604.3mm，平均年蒸发量1439.5mm，常出现伏旱和秋旱，雨量主要集中在春夏交替时期，因此夏季干旱，秋旱多。3～8月份为雨季，各月份降雨量>90mm，10月份～次年2月份为旱季，各月份降雨量一般<80mm。雷竹试验林分土壤为黄壤，有铁锰结核，微酸性，土层厚度>60cm。表层凋落物主要是竹叶、枯枝和干枯退笋，还有少量干枯杂草。
1.2 试验林概况
雷竹试验林于2000年营造，雷竹林平均株高4.32m，平均胸径3.69cm。竹林下灌木数量较少，株高10～20cm，占林下植被总量的5%～10%，草本的数量较多，占林下总量的90%～95%。每年常规生产技术措施包括：在4月出笋期，适时、适量、照顾均匀分布而有选择性地保留健壮笋体培养成新竹；在5～6月间砍伐老竹病竹；11月中旬～12月上旬施次肥（复合肥2250kg/hm2+尿素750kg/hm2，混合施用），肥料深翻入土；浇次透水。
1.3 研究方法
（1）林地覆盖：11月份对试验林林地进行覆盖，覆盖物为3层。最下为厚约1cm的鸡粪层，中间为厚约5cm的稻草层，最上为厚约30cm的谷壳与竹叶层。翌年4月下旬气温上升至20℃左右时，移去谷壳，堆积园外为下一年再度利用，鸡粪与稻草则留园内并深翻入土腐烂。
（2）标准地设置与土壤取样：2014年1月、4月、7月及10月，在有林地覆盖代表性的雷竹林分地段及同等条件下没有覆盖的雷竹林分地段设置标准地，面积均为5m×5m，林地覆盖与对照林分各设标准地3块。
在标准地周边适当地块上小心挖掘土壤剖面，分别在0～15cm、16～30cm及31～45cm土层取土壤样品，将约500g土壤装于灭菌塑料袋，重复2次。以大约1cm厚度取根系周围的土壤并以此作为根际土壤样品并装袋。土壤样品带回实验室用于土壤微生物及土壤酶活性测定。
（3）土壤微生物测定11]：土壤微生物数量及测定条件如下。细菌：牛肉膏蛋白胨琼脂稀释混合平板法，稀释液浓度为10-4、10-5及10-6；真菌：马丁氏培养基稀释混合平板法，稀释液浓度为10-2、10-5及10-4；放线菌：高氏一号合成培养基稀释混合平板法，稀释液浓度为10-3、10-4及10-5；固氮菌：改良阿须贝无氮琼脂稀释混合平板法，稀释液浓度为10-2、10-3及10-4；氨化菌：蛋白胨稀释混合平板法，稀释液浓度为10-2、10-3及10-4。每一处理设3个重复，接种后在28℃恒温培养箱内培养，细菌36～72h，真菌3～5d，放线菌7～10d，固氮菌5～7d，氨化菌3～5d，分别观察结果，进行计数。
（4）土壤酶活性测定：土壤酶按下述方法测定。土壤蔗糖酶：3，5一二硝基水杨酸比色法；土壤脲酶：靛酚比色法；土壤蛋白酶：铜盐比色法。
2 结果与分析
2.1 季节对雷竹土壤微生物数量的影响
在三大类微生物中，雷竹林分土壤以细菌数量最大，真菌数量次之，放线菌数量最少。雷竹林分土壤细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌的数量出现了明显的季节性变化，各种类型土壤微生物数量变化趋势较一致，见表1，可以看出：各种类型土壤微生物数量冬季（12～次年1月）低，夏季（4～7月）高，这可能与其气候变化相关。1月为崇阳温度最低月分，且雨水较少，低温少雨不利于土壤微生物活动与发育。4月气温上升且雨水增多，土壤微生物数量开始变多，到7月份达到最大，10月份后则急剧下降，这与郭子武等研究结果相同。方差分析表明，季节对雷竹土壤细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌的数量的影响均达到极显著水平。
在冬季对林地进行覆盖，对林分起到保温与增温作用，土壤温度的升高直接影响冬季及全年土壤微生物的数量与土壤酶活性，见表1。方差分析表明，林地覆盖对土壤细菌、真菌、放线菌、氨化菌的数量影响极显著，但林地覆盖对固氮菌数量影响不显著。这说明在一般情况下，土壤覆盖后，分解凋落物的真菌及细菌数量都明显地增加了，见表2。
方差分析表明，季节对土壤细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌数量的影响均达到极显著差异水平，见表2。
2.3 土层对雷竹林分土壤微生物数量的影响
（1）雷竹林分土层间土壤微生物数量差异：不同土壤层次，土壤中的微生物组成与数量也出现差异，见表3，可以看出：在林地覆盖的雷竹林分中各类土壤微生物数量均随土层深度的增加而逐渐减少；在林地没有覆盖的雷竹林分中，虽然细菌、真菌及放线菌数量均随土层深度增加而逐渐减少，但固氮菌及氨化菌在16～30cm土层数量最大。
土壤微生物数量在各土层间呈现差异，这可能不仅与土壤环境条件相关，如温度、湿度、松紧度、pH值等，还与各土层有机质含量及施肥的层次相关。
为了检验土层对土壤微生物数量的影响进行方差分析。结果表明，细菌、虽然真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌数量土壤层次各有差异，但没有达到显著性水平。关于雷竹林分土层间土壤微生物数量差异的影响，有待进一步研究。
（2）雷竹林根际土壤与非根际土壤间土壤微生物数量差异：雷竹林分土壤细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌数量根际土壤与非根际土壤间存在差异，结果见表4，可以看出：无论是林地覆盖与否，土壤细菌及真菌数量均表现出根际土壤的比对照的高，而土壤固氮菌则相反；在对照林分土壤中根际土壤比非根际土壤放线菌数量差异不大，而在林地覆盖林分土壤中非根际土壤放线菌数量比根际土壤的大；在林地覆盖林分土壤中根际土壤比非根际土壤氨化菌数量差异不大，而在对照林分土壤中非根际土壤氨化菌数量比根际土壤的大。
方差分析表明，虽然雷竹林分土壤细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌根际土壤与非根际土壤之间存在差异，但差异不显著。关于雷竹林根际土壤与非根际土壤之间土壤微生物类群数量差异，有待进一步研究。
2.4 林地覆盖对雷竹林土壤酶活性的影响
不同土壤酶活性的差异，反映了各种立地类型土壤的水热条件以及有机残体的转化状况。土壤酶活性的强弱，可直接反映土壤中的物质转化状况和土壤肥力水平。林地覆盖对雷竹土壤酶活性产生了较大的影响，结果如表5所示。可以看出：林地覆盖使土壤脲酶及土壤蛋白酶的活性增大，而使土壤蔗糖酶活性降低。方差分析表明，林地覆盖对雷竹土壤蔗糖酶、脲酶、蛋白酶的活性影响均达到极显著水平。
3 结论与讨论
土壤微生物与土壤酶是植物生态系统的重要组成部分，微生物是生态系统中的分解者，土壤酶参与了进入土壤的有机质进行分解、转化与合成。土壤微生物数量与土壤酶活性受环境条件的影响，如气温、相对湿度、降雨、土壤pH等等。雷竹林分土壤微生物数量呈明显季节变化规律。
在土壤三大类微生物中，雷竹林分土壤以细菌数量最大，真菌数量次之，放线菌数量最少。林地覆盖对雷竹林分土壤微生物数量，如细菌、真菌、放线菌、固氮菌及氨化菌数量，以及对土壤酶活性，如蔗糖酶、脲酶及蛋白酶的影响均达极显著水平。林地覆盖不仅使雷竹林分产笋期提前至春节前，丰富春节菜品，增加竹农产值与效益，还能在一定程度上提高林地土壤肥力。
虽然林地覆盖能对单位面积经济效益与林地产生积极的影响，但对林分也会产生一些不良影响。林地长期覆盖，会导致雷竹林土壤劣变严重，增加了土壤还原性微生物、厌气性微生物数量，致使大量的病原菌、根腐菌破坏细根的结构，减少细根碳水化合物的储存，再加上细根由于进行无氧呼吸会代谢掉大量的碳水化合物，最终使活细根活力下降，衰老增快。
陈珊等研究表明，林地覆盖雷竹林总体上1级根养分浓度和养分内循环率显著高于2级根。1级根养分迁移速率随时问的推延而降低，2级根表现出先升高后降低的趋势。林地覆盖经营对雷竹鞭根的养分浓度、迁移量、迁移速率和内循环率均会产生一定的影响，休养式林地覆盖经营总体上提高了雷竹鞭根养分浓度、迁移速率和内循环率，增强了根系养分内循环，而长期林地覆盖经营虽提高了雷竹鞭根部分养分浓度，但总体上降低了根系的养分内循环率和迁移速率，减弱了根系养分内循环。休养式林地覆盖经营利于雷竹林对养分的循环利用，长期覆盖经营阻碍了根系对养分的平衡吸收和内循环，不利于雷竹的生长更新。
郭子武通过对雷竹林地不同覆盖年限（CK、1年、3年和6年）研究表明，林地覆盖会明显改变雷竹林土壤和立竹叶片的N、P化学计量特征，引起N、P养分失衡，P素对雷竹林生长的限制性作用增强，会导致雷竹林退化。长期覆盖雷竹林土壤细菌、放菌数量与比例明显降低，真菌数量与比例明显提高，土壤养分与土壤微生物的制约性作用关系会发生较为明显变化，产生土壤障害，这是覆盖雷竹林退化的主要原因之一。短期覆盖（≤3年）经营雷竹林叶片N/P的降低可促使叶片淀粉分解和可溶性糖积累，明显增雷竹生长活性，而长期覆盖（6年）经营雷竹林叶片N/P升高则促进叶片淀粉积累，雷竹生长由N限制转变为P限制，立竹生长活性明显降低，引起雷竹林分退化。因此建议雷竹林连续覆盖经营不宜超过3年。
叶莉莎以覆盖11，3，5a和不覆盖（CK）4种处理的雷竹林为对象，研究得出：林地覆盖经营对雷竹林土壤氮素形态及组分比例的影响较明显，削弱了土壤硝化作用，土壤氮素不是限制硝化作用进行的主要因子，长期覆盖经营会显著提高土壤反硝化作用，增大土壤氮素的损失。也同样提出在实际生产中建议采用休闲式覆盖方式，连续覆盖时间不超过3a。
三种清热解毒中药抗炎活性的研究 篇10
1 材料与方法
1.1 受试中药
牛大力、溪黄草、凤尾草,购自海南隆安源大药堂,由海南大学农学院王金花副教授对其进行了生药品种鉴定。
1.2 试验动物
昆明种小白鼠,SPF级,体重为(20±2)g,许可证号为SCXK(湘)2014-0011,购自长沙市天勤生物技术有限公司。
1.3 主要试剂
氢化可的松琥珀酸钠(批号为20140512),由天津生物化学制药有限公司生产;地塞米松注射液(批号为20140801),由湖北潜江制药股份有限公司生产;伊文思蓝、冰醋酸、二甲苯,均为国产分析纯。
1.4 主要仪器
精密电子天平(型号为XPE105),购自MET-TLER TOLEDO公司;旋转蒸发仪(型号为V850),购自BUCHI公司;低温离心机(型号为Centrifuge5810R)、高速离心机(型号为Centrifuge 5418),均购自Eppendorf公司;恒温水浴锅(型号为HH-S4),购自金坛市医疗仪器厂;隔膜真空抽滤机(型号为GM-0.5A),购自天津市津腾实验设备有限公司。
1.5 三种中药提取试样的制备
取自然风干的三种中药粉碎样100 g,用100目网筛筛取粉末后装袋待用。用电子天平称取试样60 g,加水600 m L,50℃超声辅助提取2次,每次1 h。过滤并收集滤液,所得滤液经减压浓缩至药液量小于200 m L时停止,提取液用0.2μm滤膜抽滤,所得澄清药液加超纯水补足至200 m L,0.22μm无菌滤膜过滤后4℃保存,备用。
1.6 小鼠药物耐受试验
取雄性昆明小鼠18只,随机分成3组,分别灌喂三种中药提取液,1 m L/d,连续给药7 d,观察小鼠生长及死亡情况,记录结果并计算最大耐药量(MTD值)。
1.7 炎症模型的建立与试样的比较
1.7.1 中药提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
取雄性昆明小鼠60只,随机分成6组:其中中药试验组共3组,分别灌喂牛大力提取液、溪黄草提取液、凤尾草提取液0.01 m L/g;阳性对照组共2组,分别腹腔注射等量氢化可的松、地塞米松生理盐水注射液;模型对照组给予等量的生理盐水。每间隔24 h给药1次,共给药7次。末次给药1 h后,以0.1 m L/只二甲苯均匀涂于左耳前后两面,并以右耳作为对照。计时致炎30 min后处死小鼠,沿耳廓线剪下两耳,用直径为6 mm的不锈钢打孔器在同一部位分别打下圆形耳片,随即用精密电子分析天平称重[6]。以左右耳片的重量之差为肿胀度,计算各组肿胀抑制率,以肿胀抑制率表示中药提取液抗炎活性强度。耳肿胀抑制率=(对照组平均两耳重之差-药物组平均两耳重之差)/对照组平均两耳重之差×100%。
1.7.2 中药提取液对冰醋酸致小鼠腹腔膜通透性增高的影响
取雄性昆明小鼠60只,随机分为6组:其中中药试验组共3组,分别给予牛大力提取液、溪黄草提取液、凤尾草提取液0.01m L/g;阳性对照组共2组,分别腹腔注射等量氢化可的松、地塞米松生理盐水注射液;模型对照组给予等量的生理盐水。每间隔24 h给药1次,共给药7次。末次给药后20分钟尾静脉注射0.5%伊文思兰0.2 m L,随后腹腔注射0.6%冰醋酸生理盐水溶液0.5 m L。60 min后按顺序逐一处死。用消毒后的手术刀划开腹部皮肤,分离表皮与腹膜,撑开腹部表皮,观察和记录各组小鼠腹腔膜壁及染液渗出情况,并拍照。将5 m L生理盐水分成数次洗涤腹腔,移液枪吸出洗涤液,合并洗涤液后混合均匀,取2 m L加入等量生理盐水稀释。将稀释后的洗涤液以3 000 r/min离心15 min,用移液枪取上清液装入比色皿中[7]。以空白为对照,在590 nm波长处测定吸光度值。吸光度值越高则表示渗出的染液越多,通透性也越高。
1.8 统计学分析
应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析中的LSD方法对试验数据进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 小鼠药物耐受情况及MTD值
连续观察7 d,3个组的小鼠生长良好,活动正常,均无死亡情况,小鼠对三种中药提取液的耐受剂量均大于15 g/(kg·d)。
2.2 三种中药提取液对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制试验
结果见图1。
b.表示与模型对照组比较差异显著(P<0.05)。
由图1可知,三种中药提取液对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制效果,经计算,抑制率分别为牛大力56.32%、溪黄草27.97%、凤尾草33.72%,其中牛大力的抑制效果最好,与阳性对照药氢化可的松的效果相当。
2.3 三种中药提取液对冰醋酸所致小鼠腹腔膜渗出试验
结果见图2。
由图2可知,三种中药提取液对冰醋酸所致小鼠腹腔膜渗透性增高均有一定抑制作用,经计算,抑制率分别为牛大力74.96%、溪黄草37.98%、凤尾草53.17%,其中牛大力的抑制效果最明显,与阳性对照药物氢化可的松的效果相当。
2.4 小鼠剖检
结果见297页彩图3。
由297页彩图3可知:模型对照组小鼠可以清楚看见腹腔中有明显浸润现象,内有深蓝色液体渗出,见297页彩图3A;溪黄草组小鼠腹腔颜色较模型对照组浅,可见腹壁内充有深蓝色液体的毛细血管,腹腔中仍有浸润现象和少量渗出染液,见297页彩图3B;凤尾草组小鼠腹腔颜色较浅,腹壁上毛细血管已清晰可见,无浸润现象,渗出液明显减少,见297页彩图3C;牛大力组小鼠腹腔膜上毛细血管可见,腹腔中未见明显渗出液,见297页彩图3D。
b.表示与模型对照组比较差异显著(P<0.05)。
3 讨论
本研究的三种受试中药牛大力、溪黄草、凤尾草常用于清热解毒、活血化瘀、消肿止痛等中药汤剂和方剂中,均有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀的功效。研究表明,热解毒类中药在治疗炎症疾病应用中的整体功效表现出喜人的前景。沈瑾秋[8]运用清热解毒法治疗慢性炎症相关病变,结果发现,黄苓苷具有抗血管生成作用,能够减少管腔的形成和使其结构消失。而清热解毒药治疗冠心病也成为一种新的思路,有学者观察了清热解毒中药制剂对冠心病患者的治疗作用,结果发现,能够降低低密度脂蛋白(LDL-C)等脂质成分和在炎症反应中具有重要作用的因子C-反应蛋白(CRP)表达[9]。本研究采用的二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和冰醋酸致小鼠腹腔膜通透性增高模型均为考查血管通透性的动物炎症模型,该类模型可用于评价药物对炎性物质引起血管渗透性增加的抑制作用。炎症早期体内炎性细胞(如肥大细胞)被激活后,炎性递质释放出来(例如组胺、前列腺素和白三烯等)[10,11],导致动脉和静脉扩张,引起血管渗透性增加,进而引起体液和血浆蛋白外渗,形成水肿的过程。该过程可被H1-组胺受体颉颃剂、花生四烯酸代谢抑制剂和前列腺素受体颉颃剂等炎性介质抑制剂所阻断,膜稳定剂也可以降低毛细血管通透性。血管通透性的变化可以通过局部炎症部位的肿胀度或渗出液中生物染料伊文思蓝的含量来评估。
综合试验结果,三种中药提取液对小鼠耳廓肿胀和腹腔毛细血管通透性增高均有一定抑制效果,其中牛大力提取液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀抑制率为56.32%,对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加抑制率为74.96%,整体抗炎效果最为显著,具有较好的开发前景。
摘要：为了评价几种具有清热解毒功效中药的抗炎效果,试验采用小鼠炎症模型对牛大力、溪黄草、凤尾草的抗炎效果进行了比较研究。结果表明:三种中药对二甲苯所致小白鼠耳廓肿胀均有一定抑制作用,肿胀抑制率分别为牛大力56.32%、溪黄草27.97%、凤尾草33.72%,其中牛大力的抑制效果与阳性对照药氢化可的松相当;三种中药对醋酸所致小白鼠腹腔毛细血管通透性增加有明显抑制作用,抑制率分别为牛大力74.96%、溪黄草37.98%、凤尾草53.17%,其中牛大力对血管通透性增高的抑制效果最为显著。说明牛大力在抗炎作用上具有较好的开发前景。
关键词：牛大力,溪黄草,凤尾草,抗炎,耳廓肿胀抑制试验,腹腔膜渗出试验
参考文献
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