实验室诊断

实验室诊断（共12篇）

实验室诊断 篇1

即便是在1998年遭遇事业低谷之时, 陈海斌也一直坚持了下来。坚持成就了他的梦想, 他的独立实验室目标已经梦想照进现实, 借助“服务+产品”的商业模式, 迪安诊断将其连锁化实验室从江苏、浙江等地辐射到长三角地区和环渤海地区。目前, 迪安有11个实验室分布在不同的省份, 覆盖医院超过3000家, 检测项目多达1500多项, 包括肿瘤、心血管、肝胆肾、自身免疫疾病等项目。在杭州, 迪安诊断实验室负责浙江省800多家医院。

复制成功模式赢得好的开始

时间倒流至1996年, 那是陈海斌的创业初始之年。“为什么会选择创业这条路?”对于这个千万人问过他的问题, 他说只是听从了内心的声音, 因为年轻的岁月里一直有着自己做一点事的想法, 也许这就是梦想。

在那之前, 陈海斌曾是一家上市医药公司的前身———上海某医药公司团队中的一员。当时在珠海工作的陈海斌被高中同学叫到一起创业, 加入刚刚成立的这家医药公司。他们的项目就是当时颇为先进的PCR乙型肝炎诊断试剂, 这是该公司负责人在某生命科学院找到的一种新型基因诊断产品。在合作方式上, 该公司提供基因诊断检测设备和技术人员, 医院提供场地, 利润两家分成。陈海斌担任总经理, 负责开拓市场。

正是这样一种产品和简单的合作模式让陈海斌当年供职的那家公司赚到了第一个1亿元, 此时正是1995年。次年, 陈海斌内心的创业梦越来越强烈了, 他怀揣着几年打拼积攒下来的20万元来到杭州创业。他做的第一个项目就是———照搬原有的公司模式, 开拓浙江市场。

“很多人在创业初期会很辛苦, 我因为复制了别人的成功, 有了一个好的开始。”陈海斌说, 在创业后短短的两年时间里, 他就和40多家医院建立了合作关系, 而且创业团队成员达40多人。没有想到, 危机就在企业迅速成长的时候来了———1998年, 国家的一张“医院暂停使用PCR检测技术”的禁令让陈海斌的事业陷入绝境, 原因是当时PCR检测市场的不规范导致了很多临床事故。

最困难时选择了坚持

这是一次致命的事业低谷, 因为业务锐减, 当时40多人的团队最后缩减至七八个人, 出路在哪里?

陈海斌选择了坚持, 哪怕没有业务, 他依然继续保持与合作医院之间的走动。当时, 有医院的工作人员问他, 除了试剂之外, 他能不能提供一些诊断机器或是服务?当时, 正值某品牌仪器在寻中国代理, 陈海斌拿下了代理权。“这一次, 我是带着医院的需求去找项目的, 相当于是手握订单去找上游单位, 特别顺利。”陈海斌特别感激当时的合作单位, 他说是客户给了他企业的第二次生命。

当事业出现转机的时候, 陈海斌的危机意识也更强烈了。“经历了上一次危机之后, 我明白做企业必须是吃着碗里的, 看着锅里的, 想着田里的, 眼光一定要向前看一步。”陈海斌说, 当时该品牌在其他国家都是直销的, 只有在中国是代理的, 如果哪一天中国的市场成熟了, 这个品牌很可能直接取消他的代理权。这就是代理业务最致命的弱点———被动!

陈海斌开始思考做自己的产品和服务。经过一番市场调研和考察后, 他的独立实验室王国之梦越来越清晰。“我们认为独立实验室在中国是一个新的行业, 而且市场竞争也不激烈, 市场前景很大, 而且跟我们原来做的代理业务在渠道上可以共享。因为独立实验室的业务是一个B2B的业务模式, 是为医院服务的。医院的客户既可以是原有品牌仪器的客户, 也可以是外包服务的客户。”陈海斌坚信自己的市场判断, 于是独立实验室的“服务+产品”模式诞生了。

可连锁复制的独立实验室

2011年, 迪安诊断成为医学诊断服务外包行业第一家上市公司后, 加快了发展的进程。

“我们下一步的规划就是每年新开两到三家实验室, 战略上:横向上我们基本上进入全国每一个省份;纵向上我们深耕细作, 比如在杭州有实验室, 在温州又开了实验室, 接下来在宁波、义乌等地我们可能都要开设实验室。”而对于一些新市场, 陈海斌则显示出了很强的资源整合能力。他强调新市场的扩张不能从零开始, “我们要先找市场, 再建实验室, 始终把市场的主动权掌握在我们的手里。所以我们就会找当地有渠道的合作伙伴一起合作, 我们可以合资建设新的检测中心。用我们迪安的品牌和技术, 他们帮我们与医院建立关系。”但所有合作的前提是迪安要控股, 陈海斌认为, 只有这样, 才能保证迪安的质量和品牌, “因为迪安出具的检验报告是具有法律效力的, 要承担相应的责任。”

目前迪安诊断服务收入中50%来自二级医院, 大医院占10%, 还有一些是体检中心。成长最快的是社区医院, 约占20%多。陈海斌非常看好未来的社区医院, 陈海斌更坚信未来社区医院的比重会取代二级医院。

对于未来, 陈海斌表示目前迪安还是专做主业, 未来司法鉴定的业务也会进行连锁化发展, “上游产品的研发、诊断产品的生产也将纳入迪安未来的规划中, 因为我们11个实验室的产品的消耗量也有好几个亿, 如果我们自己生产消耗量大的产品, 就可以降低成本, 增强我们的市场竞争力。”

实验室诊断 篇2

班级：2008级研3班 学号：2008128 姓名：段治华 艾滋病的实验室诊断方法

段治华

（山西医科大学，太原030001）

摘要:艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染引起的传染病，实验室检测是诊断艾滋病的主要手段，检测项目包括HIV抗原和抗体检测，病毒载量检测，CD4T淋巴细胞检测，HIV耐药性检测，基因芯片技术的运用，病毒分离等。近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步，为艾滋病的准确诊断提供可靠的方法。

关键词:艾滋病 HIV 实验室诊断

艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的英文音译，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的以免疫功能缺陷为主要特点的传染病[1]。目前在我国，艾滋病的流行已进入快速增长期，要有效地预防和控制艾滋病的流行，必须有可靠的诊断方法快速准确地诊断艾滋病。目前，艾滋病的诊断主要依靠实验室检测方法，近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步。现简单叙述目前采用的实验室诊断HIV的方法。HIV结构特点

人类免疫缺陷病毒（HIV）外型呈球形或卵形，直径90～130nm，病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成其包膜。核心含有两条相同拷贝的RNA 链，外周核膜由多种蛋白质形成。HIV属逆转录病毒，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白 1 gp41组成(在HIV-2型病毒中与之相当的是gp110/ 130和gp36)[1]。HIV抗原检测

检测P24抗原可作为早期特异性诊断，因为在HIV感染的早期，血中未出现HIV抗体，血P24抗原常以低水平出现，但是该抗原检出率远比HIV 抗体为低，因为HIV 抗原出现不久即可产生抗体，抗原抗体以复合物形式存在，而游离很少。在感染后期，抗原再度升高，可作为HIV活动性感染的标志。P24抗原检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫(RIA)、免疫荧光技术(IFA)、免疫吸附电镜(ISEM)等，其中ELISA操作简单、经济、省时高效的实验方法，具有良好的敏感度和特异度 [2]。HIV抗原检测的灵敏度约50% ～ 80%，所以该结果只能作为HIV 感染的辅助诊断依据[3]。HIV抗体检测

3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA为HIV抗体初筛最常用的筛检方法，其试剂已经发展到第4代[3]。

3.2 凝胶颗粒凝集试验（PA）此法快速、简便，适合对少量标本的检测，但是灵敏度和准确性不如ELISA法[1]。

3.3 金标快速反应试验 将颗粒凝聚法的简便性和酶免疫测定(EIA)技术相结合，用于快速检测抗-HIV，特异性较好，试剂稳定，检测时不需要任何设备，快速简便，适用于应急检测以及边远地区检测[1]。

3.4 尿液HIV抗体检测 尿液检测已成为艾滋病检测的一种全新手段，在安全、便捷等方面更具优势。HIV感染者的尿液、唾液、精液及泪液中均含有HIV抗体，其HIV抗体主要成分为IgG[3]。

3.5 免疫斑点印迹试验（western blot，WB）此法被称为抗-HIV检测的“金标准”。是将HIV病毒蛋白通过十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的蛋白带分离开来,再把这些已经分离的不同蛋白转移到醋酸纤维素膜上,再将此膜切割成条状，每一条醋酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。待检血清样本用稀释液稀释成1∶100，把它直接加到醋酸纤维素膜上，恒温振荡，使其充分接触反应。血清中若含有抗-HIV，就会与膜条上的抗原结合，冲洗除去多余的抗体，再加入抗人-IgG酶结合物并孵育，经洗涤后加入底物，有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果[1]。3.6免疫荧光 将HIV感染的细胞作为抗原固定在玻片上，滴加待检血清，若含有HIV抗体，则与细胞膜上的病毒抗原结合，清洗后加荧光标记的抗人IgG，细胞膜染色为HIV抗体阳性。此法操作简便，敏感性及特异性均较ELISA法高，但存在对某些血清非特异性荧光难以去除，结果判断需较高级的荧光显微镜等缺点[3]。

3.7放射免疫沉淀试验 用同位素标记的HIV蛋白与待检血清反应，若血清中含有HIV抗体即可与HIV蛋白抗原结合，再加入葡萄球菌蛋白A，经低速离心，然后将沉淀复合物分离后电泳，放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。本法灵敏度和特异度均好，但因试剂制备复杂，成本高，且同位素操作需要严格防护而限制其应用[3]。HIV 病毒载量检测

HIV病毒载量是指体内病毒复制的数量，一般以血清HIV-RNA表示，随着生物技术的发展，HIV病毒载量检测得到人们越来越多的重视，它可以直接检测HIV-RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比P24抗原检测方法更灵敏，主要以RNA的拷贝数表示。检测方法有聚合酶链反应检测法，分枝DNA信号扩增检测法，核酸序列扩增实验。

[1]5 CD4T淋巴细胞计数

CD4T淋巴细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一，HIV主要侵犯CD4T淋巴细胞，导致其数量减少和功能缺陷，使机体免疫功能低下，导致各种机会感染和肿瘤。CD4T淋巴细胞计数是AIDS诊断、疾病分期、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的实验室标准指标。目前对CD4T淋巴细胞计数有手工操作法和自动检测法。流式细胞仪是目前最好的自动检测方法[1]。HIV耐药性检测

耐药性是指病毒对某种药物敏感性降低,药物抑制50%或90%病毒生长的浓度上升几倍或几十倍[4]。

6.1 基因型检测 原理为利用RT-PCR技术对HIV-1 病毒的POL基因区(蛋白酶区和逆转录酶区)序列进行反转录扩增(手工或自动仪器方法)，通过基因测序技术获得序列信息，与全球HIV耐药基因数据对比分析耐药位点，得出耐药结果。3 这种检测方法历时较短、费用较低，技术也相对容易[5]。

6.2 表型耐药检测 就是利用体外药敏分析方法，在逐渐增加的药物浓度下对HIV-1复制能力进行直接的评价。其结果以50%抑制浓度来表达(IC50)，并与野生株的IC50或临界值(cut-off值)相比，通过其倍数改变(fold change)来评估其耐药程度[4]。该试验耗时且价格昂贵、技术要求高[5]。基因芯片技术

HIV基因芯片技术是把PCR技术和核酸分子杂交技术完美结合。是在厘米见方的固相载体上，将基因以微点阵的形式排列，应用核酸杂交的原理来检测未知基因，具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点[1]。病毒分离培养

人体感染病毒后，便会终生携带。HIV广泛存在于人体的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织、血液和其他体液中，从这些材料中分离培养HIV，可用于HIV感染的辅助诊断，以及研究HIV在人群中的分布、变异和耐药情况。HIV病毒分离需要在P3级生物安全实验室进行，实验条件要求高[1]。

总之，对HIV检测方法分析将有助于HIV的早期诊断，避免漏检，也有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程，提高检测的灵敏性，从而缩短检测的窗口期。随着对人类HIV/AIDS 研究的深入以及其他生物技术的发展，为HIV的检测提供更快更可靠的方法，为诊断和治疗艾滋病提供技术支持。

地中海贫血实验室诊断进展 篇3

血红蛋白病主要分为α地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(简称β-地贫),是由于血红蛋白链合成部分受抑或完全抑制而引起的一组遗传性溶血性贫血。地中海贫血最早发现于地中海沿岸居民而得名,现在广泛分布于世界许多地区,东南亚是高发区之一,中国以广东、广西、四川多见。此病为自体隐形遗传疾病,因此在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断和选择性流产综合预防措施中起着重要的作用。目前实验室主要有筛查法和基因检测法两大类[1]。

1 地中海贫血的筛选方法

主要是血液学检查和血红蛋白的分析,如红细胞形态、红细胞指数、红细胞渗透脆性、血红蛋白理化性质测定、血红蛋白电泳几个方面来筛查[2]。

1.1 红细胞形态观察:制备新鲜血涂片、瑞氏染色,镜检红细胞的大小,异性等形态改变。地中海贫血患者红细胞均以小细胞低色素性改变为主,并且红细胞大小不均,可出现异型,嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞、网织红细胞比率增高,贫血越重,异形性越明显。

1.2 全血细胞计数仪的使用:随着科学技术的发展,高、精、尖科技应用到医学领域,血细胞计数也由传统的手工计数到现代仪器计数,测定项目从几项到二十几项不等。但其中红系统的6个基本参数:红细胞(RBC),血红蛋白(Hb),红细胞压积(HCT),红细胞平均体积(MCV),红细胞平均血红蛋白量(MCH)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)对地中海贫血的诊断有重要意义。而以MCV和MCH为首选筛查指标,国内使用的MCV和MCH截断值差异很大,而国际上使用较广泛的是MCV<79fl和MCH<27pg[3]。一般认为,不管Hb是否低于正常参考值,当MCV<79fl和MCH<27pg作为地中海贫血的可疑指标,此时要进一步检查。

1.3 红细胞渗透脆性试验:其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展,膜与内容物之比增大,对渗透溶解的抗性增加,在0. 32% (或0. 36% )NaCl中溶解度降低(脆性降低),一管法可用于地中海贫血群体筛查。多管法是把NaCl稀释成一系列浓度梯度而进行红细胞脆性试验,主要是检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。在低渗溶液中,当水渗透其内部达一定程度时,红细胞发生膨胀破裂,地中海贫血患者的渗透脆性降低[4]。

1.4 HbF定量测定、红细胞包涵体试验和异丙醇沉淀试验:HbF抗碱变性强,利用这点可以检测HbF;红细胞包涵体试验是将煌焦油蓝与新鲜血液一起孵育,不稳定蛋白异变性沉淀形成包涵体,常见疾病有HbH病,所以也叫HbH包涵体。异丙醇试验是检测不稳定血红蛋白,不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解,当血液中含有较多HbF、HbH、HbE时可出现阳性结果。

1.5 血红蛋白电泳:Hb电泳是确诊地贫的一种既可靠又快速的方法,目前常用醋纤薄膜电泳和全自动Hb琼脂糖电泳。醋纤薄膜电泳能进行定量测定异常Hb(包括HbH和HbE);全自动Hb琼脂糖电泳是在碱性条件下,经电场作用分离不同Hb分子,再经固定、染色、脱色、烘干、扫描定量等,能定量检测Hb各种成分。但血红蛋白电泳对轻型α-地贫有一定的局限性。

1.6 辅以血清铁和血清铁蛋白测定,排除缺铁性贫血的可能;还应该配合X线检查婴幼儿掌骨、指骨骨髓腔改变、骨板改变等的观察及临床表现。

1.7 高效液相色谱技术(HPLC)。原理:采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术,全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型,容易发现重型和轻型β地中海贫血。在操作上,HPLC采用的是全血标本,不需要制备Hb液,只要将全血标本直接放在仪器上,通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。优点:所需样本量少,自动化程度高,操作简单,快速,能消除人为误差,结果准确。HPLC也可用于胎儿脐带血的产前诊断,可诊断出重型β地中海贫血,但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿[5]。

2 基因诊断

近年来,随着分子生物学研究领域的不断发展,从最初的限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术。中国的地中海贫血的基因诊断是随着PCR技术的发展而发展的。

2.1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析)。原理:DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列,得到一定长度的DNA片段,而碱基的突变可导致酶切位

点的丢失或形成,从而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后,其电泳条带的数量和大小就会发生改变,根据这些改变可判断出突变是否存在。

2.2 等位基因特异性寡核苷酸(ASO)技术:是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法[6]。被检测基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上,分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交,通过严格控制杂交条件。可使PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交,根据有无杂交信号可判断被检扩增片段中是否带有突变点,此技术的缺点是必须严格控制杂交条件,否则会出现假阳性或假阴性,另一缺点是成本高[7]。在此基础上发展起来的反向杂交(RDB)技术,改变了传统的杂交技术一次只能检测一种突变的不足,并能区分纯合子、杂合子、突变子,快速、敏感,适于β-地中海贫血的诊断。

2.3 缺口PCR技术和反向斑点杂交技术分析:采用缺口PCR(即Gap-PCR)技术检测缺失型α-地中海贫血;用反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地中海贫血和17种β-地贫基因。

2.4 荧光-PCR:比普通的PCR敏感性高出1000倍以上,在胚胎植入前遗传学诊断(PCD)借助辅助生产技术中,荧光PCR(F-PCR)比传统的巢式PCR有更高的敏感性,降低等位基因脱扣(ADO)率,且反应周期短[8]。

2.5 液态悬浮点阵技术和基因芯片:液态悬浮点阵技术建立在PCR技术和悬浮点阵检测技术基础上,被称为“液态生物芯片”。 而基因芯片根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型。

猪丹毒的实验室诊断方法 篇4

1 细菌检查

细菌检查是诊断猪丹毒较为可靠的方法, 可用于病猪生前和死后的检查。

1.1 显微镜检查在诊断猪病时, 可从耳静脉采血或切开疹块挤出血液和渗出液作涂片。 对急性病例的尸体, 可从血液、脾、肝、肾及淋巴结采取材料作涂片, 用革兰氏或瑞氏法染色后作显微镜检查。 猪丹毒菌多是散在于红细胞之间, 也有成堆地存在, 并常发现许多菌被白细胞吞噬的现象。 慢性猪丹毒容易从心内膜炎的瓣膜增生的纤维组织中找到细菌, 并可见由长丝状菌体构成的丛状物。 此外, 在显微镜检查时, 因猪丹毒杆菌在血液中数目较少, 至少要看10 个以上的视野再作判断。

1.2 细菌培养如经显微镜检查找不到细菌或不能确定判定时, 就要采用培养检查法。 即以无菌手续采取病猪的耳血或划破疹块部的皮肤取组织液, 死猪尸体则从心血或肝、脾、肾及淋巴结中采取材料, 接种于p H7.6~7.8 的血液琼脂斜面及马丁肉汤中, 置35℃培养24h后, 按照猪丹毒杆菌的培养特性进行观察, 判断结果。 慢性病例应从心瓣膜的纤维性增生组织中或有病变的关节囊内采取材料作培养。

1.3 对死亡后时间已久的尸体作细菌培养由于这种材料容易被腐生菌污染, 所以培养方法时用含有10%血清的马丁琼脂平面划线接种, 或者取管状的骨髓作培养。 但有的学者认为用骨髓不如用肾脏培养准确。 但在交通不便的地区运送材料或遇尸体已经腐败时, 应采用骨髓作培养。 被检的材料可放在30%~40%的甘油或食盐溶液内, 以防腐败。

此外, 用细菌培养法诊断猪丹毒时, 常会遇到混感情况, 除丹毒菌外, 还可分离出大肠杆菌、巴氏杆菌等, 因此应注意观察, 分清主次。

2 动物接种

当被检材料中含菌量极少, 或已被污染, 仅做细菌分离诊断有困难的, 可以接种小动物作为补助诊断。 接种材料可取疹块部组织或血液, 或脾、肝、肾等脏器, 加少量生理盐水作成乳剂直接注射, 也可用病猪材料的24h肉汤培养物注射, 剂量一般为小鼠皮下注射0.2m L, 同时还注射豚鼠。 如被检材料是猪丹毒, 则小鼠在接种后3~5d死亡, 并可以从死亡动物的心血及脾、肝、肾等脏器内分离到猪丹毒杆菌。

3 血清学检查

3.1 凝集反应主要检测慢性猪丹毒病猪血清中的凝集点。有显微镜下检查法、 试管凝集反应与全血平板凝集反应三种, 其中以全血平板凝集反应检查方法最简便。

( 1) 全血平板凝集反应法:将选出的猪丹毒杆菌接种于10%马血清的马丁肉汤中, 在37℃培养24h, 加0.4%福尔马林杀菌24h, 再离心沉淀洗出菌体, 悬浮于1%福尔马林生理盐水中, 作为本试验的抗原。 为便于观察反应, 可在抗原中加入20%甘油及0.001%结晶紫。 取被检猪的血液1 滴放于清洁的玻片上, 加抗原1 滴混合后在1min左右出现凝集的为阳性反应。 患急性猪丹毒的病例在发病2~5d检查, 即可得出阳性结果, 但应注意凡经猪丹毒菌苗免疫的或注射抗丹毒血清的猪, 在一定时期内亦呈现阳性反应, 健康猪有时也有轻度凝集或可凝反应, 不过出现反应的时间多在1.5~2.0min以后。

( 2) 显微镜下凝集反应法:此法与全血平板凝集反应检查相似, 只是将血清与抗原各一滴混合于盖玻片, 作成悬滴标本, 在镜下检查。 细菌凝集成团块的为阳性, 而细菌仍均匀分布为阴性。

3.2 试管凝集反应法取被检血清以生理盐水作不同倍数的稀释, 加入抗原混合后置于37℃温箱4h, 取出用低速离心沉淀数分钟, 阳性反应时上液透明, 阴性的仍为混浊状。 按照这种方法检查, 阳性反应猪的凝集价, 有的可达1:200 以上。有人曾用血清生长凝集试验诊断急性猪丹毒获得成功。 方法是将病猪耳部或死亡猪只实质性脏器接种于马丁肉汤中, 内含1:40 抗猪丹毒高免血清与1m L有1000U的卡那霉素, 36℃培养12h观察结果观察结果, 如系猪丹毒病猪, 在试验管底部可见明显的凝集反应。

3.3沉淀反应这种反应用于死猪尸体诊断, 其方法与诊断炭疽的沉淀反应方法相同。沉淀素血清用兔制造的比一般抗丹毒血清的效力好。抗原可用病死猪的疹块部组织, 或肝、脾、肾等脏器加5倍生理盐水磨成乳剂, 煮沸5~10min后用石棉滤过至透明即可。检验时, 取适量沉淀素血清, 装入小试管中, 斜持试管, 沿管壁加入抗原, 重迭于血清上, 经15~30min后, 如在两液接触面上有白环出现的为阳性反应。

诊断学体格检查实验 篇5

1、熟练掌握四大生命体征的测量方法。 2、掌握四大生命体征的正常值及记录方法。 二、检查用物：

口表、酒精棉球、秒表、汞柱式血压计、听诊器。 三、检查步骤： (一)体温(腋测法)：

擦干腋窝汗液，将体温表水银端放于腋窝顶部，用上臂将体温表紧紧夹住，测量10分钟后读数。正常值为36~37℃。

(二)脉搏：

将右手食指、中指和无名指的指腹置于动脉表面(通常用两侧桡动脉)，感知动脉管壁的起伏，以检查其速率、节律、大小、强弱及动脉壁的弹性等。正常人的脉搏，每分钟60~100次，节律整齐，强度相等，其速度和节律与心跳一致。 (三)呼吸：

被检查者置于坐位或仰卧位，观察胸壁和腹壁的起伏，一呼一吸算一次。正常人的呼吸节律均匀，深浅适宜，平静呼吸时，每分钟呼吸为16~20次。

(四)血压：

安静环境休息5~10分钟，取仰卧位或坐位，肘与心脏在同一水平。袖带下缘距肘弯横纹上2~3cm，触及动脉搏后将听诊器置于其上，需与皮肤密切接触，但不能压得太重，亦不可与袖带接触，更不可塞于袖带下。充气并听诊，待动脉搏动消失后再将汞柱升高2.6~4.0kPa(20~30mmHg),然后徐缓放气，汞柱下降2mm/秒为宜。从听诊器听到的第一个声音，压力表上的读数即为收缩压。在继续放气的过程中，声音突然变弱，性质突然变得低沉，继之消失;或音调不变，声音突然消失，此时压力表上的读数即为舒张压。 正常成年人收缩压为12.0~18.6kPa(90~140mmHg)，舒张压为8.0~12.0kPa(60~90mmHg)，脉压为4.0~5.3kPa(30~40mmHg)。 四、检查结果：

姓名 性别 年龄

检查日期 籍贯 住址

实验室诊断 篇6

【关键词】α-地中海贫血;实验室诊断;筛查法;基因诊断

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-030-2

地中海贫血(thalassaemias),是由于某类珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性贫血,但并不涉及血红蛋白结构的异常。是人类最常见的单基因遗传病。地中海贫血共有α、β、γ、δ等几种亚类。其中α-地中海贫血最为常见。α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血[1]。α-地中海贫血临床表现与α-珠蛋白链的合成减少的程度相关,轻症者可无临床症状或仅有轻微的血液学改变,中间型者为HbH病,有轻至中度贫血,肝脾肿大,黄疸等,重症者为血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征,胎儿常于妊娠晚期(30-40周)死亡或早产后数小时死亡。α-地中海贫血主要见于东南亚和地中海地区,美国黑人,印度次大陆亦相当常见。在我国则以南方地区多见,如广西、广东、四川、云南等地。因α-地中海贫血的高发病率及重症者新生儿死亡,故适当的针对α-地中海贫血的诊断具有重大的现实意义,本文就α-地中海贫血的实验室诊断技术综述如下:

目前实验室诊断技术主要有筛查法和基因诊断法两种[2]:

1筛查法筛查法师实验室诊断α-地中海贫血的基本方法,具有实验方法简便,造价低廉等特点。常见的筛查法包括:血常规测定和血红蛋白分析。

1.1血常规测定:血液常规检测(blood routine test)又称血液一般检测,包括红细胞,白细胞及血小板参数检测。是地中海贫血检测的第一步,地中海贫血的重要特征之一是小红细胞和低色素,因此重要的血液学指标是红细胞平均体积(MCV)及红细胞平均血红蛋白(MCH)。现今临床诊断中应用的地贫诊断MCV截断值为国际地贫协会推荐使用的地贫筛查诊断截断值,为MCV<79fl和MCH<27pg[3]。

1.2红细胞形态学检查。在良好的染色血涂片上,正常红细胞的大小形态较为一致,染色淡红色,中央着色较边缘浅。地中海贫血可在血涂片上见红细胞大小不均,异常红细胞,靶形、球形、椭圆形红细胞,多嗜色性红细胞等。可根据红细胞形态初步判断地中海贫血。如HbH病的靶形红细胞较多,红细胞碎片少见。

1.3红细胞渗透脆性试验。即测定红细胞处于不同浓度的低渗盐水溶液中,从开始溶血到完全溶血的界限,主要取决于红细胞表面积与其体积比。因地中海贫血的红细胞膜存在形态异常,故地中海贫血患者红细胞脆性降低[4]。一些医院使用红细胞脆性一管定量法进行α-地贫的筛查[5,6]。把平均红细胞体积(MCV)测定法与红细胞脆性一管法结合,对轻型地贫具有较好的筛查作用[4,7]。

1.4不稳定血红蛋白测定:(1)异丙醇沉淀试验,含不稳定血红蛋白的血标本在加入异丙醇后很快浑浊,并形成绒毛状沉淀。血红蛋白H可出现阳性特征。(2)热变性试验,根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性的特性,在50℃时对不稳定血红蛋白进行筛查。α-地中海贫血时沉淀量偏高。本法敏感性不高,但特异性较异丙醇试验高。(3)红细胞包涵体试验,不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。变性珠蛋白包涵体对诊断α-地中海贫血HbH病是一项简易、方便且特异性较高的方法,当HBH含量较少使血红蛋白电泳未见HbH区带时,而可检测包涵体为阳性。同时对α-地中海贫血1与α-地中海贫血2的诊断也有重要意义。

1.5血红蛋白分析:诊断地中海贫血中的各种血红蛋白,并对其进行定性、定量分析。(1)血红蛋白电泳,因各种血红蛋白均带电荷,其等点电均在7以下,故在PH8.5的缓冲液中各种血红蛋白均带负电荷,在电场的作用下都向阳极运动,不同的血红蛋白,其等电点不同,电泳速度不一,故可用电泳分离定性。应用醋酸纤维薄膜作为电泳固相支持物,还可对电泳分离出的不同血红蛋白进行定量分析。(2)毛细管电泳(CE),CE是一类以高压直流电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据式样中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离、分析的新型液相分离技术。有分析速度快,灵敏度高,分辨率高,重现性好,样本用量和试剂消耗少,自动化程度高等特点。但因CE仪器只能做单个样本分析,其平均速度不能同醋酸纤维薄膜电泳相比。(3)高效液相色谱(HPLC),现已用于定量分析血红蛋白A2及抗碱血红蛋白。(4)珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳,用尿素将血红蛋白解离成多肽链,通过聚丙烯酰胺电泳的电荷效应与分子筛效应,将各种肽链分离,形成不同的区带,当各种珠蛋白链的合成量或结构发生异常时,其珠蛋白链区带相互间的含量比例或电泳迁移率可出现与正常不同的改变,通过各区带间含量比例的测定,可了解各珠蛋白基因表达的信息,可检测出大部分的α-地中海贫血患者。

2基因诊断法随着分子生物学的发展,越来越多的证据表明,遗传病的发生不仅与DNA结构有关,而且与转录水平或翻译水平的变化相关。基因诊断的探测目的物至少包括DNA和mRNA。因为α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血,大部分α-地中海贫血是由于α-基因缺失所致。故可运用基因诊断法对α-基因进行检查。1983年Mullis建立PCR技术,多年来,这种技术在实际运用中发挥了重要的作用,为遗传病的诊断提供了更加可靠的依据[8-9]。

我国对地贫的基因诊断始于20世纪80年代初,先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFL P)连锁分析、寡核苷酸(A SO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段,特别是PCR及其相关发展技术,已成为最普遍的基因诊断方法。

2.1聚合酶链反应(PCR):PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下,催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。应用血红蛋白电泳检测对血红蛋白H病能进行较好的诊断,但对标准型和静止型的α-地贫不能进行有效诊断。以PCR为基础的诊断方法已应用于α-地贫的基因诊断[10,11],并经历了单重[12]、双重[13]至多重[14]几个阶段。

多重PCR它的特点是在一个PCR体系中包含4对等位基因特异引物。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果。在诊断各种缺失型α-地中海贫血时,相对于传统的Southern

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杂交技术,操作简单,周期短,不使用放射性核素,便于临床推广[15]。

多重PCR已广泛应用于实验室诊断,单管可同时对东南亚、左缺和右缺进行检测,特别是对静止型的α-地贫可进行有效检测。

2.2Southern印记杂交法:鉴别DNA靶分子的杂交称为Southern印记杂交,是指DNA与DNA的杂交,将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固相支持物上,然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。

2.3寡核苷酸(ASO)探针检测法:ASO探针灵敏度高,可以分析样品间的单个碱基变化,最早被用来做遗传性疾病特定突变的检测。本方法将待检DNA样品点在硝酸纤维素膜上,然后与特定的ASO探针杂交,以检测点突变或缺失引起的遗传性疾病。此技术的缺点是必须严格控制杂交条件,否则会出现假阳性或假阴性,另一缺点是成本高[17]。

2.4RFLP连锁分析法:因突变导致限制性内切酶酶切位点消失或形成,从而导致相应的DNA酶切片段的改变,这在群体中表现为限制性片段长度多态性(RFLP)。当探针跨越酶切位点时[16],可在突变点两侧设计引物,使PCR产物含有该突变序列,也可以通过改变引物序列使扩增产物中产生(或消失)酶切位点。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并电泳分离,从而检测地贫基因。

2.5基因芯片:根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型,与传统方法比较,基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上,采用荧光标记及引物延伸的方法,可提高检测结果的敏感性和特异性,由于基因芯片高通量特点,可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成,适用于大面积普查[18]。缺点是芯片造价成本较为高昂,还未能广泛使用于临床检验。

近年随着分子生物学和蛋白组学实验技术迅猛发展,α-地中海贫血的实验室诊断技术亦随之提高。大量的新技术,新方法被应用于α-地中海贫血的实验室诊断中。为做好实验室诊断,在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断、选择性流产等方面起到了重要作用。及早的防治地贫,直接关系到人民的健康。为使α-地中海贫血的诊断更方便、更快捷、更便宜,为提高地中海贫血诊断的准确性,减少误诊和漏诊,需要要已有的实验技术综合应用,开陈出新,尽力创造最为适合患者诊断的实验手段。

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猪瘟实验室诊断技术研究进展 篇7

1 病毒的分离与鉴定

猪瘟病毒的分离与鉴定是诊断该病最为经典可靠的方法。取疑似病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结等含毒量高的组织病料加双抗后磨成2%~10%乳剂, 离心取上清、过滤除菌后或采集早期发病猪全血样品 (用肝素或EDTA处理) 于-20℃冻存和37℃水浴融化后, 接毒于带细胞片的PK-l5或猪睾丸细胞培养, 37℃吸附1 h, 弃去接种液, 用MEM洗涤细胞, 然后加生长液培养;细胞不出现病变, 接种48~72 h后取出接毒后的细胞片, 用CSF免疫荧光抗体法或免疫酶染法检查, 可测出细胞培养中盖玻片上细胞浆内的病毒抗原, 亦可将分离的病毒回归到健康猪只体内出现猪瘟的典型症状可确诊。病毒分离鉴定方法特异性高, 是诊断CSFV最为可靠的方法, 但耗时较长, 成本高, 且病毒在传代过程中易发生变异, 不利于对病毒核酸序列的分析

2 血清学诊断方法

2.1 荧光抗体试验 (FAT)

猪瘟荧光抗体检测是一种灵敏而又特异的诊断方法, 是目前国内外实验室诊断猪瘟最常用的方法。许多国家和地区将冰冻组织切片或触片的直接荧光抗体试验作为执行消灭HC规划的法定诊断方法。可用FAT直接检测扁桃体、脾脏、肾脏和回肠远端冰冻切片中的抗原, 且发病早期扁桃体的检出率较高。也可将猪扁桃体和脾制成20 g/L的混合匀浆后接种无瘟病毒污染的猪源细胞 (如PK-15) , 24~72 h后进行飞片FAT试验, 检查细胞中是否存在CSFV。此种病毒分离诊断方法比冰冻组织切片更为敏感。

FAT可用于猪瘟病料和组织培养物的抗原检测, 也可用于培养细胞中猪瘟病毒的抗原检测。此试验的关键因素是利用高效价的特异性免疫血清、提取Ig G、荧光标记, 染色尽可能对FA高倍稀释, 以消除非特异性染色, 设置多种对照, 即已知阴性和阳性标本以及荧光抑制试验等, 以提高试验的准确率。戴爱玲利用荧光抗体技术对20头不同病程的可疑病猪病料样品进行检测, 14头被诊断为猪瘟抗原阳性。结果表明猪瘟荧光抗体染色技术在猪瘟病毒感染早期, 检出率较高, 不仅能检出强毒抗原, 还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪。它对猪瘟的早期诊断具有十分重要意义, 猪瘟的常规诊断需要4~5 d, 而该项技术可在半天之内作出判断, 既快速又客观、准确, 在规模化猪场临床上可得到很多广泛应用。

2.2 琼脂扩散试验 (AGP)

琼脂扩散试验是用来检测抗原或抗体的经典实验方法, Molnar建立了琼脂扩散沉淀法, 他提出可选用病猪脾、淋巴结做抗原, 将琼脂糖按1%浓度加入p H8.6硼酸盐缓冲液, 煮沸溶解, 倒入平皿中, 冷却后打孔、加样品, 同时设对照, 置湿盒内37℃孵育, 48 h后观察结果。琼扩试验操作简单、不需特殊仪器、费用低, 但特异性和敏感性差, 现在猪瘟的诊断一般不采用此方法。

2.3 间接血凝试验 (IHA)

IHA能够直观的测出抗体效价, 具有简便、快捷、易操作的特点, 可用于免疫抗体的监测, 利于基层使用, 但不能区分是否野毒感染。

2.3.1 正向间接血凝试验:

正向间接血凝试验是利用CSFV致敏红细胞, 将待检血清梯度稀释后进行抗原抗体反应, 根据红细胞的凝集判断结果。此法能够测出猪瘟抗体效价, 有简便易操作的特点, 可用于免疫抗体的监测。解天珍等用制备的猪瘟间接血凝红细胞抗原诊断液与兰州兽医研究所生产的标准诊断液对猪瘟血清进行检测, 符合率达91%。由于红细胞容易产生血凝现象, 制备诊断液必须排除红细胞处理不当而产生的血凝现象。另外, 病毒细胞培养物应有较高滴度, 必须通过高倍透析浓缩纯化来避免非特异抗原的影响。

2.3.2 反向间接血凝试验:

反向间接血凝试验则是用猪瘟免疫血清提取纯化Ig G, 致敏绵羊红细胞, 用其检测CS FV。此法能够检测组织病料如脾脏、淋巴结、扁桃体中的CSFV抗原, 但由于对组织病料处理方法有差异, 而且组织中的血细胞易造成干扰, 非特异性凝集使得结果判定困难, 因而现在已很少应用。

2.4 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA是检测抗体的主要免疫学方法, 也是检测猪群抗体水平的主要技术手段, 常用于规模化养猪场的检测。根据ELISA的基本原理发展出了间接ELISA、Dot-ELISA、微波快速ELISA、竞争ELISA以及抗原捕获ELISA。目前建立的多种ELISA方法用于猪瘟病毒抗体及抗原检测, 特别是抗体检测技术在血清学调查、流行病学研究、疫苗免疫效果评估及疫病预防控制中发挥重要作用。

间接ELISA是用CSFV已知抗原包板, 待检血清稀释后加入孔中, 反应后加入HRPO标记的葡萄球蛋白A (PPA) , 作用后加入底物显色, 酶标读数后判定结果。王海震等将猪瘟兔化弱毒株 (HCLV) E2基因插入p EI-32a原核表达载体中, 构建了重组质粒p ET-2e, 将其转化宿主菌BL21 (DE3) , 以IPTG进行诱导表达, 比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量, 确定其最佳表达条件, 使外源基因获得了较高水平的表达, 可达菌体蛋白总量的36.6%。并以此重组蛋白作为包被抗原建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测, 结果显示该方法具有较高的特异性和灵敏度, 同时克服了以往检测CSF抗体水平所用抗原为完整的病毒粒子, CSFV不易培养, 滴度低, 难于纯化等缺点。

Dot-ELISA与ELISA相同, 只不过将固相载体换为混合纤维素膜, 比ELISA法操作更为简便。邓何生等应用斑点酶联免疫吸附试验 (Dot-ELISA对四川某规模化猪场的43份免疫母猪的血清进行猪瘟病毒抗体水平检测, 阳性血清30头份, 阳性率达69.8%, 试验证实Dot-ELISA是一种操作简便、准确、快速的检测方法, 特别适应规模化猪场猪瘟抗体水平的监测。

吴耀妹等建立了一种微波快速ELISA, 操作程序与常规间接ELISA法相同, 不同的是微波ELISA法将温育反应置于微波炉中进行, 可使反应时间缩短至数分钟。张富强等基于单克隆抗体、抗原表位的特异性和噬菌体拟位的“放大效应”, 以单克隆抗体为包被抗体, 以噬菌体拟位为“竞争指示剂”, 以抗M13噬菌体主要蛋白p VⅢ的特异性抗体 (标记HRP) 为检测抗体, 建立竞争ELISA用于猪瘟病毒抗原检测, 结果表明所建立的竞争性ELISA比国际标准抗原捕捉ELISA更敏感, 所有试剂不包含任何猪瘟病毒成分, 没有感染性, 可作为猪瘟病毒抗原的常规检测方法。Shannon等报道抗原捕获ELISA (AC-ELISA) 能够检测2种不同CSFV株感染的病猪血液和组织中的抗体。中等毒力CSFV (Weybridge virus) 感染4~6 d后即可检测到存在于血液中和淋巴组织中的抗体, 而弱毒株 (New South Wales virus) 感染7~9 d后可检测到抗体。该方法具有不需进行组织培养、省时 (36 h可得到结果) 的特点, 适用于猪瘟的早期诊断。

2.5 免疫胶体金技术 (IGSS)

免疫胶体金技术以其灵敏度高、简便易行、价廉无毒、样品可较长期保存等优点得到了广泛的应用。该方法最大的特点是简单快速, 特异灵敏, 不需要辅助仪器和辅助试剂, 几分钟内就可用肉眼观察到试验结果, 并可长期保存试验结果。胶体金免疫层析技术现在己经成为最快速敏感的免疫学检测技术之一, 具有巨大的发展潜力和应用前景。其原理是利用胶体金的强吸附能力吸附猪瘟病毒抗体而将其标记, 用待检抗原样本与其结合后, 在标记处大量聚集, 可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点, 表明为阳性, 斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

孔繁德等[10]建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法, 检测试纸盒与猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒、新城疫和禽流感等阳性血清不发生交叉反应。将该法与Dot-ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较, 符合率达98.4%和98.9%。郑鸣等[11]用胶体金标记抗原, 运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好, 能区分强弱毒感染, 适合猪瘟的临床诊断。

2.6 血清中和试验

2.6.1 兔体中和试验:

将猪瘟病毒与待检血清中和后接种兔体, 观察体温变化曲线。当待检血清稀释度大于132时, 则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染;当待检血清稀释度小于1∶32时, 应当及时对猪群进行免疫接种。由于BVDV和CSFV同源性很高, 在血清学上有交叉反应, 因而血清要分别和CSFV、BVDV做中和试验, 如果抗体效价高, 则可能是感染CSFV, 但要明确区分CSFV、BVDV还需用单克隆抗体技术和核酸探针技术加以区别。

2.6.2 荧光抗体病毒中和试验 (FAVN) :

该法是目前最常用的血清中和试验方法。待检血清经56℃30 min灭活后做适当稀释, 与等体积的200TCID 50/0.1m L的病毒液混合2 h, 然后接入飞片上吸附1 h, 最后加入维持液孵育2 d以上。采用直接免疫荧光方法进行荧光观察, 并设立对照组。结果发现对照组有翠绿色光斑, 而试验组光斑消失[12]。其优点特异性强, 操作简便, 不足之处是仅能定性不能定量。

3 分子生物学方法

3.1 RT-PCR技术

PCR技术的建立带动了分子生物学的飞速发展, 应用RT-PCR技术成功测定多株CSFV的全基因序列, 为CSF的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。迄今为止各国学者利用RT-PCR反应扩增并测定CSFV基因c DNA片段序列, 用生软件分析毒株间的遗传进化关系, 追踪CSFV传播来源, 对CSF的防制和扑灭将起不可替代的作用。

乔军等[13]利用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录, 再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物 (272 bp) , 并且不会扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸, 其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法, 为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。Wirz等[14]据CSFV基因组的高保守区域序列合成引物, 进行RT-PCR, 与组织培养和免疫荧光染色方法进行了对比, 结果发现RT-PCR可更快地区分CSFV。杨利峰等[15]建立的猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法, 将RT-PCR方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合, 用地高辛标记RT-PCR产物, 再用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物, 进行免疫显色得出结果。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上。臧金灿等[16]将河南省25个猪场的191只疑似猪瘟发病猪的病料组织进行RT-PCR, 利用DNA star软件将扩增的SFV TK基因进行比较发现同源性均为97.3%, 证明为猪瘟病毒感染。与传统的实验室诊断方法相比, 此方法快速、简便、准确、可以在较短时间内完成大量样品的诊断, 在临床上可广泛应用。

RT-PCR作为检测CSFV的一种方法, 其特异性强、灵敏度高、重复性好, 操作也很简单, 整个过程在1d内即可完成, 能达到快速检测的目的, 并且适合于各种含毒材料的检测, 也可用于临床。此外, RT-PCR技术还可区别与猪瘟相关的病毒, 如BVDV以及能引起和猪瘟相似临床症状的猪病的病毒, 如亚洲猪瘟病毒、伪狂犬病病毒, 其灵敏度可达100%。

3.2 实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术, 以其快速、灵敏、特异等优点在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。赵建军等[17]应用Taq Man荧光定量RT-PCR对人工感染106TCID50猪瘟石门强毒的猪只的血液中猪瘟病毒RNA进行定量检测, 此方法可以在感染猪出现猪瘟临床症状前3~4 d内作出快速确诊, 此时猪瘟病毒在宿主体内呈低水平复制的潜伏感染, 通过病毒分离、免疫荧光试验、ELISA等诊断方法很难及时而准确地检测到。

3.3 环介导的反转录等温扩增技术

日本学者Notomi[18]博士于2000年建立了一种新颖的恒温核酸扩增方法, 即环介导的反转录-等温扩增技术 (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种引物, 利用链置换DNA聚合酶在65℃左右的恒温条件下扩增几十分钟, 即可扩增出靶序列。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。该方法操作简便, 用时短, 敏感性比普通PCR高, 适于基层和现场使用。Xing-Juan等[19]采用RT-LAMP技术区分猪瘟兔化弱毒株 (HCLV) 与CSFV, 该方法灵敏度高达5拷贝每个反应, 对72例疑似HCLV的病料进行诊断中, 与荧光实时定量PCR的符合率为94.4%。

3.4 核酸探针技术

核酸探针技术是以病毒基因组为模板, 在分子标记的基础上制备探针, 反转录生成c DNA后进行Southern-blot, 特异的核酸探针会在不同病毒基因组c D-NA上产生特异性条带, 核酸探针技术可对病毒RNA进行定量检测。核酸探针技术有特异性强, 准确可靠的优点, 可用于不同毒株的分离和鉴定, 但需要合成核酸探针, 诊断费用较高。

3.5 基因芯片检测技术

基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术, 在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中已经显示出其重要的理论意义和广泛的应用前景。基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形式排布在很小的载玻片等载体上, 通过与标记的样品进行杂交, 检测杂交信号的强弱进而判断样品中被检分子的数量。包被在固相载体上的核酸分子有序排列成微点阵。可用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析, 以及基因组的功能研究等。杨素等[20]分别用水疤性口炎病毒、口蹄疫病毒、CSFV等病毒的一段高度保守的基因片段构建质粒, 在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸, 经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交, 对杂交结果扫描检测, 可同时对上述几种动物传染病进行快速、准确的诊断, 此方法敏感性高, 特异性强, 适合于大批动物的检疫。

摘要：猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的急性、热性、高度接触性传染病, 可引起各种年龄猪发病。随着猪瘟兔化弱毒疫苗在全国范围内推广应用, 猪瘟在我国得到有效控制, 大规模的爆发流行基本停止, 但是猪瘟并未被扑灭, 近年来我国开始出现非典型猪瘟、温和型猪瘟、隐性猪瘟以及“带毒母猪综合征”现象。该病严重威胁着我国养猪业的发展, 给养猪业造成极大的经济损失。文章主要对CSFV的病原学方法、血清学方法和分子生物学方法等研究进展进行综述, 为猪瘟的确诊提供参考。

深部真菌感染的实验室诊断分析 篇8

1显微镜检查

显微镜检查是检查真菌感染最快速有效和廉价的方法, 包括直接镜检和染色后镜检 (革兰染色、墨汁染色、瑞氏染色等) , 主要是通过真菌形态学特征 (包括孢子、菌丝和假菌丝等) 对真菌进行初步鉴别。对临床标本直接涂片、镜检, 方法简便、快速, 但是阳性率较低, 阴性结果不能直接排除诊断, 大多数菌种都不能直接根据结果来确定。王凤玲等[3]对呼吸内科的286例呼吸系统感染疾病患者行痰涂片染色镜检直接检测真菌, 将检测结果与真菌培养法的检测结果进行比较, 结果显示镜检法真菌检出率略高于培养法的检出率, 但两种方法差异无统计学意义, 表明应用超高倍显微仪痰涂片检测真菌准确率较高, 是一种简便、快速诊断呼吸系统真菌感染的筛查方法。

2真菌培养

真菌培养作为传统的诊断深部真菌感染的方法, 是目前各实验室检测真菌感染的基本环节。各种镜检法的阳性率均低于培养法。它能明确引起感染的真菌种类名称, 并可用相应真菌进行药敏试验。但也有一定弊端, 培养结果要结合直接镜检的结果, 必要时应多次重复检查;对于某些危险度处于 1、2 类分级标准中的真菌还需注意安全防护;而且培养需要的时间相对较长[4], 一般需要48h, 有时需要72～96h;同时在肺部真菌感染的诊断中, 单纯根据痰液培养结果难以鉴别真菌是定植还是真正的真菌感染[5]。

3血清学检查

目前真菌感染的血清学试验主要包括抗原抗体检测及代谢产物检测两大类。研究显示[6], 血清学诊断念珠菌感染的特异性和敏感性可分别达93% 和80%, 且73% 的阳性结果可早于血培养2d, 有些病例甚至可早于血培养15d。

3.1抗原检测

近年来开展的真菌抗原检测, 作为一种非侵袭性诊断方法, 有着早期、快速、高灵敏度和特异度的优点, 先后被欧洲国家、美国及中国制定的侵袭性真菌感染诊断和治疗指南列为临床诊断侵袭性真菌感染的微生物学标准之一。理想的真菌感染的抗原性标记[7]不应该太短暂, 应该与感染相关而不是集群现象。它们应该在目标菌种内保守, 不与人类和其他微生物抗原发生交叉反应, 在抗真菌治疗开始前足够早出现。真菌感染血清抗原检查主要有半乳甘露聚糖、beta-葡聚糖、cond-Tec 抗原和烯醇化酶等抗原[8]。

3.1.1 血浆葡聚糖试验

葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中, 在真菌细胞的生长代谢过程中可自然脱落下来而进入循环;当真菌减少时[9], 机体免疫系统将其迅速清除, 而在浅部真菌感染时则无类似现象。Ostrosky-Zeichner等[10]对170名健康志愿者和163例确诊或可疑深部真菌感染患者进行了检测, 结果显示以≥60ng·L-1为阳性判定界值点, 其总敏感度为69. 9%, 特异度为87.1%。虽然具有较高的诊断敏感度和特异性, 但阳性率很低。葡聚糖检测只能提示有无真菌感染, 不能明确为何种真菌, 且会有一定数量的漏诊。

3.1.2 半乳甘露聚糖 (GM) 试验

GM是曲霉菌细胞壁上的一种多糖抗原。研究显示[11], 血清GM水平与组织的真菌负荷量成正比, 动态监测血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。2003年, 美国FDA完成对该实验的临床评价, 早期诊断优势突出, 并批准GM实验用于非免疫缺陷患儿侵袭性曲霉菌病 ( IA) 的辅助诊断。但也有文献报道在儿童, 尤其是小婴儿和新生儿的假阳性率则较高。目前公认的检测[12]GM抗原最佳方法是 ELISA 法, 用 ELISE法检测高危患者中GM曲霉抗原用于临床侵袭性曲菌的早期诊断在国外已被许可。

另外, 还有隐球菌荚膜多糖抗原的检测是目前临床上诊断隐球菌感染的最重要方法之一, 已被广泛应用;而由于甘露糖广泛存在于各种真菌细胞中, 导致该检测方法特异度较低, 限制了临床应用;烯醇化酶的抗原性较强, 在体内清除较快, 阳性率不如其抗体检测。

3.2抗体检测

少数引起深部感染的真菌, 其胞壁成分甘露聚糖及胞膜代谢产物阿拉伯糖可作为抗原产生相应抗体。孔晓祥等[13]通过实验研究表明, ELISA 法检测血清抗白念珠菌烯醇化酶抗体对诊断该菌深部感染有重要价值。

4分子生物学检测

随着分子生物学技术的发展, 包括 PCR 法在内的多种分子生物学技术开始应用于真菌病的诊断和研究, 其敏感性高、特异性强、重复性好、快捷方便等优点引起了广大学者的高度关注。但由于缺乏标准化和经过验证的商品化试剂, PCR技术尚未常规应用于临床标本的诊断。同时, 由于PCR强大的扩增能力与灵敏度, 极微量的污染即可能导致假阳性结果。真菌 DNA的提取方法有很多种[14], 如氯化苄法、蜗牛酶破壁法、液氮研磨法等。有学者[15]用多重PCR测定法鉴定口腔念珠菌属, 采用引物ITS1、ITS2、CA3和CA4进行检测, 结果能比培养法更准确检测出所有样本菌, 说明多重PCR是一种检测假丝酵母属的快速方法。Kanbe等[16]应用套式 PCR 检测侵袭性曲霉感染, 发现此方法特异性和敏感性均很高。

5其他检验方法

真菌病的病理学检查在临床上非常重要, 特别是在诊断深部真菌感染时意义尤为重大。它可根据镜下的形态作出初步的鉴定, 但确切的感染菌种还要依靠真菌培养。有些真菌[17]如瘢痕疙瘩样芽生菌、鼻孢子菌等不能培养生长, 只能依靠组织病理检查。但组织穿刺往往不易被患者接受, 且穿刺部位及所取组织量也会影响诊断结果, 临床开展受到一定的限制。席丽艳等[18]报导应用气相色谱-质谱选择离子法检测血浆中的 D/L 阿刺伯醇, 可以早期诊断系统性真菌感染。

登革热实验室诊断研究进展 篇9

1 登革热病原学检测

1.1 登革病毒分离

病毒分离培养是确证感染登革病毒的金标准, 不仅能确认病毒感染, 而且能区分不同的血清型。登革病毒必须在活细胞内存活, 可以通过感染活蚊、接种敏感细胞和动物进行分离培养。目前多采用胸腔接种白纹伊蚊或C6/36白纹伊蚊细胞和新生乳小白鼠 (1-3日龄) 分离登革病毒, 根据观察病毒对细胞或动物产生的变化 (病变等现象) , 应用间接免疫荧光试验检测病毒的存在和型别。从患者血液、组织一旦分离出登革病毒, 即可确诊感染和病毒型别。尽管活细胞培养分离病毒较最早的蚊体和鼠脑培养病毒方便很多, 但有研究证实其在实际操作中敏感性仅为40.5%[1]。因其对样本要求严格, 需要专业的操作人员和相关设备, 仅能用于病毒血症期的样本, 检测窗口期受限, 分离病毒耗时长, 难以在普通实验尤其是基层实验室进行, 达不到早期快速诊断的目的, 在临床检测中使用较少, 目前国内外实验室更多地采用分子生物学检测方法取代DV病毒分离。

1.2 登革病毒RNA检测及型别鉴定

近年来, 随着聚合酶链反应技术的广泛使用以及登革病毒基因组序列分析成功, 登革热检测技术已经从传统的病毒分离及血清学实验进入分子生物学检测阶段, 通过核酸检测扩增出特异性的病毒基因, 并可区分病毒血清型。登革病毒为单股正链RNA病毒, 研究证实在登革病毒感染10天内均可以做RT-PCR, 尤其是感染6天内检出率较好, 操作简单, 能进行分型, 适合于登革病毒的快速检测, 且RT-PCR比病毒分离具有更好的敏感度 (敏感性为48.4%~98.2%) , 针对同一病人不同样本进行检测, 全血检测敏感度为90.0%, 血清或血浆相对较低 (62.0%) [2,3]。现行的卫生行业标准中 (WS216-2008) 推荐使用RT-PCR技术检测登革病毒RNA及Tap Man探针实时荧光定量PCR检测。市场上均有商品化试剂盒, 操作简单易行。有研究通过比较两种检测方法, 认为Taq Man实时定量RT-PCR比常规RT-PCR敏感性提高了100倍, 达到了0.001TCID50/m L, 且检测时间至少节约了2小时, 认为Taq Man实时定量RT-PCR是一种灵敏、特异、快速、低污染的登革病毒RNA检测方法, 可定性或定量检测登革热患者早期血清中的登革病毒。虽然分子生物学检测存在标准化等问题, 相对病毒分离具有较高的敏感性和特异性, 且操作简单方便, 已经得到越来越多的认可[4]。

2 登革热血清学检测

2.1 针对抗原的检测

登革热发病5日后, 登革病毒随着发热消退而从血液中消失, 愈后不产生病毒携带现象, 这就决定了抗原检测在早期诊断中的作用。登革病毒的抗原检测中使用最广泛的是检测NS1蛋白。NS1蛋白为登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白, 其含有2个N-连接糖基的结合位点, 高度保守, 可以辅助病毒颗粒的装配和成熟, 是一种保护性蛋白[5]。有研究发现, 酶联免疫法检测NS1蛋白, 无论是初次感染还是二次感染, 在感染后9天内均可检测, 个别可以持续到18天[6]。Philippe Dussart等用bio-rad的ELISA试剂盒检测NS1蛋白, 敏感性为88.7%, 尤其对0-4天的样本敏感性到87.6%而MAC-ELISA Ig M抗体检出率仅8.6%[7], 认为NS1蛋白检测大大扩大的登革热可检测时效, 意义重大, 可以用做检测急性期登革病毒感染的一线方法[8]。Huang CH等采用Bio-Rad公司的NS1抗原检测试剂条对392个确诊病人急性期样本进行检测, 阳性检出率达68.37%, 同步采用PCR检测阳性率为71.94%, 通过比较认为登革病毒NS1抗原快速检测试剂条是登革热诊断的强有力方法, 进一步论证了急性期检测NS1蛋白的可行性[9]。

2.2 针对抗体的检测

抗体检测主要是针对Ig M抗体和Ig G抗体, 登革病毒Ig M抗体在感染后3-5天即可出现, 2周达到顶峰, 可持续2-3个月之久。尤其在初次感染者中Ig M抗体升高明显[8]。Ig G抗体在初次感染后10天可出现, 再次感染4天即可出现, 3W后达到峰值, 并可产生免疫记忆。在新发感染的病例中, Ig G抗体滴度往往≤1:180, 再感染的病例中, Ig G抗体可以迅速上升, 可达1:2 560, 并抑制Ig M抗体的滴度水平。检测Ig G抗体多采集急性期和恢复期双份血清, 如果恢复期血清比急性期血清Ig G抗体滴度有4倍以上升高, 即可确诊感染。单份血清检测一般表明其曾受过登革病毒感染, 通过双份血清检测Ig M抗体和Ig G抗体, 可以区分初次感染和再感染病例, 尤其在二次感染异型的登革热患者, 发生DHF和DSS的机率较大, 区分感染状态对临床治疗意义重大。目前国际上已经把采集急性期和恢复期双份血清进行Ig M抗体和Ig G抗体检测作为鉴别新发感染和再感染的新标准[10]有研究表明在初次感染后4个月, 大多都检测不到Ig M抗体和Ig G抗体, 二次感染者在感染后10个月, 仍能检测到高滴度Ig G存在[2]。具体检测方法主要有酶联免疫吸附法 (ELISA) 和乳胶层析法 (快速法) 。

2.2.1 ELISA法Ig M抗体和Ig G抗体检测

登革病毒Ig M抗体可以应用Ig M捕捉酶联免疫吸附试验 (Mac-ELISA) 或者应用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测登革病毒Ig M抗体。均是根据抗原抗体特异性结合的原理, 检测血清中的Ig M, 显色程度和特异性Ig M抗体含量呈正比。Ig M抗体阳性, 表示患者新近感染登革病毒, 适用于登革病毒早期诊断。有研究表明此法检测敏感性为61.5%~99.0%, 特异性可达79.9%~97.8%, 敏感性和特异性与样本采集时间直接相关[11]。Ig G抗体检测多应用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测登革病毒Ig G抗体或免疫荧光法 (FA/IFA) 检测双份血清Ig G抗体, 尤其以前者应用较多, 但其特异性相对较差, 且和其他黄病毒存在严重的交叉反应, 主要通过测定双份血清Ig G抗体水平, 进而区分新发感染和再感染[12]。2.2.2快速法检测Ig M抗体和Ig G抗体登革热的诊断及新发感染和再感染的区分对疾病的流行和病情发展意义重大, 免疫层析法操作简单方便, 可以同时检测Ig M抗体和Ig G抗体, 有助于区分初次感染和再感染, 是实验室检测登革热感染的重要方法。例如Panbio公司的快速法检测试剂, 可以同时检测Ig M抗体和Ig G抗体, 对Ig G抗体检测采用半定量方式, 只有在血清中Ig G抗体滴度≥1:2 560时才会显色呈阳性反应, 借此来区分二次感染。快速检测试剂条的使用, 大大提升了实验室尤其是基层实验室检测登革热的能力, 并能区分新发感染和二次感染对疾病的诊治及疫情估计意义重大[13]。相对于ELISA检测的繁琐步骤, 快速法检测能更加快捷及时。虽然普遍认为快速法检测敏感性 (20.5%~97.7%) 和特异性 (76.6%~90.6%) 较ELISA法均低[11], 但JoséRubens Costa Lima等用panbio试剂检测1 156份疑似登革热样本, 发现快速法的阳性检出率为40%, Ig M-ELISA法阳性检出率为42%, 认为两者无明显区别, 快速法是一种可靠的检测方法[12]。和其他检测方法一致, 分析层析法检测的敏感性和特异性检测中, 样本采集时间对结果影响重大, 不同公司试剂条原理相同, 敏感性、特异性略有不同。

2.2.3 血凝抑制实验

登革病毒具有血凝活性, p H和温度被控制在适当的条件下, 登革病毒能使鹅、鸡、鸽及绵羊红细胞发生凝集, 而在特异性抗体存在的情况下这种凝集现象能被抑制, 即血凝抑制 (HI) 试验。可以用来分类初次感染和再感染。初次感染后5-6天即可检测到抗体, 但滴度一般都小于1:640, 再感染当天即可检测到较高的抗体水平 (大于1:1 280) 。WHO曾把HI作为登革热的标准诊断方法, 但HI检测需要双份血清, 试剂和操作不易标准化, 不能确定病毒的血清型, 与其他B组虫媒病毒成员存在交叉反应, 缺乏特异性[10,14], 因此已经逐渐被Ig M抗体、g G抗体检测等快速诊断方法所取代。

2.2.4 中和试验

当人体感染登革病毒后, 血清中可产生保护性的中和抗体, 登革病毒与这种特异性抗体作用后, 能被特异性的中和, 进而抑制病毒的复制和繁殖, 使其失去感染能力。动物中和试验由于对试验条件的特殊要求, 一般的实验室很难做到, 所以更多的实验室采用的是组织培养中和试验和空斑减少中和试验。中和反应试验在血清学检测种具有较好的敏感性和特异性。但是该方法价格昂贵, 耗时长, 对操作人员要求高, 因此该试验的应用受到限制, 目前应用较少。

2.2.5 免疫斑点法 (DIBA)

斑点免疫于20世纪末开始应用于登革热病例检测, 研究表明, DIBA用于检测登革病毒Ig M抗体, 敏感性较高, 结果判读容易, 但和其他黄病毒属病毒及虫媒传染病之间存在严重交叉反应, 且操作复杂, 成本相对较高, 不适合用于初筛实验。而DIBA用于检测DV-Ig G抗体比HI及IFA具有更高的敏感性和特异性, 可作为登革病毒感染的确证实验[16,17,18]。

3 登革热实验室诊断分子靶标及检测方法的选择

登革病毒感染后, 体内各抗原抗体出现时间不同[19], 可以分为两个阶段, 根据不同阶段选择不同的检测靶标。第一阶段:感染早期即发热期和病毒血症期, 该阶段可进行病原学检测 (病毒分离和基因检测) 和NS1抗原检测。尤其是发病后5d内, 进行PCR和NS1检测效果肯定。目前有针对PCR检测已有成熟的商品化试剂盒, NS1蛋白检测可以采用酶联免疫法和乳胶层析法。第二阶段为热退后体内抗体出现期, Ig M抗体在发病5d后即可出现, 2周达到高峰, 可持续90天。Ig G抗体在初次感染者中出现晚于Ig M抗体, 一般与发病10天左右出现, 并将长期存在;再次感染中, Ig G抗体因免疫记忆可迅速出现, 急剧升高。根据各抗体出现时间, 采集急性期和恢复期双份血清进行综合判断, 对诊断意义重大。可以选择乳胶层析法 (快速法) 或酶联免疫法进行Ig M抗体和Ig G抗体检测, 市场上有比较成熟的商品化试剂盒可供选择。

4 不同方法的比较

登革热实验室诊断已经有数十年的发展历程, 目前可进行多种方法进行检测, 针对不同的条件和样本, 需要选择适合的方法。病毒分离、血凝抑制及中和试验, 由于操作复杂, 实验条件要求苛刻, 耗时长, 使用受限。PCR检测及抗原和抗体检测是目前使用广泛的方法。Start D.Blacksell等对3大试剂盒生产商的7种商品化登革热酶联免疫试剂盒进行了比较, 分别为SD公司和Panbio公司的NS1、MAC-Ig M、Ig G ELISA试剂盒以及Bio-Rad公司的NS1 ELISA试剂盒, 对239个登革热阳性病人急性期和恢复期双份血清共478份样本和98例阴性病例进行检测, 认为NS1蛋白抗原检测和Ig M抗体检测均可作为急性期检测方法, 通过比较不同检测方法, 各试剂的敏感性和特异性存在差异, 且对不同血清型的样本各试剂盒的阳性检出率不同, 如panbio公司的MAC-Ig M ELISA试剂盒, 对1型登革热阳性样本的检出率为91%, 而对4型登革热阳性样本的检出率相对较低为70%。无论是检测NS1抗原还是Ig M抗体, 单一的检测均存在缺陷, 而通过NS1和Ig M抗体联合应用则可以获得理想的敏感性和特异性检测。另外文章指出panbio的Ig G抗体检测采用半定量的方法可以达到区分新发感染和再感染的目的, 但单一的Ig G抗体检测对急性期病人的诊断价值不大[20]。Blacksell SD等通过对6种快速法登革热检测试剂进行对比后, 认为快速法检测尤其适合少量样本的快速检测, 采用抗原抗体检测组合的方式效果肯定, 如采用SD公司的NS1抗原和Ig M抗体双重检测, 敏感性和特异性可达到93%、89%[21]。Huang CH等采用Bio-Rad公司研制的NS1抗原检测试剂条对392个样本进行检测, NS1抗原检测试剂条的检出率为68.37%, 同时PCR的检出率为71.94%。认为早期样本 (0-3天) 检测中, PCR和NS1试剂条的双重检测敏感性高, 较晚期的样本 (4-8天) 采用ELISA法检测Ig M/Ig G抗体和NS1试剂条的组合方法效果理想, 可以达到90%以上的诊断[9]。赵珠英等比较了panbio胶体金与血凝抑制实验在Ig M和Ig G抗体上的检测, 结果认为HI检测Ig M抗体优于快速法, 而在Ig G抗体检测上两者无明显差异[22]。

实验室诊断 篇10

关键词：CSF,PRRS,FMD,抗体水平,抗体合格率

对养猪业而言, 猪瘟 (CSF) 、高致病性猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 与口蹄疫 (FMD) 是威胁最为严重的传染病, 也是国家强制规定的免疫生猪病种[1]。抗体水平监测是猪疫病防治工作中的一个关键环节, 对其体内抗体水平的监测能够对重大疫病免疫效果做出评估, 防止重大疫情的发生。本研究采用ELISA法对某规模猪场CSF、PRRS及FMD三种疫病的抗体水平进行了监测, 以期为猪群疫病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 免疫

该规模猪场对生猪进行了CSF、PRRS及FMD 3种重大动物疫病的强制免疫。使用疫苗为:CSF疫苗为猪瘟活疫苗, 由上海海利生物技术股份有限公司生产 (脾淋源) ;PRRS疫苗为高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗, 由上海海利生物技术股份有限公司生产;FMD疫苗为口蹄疫O型合成肽疫苗, 由中牧实业股份有限公司生产。

1.2 采集血样

2015 年10 月对猪场采集猪血液样本200 份, 血液采集过程中严格实施无菌操作, 避免血液样本受到污染, 将血液样本置于冷藏箱送至农产品安全检测中心进行实验室检测。

1.3 抗体检测方法[2]

采用ELISA法对CSF、PRRS及FMD三种疫病的抗体水平进行监测, CSF病毒抗体ELISA试剂盒、PRRS病毒抗体ELISA试剂盒及FMD病毒抗体ELISA试剂盒均由IDEXX公司生产。 ① 参照GB/T1665-2008 猪瘟诊断技术标准对CSF抗体水平进行监测, 合格: 抗体阳性; ② 参照GB/T18090-2008 猪繁殖与呼吸综合征诊断技术标准进行PRRS抗体水平监测, 合格:抗体阳性;③参照GB/T18935-2003 口蹄疫诊断技术标准对FMD抗体进行监测, 合格:抗体效价在25 及以上。

1.4 统计分析

计数资料采用百分率表示, 采用SPSS19.0分析, 计数资料采用X2检验, 显著水平 α =0.05。

2 结果

2.1 规模场3 种抗体合格率检测

由表1 结果可知, 该规模场CSF、PRRS、FMD病毒抗体合格率分别为78.5%、89.0%、89.5%, 达到农业部规定标准70%。

2.2 不同猪群3 种抗体合格率比较

对比种猪、仔猪与育肥猪的CSF、PRRS、FMD病毒抗体合格率, 结果发现3 种抗体合格率都以仔猪最低, 但三者合格率之间差异并无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

3 结论

当前, 猪病较为复杂, 免疫力较低, 因此做好规模猪场的免疫监测, 掌握猪群的整体免疫情况, 可为免疫程序的调整提供依据, 进而确保猪群拥有良好的免疫水平, 降低猪疫病的发病率[3]。采用ELISA法对规模猪场CSF、PRRS及FMD三种疫病的抗体水平进行监测, 可为疫病的防控提供科学的依据, 可对猪群整体免疫情况做出科学的评估, 制定并调整免疫程序, 当疫苗注射后抗体不达保护水平的生猪, 需要及时补种, 有效防止免疫失败的发生, 切断传染源。

参考文献

[1]曾瑛, 曾晓毛, 曾琥程.规模猪场疫病实验室诊断分析实例[J].当代畜牧, 2012, (1) :22-23.

[2]郁星星, 邢涛, 周光胜, 等.近三年上海浦东新区南汇新城CSF、FMD、PRRS抗体水平监测分析[J].畜牧与兽医, 2015, 47 (5) :114-116.

医学实验诊断学教学改进 篇11

关键词：临床实验 诊断教学 教学改革

中图分类号：G421文献标识码：A文章编号：1673-9795（2012）09（b）-0051-02

实验诊断学是诊断学的组成部分，是指医生医嘱通过临床实验室分析得到的信息，为预防、诊断、治疗疾病和预后评价所用的医学临床活动[1]。在现代医学中，实验诊断学的学习是一名合格医生必须经过的培训，如何在众多检测项目中选择快速、准确、经济、适用的项目是合格临床医生必须具备的基本技能。随着科学技术的迅速发展，先进的技术方法、管理理念迅速被应用于临床实验室，并对传统的实验诊断学教学产生了较大的冲击，我们教研室在“教育国际化”思想指导下，基于临床工作的实际和现代合格医生的要求，对实验诊断学教学进行了一系列改革尝试，并取得了较好的效果。

1 理顺学习目的

实验诊断学在诊断学中占有重要地位，是将临床本科生从基础医学引向临床医学的桥梁，是临床诊断的重要依据，是临床治疗的重要前提，并可为科学研究提供重要的资料。

实验诊断学教学目的在于使学员了解实验诊断学有关概念和内容，也包括国内外学科技术方面进展和前沿性的内容；进一步使学生强化实验诊断意识，增强实验诊断临床应用能力和分析问题内容，并初步具有从事临床实验研究的能力，从而成为本科生学科教学的目的和要求。根据此目的，我们结合当代临床检验技术飞速发展的特点，优化了部分教学内容，改革了教学方法，从而使我们的本科生教育和临床实践紧密结合，为以后学生走向临床开展医疗、科研工作打下坚实基础。

2 优化教学内容

2.1 扩展学生的知识结构

检验医学是一门实践性很强的学科，也是一门综合性的边缘科学，它涉及临床医学、基础医学、医学物理学、化学、生物学、管理学、经济学和经营学等多种学科的内容。因此我们在教学中，有意识的增加学生的知识范围，使他们能够深入了解基本检测项目原理、方法，增加对检测结果的正确认识，从而将这些实验数据和信息与临床资料进行综合分析。在血常规检查教学中，我们增加了流式细胞仪原理、方法，在微生物检验教学中，增加了分子生物学知识的复习，通过这些内容的增加，一方面增加了学生对检验医学新进展的认识；另一方面，也为他们将来临床工作中科研能力的培养奠定了基础。

2.2 增加临床检验发展趋势的分析

检验医学随着科技的发展，日新月异，往往是临床医学中最先享受科技发展带来的快速变革，因此，我们在教学中，增加了临床检验发展趋势的讲解，及时检验（POCT）就是其中之一。最近美国国家临床生化科学院（NACB）在其制定的“POCT循证文件”草案中，将POCT定义为：“在接近患者治疗处，由未接受临床实验室学科训练的临床人员或者患者（自我检测）进行的临床检验是在传统、核心或中心实验室以外进行的一切检验”。POCT是检验医学发展的新领域，作为临床检验一种新的检验手段，分析方法快速、简单，现场分析，减少了样品转送流程，缩短了报告时间，实现了个性化的[2]。但POCT也面临众多问题，如法律法规不健全、检测结果准确性等都是当前急需解决的问题，通过对学生的讲解，使他们对此有了一个清晰的认识，从而在以后行医过程中培养成对实验室结果进行综合分析的好习惯。

2.3 减少部分检验方法的讲授

新科技带来检验医学的快速发展，新的检验技术、方法、仪器不断出现，一些手工、旧的检验方法在大中型医院、甚至一些基层医院已经逐步被淘汰，因此，我们在教学中，减少了这部分检验方法的介绍。血常规是临床检验科最基本的检验项目之一，其经历了从手工到仪器，从半自动到全自动，从三分群血液细胞计数仪到五分类血液计数仪，从电阻抗法到多角度偏振光散射法的快速发展。在当前医院中，已经很少利用手工方法进行计数，我们在教学中减少手工计数方法的介绍，而增加了仪器基本原理的讲解，让学员初步了解我们现在大部分医院所采用的检测仪器。我们在讲解这部分内容时，强调了检验方法发展的连贯性，给学生一个全面的检验医学发展史，让他们体会到检验医学是一门快速发展的学科，也是一门将来可以大展宏图的学科，该学科往往站在医学发展的前沿，增加学员对检验医学的兴趣，使他们对临床医学有一个全面，客观的认识。

3 优化教学方法

3.1 增加实习见习机会

检验医学是一门实践性很强的学科，在以往的教学中，我们主要让学生通过实验室手工检测的方法了解检验流程，但随着科学技术在检验医学中的应用，使得教学内容与检验科实际情况严重脱节，因此，在教学中如何让学生更直观的体会到实验室检查流程，一直是我们教研室改革的重要内容之一。在本次教学改革中，我们增加了仪器操作技能的培训，专门给教研室配备了尿液分析仪、血常规检测仪、以及全自动生化仪，从而让学生了解了当代检验科检测的常用方法，增加了对检验科现代检验方法的感性认识，使学生在基本操作的基础上达到传统与全新概念的有效结合。同时我们增加了同学到检验科见习的机会，让他们有机会和检验科一线人员进行交流，对检验科有一个全面的、初步认识，为将来他们走上工作岗位后，更畅通地与检验人员交换意见，更好地为病人服务打下基础。

3.2 增加化验单分析教学

实验诊断学是在医生的医嘱下，临床实验室根据医嘱进行的一系列检查，当前国内的现状是，医生与实验室人员之间的交流主要是通过化验单来进行：医生通过化验单说明患者的基本情况、需要检查项目，而临床检验科则是根据这些信息和要求对患者留取的标本进行体外检测，然后通过化验单的形式返回给医生和患者，医生再通过全面系统综合分析后，判断患者健康状况及指导临床诊断、病情监测、疗效判断和预后评估等。因此，化验单是检验科医师和临床医生之间的纽带。一份完整的检验报告单应包括三方面的内容：一是医院名称、实验室名称、报告题目、就医者姓名、性别、出生日期（年龄）、病案号、科室、临床诊断、送检医师；二是标本编号、采集时间、种类检验项目及其检验结果、参考值和异常提示；三是送检时间、报告时间、操作者和审核者，发出检验报告时，应经2位检验医师检查审核，重要检测项目应经实验室负责人审核。在检验过程中，如发现溶血、脂血、黄疸等可能干扰结果准确性的因素，应在检验报告单的备注栏标明。对有疑问的结果，应复查并主动联系送检医师详细了解患者的具体病情，必要时重新采集标本检测。对急诊或危重患者，收取标本和发放检验报告时间应具体到[3]。通过在教学中，培养学生规范填写检查申请单，规范出具检查结果，综合全面分析结果等等，使学生对实验前、实验后质量控制有一个全面认识，为将来更好的利用好实验室诊断指标打下坚实基础。

3.3 提高学员的创新能力

实验室诊断学是一门实践性很强的学科，创新是时代的要求，医学事业的发展急需具有创新能力的[4]，医学创新人才的培养是21世纪高等医学教育的战略目标和重点，培养具有实践能力和创新能力的人才也是包括检验医学在内的医学教育成果的主要标志。因此，我们在教学中注重激发同学的创新能力。肿瘤标志物在肿瘤早期筛查、疗效评估、预后判断以及肿瘤治疗方案等方面被临床广泛应用，单独使用灵敏度都比较低，特别是用于早期诊断漏诊率较高。如何提高早期诊断率是目前国内外学者共同关注的问题，许多研究者尝试用多项指标组合以提高阳性诊断率，有人主张高危人群乳腺癌筛查用乳腺癌特异蛋白、TPS和C-erbB2，而对于病情监测和术后早期复发用CEA、CA15-3联合应用，我们在教学中，为了激发学生的创造性，让学生自己根据每个肿瘤标志物的特点，针对不同种类肿瘤进行组合，然后进行集体讨论，从而激发同学们学习兴趣，加强了他们提出问题和解决问题的[5]。

总的说来，实验诊断学教学是医疗系本科教育中重要组成部分，通过我们对教学改革的初步尝试，使学生能够在学习中紧跟现代临床检验技术发展步伐，熟悉当代临床实验室工作流程、激发同学创新思维，从而为将来他们走向临床奠定坚实的基础，更好地利用实验室诊断为患者服务，更为重要的是通过教改的实施，将学员从基础医学引向临床医学，以达到“面向世界”的要求。

参考文献

[1]陈文彬.潘祥林诊断学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2009.

[2]黄祥芬.即时检验（POCT）发展现状与应用[J].中外医学研究，2011，9（25）：154-156.

[3]赵洪波.临床检验分析质量控制的管理方法和措施[J].中国医药指南，2011，9（33）：231-232.

[4]曾照芳，向华，谢国明，等.以培养创新能力为主线实施《临床检验仪器学》精品课程建设[J].数理医药学杂志，2009，22（6）：737-739.

一起牛有机磷中毒的实验室诊断 篇12

1 发病情况

该牛场饲养80头牛全部为自繁自养, 所用饲料一直为麦秸和自配精料, 饮水来自该牛场的深井。该牛场牛于早晨7时突然发病, 浑身发抖、抽搐, 倒地死亡, 情况十分严重。该场动用紧急预案, 即上报各级政府相关部门, 省政府也高度关注该事件, 要求本中心快速拿出检验结果, 截止第二天8时, 已死亡49头牛。大批相同症状牛发生死亡后, 该场立即换料、换草、换饮水、清扫牛舍、消毒, 第三天再无死亡发生。

2 症状及病变

该场早中晚各投一次自配精料, 一种是油渣配玉米, 一种是玉米料, 其余时间投喂麦秸, 自由饮水, 控制活动。牛死前有轻微的角弓反张, 解剖心脏出血, 肝脏质地变脆, 瘤胃粘膜脱落, 小肠、大肠出血, 淋巴结、肾脏、肺脏、脾脏等无明显肉眼病变。病牛应用解磷定、硫代硫酸钠配合葡萄糖、维生素C等药物治疗效果不佳, 死牛均为育肥期的肉牛。

3 实验室检验

3.1 送检材料

牛脾脏一个, 肺1/3, 心脏1/3, 肌肉500 g, 肝脏1/3, 血液500 mL, 饮水500 mL, 干草5 kg, 精料 (油渣料) 1 kg, 饲料 (玉米) 1 kg 。

3.2 一般检查

主要查看精料、胃内容物、饮水。打开精料包装后发现有一股浓烈刺鼻的油渣昧, 胃内容物中也有该味及未反刍的油渣料, 饮水有一股浓烈的84消毒液的味儿, pH=6 (用试纸法测得) , 血液中pH=6.88 (酸度计测) 。

3.3 毒物分析

依据症状病变及实验室检验能力, 主要做了有机磷、有机氟、毒鼠药磷化锌、菜籽饼中的异硫氰酸丙烯酯等的定性检验。

3.3.1 有机磷定性检验:

分离与提取。将内脏剪碎混合取50 g捣碎, 并加入无水硫酸钠充分研磨, 成沙粒状, 盛到烧杯中, 用三氯甲烷浸提, 同法提取饮水、饲草、精料, 并在烧杯上做好标记, 浸提24 h后, 过滤取上清液。滤液于60℃水浴浓缩, 供检验用方法。

薄层层析法: ①薄层板的制备与活化:称取8 g硅胶G, 量取20 g纯净水, 在乳钵中研磨成均匀的糊状, 倒到5 cm×15 cm的干净玻璃板上, 两手侧面抓稳, 在振荡器上稍做振荡, 使之分布均匀, 室温干燥。随后将薄层板置于120℃恒温干燥箱中加热干燥活化1h即可。制好的薄层板置于干燥器中保存备用。 ②点样展开及显色:将各样残渣用95%乙醇溶解, 每样点20 μL到薄层析一端2 cm处, 间隔1 cm。一样一板, 每板均做阳性对照。挥干后上行法于展开缸中展开层析板。展开剂用苯∶丙酮 (9∶1) , 显色剂用0.1%氯化钯溶液。

结果:阳性对照在最前端呈黄色, Rf值为0.95。胃内容物呈黄绿色斑点, RF=0.818, 与农药1240 (Rf=0.821) 接近。脾、肺、肝混合样100℃烘烤30 min后, 出现橙黄色斑点, Rf=0.648, 与倍硫磷 (Rf=0.65) 接近。饮水呈淡黄色斑点, Rf=0.818, 同胃内容物检出结果一致, 而饲草、精料却无任何斑点, 故检验结果为有机磷定性检验阳性。

3.3.2有机氟定性检验:

分离与提取。将内脏剪碎混合取50 g捣碎, 并加入无水硫酸钠充分研磨, 成沙粒状, 盛到烧杯中, 用甲醇浸提, 同法提取饮水、饲草、精料, 并在烧杯上做好标记, 浸提24 h后, 过滤取上清液。滤液于56℃水浴浓缩, 供检验用。

薄层层析法: ①薄层板的制备与活化:与有机磷方法相同。 ②点样展开及显色:将各样残渣用95%乙醇溶解, 每样点20 μL 到薄层析端2 cm处, 间隔1 cm。一样一板, 每板均做阳性对照。挥干后上行法于展开缸中展开层析板。展开剂用氯仿∶乙醇 (5∶1) , 显色时先用自制氯气熏板10 min, 取出挥尽氯气后再用饱和碘化钾丙酮溶液喷, 最后喷0.1%淀粉溶液。

结果:阳性对照在中间呈蓝灰色, Rf值为0.67。胃内容物及脾、肺、肝混合样, 饮水, 饲草, 精料却无任何斑点。故检验结果为有机氟定性检验阴性。

3.4 菜籽饼中异硫氰酸丙烯酯定性检验

分离与提取。直接取精料、胃内容物放在烧杯里做好标记, 用不浸提2 h后, 过滤取上清液。滤液供检验用。

硝酸显色反应:异硫氰酸丙烯脂 (C3H5CNS) 与浓硝酸作用呈现红色反应。

精料浸出液取5 mL滴加3～4滴浓硝酸, 则迅速呈现明显的红色反应。结果判定为阳性反应。胃内溶物浸出液取5 mL滴加3～4滴浓硝酸, 亦迅速呈现明显的红色反应, 结果判定为阳性反应。

氢氧化铵显色反应。异硫氰酸丙烯脂与浓氨水作用, 呈现明显的黄色反应。精料浸出液取5 mL滴加3～4滴浓氨水, 亦迅速呈现明显的黄色反应。结果判定亦为阳性反应。

3.5 杀鼠药磷化锌的定性检验

3.5.1 锌的定性检验:

采用亚铁氰化钾反应。在微酸性溶液中, 锌与亚铁氰化钾反应生成白色亚铁氰化锌沉淀物, 亚铁氰化锌不溶于稀酸而溶于碱中。取胃内容物、精料纯水浸液, 酒石酸酸化后过滤, pH=3, 滤液无色, 加5%亚铁氰化钾溶液定性检锌, 结果未出现白色沉淀, 为阴性。

3.5.2 磷的定性检验:

采用硝酸银试纸法和溴化汞试纸法检磷。磷化锌在酸性条件下生成磷化氢, 磷化氢遇硝酸银生成黑色磷化银, 磷化氢和溴化汞作用生成黄红色的PH (HgBr) 2化合物。取胃内容物、精料纯水浸液于三角烧瓶中, 加水呈粥状, 瓶口上塞上软塞, 内装Y型玻璃管, 管下塞疏松的碱性醋酸铅棉花, 上面分别放入硝酸银试纸条和溴化汞试纸条, 然后于瓶中加入10%盐酸适量, 套黑色纸套, 在50℃水浴上加热30 min, 若有磷化物存在, 硝酸银试纸条变黑色, 溴化汞试纸条变黄红色 (或橙红色) 。结果两种试纸条均不变色, 表明结果为阴性。

4 分析与结论

经过紧张而严谨的操作, 通过一遍遍的试验, 根据实验结果及综合分析得出最后结论为牛有机磷中毒。

该养殖场发生大批量不明原因死亡时, 该场立刻换料, 换饲草、换饮水、清扫牛舍, 次日再无死牛情况发生, 说明该场内部管理混乱, 间接证实肉牛确实是中毒而死。

造成如此巨大的经济损失, 该场应从管理制度上真抓实干, 责任落实到人, 保证牛场的良性发展。精料中查出异硫氰酸丙烯酯说明了肉牛在解磷定治疗时疗效不好的可能原因之一。