纳米羟基灰石（共9篇）
纳米羟基灰石 篇1
随着科学技术的发展, 生物材料在口腔领域引起了人们的广泛关注, 羟基磷灰石因与生物体硬组织如骨、牙中的无机成份相似而具有良好的生物相容性, 已被广泛用于植骨和盖髓研究[1]。而纳米仿生材料的出现为盖髓剂的研究开拓了一个全新的领域。nHA-PA66作为新型纳米仿生材料的代表成为研究的热点, 它已通过前期实验表明具有较好的生物安全性、生物相容性和生物活性[2,3]其有机物和无机物的组成比例及力学性能与牙本质相似[4], 本实验通过对比纳米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石聚酰胺66作狗牙直接盖髓术的组织学反应, 为临床筛选理想的盖髓材料提供组织学依据。
1 材料和方法
1.1 主要材料
纳米羟磷灰石, 纳米羟磷灰石/聚酰胺66:购自四川国纳科技有限公司。纳米羟基磷灰石甲硝唑粉末, 按纳米羟基磷灰石:甲硝唑为100∶5 的比例称取。纳米羟基磷灰石/聚酰胺66甲硝唑粉末, 按纳米羟基磷灰石/聚酰胺66:甲硝唑为100∶5 的比例称取, 实验犬购自哈医大动物实验中心。
1.2 实验动物
杂种犬4只, 犬龄12～20个月, 体重15～18kg, 无牙体与牙周疾患, 恒牙完全萌出, 牙齿完好无缺损, 随机分两组, 每组2只杂种犬共84颗牙齿随机选取75颗牙齿用作实验牙。将75颗实验牙随机分为实验1组 (nHAM) 实验2组 (nHAPM) 和对照组 (CH) , 各组25颗牙。
1.3 实验步骤
(1) 实验狗用速眠新0.1mL/kg肌注麻醉麻醉实验动物后, 用酒精和碘伏消毒手术野, 用3%过氧化氢液清洗口腔。实验牙用棉球隔湿, 消毒高速手机喷水冷却下在实验牙的颊面或唇面距釉牙骨质界1mm处的釉质部位小心预备V 类洞, 窝洞四周均应有牙釉质, 范围不要超过近远中牙面, 洞型直径约为2mm, 洞深度达洞底某处近髓透红为止, 再用无菌锐利探针在透红处小心造成探针尖头大小的点状穿髓孔, 直径约0.5～1mm, 用无菌生理盐水冲洗, 消毒棉球止血, 干燥窝洞。分别用nHAM, nHAPM和CH盖髓, 玻璃离子充填。术中操作均在吸唾隔湿下进行, 以减少术区污染, 且所有备洞盖髓操作由一人完成以减少人为操作误差。 (2) 术后观察动物进食及日常活动无异常表现, 分别于术后7d、70d过量麻醉剂处死动物, 取出上下颌骨, 拔出实验牙。观察到牙齿有轻度磨耗, 大部分充填物未脱落, 无牙齿变色, 立即置于10%中性福尔马林液中固定。
1.4 组织学观察
10%中性福尔马林固定一周, 甲酸-甲醛脱钙、梯度酒精脱水, 常规石蜡包埋, 通过牙齿唇 (颊) 舌面沿牙长轴过露髓孔自冠部至根尖部连续切片, 切片厚度为5～10μm, 间隔取片, HE 染色, 光学显微镜下观察。评估炎症反应情况。
1.5 组织学评定标准
分级参照Josimeri Hebling标准[5], 0:无或少量炎症细胞在露髓处或为正常组织; 1:轻微炎症细胞浸润;2 :中等量的炎症细胞浸润;3:冠髓中有大量的炎症细胞浸润或有脓肿出现。
1.6 统计学处理
统计学分析采用卡方检验和秩和检验。
2 结果
盖髓后7d组和70d组牙髓炎症反应见表1、2。3种材料盖髓后7d时, 穿髓孔处和整个髓腔内均看到不同程度的炎症细胞浸润 (见表1) 。3种材料盖髓后70d时, 穿髓孔处和整个髓腔内炎症浸润较7d时有所下降 (见表2) 。
(i2=13.136, P<0.05) 可以认为三组间差异有统计学意义, 经组间比较两种材料与氢氧化钙比较, (i2=8.537, P<0.05, i2=12.667, P<0.05) 差异有统计学意义。可认为两种材料盖髓7d时产生的炎症反应明显小于氢氧化钙。实验组间两种材料相比 (i2=1.129, P>0.05) 两种材料盖髓7d时产生的炎症反应无显著性差异。
(i2=7.283, P<0.05) 三者之间差异有统计学意义, nHAM66与CH比较 (i2=4.353, P<0.05) , nHAPAM盖髓70d时产生的炎症反应明显小于CH, 差异有统计学意义, nHAM与CH比较 (i2=0.258, P>0.05) , nHAM与CH比较盖髓70d时产生的炎症反应无显著性差异。nHAPM与nHA比较 (i2=6.501, P<0.05) 两种材料之间有差异nHAPM盖髓70d时产生的炎症反应明显小于nHAM。
3 讨论
由于羟磷灰石本身没有抑菌/抗菌性, 而甲硝唑Metronidazole于1978年被WHO确定为抗厌氧感染的首选药物, 而龋坏性牙本质或牙菌斑中的优势菌属是厌氧菌[6]。所以本实验在羟基磷灰石中加人甲硝唑成份以增强疗效。传统观点认为羟磷灰石与蒸馏水或生理盐水调合后应用。后来改为用甲硝唑注射液代替蒸馏水或生理盐水调合。考虑到实验中的渗血与盖髓材料相混合成湿沙状可减少髓腔压力, 所以本实验用纳米羟磷灰石甲硝唑粉末直接盖髓。两种材料盖髓7d时产生的炎症反应明显小于氢氧化钙, 可能实验组盖髓剂的抗感染性能在早期高于氢氧化钙, 其抗菌性要优于氢氧化钙。而实验组间两种材料相比, 两种材料盖髓7d时产生的炎症反应无显著性差异。3种材料盖髓后70d时, 穿髓孔处和整个髓腔内炎症浸润较7天时有所下降, 对照组下降幅度最大, 可见随着时间的延长, 修复性牙本质的形成弥补了氢氧化钙制剂的缺陷, 增加了抗微渗漏的屏障, 因此70d时对照组术后炎症细胞浸润与实验1组无差异。纳米羟磷灰石/聚酰胺66其组成成分聚酰胺为使用较广的医用惰性有机材料, PA66的降解产物己二胺和己二酸在体内还可起到抗菌的作用。苏勤等[7]证实nHA-PA66在体外对穿髓孔有较好的机械封闭能力, 其作为盖髓剂较硬质氢氧化钙Dycal与牙髓界面的微渗漏更小。以致盖髓后70d实验2组盖髓70d时产生的炎症反应明显小于对照组。黄华等[8]对HAP复合盖髓剂的体外抑菌实验, 发现复合制剂抗菌性能明显优于HAP和氢氧化钙。甲硝唑加入nHA-PA66中既保持了纳米羟磷灰石复合材料的生物相容性和生物活性, 又利用了甲硝唑强抗菌作用, 从而使nHA-PA66更好地满足盖髓剂抗菌性能的要求, nHA-PA66作为盖髓剂其炎症细胞反应小于氢氧化钙和纳米羟基磷灰石, 是一种比纳米羟基磷灰石具有更好的发展前景的新型纳米仿生盖髓材料。
参考文献
[1]Jaber L, Mascres C, Donohue WB, et al.Reaction of the dental pulpto Hydroxyapatite[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1992, 73¨92
[2]严永刚, 李玉宝, 汪建新, 等.聚酰胺66/羟磷灰石复合材料的制备和性能研究[J].塑料工业, 2000, 28 (3) :38
[3]王学江, 汪建新, 李玉宝, 等.常压下纳米级羟基磷灰石针状晶体的合成[J].高技术通讯, 2000, 11 (6) :92
[4]Jonason AS, Baker SM, Sweasy JB.Interaction of DNA polymerasebeta with GRIP1 during meiosis[J].Chromosoma, 2001, 110 (6) :402-410
[5]Josimeri Hebling, Elisa Maris Aparecida Giro&Carlos Alberto deSouza Costa.Biocompatibility of an adhesive system applied to ex-posed human dental pulp[J].Journal of Endodontics, 1999, 25 (10) :676-682
[6]Hoshino E.Predominant obligate anaerobes in human carious dentin[J].J Dent Res, 1985, 64¨1195
[7]苏勤, 叶玲, 周学东, 等.聚酰胺/纳米羟磷灰石复合生物材料盖髓封闭性能的体外实验研究[J].华西医大学报, 2002, 33 (4) :561-562
[8]黄华, 彭彬, 陈智, 等.羟基磷灰石复合盖髓剂的体外抑菌实验[J].口腔医学纵横杂志, 1999, 15 (2) :117
纳米羟基灰石 篇2
关键词：医用钛合金；表面处理；羟基磷灰石；研究进展
引言
在生物医学中钛合金主要用于骨的替代和修复，其表面涂层或者说表面改性能改善钛合金的稳定性、生物相容性与生物诱导性。[1、2]
钛合金金属材料是一种生物惰性材料，虽然生物相容性没有问题，但是并不具有生物诱导性，没有表面处理的情况下，新生骨与其表面会有炎症反应。Hulshoff[3]等人指出，在植入人体的钛表面会出现组织纤维化。要使其与骨连接的时间长达6个月。
羟基磷灰石（HA）[Ca10（PO4）6（OH）2]的成分和结构都和天然骨的无机成分类似。用不同方法合成的羟基磷灰石其组分和结构还可以调节到不同的状态，使得羟基磷灰石作为植入物时，其表面与新生骨结合很好。羟基磷灰石（HA）、氟磷灰石（FA）、磷酸三钙（β-TCP）等，都属于这一类材料。
1.等离子喷涂法
等离子喷涂法是将羟基磷灰石高温熔化为等离子体，将此等离子体加速喷射到钛合金材料上。
实验发现，在6OO℃ ～800℃温度范围内进行热处理后，HA涂层表面裂纹或边缘处出现近纳米尺寸颗粒，是涂层中非晶结晶后的HA晶体.[4]
此方法应用较早，存在的问题主要是羟基磷灰石与钛的结合主要靠物理方式，并且由于在喷射中温度梯度造成的应力残余[5、6]，造成羟基磷灰石与钛的结合不够强。
2.仿生溶液制备HA
所谓仿生溶液法，就是将钛合金放入模拟体液中，钛合金在模拟体液中像自然界中的羟基磷灰石形成一样，在钛合金表面形成羟基磷灰石涂层。
Lenka Jon等人[7]研究得到：先进行碱溶液的处理，再放入模拟体液中，钛合金的涂层为含有碳酸根的羟基磷灰石。并且涂层在20天的浸泡后并不均匀。如果将钛合金先进行酸蚀，再进行碱液处理，之后放入模拟体液中能得到均匀的羟基磷灰石。
也可以用微弧氧化的方法先对钛合金进行处理，再放入到模拟体液中。比如Won-Hoon Song[8]等人就是这样做的。他们在1和1.5倍浓度的模拟体液中都进行了浸泡，获得了羟基磷灰石涂层。
研究者[9]发现：一些基团具有沉积过程的诱导作用，比如-PO4H2，-COOH，-CONH2，-OH 和-NH2。
3.溶胶凝胶（Sol-gel）法
溶胶凝胶法在制备涂层方面是一种比较成熟的方法，比如在电子工业中制备半导体薄膜等。所以研究者也把这种方法用于在钛合金基体上制备羟基磷灰石。用这种方法的优点在于，可以在制备涂层的时候加入一些其他的元素，并且能够有效的控制各种元素的含量。比如翁文劍等[10]用乙醇体系加入含氟元素的组分，获得了含有氟的羟基磷灰石。含有氟的羟基磷灰石在溶解度，热膨胀系数方面都具有更小的特性，但是生物活性降低。Kim[11]等做了类似的工作，所不同的是他们采用的乙醇体系的组分有所不同。
溶胶凝胶法虽然具有涂层组分可调节的优点，但是这种方法不适合于各种不同的钛合金表面形状。并且涂层的结合力也还不够强。
4.其他方法制备HA
除了以上提及的方法，制备羟基磷灰石的方法还有化学气相沉积、电子束沉积[12]、离子束溅射沉积[13]、脉冲激光沉积[14]等等。这些方法都有其各自的缺点，有些制备工艺复杂，有些结合力还不够好。
5.结论
羟基磷灰石作为一种无机物，具有很好的生物兼容性，但却不具有生物诱导性。为了提高其生物诱导性，研究者开发了多种制备方法以制备复合的涂层和其他涂层，但这些涂层的稳定性还没有得到确认。
参考文献：
[1]张玉梅；郭天文；李佐臣.钛及钛合金在口腔科应用的研究方向.[j]生物医学工程学杂志.2000（02）.
[2]刘敬肖；扬大智；王强伟.表面改性在生物医用材料研究中的应用.[j]-材料研究学报.2000（03）.
[3]Hulshoff G；K Von Dijk.Evaluation of plasma-spray and magnetron-sputter Ca-P-coated implants：An in vivo experiment using rabbits [J] Journal of Biomedical Materials Research，Vol.31，329-337（1996）
[4]吕宇鹏，李士同，朱瑞富等.等离子喷涂羟基磷灰石涂层的晶化及其结构特征.[J]无机化学学报.2002，8：844-848
[5]陈艳霞，翟雪松.界面形貌对涂层残余应力影响的数值模拟.[J]太原科技大学学报，2012，33（2）：137-140.
[6]Gasik M，Keski—Honkola A，Bilotsky Y，et a1.Development and optimisation of hydroxyapatite b-TCP functionally gradated biomaterial.[J] J Mech Behav Biomed Mater，2014，30：266-273.
[7]Lenka Jon，Frank A.Muller，Jakub Strnad etc，Biomimetic apatite formation on chemically treated titanium.Biomaterials 25（2004）1187-l194.
[8]Won-Hoon Song，Youn-Ki Jun，Yong Han，Seong-Hyeon Hong etc.Biomimetic apatite coatings on micro-arc oxidized titania.Biomaterials 25（20O4）334l-3349.
[9]Qing Liu，Jiang Ding，Francis K.Mante etc，The role of surface functional groups in calcium phosphate nucleation on titanium foil：a self-assembled monolayer technique.[J] Biomaterials.23（2002）3103—3l11.
[10]赵朝霞，翁文剑，曲海波.[J]材料科学与工程学报，2005，23（2）：226
[11]Kim H W，Kong Y M，Bae C.[J]Biomater，2004，25：2919
[12]Leea E J，et al.[J] Biomaterials，2005，26：3843
[13]Chen T S，Lacefield W R.[J] Mater Res，1994，9：1284
纳米羟基灰石 篇3
关键词：纳米羟基磷灰石,溶胶-凝胶法,氨基酸,结构,吸附机理
羟基磷灰石(HA)是人类骨骼和牙齿的主要无机成分,具有优良的生物相容性、生物活性和骨传导性,从羟基磷灰石的框架结构来看,可以认为骨是一种弹性高分子聚合物增韧的羟基磷灰石基复合材料。人工合成羟基磷灰石的成分,结构,与人体骨组织的无机质成分结构相类似,它具有无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变性和致癌性,是一种生物相容性材料,可与骨发生化学作用,有很好的骨传导性,因此可以广泛应用于生物硬组织的修复和替换材料,如口腔种植、牙脊骨增高、耳小骨替换、脊椎骨替换等,并较金属和聚合物有更好的效果[1,2,3,4]。继美国和日本20世纪70年代先后合成了轻基磷灰石材料后,国内也合成这种材料,并且相继应用于临床等方面,取得了一些结果,已成为牙和骨科材料的研究热点之一。如叶青[6]等研究了羟基磷灰石与血清蛋白相互作用,林英光[7]等研究了纳米羟基磷灰石的抗菌性能,结果表明,羟基磷灰石在动态下即在充分接触的情况下具有抑菌作用;文献[2,3,4,5]研究了羟基磷灰石对牛血清蛋白吸附特性和纳米羟基磷灰石/溶菌酶复合体的原位合成及酶活性等问题。
羟基磷灰石晶体属六方晶系、L6PC 对称型和P63/ m 空间群,其结构为六角柱体,与c 轴垂直的面是一个六边形,a,b 轴夹角120°,晶胞参数a0 =0.943～0.938 nm,c0 = 0.688～0.686nm,单位晶胞含有10 个Ca2+ ,6 个PO43- 和2 个OH-。其中OH-位于晶胞的4 个角上,10 个Ca2+ 分别占据2 种位置,4 个Ca2+占据Ca (Ⅰ) 位置,即z=0和z=1/2 位置各2 个,该位置处于6个
O 组成的Ca-O 八面体的中心。6 个Ca2+ 处于Ca (Ⅱ) 位置,即z=1/ 4 和z=3/ 4 位置各有3 个,位置处于3 个O 组成的三配位体中心。6 个PO43- 四配位体分别位于z=1/4和z=3/ 4 的平面上,这些PO43- 四面体的网络使得HAP 结构具有较好的稳定性。制备HAP粉末有许多方法,大致可分为湿法和干法。湿法包括沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、超声合成法、微乳液法及超声合成法等,干法为固相反应法等。溶胶-凝胶法是近些年才发展起来的制备羟基磷灰石的新方法,并引起广泛的关注。本工作应用溶胶-凝胶法制备羟基磷灰石材料,通过紫外分光光度法、X射线衍射(XRD)物相分析和X射线衍射谱(XPS)分析,研究了其组成及对氨基酸的吸附作用。
1 实验材料
实验中所用的化学试剂为磷酸氢二铵,硝酸钙, 尿素, 天冬氨酸,谷氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,溴化钾和无水乙醇。 所用的设备为磁力搅拌器,电子天平,烘箱,708型表高温硅碳棒炉,红外扫描仪,高速离心机和精密酸度仪。
2 实验过程和结果
2.1 羟基磷灰石粉体的合成
在合成粉体中先称取磷酸氢二铵6.6g(0.05mol),配制成150mL溶液,按摩尔比Ca/P=1.67称取硝酸钙19.72g(0.08352mol),配成溶液。在磁力搅拌器上,将硝酸钙溶液缓慢滴加到磷酸氢二铵溶液中(纺织大快胶粒形成)。熟化3h后,加入尿素,清除NO3-,并调节pH值至9,既保持碱性环境。反应后体系形成溶胶,陈化两天后形成白色果冻状凝胶。将凝胶放入微波炉中干燥10～20min,然后反复水洗,去除NH4NO3。在1100℃下烧制2h,即得纯的羟基磷灰石粉体。实验装置由恒温浴槽,搅拌器控制装置,半圆底铁架台,搅拌器, 精密酸度仪, 平底烧杯和反应溶液组成。
将制得的羟基磷灰石粉体放入不同氨基酸溶液中一定时间后,离心后取上清液作紫外分光分析,对粉体作X射线衍射(XRD)物相分析和X射线衍射谱分析,确定其成分。
2.2 羟基磷灰石吸附氨基酸的紫外分析
称取天冬氨酸, 天冬酰胺和谷氨酰胺晶体粉末约50mg,加水适量,振摇使溶解,并稀释成浓度约为0.25mg/mL的溶液。以水为空白,在400～190nm波长范围内的分别用203,196nm和203nm的紫外光对天冬氨酸, 天冬酰胺和谷氨酰胺等三种氨基酸扫描,结果如图1所示。从图1可知,天冬氨酸溶液有196nm 和 227.0nm 两个吸收峰,天冬氨酸溶液有199, 203nm 和 268.6nm 三个吸收峰, 天冬氨酸溶液有199,203nm 和 227.16nm 三个吸收峰。
然后,取25mg 的上述各氨基酸和谷氨酸置于100mL容量瓶中,用水适量溶解并稀释,摇匀,配成标准液。分别取标准液4,8,10,15mL置于不同试管中,加去离子水,配成 0.05,0.10,0.125,0.1875mg/mL各20mL。测定的紫外光的光密度(OD)值如表1所示。
用EXCEL软件作各氨基酸的标准曲线,于是能够求出其分别满足以下公式,天冬氨酸: Y=2.0251X+0.2326,天冬酰胺:Y=4.1141X+0.0105,谷氨酰胺:Y=3.9305X+0.0133,谷氨酸:Y=1.115X+0.0454。
(1)在0.1875mg/mL天冬氨酸溶液8mL中加25mgHAP,30min后离心,上清液的OD值为(重复3次)0.530, 0.529, 0.536, 平均值Y为0.532。 于是,从以上公式能够求出天冬氨酸的X=0.1478。则,羟基磷灰石粉体吸附天冬氨酸的值为:A=8×(0.1875-0.1478)×100/25=1.27mg/100mg。
(2)在0.1875mg/mL谷氨酰胺溶液8mL中加25mgHAP,30min后离心,上清液的OD值为(重复3次)0.638,0.651,0.637,平均值Y为0.642。 于是,从以上公式能够求出谷氨酰胺的X=0.160。则,羟基磷灰石粉体吸附谷氨酰胺的值为:A=8×(0.1875-0.1478)×100/25=1.27mg/100mg。
(3)在0.1875mg/mL天冬酰胺溶液8mL中加25mgHAP,30min后离心,上清液的OD值为(重复3次)0.737,0.734,0.735,平均值Y为0.735。 于是,从以上公式能够求出天冬酰胺的X=0.176。则,羟基磷灰石粉体吸附天冬酰胺的值为A=8×(0.1875-0.176)×100/25=0.368mg/100mg。
(4)在0.1875mg/mL谷氨酸溶液8mL中加25mgHAP,30min后离心,上清液的OD值为(重复3次)0.206,0.204,0.210,平均值Y为0.207。 于是,从以上公式能够求出谷氨酸的X=0.145。则,羟基磷灰石粉体吸附谷氨酸的值为:A=8×(0.1875-0.145)×100/25=1.36mg/100mg。
以上结果表明羟基磷灰石都能吸附氨基酸分子。
2.3 羟基磷灰石吸附氨基酸的X射线衍射(XRD)物相分析
将羟基磷灰石材料磨细粉体,各200mg分别加入到100mL去离子水和100mL谷氨酸饱和溶液中,室温下两天后过滤滤液和不溶物。用去离子水冲洗不溶物,反复6次以去除表面过量的谷氨酸,然后再将不溶物真空干燥1h,得到干燥的不溶成分,处理后测得的XRD如图2所示。从图2看出,与没有吸附氨基酸的样品比较,未吸附谷氨酸的线不尖锐,吸附谷氨酸后的羟基磷灰石的峰值变得更尖锐、更高,说明羟基磷灰石的晶化程度更高。同时发现一些峰值消失。
2.4 羟基磷灰石吸附氨基酸后的X射线衍射谱(XDS) 分析
将吸附有氨基酸的样品与没有吸附氨基酸的样品比较,并对峰值进行分析, 得出了如表2所示的羟基磷灰石包含的成分: 荷电物理位移(CPS), 峰的半宽(SF) 和含量百分比。计算出在100mg样品中,表面钙与磷的摩尔比为Ca/P= 21.14/24.45=0.865<1.67。这表明在羟基磷灰石粉体表面,PO43-是分布在表面外,Ca2+是在表面内。同时也得出每100mg羟基磷灰石表面吸附有1.90mg的谷氨酸,说明谷氨酸的主要结合在羟基磷灰石表面的PO43-位点上。
2.5 用MTT法检查纳米羟基磷灰石对细胞生长的影响
用浸提法制成羟基磷灰石粉末+含10%(质量分数,下同)的小牛血清RPMI1640培养液,在这个当中将羟基磷灰石与浸提的10%的小牛血清RPMI1640溶液以5,10mg/mL的比例在37℃恒温箱中浸提24h,得到所需要的培养液。对于单层传代稳定的成骨细胞MG63用0.25%胰蛋白酶进行消化,用细胞培养基将成骨细胞配制成10个/mL细胞悬液,分别注入于4块96孔内,每组8孔,每孔200L,置于含有5%(V/V)二氧化碳空气、37℃的培养箱内进行培养。培养液每三天更换一次。24h后,弃去原培养液,用PBS液洗涤2次后,每孔按实验分组进行换液,再把培养板放入原培养箱内继续培养,分别于1,3,5,7天后各取出一块培养板。在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并摄影,然后加入20L/孔MTT液,继续培养4h后,在倒置相差显微镜下观察结晶物的形成密度,摄影,吸除原液,再加入150L/孔二甲基亚砜,震荡10min,使结晶物充分溶解,在具有490nm波长的酶联免疫检测仪上测定其光吸收值。 公式如下:
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计算细胞相对增殖率P,并用它来评价羟基磷灰石(HA) 和羟基磷灰石+二氧化锆(HA+CrO2)纳米粉末对细胞生长的影响。所得的实验结果如表3所示。
从以上的结果得出,当纳米羟基磷灰石加入后,随时间的增加,其对细胞增长速率的影响较小。
3 结论
(1)采用紫外分光光度法分析得出羟基磷灰石对氨基酸有明显的吸附作用,其中对酸性最强的谷氨酸的吸附作用最强。并且通过XRD分析发现吸附了氨基酸后的羟基磷灰石晶形更加细化。利用XPS分析,在 2天后,可以检测到N元素的峰,并且根据实验测出的元素含量值,可以计算N元素占整个组成的1.9%。而且XPS的结果进一步显示PO43-是羟基磷灰石上氨基酸的主要结合位点。
(2)从分析烧结工艺和对羟基磷灰石吸附氨基酸的作用的基本机理得出,羟基磷灰石对氨基酸具有吸附作用的能力因氨基酸不同而不同,一般来说,酸性越强,吸附能力越强。实验中所用的四种氨基酸,其羟基磷灰石对谷氨酸的吸附能力最强。羟基磷灰石表面的钙磷摩尔比Ca/P=0.865<1.67。这表明在表面上P的含量明显多于内部,其表面氨基酸吸附量大于内体,再次说明PO43-是氨基酸主要的吸附位点。
(3)用MTT法检查羟基磷灰石纳米粉末对细胞生长的影响发现纳米羟基磷灰石对细胞增长速率的影响较小。
参考文献
[1]LIU Run-rong,MAO Xuan,YU Qi-cong,et al.Proeparation ofbioactive nanohydroxya-patite coating for artificial cornea[J].Current Applied Physics,2007,7(1):85-89.
[2]WU Zhen-jun,HE Li-ping,CHEN Zong-zhang.Fabrication andcharacterization of hydroxyapa-tite/Al2O3biocomposite coating totitanium[J].Trans Nonferrous Met Soc China,2006,16(3):259-266.
[3]CHAI C S,BEN-NISSAN B.Bioactive nanocrystalline sol-gelhydroxyapatite coatings[J].J Mat Sci Mat in Med,1999,10(4):465-469.
[4]于方丽,周永强,张卫珂,等.羟基磷灰石生物材料的研究现状、制备及发展前景[J].陶瓷,2006,23(2):6-11.
[5]BENNICK A,CANNON M,MADAPALLIMATTAM G.Thenature of the hydroxyapatite-binding site in salivary acidic proline-rich proteins[J].Biochem J,1979,183(1):115-126.
[6]叶青,胡仁,林种玉,等.羟基磷灰石与牛血清白蛋白相互作用的原位红外光谱研究[J].高等学校化学学报,2006,26(8):946-950.
纳米羟基灰石 篇4
关键词羟基磷灰石义眼座巩膜
羟基磷灰石义眼座的植入是眼球摘除术后矫正眼眶凹陷畸形目前最常用的、首选植入物，植入方法有两种比较常用，无包裹植入和自体巩膜包裹后植入，虽然后者理论上会增加义眼座的组织相溶性，但临床上发现巩膜自溶也会有一些并发症。在此，4年来收治眼球摘除+羟基磷灰石义眼座植入术患者27例，采用两种不同术式的临床资料分析报告如下。
资料与方法
2007～2010年收治因眼球破裂伤导致眼球摘除+羟基磷灰石义眼座Ⅰ期植入患者27例（27眼），隨机分为无包裹组17例（17眼），男15例，女2例，平均年龄32岁；另组为自体巩膜包裹组10例（10眼），男4例，女6例，平均年龄35岁，术后随访2年。均采用多孔羟基磷灰石义眼座，规格直径18～22cm，内孔径200μm和300μm。
手术方法：①眼球摘除术：常规术前准备，沿角巩膜剪开球结膜，分离暴露四条直肌，预置缝线，离断直肌，剪断上下斜肌和视神经，摘除眼球，压迫止血。②无包裹义眼座植入：长5号针在义眼座直肌附着点之间钻2条隧道，预留5-0不可吸收缝线。钝性分离扩大肌锥腔，用消毒塑料薄膜包住义眼座，利用薄膜的光滑面将义眼座放入肌锥腔内，抽出薄膜。四条直肌预置缝线与义眼座预留缝线交叉打结，使义眼座与直肌结合紧密，缝合球结膜筋膜层和球结膜层，结膜囊放置透明支撑塑料片，加压包扎。③自体巩膜包裹义眼座植入：将摘除眼球剪除角膜，纵向剪开，充分清除眼内容物，包裹义眼座，缝合巩膜，在四条直肌附着点处剪开巩膜开窗。同样钝性扩大肌锥腔，消毒塑料薄膜将包裹义眼座放入肌锥腔，四条直肌预留缝线缝合于巩膜窗上方，使直肌断端与义眼座直接接触，缝合筋膜层和球结膜层，结膜囊内放置透明支撑塑料片，加压包扎。
结果
术后反应：27例（27眼）术后均有眼部胀痛感和眼睑肿胀、球结膜水肿等表现，3～5天可逐渐好转。
并发症：无包裹义眼座植入组：1例患者术后结膜口裂开，暴露义眼座，再次进行结膜口清创修补后愈合良好。自体巩膜包裹义眼座组：3例术后发生巩膜自溶导致结膜囊裂开，义眼座暴露，多次修补伤口均愈合欠佳。其中2例多次修补无效后重新取出义眼座，祛除义眼座表面残存巩膜组织，义眼座高温消毒后以无包裹形式再次植入肌锥内，随访2年，伤口一直愈合良好。1例经削除义眼座前表面巩膜和义眼座前端磨平，充分分离结膜组织，无张力状态下缝合结膜囊伤口，愈后良好。术后效果：上述两组病例最终均成功安装义眼片，义眼座活动度良好，眼窝饱满，患者满意度99%。
讨论
眼球摘除术后既破坏患者的面貌，又给患者增添痛苦，羟基磷灰石义眼座的植入，既改善患者面貌，又从心理上安抚了患者，减少了眼球摘除带给患者的心理负担和痛苦。羟基磷灰石是由海洋珊瑚加工而成，它与人体骨骼中无机盐的成分极其相似，有良好的生物相溶性，其内多孔结构有利于新生血管和纤维组织长入，植入后能与眼眶内的组织融为一体，既能良好的固定在眼眶内，又能随眼外肌的收缩而运动，是目前眼眶填充治疗和整形的首选材料。
本文27例术眼术后眼窝饱满度及义眼座活动度均收效良好，患者满意度100%。羟基磷灰石义眼座植入术后最常见的并发症是结膜伤口裂开，义眼台暴露，国内外报道2.88%～28%。手术中，无包裹组1例（5%）术后结膜囊伤口裂开，义眼座暴露，考虑患者的营养状态较差所致，影响到伤口愈合。自体巩膜包裹组3例（30%），术后发生巩膜自溶导致结膜囊裂开，义眼座暴露，考虑为巩膜组织阻止软组织黏附植入物，不利于血管化，外加术后眶内渗血及组织水肿物的排出致结膜囊裂开，义眼座暴露。另外，新鲜的自体巩膜含有较多的生物活性物质，发生潜在感染和急性免疫排斥反应的几率增高，而且术式步骤增加，故认为无包裹羟基磷灰石义眼座术式优于自体巩膜包裹羟基磷灰石义眼座植入术式。
参考文献
1刘文斌，孙思勤，温跃春，等.改良羟基磷灰石义眼座植入104例观察.中国实用眼科杂志，2002，20（3）：234-235.
2董枫，李瑾，郑海华.羟基磷灰石眶内植入并发症原因分析.眼外伤职业眼病杂志，2004，26（1）：34-36.
纳米羟基灰石 篇5
近年来,生物材料纳米羟基磷灰石的应用研究比较热[1,2,3,4,5],其制备方法介绍甚多,但是各有利弊:有的仪器比较复杂且工序繁琐,有的原料特别标明自制[6,7,8],很难看到简单又实用的方法。另外成品价格高而且量又大,浪费不实用。本文将详细介绍一种实验室简单通用的制备纳米羟基磷灰石的方法,为普通实验条件下研究该材料性能及应用的打下基础。
1 实验过程
1.1 纳米羟基磷灰石的制备
选用分析纯Ca(OH)2;分析纯Ca(H2PO4)2·H2O;聚丙烯酸纳;量筒,锥形瓶或烧杯,酸式滴定管或200μl移液枪,磁力搅拌器,超声波清洗机,100℃左右的烤箱或热处理用的炉子,培养皿,500mL的空葡萄糖瓶,超净台,二氧化碳培养箱。
根据Ca(OH)2饱和溶液的溶解度估计,大概超出溶解度百分之二十的量溶解,然后放入冰箱4℃过夜,注意一定要密封Ca(OH)2饱和溶液,防止与空气中的CO2反应,第二天用吸管吸取上层澄清的饱和石灰水,宁少勿多,接着用移液枪或酸式滴定管滴定,HCl浓度为0.06mol/L,计算Ca(OH)2的量,然后根据化学反应方程式3Ca(H2PO4)2·H2O+7Ca(OH)2→Ca10(PO4)6(OH)2+15H2O,计算Ca(H2PO4)2·H2O的反应的量,再把Ca(H2PO4)2·H2O溶解到双蒸水或灭菌水中,尽量使Ca(H2PO4)2的浓度高,这样可得到足够的纳米羟基磷灰石。
溶液配置好后,把Ca(H2PO4)2溶液倒入锥形瓶中,饱和的Ca(OH)2溶液中按100mL加入80mg聚丙烯酸钠计算,然后放置Ca(H2PO4)2溶液的锥形瓶于磁力搅拌器上,磁力搅拌器的搅拌速度设置到最大或稍小点,室温下用移液枪或吸管在磁力搅拌器搅拌的过程中逐滴地加入加了聚丙烯酸纳的Ca(OH)2饱和溶液,加完后磁力搅拌50分钟左右后迅速用超声作用5～10分钟,然后每磁力搅拌50分钟后超声波作用5～10分钟,连续5次,就可获得稳定的纳米羟基磷灰石溶胶,记录溶胶的体积,计算出溶胶浓度,本文获得胶体浓度为6.4mmol/L,所得的纳米羟基磷灰石溶胶10mL离心管分装密封常温保存。
如果需要纳米羟基磷灰石粉末,把所得的溶胶取出20mL左右均匀倒入培养皿或其他容易烤干且洁净的容器中在100℃左右的烤箱烤干,用干净牙签刮下来存入1m L的Ep管即可供后续应用研究实验使用。
1.2 纳米羟基磷灰石的分析
通过X射线衍射(XRD)分析制备粉末,本实验采用岛津XRD-7000衍射仪,实验条件为Cu靶Kα,管电压30KV,管电流30mA,在10°～80°范围内进行扫描,步长为0.02’,测试结果与羟基磷灰石的标准图谱比较分析。
把胶体超声波作用30分钟,然后将HAP溶胶滴在带有碳膜的电镜用铜网上,待载液挥发后,透射电镜观察HAP纳米粒子的形貌、粒径及分散度。
把10mL纳米羟基磷灰石溶胶装入清洗干净的10mL的灭菌小玻璃瓶中,高压灭菌后分装到1mL Ep管中,方便后续做生物实验使用。本实验制备的胶体浓度为6.4mmol/L,用1640培养基稀释该纳米羟基磷灰石溶胶为0.8mmol/L后,与宫颈癌Hela细胞共培养24小时,与Hela细胞正常培养24小时及0.5mmol/L的紫杉醇与Hela细胞共培养24小时比较分析。
2 结果与讨论
2.1 X射线衍射(XRD)分析
X射线衍射(XRD)分析结果见图1。通过对比图1中制备粉体的XRD图谱与羟基磷灰石标准XRD图谱,可见制备出的粉体确实是羟基磷灰石。
2.2 透射电镜分析
透射电镜结果见图2。从图2中可以看出,纳米粒子形貌呈细针状,集成羽毛状均匀分布,长度约20～50nm,羽毛根部宽约20～30nm;纳米颗粒的电子衍射环均匀、无斑点,说明结晶细小[9]。
2.3 与Hela细胞的共培养
下面三张图片就是与Hela细胞共培养的结果。通过三幅图的对比:图3中细胞出现萎缩,形貌由图4的正常Hela细胞的透明的多边形状向膜内多粒的圆形改变,且培养基中出现了细胞碎片,而临床上常用的杀伤癌细胞的药物紫杉醇与宫颈癌Hela细胞的作用,从图5中明显看观察到细胞也明显变圆,但培养基中未出现细胞碎片,这点与0.8mmol/L纳米羟基磷灰石溶胶作用于癌细胞的结果可能不同。可见所制备纳米羟基磷灰石溶胶具有与紫杉醇相同的药物活性,可以在一定程度上杀伤Hela癌细胞,但低浓度的紫杉醇对正常细胞的杀伤力远大于纳米羟基磷灰石溶胶,但纳米羟基磷灰石颗粒与细胞有良好的相容性[10,10],而紫杉醇对病人的副作用更大,故考虑注射纳米羟基磷灰石溶胶治疗癌症也是临床上的新思路。
通过以上几种方法对制备的胶体和粉末的鉴定结果综合分析,确定本文制备的材料确实是纳米羟基磷灰石。目前研究结果表明:该材料可用于牙根管填充材料[11],骨重建材料[12]等等,希望这种简单实用的制备方法,可以为该材料的后续广泛应用研究打下基础,为临床治疗提供新的思路,为患者减轻经济负担。
3 结论
1)一种通用、简单实用的方法,成功地制备了尺寸20～50nm羟基磷灰石材料。
2)获得的纳米羟基磷灰石材料结晶细小。
3)制备的纳米羟基磷灰石对Hela癌细胞具有一定的杀伤力,而其与细胞有良好的相容性,为临床治疗提供新的思路,为后续研究该材料的应用解决了制备问题。
摘要：详细介绍了如何在普通的实验条件下获得纳米羟基磷灰石的方法。采用化学沉淀法以Ca(H2PO4)2.H2O和Ca(OH)2为原料,聚丙烯酸纳为稳定剂,磁力搅拌器搅拌并辅以超声波作用,通过X射线衍射、透射电镜及细胞共培养评价所制备的材料。结果成功地制备了羟基磷灰石纳米粒子,粒径20～50nm,形貌呈细针状,集成羽毛状均匀分布,羽毛根部宽约20～30nm;并且这些纳米粒子与细胞的共培养效果良好。
关键词：化学沉淀法,纳米羟基磷灰石,生物活性
参考文献
[1]Li J,Zuo Y,Cheng X,etal.Preparation and charcterization of nanonydroxyapatite/polyamide 66Composite GBR.membrance with asymmetric porousstructure.J Mater Sci.Mater.Med.2009:20(5):1031～1034
[2]Solchaga LA,Yoo JU,Lunderg M,etal.Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochdral defect.JOrthop Res.2000:18(5):773～775
[3]刘泉,莫安春,黄文.纳米羟基磷灰石颗粒与成骨细胞相容性的研究.实用临床医学.2007,8(11):4～7[3]Quan liu,AnChun Mo,Wen Huang.ExperimentalResearch on the Effect of Nano-Hydroxyapatite onOsteoblasts Functions.practical clinical medicine.2007,8(11):4～7
[4]张胜利,邓展生.大鼠脂肪干细胞复合纳米羟基磷灰石/胶原/L-聚乳酸体内成骨的研究.重庆医学,2010年6月第39卷12期,1533～1535[4]ShengLi Zhang,Zhan Ssheng Deng.Bone constructionwith adipose derived mesenchymal stem cells onnanohydroxyapatite/collagen/poly(L-lacticid)in vivo.chongqing medical journal.June 2010 Vol..39 No.12.1533～1535
[5]毛萱,吴佩珠等.用于骨靶向治疗的纳米羟基磷灰石溶胶的稳定性研究.中国临床康复.2004年8月15日第8卷第23期,第4709页[5]Xuan Mao,PeiZhu Wu,etal.Study on the stabilityof nano hydroxyapatite sol for targeting treatment.Chinese of Cliniical Rehabilitation,August 15 2004 Vol..8No.23.4709
[6]王海,王友法.影响纳米羟基磷灰石溶胶在水介质中分散性能的因素,山东陶瓷,2005年12月第28卷第6期,第9页[6]WANG hai,WANG youfa.A Study on the FactorsInfluencing Dispersity of Nano-HydroxyapatiteSol inAqueous Dispersion.SHANDONG CERAMICS Vol.28No16 Dec 2005.9
[7]张爱娟,溶胶-凝胶法制备纳米羟基磷灰石的研究进展,材料工程2006年增刊1,463～465[7]Zhang AiJuan.Study progress in preparation ofnano-hydroxyapatite about sol-gel method.materialsengineering.2006.s1:463～465
[8]江昕,韩颖超等,快速均匀沉淀法制备纳米级HAP粉末,硅酸盐通报2002年第1期,44～46[8]Jiang Qi,Han YingChao,etal.Nanosize HAP PowdersPrepared by Quick Homogeneous Precipitation Method.bulletin of the chinese ceramic society.2002.1:44～46
[9]郭连峰,张文光,王成焘,Ca10(PO4)6(OH)2纳米粉体的制备及TEM分析,电子显微学报,2004年6月第23卷第3期,236[9]Guo LianFeng,Zhang WenGuang,etal.Synthesis andTEM analysis of nanoparticle Ca10(PO4)6(OH)2 powders.journal of chinese electron microscopy society.June2004Vol.23 No 3:236
[10]吴苑,席永梅等,纳米羟基磷灰石颗粒对成骨前细胞的增值和分化的影响。浙江大学学报,2008年11月第35卷第6期.664～665
[10]马旭东,王健平,纳米复合羟基磷灰石(nHA)根管充填材料的应用基础研究,西南军医,2009年第三期,485～489
纳米羟基灰石 篇6
关键词：药物载体,纳米羟基磷灰石,表面吸附,孔结构,复合
0 前言
实现药物选择性地作用于病变部位,并按需精确控释或缓释,延长药物作用时间,在满足疗效的前提下减少投入剂量,从而减轻毒性反应,是医药界长期追求的目标。载体药物正是为实现这一目标而结合药剂学、材料科学和临床医学发展起来的一种新兴给药形式。
目前用于药物可控释放的材料多为有机高分子材料,利用有机高分子聚合物作为活性制剂的载体或介质制成缓控释制剂,从而实现活性制剂的可控释放。虽然有机高分子材料在可控释放方面的应用与研究已经取得了长足进展[1,2],但由于有机材料机械强度低、化学稳定性差、部分有机材料生物相容性不理想,甚至有一定的毒性,使其应用受到局限。如在骨疾病治疗过程中,有机载体材料无法兼有病灶填充和药物缓释的双重作用,相反,无机生物医用材料却有着独特的应用前景,其中,n-HAP作为药物载体的研究尤其受到广泛关注,已成为无机生物医用材料领域中的热点之一。本文拟对近几年来有关的研究现状进行评述分析。
1 纯n-HAP作为药物载体的研究现状
n-HAP作为骨疾病治疗用的药物载体具有以下优势:①与人体骨骼、牙齿成分相近,具有良好的生物相容性,无毒、无刺激、无免疫原性、不致过敏反应、不致突变、不致溶血、不破坏生物组织[3]。②具有独特的多孔结构,且作为纳米材料具有巨大的比表面积和高表面活性,能粘附和传递蛋白质、多肽类、免疫调节剂、疫苗等生物大分子药物,使药物从载体内部孔道缓慢释放,并通过改变孔隙率和孔径来控制释药速度。③化学稳定性很好,与许多药物都不起化学反应,可以作为多种药物的缓释载体。④本身还具有抗癌作用,使其在癌症治疗方面具有广阔的发展前景[4,5]。
1.1 n-HAP表面晶体化学结构及其对载药的影响
HAP的晶体结构见图1[6],其独特的表面晶体化学结构影响着它的载药性能。
由图1可知,HAP微晶表面具有3种可能的表面状态:(1)OH- 位于晶体表面时,OH- 与2个Ca (Ⅱ) 离子相连,当水溶液中存在HAP时,晶体表面OH- 位置至少在某一瞬间空缺,由于2个Ca (Ⅱ) 离子带正电荷形成了1个吸附位置,该位置能吸附PO43- 或大分子上的磷酸根基团或羧基基团,因此,可有效吸附含有磷酸根基团或羧基基团的大分子药物,如抗生素阿莫西林类药物、含有羧基基团的蛋白质类药物,而对没有特征基团的药物,如抗肿瘤药鬼臼毒素,则没有明显的吸附效果[6,7]。(2)Ca2+ 位于晶体表面时,由于Ca (Ⅰ) 与6个带负电荷的O原子相连,Ca (Ⅱ) 与3个带负电荷的O原子相连,当水溶液中存在HAP时,表面的Ca (Ⅰ) 位置在某一瞬间空缺,形成较强的吸附位置,能吸附Sr3+ 、K+ 等阳离子及蛋白质分子的氨基基团,而在Ca (Ⅱ) 位置则形成一个较弱的吸附位置。对于一些两性分子,如甘氨酸,不仅可通过NH43+与O原子形成氢键,还可以通过羧基基团与Ca2+形成静电吸附,使吸附更加牢固[8]。(3)PO43- 位于晶体表面时,蛋白质分子也可通过氢键与PO43-结合,且酸性越强,吸附性能越好,如在天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中,酸性最强的谷氨酸吸附性能最好[9]。
上述分析对n-HAP的表面状态同样适用,由此可见,n-HAP对某些特征基团分子具有特异性吸附作用,可用作一些有特殊基团的药物或大分子蛋白的载体。而且根据这一特性可知,通过改变n-HAP的表面结构可改变其对药物的吸附性能,途径如下。
(1)通过改变介质调节n-HAP的表面状态,进而影响其对药物的吸附。在介质中pH值相同的情况下,吸附作用是由吸附剂与蛋白分子之间的络合作用产生,见式(1)。
S(HA)-Ca2++Protein-COO- →
Protein-COO--Ca2+-S(HA) (1)
S(HA)-Ca2++PO43- →S(HA)-Ca-PO4- (2)
S(HA)-PO43-+Ca2+ →S(HA)-PO4--Ca (3)
加入PO43-抑制蛋白的吸附,PO43-与n-HAP表面的Ca2+发生络合,从而抑制蛋白质分子中COO-与Ca2+结合,见式(2)。加入Ca2+可促进蛋白的吸附,Ca2+与n-HAP表面的PO43-位点发生络合,相当于增加其表面Ca2+结合位点,从而使蛋白吸附量增加,见式(3)[10]。
(2)通过掺杂改变n-HAP的表面状态,进而影响其对药物的吸附。Si-HAP具有比纯HAP更好的吸附优势。一方面,由第一种表面状态可知,2个Ca (Ⅱ)吸附位的产生是由于HAP表面OH-的空缺,而SiO44-取代PO43-后,可造成OH-进一步流失,使与之相连的Ca2+空余的成键能力增强;另一方面,蛋白质的氨基通过氢键与SiO44-的结合能力比与PO43-的强,导致Si-HAP吸附蛋白质的能力较HAP增强[11]。Zn-HAP或Mg-HAP吸附量较HAP的大,Zn、Mg离子半径分别为0.74Å和0.72Å,Ca离子半径为0.99Å,用Zn、Mg取代Ca后,会使晶格变形,a轴键减短,c轴键变长,c轴方向键松弛,结晶度降低。蛋白质类药物的吸附是由于COO-与Ca2+的静电相互作用,因而c轴键增长加剧了静电作用,使吸附量增大[12]。在偏酸性条件下,Sr-HAP也可使蛋白质(BSA)的吸附量增大,但在碱性条件下吸附量减小[13]。同时,掺Sr可以产生蓝色荧光,吸附药物后荧光强度下降,随着药物的释放荧光强度逐渐增强,可用来监控药物的释放[14]。
(3)通过表面修饰大分子物质改变n-HAP的表面状态,进而影响其对药物的吸附。n-HAP可吸附的蛋白质为酸性蛋白,通过表面修饰巯基丁二酸后,可负载碱性蛋白质,如BMP[15]。
1.2 n-HAP的孔结构对载药的影响
n-HAP具有天然的孔道结构所形成的微孔,使其适用于药物载体。现今制备使用的n-HAP药物载体有两类:一类是未对其孔结构进行控制的n-HAP粉体,呈不规则或棒状晶体,所形成的孔道较少,药物多吸附于外表面,因而吸附效果不理想(见图2(a))[16],但优点是制备方法简便,使用传统的水热法[17]、沉淀法[18]、溶胶-凝胶法[19]、乳液法[20]即可制备;另一类是对其微孔结构和颗粒形状进行控制,形成特定孔结构或颗粒形状的载药颗粒,颗粒形状有棒状、球状,孔的结构有介孔、花状、中空孔,药物可吸附于孔内部,增强载药性能和缓释性能,见图2(b)[16]。
n-HAP晶体的存在形式为六角形晶体,如图3[21] 所示,无其它控制条件时,Ca2+易在c面(带负电)沉淀,形成新核,生长,最终得到棒状或带状HAP[22],要想获得球状颗粒则需要采用其它方法。
(1) 加入添加剂控制n-HAP的生长方向
在制备过程中加入添加剂可增强晶体a、b面(带正电)的生长,抑制c面的生长。如加入PSS(聚苯乙烯磺酸盐),PSS在水溶液中可完全电离,呈负电,易吸附正离子或连接到正电表面。在HAP的生长过程中PSS有两个作用[22]:其一,可吸附溶液中的Ca2+,使溶液中的Ca2+浓度下降,从而减缓c面的生长;其二,PSS与Ca2+形成配合物PSS-Ca,且可吸附到呈正电的a、b面上,将Ca2+有效传递到成核位促进晶体生长。低浓度PSS时,HPA类纤维束状,随着浓度的升高,PSS的吸附作用、Ca2+传递作用明显,可得到花状微球。
(2) 制备模板控制n-HAP的形状及孔结构
可采用聚合物为模板,制备球形或者是棒状的n-HAP。现今多采用水溶性高分子PEO-PPO-PEO(P123,聚丙二醇与环氧乙烷的三嵌段共聚物)作为模板。在水溶液中,P123低于15℃时为球状颗粒,温度稍微升高,转变为椭圆形或棒状[13],此时亲水基在外,亲油基在内。加入Ca2+与有机酸盐螯合形成前驱体溶液,其上的OH通过氢键连接在模板的亲水基上,提供成核位,再加入K2HPO4,即反应生成HAP,最终可得到介孔纳米微球或纳米棒,见图4[23]。将此方法改进,以P123为核,Tween-60为壳,可得到中空纳米微球;再添加柠檬酸作为助表面活性剂,使中空n-HAP颗粒的形貌从纳米球转变为纳米管,见图5[24];然后加入阳离子电介质,可形成由pH控制的智能释药系统。离子化柠檬酸附着在纳米管的开口处,呈负电。封装时pH值为7.4,PDAD(阳离子电介质)与离子化柠檬酸结合,阻止药物释放;释药时,pH值为5.4,柠檬酸质子化,PDAD不再与其结合,实现药物释放[24]。
在溶液中构建CO2气泡作为模板[25,26],制备花状多孔的碳酸化n-HAP(n-CHAP)微球。加入螯合物离子(Na2EDTA、Na3CA),通过调节螯合物离子浓度和溶液的表面张力来控制孔径,螯合物离子浓度升高,表面张力升高,这些都可使孔径减小。其自组装过程及机理为:CO2气泡聚集形成稳定球状泡沫,螯合物离子吸附在气泡表面,溶液中的Ca2+通过螯合离子导向性吸附在气泡表面;HAP在普拉特奥边界区(Plateau border 3个气泡的交界区)形核,气泡上吸附的Ca2+导向性向这一区域释放,使得在气泡之间取向性地自组装形成n-CHAP薄片;这些薄片相互连接形成孔结构,最终形成介孔微球,如图6[27]所示。
(3) 浸泡碳酸钙或玻璃微球得到n-HAP微球
使用缓冲溶液直接浸泡碳酸钙微球CCMs或玻璃微球制备n-HAP微球的研究已有很多[28],但制备出的微球其孔结构不规则,影响载药性能。而使用新的方法——乳液体系浸泡可得到可控介孔n-HAP微球(MHAMs)。如用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)/Na2HPO4/环己烷/正丁醇乳液体系浸泡CCMs。制备过程中,CTAB在微乳液中形成微反应器,附着在CCMs微球上;CaCO3分解,CCMs表面Ca2+浓度增加;CTAB亲水基通过静电引力吸收PO43-和HPO42-,增加了CCMs-CTAB界面的相对过饱和度。随着反应时间的延长,CCMs逐渐转变为磷灰石层,CCMs-CTAB界面被CCMs-磷灰石、磷灰石-CTAB界面取代,而后羟基磷灰石易在CCMs-磷灰石界面非均质形核。初生纳米晶粒聚集形成孔,其孔径为3.9～9.0nm,较小的孔由纳米颗粒直接聚集形成,不随反应时间产生明显改变;大的中孔由CTAB微反应器形成,而CTAB微反应器不稳定,随反应时间的延长,从6h到1d,孔径由9nm降为7.4nm,反应3～5d后大的孔几乎消失。最终得到表面花状的介孔微球[29]。
2 n-HAP复合物作为药物载体的研究现状
n-HAP因其比表面积大,具有较高的载药量,但用作药物载体时,由于所载药物前期往往有明显的突释现象,且难以形成长时间、平稳有效的药物浓度,使其应用受到一定限制[30]。而高分子材料,如PHBV、PEG,有良好的组织相容性,可降解,具有弹性,通过改变多聚物的亲水性和晶体结构,可很好地控制药物的缓释[31]。因此,将二者结合起来制成纳米复合释药系统已经成为一个研究热点。其复合类型分为两类:
(1) 弥散型。这一类复合载药微球中,n-HAP载药颗粒分散地分布在高分子微球中。制备方法按过程可分为单相微乳液法(SM)和双相微乳液法(DM),按载药的先后可分为In-situ法和Ex-situ法。SM法一般采用水包油体系(O/W),如以已载药的n-HAP颗粒和PLGA的二氯甲烷为油相O,以聚乙烯醇水溶液作为水相W,混合后得到S/O/W微乳体系,见图7(a)[32]。该方法中,将药物在制备之前就负载于n-HAP颗粒上,是一种Ex-situ制备方法。DM法一般采用W/O/W体系,制备过程中将药物分散于水相,使其在制备过程中负载于n-HAP上,是一种In-situ制备方法。而n-HAP颗粒既可以分散于油相,也可以分散于水相:n-HAP分散于油相的方式,如将药物溶于水中作为水相W1,以分散有PLGA、HAP的二氯甲烷为油相O,将二者混合得到一次油包水(W1/O)微乳液体系,而后以聚乙烯醇水溶液为水相W2,与W1/O混合得到二次W1/O/W2微乳体系,见图7(b)[32];n-HAP分散于水相,与分散于油相不同,使用分散有药物和n-HAP颗粒的缓冲液作为水相W1,后续过程与上述分散于水相的方法相同,见图7(c)[33]。从载药能力来看,SM(Ex-situ)方法的载药能力最强[34],而对DM方法来说,将n-HAP分散于油相时,由于PLGA的阻碍作用药物不易吸附到其上,约有70%的药物都未能与n-HAP螯合,产生了大量流失,载药能力最弱[32]。
(2) 核壳型。这一类复合载药微球中,将已载药的n-HAP微球作为核,在外部包覆上高分子壳。一般的制备方法为层层自组装法(LBL),如将制备好的已载药n-HAP交替浸泡于PAH(聚聚烯丙基胺盐酸盐)、PSS(聚苯乙烯磺酸钠)中,使其自组装形成PAH、PSS交替的4层高分子膜,见图8[22]。
这两类复合微球与单纯n-HAP微球相比都可以有效降低前期的药物突释,还可延长药物的缓释时间,控制药物稳定释放。n-HAP微球前期的突释现象是由于吸附在微球表面的药物快速解吸引起的,而在复合微球中,n-HAP不直接与释药介质相接触,其表面所吸附药物的释放要经过高分子层,从而降低了突释。药物从载药材料中的释放是受扩散机制、溶蚀机制和溶胀机制控制的,要想延长药物的缓释时间,控制药物稳定释放,就要增长药物释放的通道长度,减缓药物载体的溶胀、溶蚀[35,36,37]。在复合微球中,高分子为链状缠绕于n-HAP颗粒周围,形成迂回通道,增长了药物释放到介质中所需的路程[38,39]。复合微球也可减缓溶蚀,如高分子PLGA的降解产物是酸性的,而n-HAP在碱性介质中易溶解,两者相互作用,降低了溶蚀速率[33]。同时,n-HAP在复合微球中能起到无机交联剂的作用,使高分子的结合更为紧密,限制了高分子链的移动,降低了溶胀率。这些都有利于药物的稳定缓释[39]。
3 结语
综上所述,n-HAP作为药物载体,其载药特性主要来源于其特殊的表面晶体化学结构和多样性的孔结构。n-HAP表面不同的吸附位点可吸附含有不同基团的药物,通过对介质的调节或掺杂,可调节表面吸附位点,进而控制其对药物的选择性吸附。此外,具有特殊形状和孔结构的n-HAP颗粒有利于药物吸附量的控制,具有良好的应用前景。但纯n-HAP药物载体在应用方面有一定的缺陷,如产生突释现象,而使用高分子材料对其药物缓释性进行调节已成为一个新的研究热点。目前的复合微球主要有两类,核壳型及弥散型。根据药物缓释机理,在复合微球中n-HAP和高分子相互作用共同提高药物的缓释性能。
纳米羟基灰石 篇7
漆酶(laccase)又称苯二醇:氧氧化还原酶(EC1.10.3.2),是一种含铜的多酚氧化酶,它能催化一系列有机和无机化合物发生一个电子氧化,同时伴随有氧还原成水[6]。漆酶在生物合成,造纸工业,有毒化合物的生物消除及生物检测等方面的科研和工业生产中有广泛的应用[7]。但是,因为环境条件变化而导致漆酶在使用过程中变性失活,特别是游离酶与反应产物混合在一起,难以实现重复利用等都限制了漆酶制剂的产业化应用。因此,改善漆酶稳定性,并使酶制剂重复连续使用显得尤为重要。
酶固定化技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段。近年来,国际上对真菌漆酶的固定化进行了较深入研究,国外这方面的研究主要是利用环氧活化的载体[8]多孔玻璃[9]来固定,Izabella Zawisza等用硅酸盐薄膜固定化了漆酶[10]。M.Moeder等将漆酶固定化在多孔聚丙烯纤维薄膜上[11],除此之外,漆酶的固定化也在(Cu TAPc)-Fe3O4磁性纳米颗粒,聚乙烯,多聚阳离子表氯醇等多种材料上进行了固定化[12,13,14]。在本研究中将以纳米羟基磷灰石粉体作为载体固定化漆酶。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;p H计;真空干燥箱。
硝酸钙(分析纯),成都化学试剂厂;磷酸氢二铵(分析纯),成都化学试剂厂;氨水,成都长联化工试剂厂;无水乙醇,成都长联化工试剂厂;50%戊二醛,成都化学试剂厂;磷酸缓冲液(p H 6.0);漆酶粗酶液,由四川农业大学黄乾明老师提供;ABTS(2,2-azinobis-(3-ethyl benzthiazoline-6-sulphonate))(Sigma);磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H 4.0)。
1.2 羟基磷灰石粉体的合成
按照化学沉淀反应原理:
分别配制0.50 mol/L的Ca(NO3)2水溶液和0.30 mol/L的(NH4)2HPO4水溶液,并用氨水调节溶液的p H>10,按Ca/P=1.67(摩尔比)的比例,在搅拌下将Ca(NO3)2溶液逐滴滴入(NH4)2HPO4的溶液中,滴加过程用氨水保持反应体系的p H值为10.5左右。沉淀完成后于室温下陈化24 h、过滤、再分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤,每次洗涤完后抽滤,然后于真空干燥箱中70℃下干燥24 h,即得羟基磷灰石粉体。
1.3 漆酶活力的测定
漆酶可催化ABTS发生氧化,生成的氧化型ABTS在420 nm处有还原型ABTS所没有的强吸收峰,所以可通过检测420 nm处的吸光度的增加来测定漆酶的活力。
在体系中加入2 m L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H 4.0),2 m L 0.5 mmol/L ABTS,1 m L酶液,在30℃水浴恒温,测定开始3 min内420 nm处的OD420的值。
酶活力单位(U)定义为:在30℃,p H 6.0条件下,每分钟氧化1μmol BTS所需的酶量。
漆酶酶活计算公式如下:
式中:4———反应体系体积数,m L
△A———3 min内反应液在420 nm处吸光值得变化3———反应时间,min
36000———摩尔消光系数,(mol/L)-1cm-1
1.4 漆酶的固定化
称取粉体羟基磷灰石0.8 g于离心管中,加入磷酸缓冲液(p H 6.0)2 m L,将离心管放入超声破碎仪中超声分散5 min,然后以8 000 r/min离心1 min,再用磷酸缓冲液洗涤两次,每次洗涤完后都以相同的方式离心。将配制好的p H 6.0的戊二醛溶液2 m L加入羟基磷灰石中,并震荡成悬浮液,然后用磁性搅拌器搅拌交联2 h。再用磷酸缓冲液洗涤3遍,每次加入2 m L,每次洗涤后离心。再向准备好的粉体中加入1 m L的漆酶粗酶液,震荡成悬浮液后再用磁性搅拌器搅拌2 h,将漆酶固定在羟基磷灰石载体上。固定完后分别用磷酸缓冲液和蒸馏水洗涤三次得到以羟基磷灰石为载体的固定化漆酶。
1.5 游离漆酶和固定化漆酶的酶学性质研究
1.5.1 固定化过程条件的选择
测定不同固定化条件下(温度,p H,固定化时间,戊二醛浓度),固定化酶的酶学性质。以各渐变化条件的值为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图(以酶活最高者为100%)。
1.5.2 动力学常数Km值的测定
将底物分别配成下列浓度的溶液:0.1、0.15、0.2、0.25、0.5mmol/L。在不同底物浓度的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H4.0)反应体系中,按酶活力测定方法,测定固定化漆酶和游离漆酶的A420的动力学变化以计算酶反应得初速度。以底物浓度的倒数(1/S)为横坐标,以酶反应得初速度的倒数(1/V)为纵坐标,作Lineweaver-Burk双倒数图。
2 结果与讨论
2.1 固定化漆酶活力的影响因素
2.1.1 反应温度对固定化漆酶和游离漆酶的影响
分别取0.08 g羟基磷灰石与1 m L酶液固定化,恒定其它固定化条件(p H 6.0,戊二醛浓度5%,交联时间2 h,固定化时间2 h),按照酶活力测定的方法,分别在30℃,40℃,50℃,60℃,70℃下测固定化漆酶和游离酶的△A420,以温度为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图(以酶活最高者为100%)(如图1)。
结果表明,当温度为变化范围在30～70℃之间时,游离漆酶的活力随温度的升高而升高,在70℃时酶活力达到最大。对于固定化漆酶来说,当温度为50℃时,活力达到最大。可以从此图1看出,游离漆酶与固定化漆酶的最适反应温度是不同的。而在此图中,固定化漆酶的活力在相同条件下明显低于游离漆酶的活力,这可能是因为相同量的漆酶在固定化的过程中不能完全固定在载体上,在洗涤的过程中已失去大部分酶活。
2.1.2 p H对漆酶固定化的影响
分别称取0.08 g羟基磷灰石,首先洗涤时用不同p H的磷酸缓冲液(5.8、6.0、6.2、6.4、6.6)洗涤3次,再用戊二醛溶液交联时,用不同p H的戊二醛溶液(5.8、6.0、6.2、6.4、6.6)进行震荡交联。然后在交联后以及固定化完后用磷酸缓冲液洗涤时也用原先相对应的缓冲溶液洗涤。其它固定化条件均恒定(戊二醛浓度5%,交联时间2 h,固定化时间2 h)。反应时都在30℃下以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H 4.0)作为反应缓冲液进行反应。以固定化酶相对活力为y轴,p H值为x轴作图(如图2)。结果表明,当固定化过程中p H为6时,固定化好的漆酶的活力最高。这可能是由于p H的不同影响了羟基磷灰石和漆酶分子上氨基的解离,从而影响希夫碱的形成,进而影响固定化酶的总活力,而p H 6可能恰好是本反应中希夫碱的形成的最适p H。
2.1.3 戊二醛浓度的选择
分别配制不同浓度(3%、4%、5%、6%、7%)的戊二醛溶液(p H 6.0),分别称取0.8g的羟基磷灰石粉体,在交联过程中,分别在不同戊二醛浓度的溶液中震荡进行。其它固定化条件均恒定。固定完后在相同条件下进行酶与底物的反应。以固定化酶相对活力为y轴,以戊二醛浓度为x轴作图(如图3)。结果表明,在不同浓度的戊二醛溶液交联的条件下,固定化酶的活力相差不大,这说明不同浓度的戊二醛溶液的交联过程对漆酶的固定化影响效果不大。当戊二醛浓度为6%时,固定化酶的活力达到最大,这可能是因为:随着戊二醛浓度的增大,羟基磷灰石表面上连接的戊二醛增多,相应地与戊二醛交联的酶分子增多,所以固定化酶的活力增加;而当戊二醛浓度过高时,除了过量的戊二醛自身发生羟醛缩合,固化成不规则物附在产物表面,影响纳米羟基磷灰石颗粒的表面结构,使得酶不易被固定外,还可能会在颗粒上产生过多的醛基与漆酶反应,易引起酶的构象发生变化,造成酶活力下降。
2.1.4 固定化时间的影响
分别取交联好的羟基磷灰石颗粒与1 m L漆酶溶液震荡固定不同时间(1、2、4、6、8 h),其它固定条件恒定,并最终制出固定化漆酶。以酶活力为y轴,固定化时间为x轴作图(如图4),结果表明,当固定化时间为1 h时,固定化漆酶的酶活力最大。这是因为时间过长会使固定化漆酶失活,最终表现为总活力下降。
综上所述,纳米羟基磷灰石颗粒固定漆酶的最适条件可确定为:在p H 6.0条件下,6%戊二醛活化0.08 g羟基磷灰石2 h后,加入1 m L漆酶固定1 h。
2.2 动力学常数Km值
由双倒数法可求得固定化漆酶和游离漆酶的Km值。米氏常数Km可表示酶与底物亲和力的大小,Km值越小,表示酶与底物的亲和力越大。实验结果表明:漆酶经羟基磷灰石固定后,米氏常数减小,说明该酶经固定后,与底物的亲和力显著增加。
3 讨论
本实验为研究纳米羟基磷灰石粉体对漆酶的固定化条件的优化,分别从固定化时间,交联剂戊二醛浓度,固定化p H值等影响因素对进行了研究。随着戊二醛浓度以及p H值的增大,固定化漆酶的活力随之上升,但当戊二醛浓度和p H值达到一定值以后,固定化酶的活力开始下降,因为磁性微球所含总活性基团(氨基)是一定的,当戊二醛浓度增大到一定程度,活性基团反应完全,达到饱和,固定的酶量将不再增加,当然酶活力也就不再增加。p H对固定化的影响则主要体现在H+对希夫碱的形成的作用上[7],整个固定化体系需要一个最适宜的p H值。而随固定化时间的增加,固定化漆酶活力却随之而降低,这有可能是由于时间过长会使固定化漆酶失活,最终表现为总活力下降,但在固定化过程2 h内的最初一段时间内总活力应该是随着时间的延长而上升,因为随着反应时间的增长,固定于羟基磷灰石上的酶分子逐渐增多,表现为总活力的升高。
摘要：利用羟基磷灰石对漆酶进行了固定化研究,确定了羟基磷灰石对漆酶固定的最适条件,并研究了不同温度下游离漆酶与固定化漆酶活力的差异,同时也对游离漆酶与固定化漆酶的Km值进行了研究。结果表明:0.08 g羟基磷灰石固定1 mL粗酶液,当固定化过程pH为6,交联剂戊二醛浓度为6%,固定化时间为1 h时,酶活力达到最大。当温度在30～70℃之间变化时,游离漆酶的活力随温度的升高而升高,在70℃时酶活力达到最大。而对于固定化漆酶来说,当温度为50℃时,活力达到最大。
纳米羟基灰石 篇8
本文对近年来纳米HAP与有机物复合的研究进展进行综述。根据有机物的来源,将有机物掺杂主要分为两类:与人工合成有机物复合及与天然有机物复合。
1 与人工合成有机物的复合
人工合成的有机物具有良好的力学性能,通过将人工合成的有机物与HAP复合,可以明显提高HAP的力学强度和韧性。目前与HAP掺杂的人工有机物主要包括聚乳酸(PLA)、聚乙烯(PE)、聚己丙脂(PCL)、聚酰胺PA等。
1.1 与PLA的复合
强小虎等[2]采用共混复合工艺制备不同质量分数的纳米HAP/PLA复合材料,研究表明,复合材料的弯曲强度和弯曲模量随着纳米HAP含量的增加而增大。HAP颗粒的为15%时,弯曲强度最大,为153.6MPa;降解12周后,复合材料的弯曲强度仍有123.7MPa。弯曲模量为5.7GPa的复合材料,降解12周后复合材料弯曲模量为5.3GPa。剪切强度随着纳米HAP含量的增大呈下降趋势。在降解性能上随着降解时间的延长,复合材料的降解速率变化不大。
黄福龙等[3]用开环聚合合成了PDLLA,液相-沉淀法合成了磷灰石(HA)超微粉。然后采用液相吸附法制备了HA/PDLLA复合材料。研究表明,HA/PDLLA复合材料较单纯PDLLA材料的降解速度减慢,机械强度升高。体内实验表明,HA颗粒从材料表面脱落后,成纤维细胞向组织内长入,并伴有少量新生骨痂的形成,显示复合材料具有良好的降解性能,一定的成骨性和骨连接性。24周时,HA/PDLLA材料被组织分隔包裹,新生骨组织长入材料,骨愈合情况良好。
Lin等[4]将PLA和HAP进行混合制成PLA和羟基磷灰石的复合物。研究发现,不同含量的HAP对于复合材料的机械强度和细胞增殖有明显的作用。该研究有助于对起始的阶段细胞增殖的快速研究和确定特定医疗应用材料的最佳PLA含量规律。
1.2 与PA的复合
程琳等[5]以NaCl为致孔剂,采用粒子沥滤-相转移法制备了纳米HAP/PA6(n-HA/PA6)多孔支架材料。结果表明,用该方法制备的多孔支架孔径分布在50～300μm,孔隙率约为77%,孔与孔之间的贯通性良好。制备的支架中PA6的晶胞体积较制备前有所增大,同时其结晶度也有增加。NaCl粒子的存在促进了PA6聚合物晶体的生长。在制备成支架后,n-HA/PA6复合材料中PA6仍为混晶型高聚物,其晶型部分发生了转变,由制备前α晶型占多数变成了γ晶型占多数。支架的制备过程使PA6更易结晶,但结晶总速率在制备前后均没有太大改变。
Wang等[6]通过热致相分离技术合成纳米HAP和PA的复合支架。研究表明,复合支架具有好的生物相容性。体外实验表明,对间充质干细胞没有副作用。将含有间充质干细胞的复合支架和纯的复合支架植入兔子的下颚部进行检验,表明复合支架具有很好的相容性并在主骨上有大量新生骨生成。在植入的起始阶段,含有间充质干细胞的复合支架显著提高了新骨的形成速率。从长期看,纯的复合支架较含有充质干细胞的复合支架具有更好的生物相容性和骨诱导性。
Wei等[7]通过共溶解共沉淀方法在常压下进行水处理制备了针状纳米级HAP和PA的复合支架。该复合支架中的纳米晶体直径在10～20nm,长度在70～90nm之间。该复合支架具有良好的生物相容性、高的纳米羟基磷灰石含量和高的生物活性。纳米HAP和PLA之间建立了强的分子相互作用和化学键连接,这种支架具有接近人体骨的机械强度。通过注射气泡的方法制备了多孔支架,表明不仅存在大孔隙,同时大孔隙的侧面有小孔空隙,孔隙率大概是80%,平均大孔隙的尺寸在300μm,因此该复合支架可以作为组织工程和骨移植或骨替代材料。
1.3 与PE的复合
罗庆平等[8]采用磷酸单酯偶联剂对HA进行表面改性处理,通过熔融共混复合等工艺制备了改性HA/高密度聚乙烯(HDPE)复合人工骨材料。研究表明,所制备的改性HA/HDPE复合材料比未改性HA/HDPE具有更好的流变性能和机械力学性能,组成均一、具有良好的热稳定性,通过控制复合材料中改性HA及HDPE配比,可制备出机械力学性能优良的复合人工骨材料。
张斌[9]等通过自制模具获得HAP/超高分子量聚乙烯复合功能材料,在此基础上通过层叠法获得5层HAP含量不同的对称分布的功能材料。研究表明,随着HAP含量的增加,复合材料的拉伸强度和抗弯强度均下降,而弹性模量随体积比增加而增加。超高分子量聚乙烯通过其超常分子链获得网络结构,起着骨架作用,而HAP被包裹在超长细链形成的层层网状结构之中,HAP和超高分子量聚乙烯之间只是机械混合在一起。5层复合材料的层与层之间的界面清晰但紧密连接在一起,而HAP含量在界面并没有形成梯度变化。
1.4 与PCL的混合
徐艺展[10]选用可降解的PCL为基底,纳米HAP为增强相,采用熔融共混法制备HA/PCL生物复合材料。实验表明,HA/PCL复合材料M-HP3在SBF中浸渍14d后,在其表面上覆盖一层弱结晶的碳磷灰石(CHA)层,说明得到的HA/PCL复合材料具有良好的生物活性。
Koh[11]等通过快速直接沉淀法制备了PCL和HAP复合支架。这种方法制备的支架直径在330μm左右。同时HAP能够很好的分散在PCL基体中。通过在60℃热处理3h,这种纤维之间的连接力能够得到进一步提高。这种支架在应力作用下具有较强的线弹性,而不会出现断裂。
2 与天然有机物的复合
天然有机物具有良好的生物相容性,生物降解性和力学性能。通过与HAP相结合能够明显改善HAP的力学强度。目前与HAP掺杂的天然有机物主要有:胶原(COL)、壳聚糖(CS)、人骨形成蛋白、明胶等。
2.1 与COL的复合
曾毅[12]用酸碱中和法制备了纳米HAP。采用原位复合法制备得到致密多孔的纳米HAP/胶原复合膜材料,并通过改变胶原量和pH值探索了最佳的合成工艺。结果表明,这种复合生物膜三维结构完好,孔径在15～40μm之间,胶原上均匀附着的纳米HAP颗粒尺寸接近天然骨。
Degirmenbasi等[13]为了研究骨修复和骨重建的材料,首先合成尺寸在10～50nm的HAP,然后通过原位合成的方法将聚乙烯醇加入到HAP中制备二者的复合物。这种复合物具有相对较高的弹性,尤其在低温处时更加明显。将胶原加入到这种复合材料中为这种材料产生了大量的孔洞,孔洞的直径在50～500nm。
Monkawa等[14]采用反湿润方法在烧结的HAP的光滑表面涂上一层纳米结构的胶原。HAP的表面可湿润性、表面能和张力对形成一层纳米结构的胶原非常关键。通过吸附等温曲线的分析方法分析了形成纳米尺寸胶原层的机理,并确定了HAP的颗粒对胶原的最大吸附量和连接的紧密程度。吸附的胶原层中少量胶原的蒸发能够产生尺寸直径在80～90nm的网状孔,用原子力显微镜观察其边缘厚度大约在2～3nm之间。
Liao等[15]从功能梯度材料受到启发,制作成分和结构梯度材料作引导组织再生隔膜。该材料的一面是多孔的,这样有利于组织细胞再生;在材料的另一面是光滑的,这样抑制细胞再生。设计了三层梯度材料的隔膜,一面是含8%HAP和胶原及聚乳酸羟基乙酸复合隔膜,相反的一面是单一的聚乳酸羟基乙酸隔膜。中间一层是含4%碳HAP和胶原复合的隔膜,采用层层铸造方法将它们结合在一起。这种梯度材料具有良好的韧性和机械强度,很容易加工。具有高生物相容性和骨诱导性。通过这种梯度材料在造骨细胞MC3T3-E1中的培养表明,与单纯的聚乳酸羟基乙酸隔膜相比,具有一定的促进作用。
2.2 与CS的复合
孙凯莹等[16]用溶胶-凝胶法制得的纳米HAP充分混合于2%CS乙酸溶液中,冷冻干燥制备纳米HAP/CS复合材料,结果表明,溶胶-凝胶法制备的HA和nHA的晶体结构符合标准HAP的空间六方晶体结构。nHA/CS材料中HAP为纳米级粉体。接种试验表明,材料表面的细胞粘附数量高于HA组,差异有显著性(P<0.05)。扫描电镜下,细胞以多个突起粘附于复合材料表面,并具有良好的伸展状态。
Jin等[17]通过原位共沉淀法合成多孔HAP/壳聚糖海藻酸盐复合支架。研究表明,这种复合支架的孔结构与壳聚糖海藻酸盐支架的孔结构相似,微观形貌没有因为HAP的加入而发生改变。但随着HAP的含量加到30%之后,孔的直径降低,最后孔的结构发生坍塌,甚至消失。但强度随着HAP的含量增加而变大。
Kong等[18]为了提高CS的生物活性和生物相容性,将HAP通过原位合成方法加入到CS支架中。研究表明,放在模拟体液中之后,两个生物支架都有碳HAP形成。但复合的生物支架上的HAP和纳米级HAP数量都比纯CS支架的多。与纯的CS支架相比,含有纳米HAP的复合支架在生物模拟过程中更容易形成磷灰石,这表明复合的生物支架具有更好的矿化活性。另一方面,复合支架的表面层影响了磷灰石的形成,预沉积的HAP能够提高磷灰石的附着。这对磷灰石涂覆生物支架的制备具有重要的意义。
2.3 与人骨形成蛋白(BMP)的复合
龙厚清等[19]将3种钙磷陶瓷材料HA、TCP、HA/TCP复合重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2),比较它们在体内异位成骨效果。然后进行动物试验,结果表明,术后2、4周复合植入物ALP活性测定从高到低依次为HA、HA/TCP、TCP。8周时新骨形成以双相陶瓷HA/TCP最佳。
韩亚萍等[20]BMP与HA按1∶20加以复合。加入8%甲硝唑,消毒后4℃冷藏备用,使用时用盐水调和,然后进行动物试验。结果表明,复合骨形成蛋白组对于根尖形成的作用明显优于氢氧化钙组。因此骨形成蛋白与HAP有协同作用,弥补相互间的不足,是一种有骨诱导作用而优于其他根充剂的新型材料。
2.4 与明胶的复合
刘文斌[21]在湿法合成HAP的基础上加入明胶,解决两相均匀分布,研究并优化制备了HA/明胶复合材料。实验表明,反应过程中pH应控制在明胶的等电点之间,所制备的复合材料既利于HA的生成,又有利于明胶在反应过程中的沉积;利用戊二醛G(A)对复合材料浆料明胶进行交联。当明胶和AG的最低浓度为5%(质量分数),AG与复合材料浆料间的体积比为15∶100,交联效果最佳。
孙恩杰等[22]采用均相沉淀法制备HAP-明胶粉体并对溶胶进行了研究。结果表明,采用均相沉淀法可以制得小尺寸且分布均匀的颗粒;HAP-明胶溶胶可以稳定3个月以上;在HAP-明胶结构中,HAP微晶和明胶高分子产生了键连作用,且HAP沿着明胶纤维上呈现自组装结构。
3 结 语
纳米羟基灰石 篇9
随着纳米技术的兴起,人们对羟基磷灰石(HAP)的研究热点逐渐向纳米领域发展,各种制备不同尺寸及形貌纳米羟基磷灰石的技术手段应运而生[1,2,3]。Nano-HAP因其良好的生物相容性、骨结合力等而广泛应用于骨组织工程、药物载体等领域。虽然已有研究发现,Nano-HAP具有促进成骨细胞分化的潜能[4,5],但也有文献报道了Nano-HAP由于提高了培养液中Ca2+的浓度,从而抑制了某些与成骨细胞分化相关蛋白的表达[6,7]。另外,Nano-HAP还具有一些HAP不具备的特殊性质,其可透过细胞膜上的孔隙进入细胞,甚至进入细胞内的各种细胞器,如细胞核、内质网、线粒体等。进入细胞内的Nano-HAP还可以与细胞内生物大分子结合,影响细胞内的基因表达等。实验已经证明Nano-HAP粒子在体外具有抑制肿瘤细胞生长的特性[8,9,10]。
作为骨组织工程材料,Nano-HAP介导干细胞向成骨细胞分化的具体机制目前尚不清楚,Nano-HAP是否进入了细胞内部并在其内介导了某些生化反应也尚未有研究报道。在抗肿瘤的应用领域,关于Nano-HAP粒子抑制肿瘤生长的机制尚不十分清楚,可能是由于Nano-HAP的体积小,可以通过细胞膜和核膜导致DNA损伤。在药物治疗领域,实现体内同步治疗和成像是临床治疗的新方向。Nano-HAP在药物缓释系统中发挥着药物载体的作用,随着同步治疗和成像理念的提出,通过修饰Nano-HAP从而实现实时监测体内药物动态释放过程显得尤为重要。
为了进一步深入研究Nano-HAP在骨组织、抗肿瘤及药物载体方面的应用,各种功能化Nano-HAP的制备技术迅速发展起来,主要包括荧光素标记Nano-HAP[11,12]、量子点标记Nano-HAP[13]、稀土元素掺杂Nano-HAP[14,15,16,17,18,19]、生物磁性Nano-HAP[20,21]等。通过荧光检测、核磁共振及计算机断层成像扫描等技术能实时监测Nano-HAP在细胞内及体内的定位及迁移过程。本文主要综述了各种功能化Nano-HAP的制备方法,及其在骨组织、抗肿瘤及药物缓释等方面的应用进展。
1 功能化Nano-HAP的制备
1.1 荧光素标记Nano-HAP的制备
荧光素是具有光致荧光特性的染料,其在特定波长光源的激发下可以发出不同颜色的荧光。荧光染料种类很多,目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种:异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明。
荧光素标记法修饰Nano-HAP最初是利用物理吸附[22]的方式,将荧光素分子直接标记至Nano-HAP上。然而此法所得荧光素与Nano-HAP之间的键合能力较差,大量的荧光素分子在后续的细胞培养等过程中游离出来,从而限制了其应用[11]。因此有研究者通过首先对Nano-HAP表面进行处理,然后利用其上的某些功能团如羟基、羧基等与荧光素上的某些功能团如羧基、氨基等通过共价键交联,将具有荧光特性的荧光素分子引入到Nano-HAP基体中,从而得到具有光致发光效应的Nano-HAP。此种方法一般可得到具有较好稳定性的荧光素标记Nano-HAP。
Yuang Zhang等[11]采用表面处理技术将荧光素分子固定到Nano-HAP上,得到了具有较好稳定性的荧光素标记Nano-HAP。他们采用AMPTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)处理Nano-HAP,使其表面带上氨基基团,再通过酰胺键与荧光素分子上的羧基结合将荧光素分子固定至Nano-HAP上。实验结果证明,此种方法增强了荧光素与Nano-HAP之间的键合能力,从而得到了稳定的目的产物。同样,Yuan Yuan等[12]首先用AMPTES处理Nano-HAP,继而将异硫氰酸荧光素(FITC)分子固定到了Nano-HAP上。
利用荧光素标记Nano-HAP,可实现细胞内及体内实时监测Nano-HAP的目的。目前用于荧光成像分析的荧光探针是应用较广的有机荧光染料分子,如罗丹明、吖啶橙、溴化乙锭等,它们的灵敏度较高,但具有光漂白性[23,24,25],荧光寿命较短,使其在荧光成像寿命及长时间的实时动态连续测定方面具有较大的局限性。
1.2 量子点(QDs)标记Nano-HAP的制备
量子点是一种粒径在1～10nm的半导体纳米晶体,主要是由Ⅱ族-Ⅵ族或者是Ⅲ族-Ⅴ族的元素组成,自20世纪90年代开始被用作生物标记材料。这种荧光材料具有荧光强度高,抗光漂白性强,有很宽的激发光谱和窄的发射谱且荧光光谱可调等许多其他荧光染料无法比拟的优点,因此广泛应用于临床检测、药物筛选、分子标记、细胞生物学等方面[26,27]。
刘怡等[13]通过化学沉淀法制备了QDs标记的Nano-HAP, 具体方法是:在三颈烧瓶中首先加入一定量的QDs,通过水浴控制温度,滴加入一定量的Ca(NO3)2,同时用NaOH调节pH=11并保持稳定;后逐滴加(NH4)2HPO4,同样用NaOH调节pH值使其稳定在11,反应完成后将所得沉淀用双蒸水洗涤至上清无荧光,即得QDs标记的Nano-HAP粉体。研究结果发现,当反应时间为3h时复合材料的荧光强度最强。
1.3 稀土元素掺杂Nano-HAP的制备
三价稀土元素 Eu3+、Tb3+等掺杂的发光材料具有荧光寿命长、发射峰窄和 Stokes 位移大等发光性质,且 Eu3+、Tb3+的离子半径与 Ca2+的离子半径接近[28,29],易于取代宿主晶格中的 Ca2+[30],其生物毒性也相对较小。因此,Eu3+、Tb3+掺杂的Nano-HAP发光材料有望作为新型的荧光探针,解决有机荧光探针的光漂白以及量子点探针的生物毒性问题。
1.3.1 沉淀法
宋志国等[14]采用沉淀法制备了Eu3+掺杂的Nano-HAP,将一定浓度的NH4H2PO4溶液滴加到等体积的Ca(NO3)2水溶液中,通过剧烈搅拌,并用NaOH及HCl调节体系的pH值,根据n(Eu3+)/n(Ca2+)=5%的比例加入EuNO3溶液,陈化24h即得具有发光效应的Nano-HAP粒子。结果表明,所制备的Nano-HAP粒子可在紫外及可见波段下被激发,发出617nm的荧光,可以作为生物荧光探针被实时观测。R. Ternane等[16]同样利用沉淀法制备了Eu3+掺杂的Nano-HAP。
1.3.2 水热法
水热法制备Nano-HAP粉体由CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、正丁醇、正辛烷和水构成微乳体系,Ca(NO3)2和NH4H2PO4在体系中反应,得到产物Nano-HAP,反应过程可以表示为:
Ca(NO3)2+(NH4)2HPO4→
Ca10(PO4)6(OH)2+NH4NO3
Eu3+、Tb3+掺杂Nano-HAP典型的制备过程[16,17,18]是:将一定量的Eu(NO3)3、Ca(NO3)2·4H2O和CTAB溶解在含有正丁醇和正辛烷的混合溶液中,得到反胶束Ⅰ;将 (NH4)2HPO4溶解在相同的微乳液溶液中且用NaOH调整pH值到10就得到了反胶束Ⅱ。然后,将两种反胶束溶液在剧烈的搅拌下快速混合均匀并转移到封闭的反应釜中,并且在160℃反应;将最终产物从反胶束溶液中离心分离出来,用甲醇和二氯甲烷的混合溶液洗涤,离心分离,干燥,即得Eu3+掺杂的Nano-HAP。Tb3+掺杂Nano-HAP可采用相似的方法制备,不同之处在于添加的发光源由Tb(NO3)3替代。实验结果表明,当n(Eu3+,Tb3+)/n(Ca2+)=5%及反应温度为140℃时效果最佳,其中Eu3+、Tb3+掺杂的Nano-HAP在365nm处即可发射强绿光和强红光。Piaoping Yang等[19]以阳离子活性剂作为模板,得到了具有生物活性、发光性能以及介孔特性的多功能Nano-HAP。
1.3.3 微波辅助微乳液法
用微波辅助微乳液法制备Eu3+掺杂HAP[31]的步骤为:首先制备反微乳液[32],按化学计量比准确称取Eu(NO3)3、Ca(NO3)2·4H2O和CTAB,然后加入到m(CTAB)∶m(正丁醇)∶m(正辛烷)∶m(H2O)=18.5∶15.1∶51.8∶14.6的混合溶剂中,得到反胶束Ⅰ。按化学计量比在相同的微乳液溶剂中溶解(NH4)2HPO4(n(Ca)/n(P)=1.67),并用2mol/L 的 NaOH调节pH值分别为7、9和12得到反胶束Ⅱ。将两种反胶束溶液在强烈的搅拌下快速混合均匀,并将所得溶液转移到配有回流系统的微波仪中,在N2保护的环境中反应一定的时间,最终的产物从反胶束溶液中离心分离出来,得到的沉淀用体积比为1∶1的甲醇和二氯甲烷混合溶液洗涤数次,之后离心分离回收产物,真空干燥,从而得到Eu3+掺杂的HAP。
1.4 生物磁性Nano-HAP的制备
近年来,纳米磁性粒子在生物医学领域的应用得到了极大的关注[33,34,35]。目前,Fe2+、Fe3+、Gd3+、La3+等金属离子已被广泛地应用于纳米磁性粒子[20,21]的制备。Anna Tampieri等[20]利用共沉积的方法制备了Fe2+及Fe3+(Fe-Nano-HAP)掺杂的Nano-HAP,并进一步研究了Fe-Nano-HAP的物理化学性质、微观结构及其磁性特征。结果表明,此种Fe-Nano-HAP具有与Nano-HAP非常相似的结构与良好的生物相容性;Fe2+和Fe3+的引入使得Nano-HAP具有了磁性特征,从而为热疗法在骨再生及抗肿瘤领域的应用提供了新的设计方向。Masato Wakamura 等[20]采用共沉淀法,通过离子交换的方式得到了Al3+、La3+和Fe3+替代Ca2+的Nano-HAP。Anusha Ashokan等[21]采用未添加表面活性剂的方法,即在100℃时通过水相的湿化学方法将Gd3+掺杂到Nano-HAP中,从而得到了具有顺磁特性的Nano-HAP。
2 功能化Nano-HAP在生物医学领域的应用
2.1 在骨组织工程领域的应用
Nano-HAP作为天然骨组织的无机组成成分之一,广泛应用于骨组织工程、骨填充材料等领域[36,37]。目前已有大量文献报道,Nano-HAP具有促进成骨细胞粘附、增殖、分化等作用[38,39,40]。
Kyobum Kim等[5]将Nano-HAP负载到可降解的聚富马酸二羟丙酯支架上,并研究了Nano-HAP对复合材料的表面性质及小鼠骨髓间充质干细胞内早期成骨生长因子基因表达的影响。结果表明,Nano-HAP改善了材料表面的性质,提高了材料表面的粗糙度、亲水性、蛋白吸附以及最初的细胞粘附,促进了内源性成骨信号分子的表达,如BMP-2、FGF-2、TGF-β1以及Runx2;同时提高了与成骨分化相关的碱性磷酸酶活性、促进了骨钙素基因的表达并且增加了钙沉积量等。Lei Cai等[4]利用光交联法制备了Poly(e-caprolactone)diacrylate (PCLDA)/HAP 纳米复合材料,利用刀片切除复合材料表面以暴露出Nano-HAP,并将MC3T3-E1种植于未经处理的及暴露出Nano-HAP的复合材料表面。研究结果表眀,暴露出Nano-HAP的复合材料表面具有更高的硬度及粗糙的拓扑结构,同时显著地促进了MC3T3-E1在复合材料表面的粘附、增殖及其向成骨细胞的分化。
Shinnosuke Okada等[39]通过前驱体水解的方法,改变体系的pH值及离子浓度,制备了具有纤维状、针状及片状的Nano-HAP,并研究了不同形貌的Nano-HAP对小鼠骨髓间充质细胞的活性、增殖以及粘附的影响。结果表明,纤维状及针状的Nano-HAP抑制了细胞的相关活性,而细胞在片状的Nano-HAP上具有稳定的增殖活性。
大量研究已经证明不同粒径的Nano-HAP[40,41]对培养细胞的活性及成骨分化等的影响具有很大程度的差异。Mohamadreza等[41]分别制备了Nano-HAP/PLLA及Micro-HAP/PLLA复合支架,并研究了骨髓间充质干细胞在两类材料上的增殖及向骨分化的情况。实验通过MTT法对细胞增殖情况进行了检测,并通过ALP活性及其他与成骨相关因子的检测研究了其向成骨分化的程度。结果表明,Nano-HAP促进了支架上细胞的增殖,提高了ALP的活性,同时促进了细胞内与成骨相关的基因的表达。N. Ribeiro等[40]研究发现,骨粘连蛋白和纤连蛋白在不同尺寸的Nano-HAP上具有不同的粘附行为,两种蛋白更易吸附于具有较大尺寸的Nano-HAP上;同时较大尺寸的Nano-HAP上的MC3T3-E1细胞具有较高的细胞活性及细胞粘附量。
然而Nano-HAP如何具体介导间充质干细胞及其他成骨前体细胞系向成骨细胞分化的机制;Nano-HAP是否能够被此类细胞吸收;其进入细胞内的具体途径;进入细胞后Nano-HAP在细胞内的分布情况以及进入细胞内的Nano-HAP是否介导了细胞内某些蛋白、基因的表达;Nano-HAP能否与细胞内某些蛋白结合;其是否激活或者阻断了细胞内某些信号通道,目前尚未有相关的研究报道。但随着功能化Nano-HAP的合成,研究工作者可通过各种技术手段制备具有各种特性的Nano-HAP,通过激光共聚焦等手段实时监测其进入细胞内的情况,进而研究后续的相关问题。
2.2 在抗肿瘤领域的应用
随着纳米技术的兴起,研究发现将HAP制备成纳米级之后,其还具有一些HAP不具备的特殊性质:可以透过细胞膜上的孔隙进入细胞,甚至是细胞内的各种细胞器,如细胞核、内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体;可以在细胞内产生自由基;跟生物大分子结合;催化细胞内生化反应;影响细胞内的基因表达等。实验已经证明Nano-HAP粒子在体外具有抑制肿瘤细胞生长的特性[8,9,10]。一种可能的机制就是肿瘤细胞较正常组织细胞有更高的吞噬活性,Nano-HAP溶胶由于粒径较小,容易被吞噬,进入细胞后与初级溶酶体结合形成次级溶酶体,在其内降解产生游离酸或其他细胞毒性产物,从而启动了溶酶体的凋亡途径[42,43]。随着功能化Nano-HAP制备技术的兴起,为了进一步深入研究Nano-HAP与肿瘤细胞之间的相互作用机制,各研究工作者采用各种技术手段制备具有发光效应的Nano-HAP,以正常细胞作为对照,探讨了不同形貌及粒径的Nano-HAP进入肿瘤细胞内的途径及其在细胞内的分布[12]。同时进一步研究了Nano-HAP在蛋白及基因水平的抗肿瘤机制。
Yuan Yuan等[12]研究了不同尺寸Nano-HAP对肝癌细胞活性及凋亡信号蛋白表达水平的影响。实验利用FITC标记Nano-HAP,得到具有发光效应的功能化Nano-HAP,以及不同尺寸Nano-HAP在细胞内的定位情况。结果表明,所有Nano-HAP均可进入细胞内,且主要集中于细胞核周围,并未进入细胞核,此外Nano-HAP的抗肿瘤效应与其尺寸具有极大的相关性,其中45nm的Nano-HAP具有最佳的抗肿瘤效应。
武奎等[44]采用水热合成及微波合成法制备了Eu3+标记的Nano-HAP,用其处理Bel-7402细胞和L02细胞,再用DAPI作为细胞核特异荧光探针对两种细胞的细胞核染色,然后用DioC6(3)作为内质网特异荧光探针对两种细胞的内质网染色,最后在激光共聚焦显微镜下观察经荧光探针标记的Bel-7402细胞和L02细胞,发现Nano-HAP处于内质网中,且分布于肝癌细胞内质网中的Nano-HAP明显多于正常干细胞。而内质网是参与分泌性蛋白的合成、分泌、空间折叠、蛋白质糖基化修饰的重要细胞器,对蛋白的合成有着至关重要的作用。这表明Nano-HAP进入肝癌细胞后的作用靶点为内质网,并可能通过内质网影响相关关键蛋白的合成、分泌、空间折叠、蛋白质糖基化修饰等功能,进而抑制肝癌细胞生长。
近年来随着热疗技术在抗肿瘤领域的应用及生物磁性Nano-HAP制备技术的兴起,已有研究工作者利用Nano-HAP的生物磁性采用热疗法治疗肿瘤。Chunhan Hou等[45]采用共沉积的方法制备了具有磁性的Fe2+掺杂的Nano-HAP,选取小鼠作为试验模型研究了磁性Nano-HAP体内热疗法治疗肿瘤的效率。他们将试验模型置于热感应的高频变化的磁场中,以未掺杂Fe2+的Nano-HAP作为对照组,处理15天后,发现只有注射了磁性Nano-HAP并且有外加高频磁场存在的实验组才极大地降低了肿瘤组织的体积,同时皮下注射后小鼠的血液相容性试验表明该磁性Nano-HAP具有良好的生物相容性和极低的毒性。
2.3 在药物载体领域的应用
Nano-HAP粒子具有良好的组织相容性、无毒、无免疫原性、比表面积大、生物粘附性强且能结合和传递大分子药物等特点。Nano-HAP粒子作为药物载体系统能提高药物在生物膜中的透过性,有利于药物透皮吸收并发挥其在细胞内的药效。Nano-HAP作为药物载体十分安全,因为其与人或动物的骨骼、牙齿成分相同,且不为胃肠液所溶解,在释放药物后可降解吸收或全部随粪便排出。此外,Nano-HAP在生成过程中很方便引入放射性元素,可用于癌细胞的灭活[46]。目前新型Nano-HAP的制备为其在药物载体领域的应用注入了新的血液,利用其生物磁性、发光性能等特性,实现了实时监测药物载体在药物治疗过程中的行为及药物释放情况的目的,为临床治疗及治疗效率的提高带来了希望。
Feng Chen等[47]采用微波合成法合成了多功能的Eu3+、Gd3+共掺杂的Nano-HAP,通过Eu3+和Gd3+的引入,使得此Nano-HAP同时具有发光性和生物磁性两种特性,且Nano-HAP的发光强度可通过改变Eu3+和Gd3+的浓度而调整,而其磁性则随着Gd3+浓度的增大而增强。体外生物相容性试验表明此多功能的Nano-HAP几乎没有细胞毒性,更为重要的是它还具有很高的药物吸附能力。他们以此功能化Nano-HAP作为药物载体,以布洛芬作为模型药物,通过皮下注射的方式将其注入裸鼠体内,利用Nano-HAP的发光特性及生物磁性,通过发光成像及计算机断层扫描技术实现了无创监测药物在体内的释放过程。此法为影像介导的多功能药物释放系统的建立奠定了基础。
Marija Vukomanovic等[48]制备了PLGA/Nano-HAP纳米复合微球作为药物载体,并研究了克林霉素在此微球中的分布。其中分别以5-氨基荧光素、茜素红、罗丹明-B标记PLGA、Nano-HAP、克林霉素。通过3种组分在荧光显微镜下所显示出的不同颜色的荧光分布,得到了克林霉素在纳米微球中的分布情况。此法为实时监测药物及其载体在体内治疗过程中的活动情况提供了可能。
Tse-Ying Liu等[49]利用具有顺磁性的Fe2O3修饰Nano-HAP,得到了具有生物磁性的Fe3+掺杂的Nano-HAP,并将其涂覆于载药脂质体表面。体外实验研究发现该药物载体能够在超声作用下引发药物释放,并通过超声诱发磁共振影像扫描发生变化。因此,此药物载体不仅可以用于在磁共振影像介导下利用超声刺激引发药物释放,同时还可以通过磁共振报告探测药物载体的位置。
3 结语
近年来随着纳米技术的兴起,纳米物质的特性被不断地发现,人们对HAP的研究热点逐渐向纳米领域发展,各种制备不同尺寸及形貌Nano-HAP的技术手段应运而生[1,2,3],同时纳米技术与生物学技术的结合也成为了生物学发展的新趋势。在此趋势推动下,各种荧光素标记、量子点标记、稀土元素掺杂以及磁性Nano-HAP的制备技术开始兴起,从而得到了具有了发光、生物磁性等特性的新型Nano-HAP。利用Nano-HAP的发光、磁性特征,可以通过荧光检测、核磁共振及计算机断层成像扫描等技术实时监测Nano-HAP在细胞内及体内的定位及迁移过程,为深入探讨Nano-HAP在骨诱导、抗肿瘤及介导药物释放等领域的作用机制提供了强有力的技术支持。相信随着研究的深入,对新型功能化Nano-HAP性能的了解将会越来越多,其用途也会越来越广泛。
摘要：介绍了各种生物化学方法如荧光素法、稀土元素掺杂法、量子点标记法等修饰纳米羟基磷灰石的技术,并着重阐述了生物化学修饰后的纳米羟基磷灰石在骨组织、抗肿瘤及药物载体方面的应用及其优势。相信随着研究的深入,对新型纳米羟基磷灰石性能的了解会越来越多,其用途也会越来越广泛。