蛋白表达系统研究论文

蛋白表达系统研究论文（共10篇）

蛋白表达系统研究论文 篇1

1 引言

近年来, 无细胞蛋白质表达系统再次受到关注。相比较体内表达, 无细胞蛋白表达系统具有其明显的优点[], 例如, 不受细胞生理限制可进行较大量的毒性蛋白表达;产物的活性和溶解性增加;产物不受胞内蛋白酶的降解;反应可以在短时间内进行;无需繁杂的下游处理;适合于高通量表达。而且通过优化反应系统, 可以得到高产率表达产物。总之, 在无细胞系统合成蛋白质可提高目标蛋白的表达效果。

随着核酸测序技术、芯片技术和RNA干扰技术的建立和突破, 人们对核酸信息的了解越来越多。而生命过程最终多是以蛋白质形式执行其功能的, 因此对蛋白质结构和功能的研究成为后基因组时代重要的工作。因此, 发展能够合成任何目标蛋白系统以及实现高通量表达是当今生物技术中重要的课题。

2 无细胞蛋白表达系统

无细胞蛋白质合成系统是一种以外源DNA或m RNA为模板, 利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系, 通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统 (如图一) , 1958年, Zamecnik首次证明, 从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成;1961年, Nirenberg和Matthaei[4]利用蛋白质的无细胞合成体系, 以破译遗传密码子。该方法对蛋白翻译机制的研究, 同样也作出了重要贡献。然而, 当时由于此方法的表达量有限, 无法进行规模化生产, 因此, 在过去几十年一直没能被重视起来。

随着人们对蛋白质生物合成机制的深入了解, 建立稳定的无细胞蛋白表达体系已成为可能。现已确定, 蛋白质生物合成的机器是核糖体, 如果存在有t RNA, 以及蛋白折叠加工必需的酶和各种相关因子, 只要提供外源的RNA模板、氨基酸和能量, 无需其他的细胞结构 (如线粒体) , 蛋白质合成也能顺利进行。而在各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因子。因此, 可以在无细胞体系中实现蛋白质表达, 通过对无细胞反应体系的优化, 系统的稳定性和蛋白产率得到了大幅度的提高。

目前, 已开发出来的无细胞表达系统有原核和真核系统两大类型。原核系统通常是通过E.coli BL21 (DE3) 或其他敲除了内源蛋白酶和核酸水解酶的菌种, 如A19来进行无细胞表达体系的建立;真核系统, 目前较为成熟的是利用兔网织红细胞和麦芽提取物来实现无细胞蛋白表达系统的建立。理论上来说, 任何遗传信息都可以在这两大类体外表达体系中进行翻译而得到目的蛋白, 但不同的系统有着不同的特点, 应该根据自己的需求来进行选择。

2.1 原核系统

原核系统表达系统主要利用大肠杆菌的提取物来实现的。目前对大肠杆菌蛋白合成机制已有十分详细的认识, 这使得大肠杆菌的体外表达系统也随之不断得到改进。大肠杆菌提取物基础上建立的无细胞蛋白表达系统有一个很大的优势就是它的耐受性, 它可以在含有其它不同成份杂质时仍可以进行目标蛋白的表达。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂, 分子伴侣, 代谢物, 非天然氨基酸甚至是少量的变性剂, 也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。为此, 该体系的弹性非常大, 可以加入许多其它必要成份以提高产率和提高溶解性。例如:微修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键, 然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定的修饰, 比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是, 蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍然是一个问题, 特别是利用这一系统合成那些多结构域构成和含有二硫键的真核蛋白。不过, 由于真核体外合成体系也未能解决蛋白质翻译后加工的问题, 而大肠杆菌的材料来源成本最低, 实用性高, 表达效率也高, 因而依旧是体外表达的热门选择。

2.2 真核系统

2.2.1 兔网织红细胞

兔网织红细胞是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来, 在体内主要是负责合成大量血红蛋白 (90%以上) , 以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核, 但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力, 而没有复杂的背景, 即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定, 体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少, 有助于长链RNA的稳定 (包括有帽子或者没帽子结构的RNA) , 因而可以合成较大的蛋白。

2.2.1 麦芽提取物

麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的m RNA很少, 这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高, 直到最近[5]才通过延长合成时间的方式提高了产率。如果要保持麦芽提取物系统持续数日的合成效率, 就必需保证反应体系不含有任何会破坏核糖体功能以及其它合成中使用到的相关的酶。这样此系统的合成效率可以被不断加强, 由试验结果显示, 24小时内最高的合成量可达1mg/ml。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。

3 应用

利用无细胞体系表达蛋白质已经应用于很多方面, 但是大致可以归属于以下两个方面。

3.1 结构蛋白质组研究中的应用

首先, 利用无细胞体系可以进行蛋白质的高通量表达, 能同时得到许多用于结晶的蛋白质, 进而开展结构蛋白质组的研究。第二, 特别是膜蛋白和有细胞毒性的蛋白质都可以利用无细胞体系进行表达。第三, 可以在蛋白质中人为地引入硒代半胱氨酸, 有利于蛋白质的X射线结晶学研究。第四, 因为可以在很小体积内进行无细胞体系的蛋白质表达, 这样有利于蛋白质的同位素标记, 例如进行了双重同位素标记蛋白质后, 无需烦杂的纯化, 即可进行灵敏的NMR测定。

3.2 功能蛋白质组研究中的应用

同样是由于无细胞体系可以进行蛋白质高通量、微量化的表达, 表达后又可省去烦杂的分离纯化, 因此对表达产物的活性测定非常容易, 尤其是对酶的活性研究。如果进一步降低无细胞表达体系的体积, 使得反应浓集在很小区域内 (例如在96孔板中) , 几乎可以达到蛋白质 (微) 阵列的目的。

在无细胞体系表达蛋白质时可以引入非天然氨基酸 (其中包括荧光和生物素光标记的氨基酸、可以进行光化反应的修饰氨基酸) , 对蛋白质进行修饰和标记。这样可以更为有效地研究蛋白质组中得到的各个组分的功能。

4 讨论及展望

体外表达由于是在无细胞的条件下进行的, 缺少蛋白质翻译后加工所需要的细胞器和空间结构, 所以其致命的弱点就是:即使是真核体外表达系统, 目前依然无法对蛋白进行糖基化和其它天然蛋白必需的高级修饰。所以有必要对体系进行改进, 如渗入单糖基化的氨基酸或加入微粒体 (microsome) 等, 理论上可以实现一些必要的修饰。

基于蛋白质组学的研究需要进行高通量的蛋白质表达, 体积无需很大, 表达量不必很多, 但是要快的速度, 表达的蛋白质可以被翻译后加工。而这几个方面正好是无细胞蛋白质表达系统的专长。为了能使蛋白质的无细胞表达更有成效, 在方法和技术上也需改进和发展。在方法改善的同时, 其应用也日益拓展。

蛋白表达系统研究论文 篇2

脑内水通道蛋白4(AQP4)在细胞分化不同阶段表达情况不同,内皮细胞也影响其表达分布;星形胶质细胞及其微环境的渗透压、氨浓度、氧分压、温度以及一些其他因素如激素及肽类、外源性物质铅、补体抑制剂、脂多糖等的存在都会影响AQP4表达.但脑内AQP4表达的调节机制不十分清楚,与之相关的有蛋白的相互作用、蛋白激酶C(PKC)磷酸化途径、丝裂原激活的蛋白激酶信号转导途径、钙信号途径、转录因子活化等,其中研究最多的`是PKC通过磷酸化抑制AQP4的活性.

作 者：师忠芳 袁芳 SHI Zhong-fang YUAN Fang 作者单位：师忠芳,SHI Zhong-fang(首都医科大学,北京市,100054)

袁芳,YUAN Fang(北京市神经外科研究所,北京市,100050)

蛋白表达系统研究论文 篇3

[关键词] Bcl-2；IGF-2；子宫肌瘤

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）13-0013-02

子宫肌瘤是女性生殖系统常见的一种性激素依赖性疾病，大多数患者无症状，或有轻微的盆腔疼痛、经期延长、月经量增多等临床表现，因此临床报道的发病率远较真实的发病率低[1]。目前关于子宫肌瘤的发病机制尚不十分清楚，有关于PTEN基因、瘦素、Survivin等在子宫肌瘤组织中表达的研究。有研究表明，胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因的过度表达可以导致乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展[2]。另有研究表明Bcl-2可以表达在子宫肉瘤中，呈局灶性或散在分布。为进一步探讨上述两种因子在子宫肌瘤发病中的可能机制，我们做了下述研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2011年8～12月就诊于我院妇科病房因子宫肌瘤而切除的子宫标本40例为研究组，术后经病理检查证实为子宫肌瘤；选取同期因器官脱垂等非肿瘤因素而行子宫部分或全部切除的标本40例作为对照组，同样经病理检查证实为正常平滑肌组织。研究组患者年龄35～58岁，获取的标本均经患者知情同意。

1.2 测定方法

采用免疫组化SP法检测组织中Bcl-2、IGF-2蛋白的表达。多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；SP试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

1.3 结果判定

严格按照试剂盒说明书的诊断标准执行。即细胞浆内出现棕黄色颗粒为Bcl-2、IGF-2阳性。根据染色强度与阳性细胞百分比分为4个等级：0～1分为阴性（-），2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～7分为强阳性（+++）。染色强度阴性为0分，染色强度中等为2分，介于两者之间为1分，染色强者为3分；染色阳性细胞数<5%为阴性（0分），5%～25%为弱阳性（1分），26%～50%为阳性（2分），51%～75%为强阳性（3分），>75%为强强阳性（4分）。按综合评分的等级来评价两种蛋白的表达情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS12.0软件进行数据分析。阳性表达率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关进行。

2 结果

2.1 Bcl-2、IGF-2蛋白在子宫肌瘤组织及正常肌层组织中的表达

子宫肌瘤组织中Bcl-2蛋白的阳性表达率为100%，IGF-2蛋白的阳性表达率为95%，均高于正常肌层组织中的阳性表达率（分别为21.21%、25.00%）。Bcl-2蛋白在子宫肌瘤组织及正常子宫肌层组织中表达率[12.862（v=1），P < 0.01]，差异具有统计学意义；IGF-2蛋白在子宫肌瘤组织及正常子宫肌层组织中表达率[5.000（v=1），P < 0.05]，差异具有统计学意义。

2.2 Bcl-2、IGF-2蛋白与子宫肌瘤发生的相关性分析

Bcl-2蛋白的表达与子宫肌瘤的发生作相关性分析，得出相关系数为r = 0.096 9；IGF-2蛋白的表达与子宫肌瘤的发生得出相关系数为r = 0.941，两种蛋白的表达与子宫肌瘤的发生呈正相关，经检验P < 0.05，差异有统计学意义。

3 讨论

目前广泛认为子宫肌瘤生长的主要促进剂为性激素，外源性激素的应用可使肌瘤体积增大，降低激素浓度可使肌瘤体积减小，并缓解其临床症状[3]。迄今为止其发病机制以及发生发展的分子生物学基础尚不明确，环境因素及基因突变可能参与了子宫肌瘤的发生发展。

IGF-2是目前所知功能最复杂的生长调控因子，通过其重要的生物学作用引起细胞的增殖和分化[4]。IGF-2同时也是一种具有强大自分泌和旁分泌作用的有丝分裂原，可促进正常细胞的生长发育及促进胚胎的形成。目前的研究已经证实IGF-2的过度表达可以导致乳腺癌的发生，高伟[5]等研究表明IGF-2在乳腺癌组织中的表达明显高于乳腺纤维腺瘤及乳腺增生的组织。本研究中发现在子宫肌瘤患者中IGF-2也呈过度表达，阳性表达率达95%，与正常子宫肌层组织中IGF-2的阳性表达率相比，差异具有统计学意义。

bcl-2是bcl-2基因家族中的原癌基因之一，可以抑制肿瘤细胞的凋亡，与其他癌基因如p53等共同控制着细胞的生长、分化、增生和凋亡[6]。有研究表明，肿瘤细胞中bcl-2的过表达可以抑制程序性细胞死亡和使肿瘤细胞产生耐药性[7]。本研究中Bcl-2在子宫肌瘤组织中阳性表达率达100%，在正常肌层组织中阳性表达率为21.21%，两者比较差异具有统计学意义。上述两种蛋白与子宫肌瘤的发生行相关性分析得出，Bcl-2、IGF-2蛋白与子宫肌瘤的发生呈正相关。但是子宫肌瘤存在异质性的遗传背景，本实验并未阐明，有待于后续研究。

[参考文献]

[1] 乐杰. 妇产科学[M]. 第6版. 北京：人民卫生出版社，2004：295.

[2] 史艳平，封全灵. 子宫肌瘤组织中TSP-1和IGF-2蛋白的表达及意义[J]. 山东医药，2011，51（4）：92-93.

[3] Morikawa A，Ohara N，Nakabayashi K，et al. Selective progesterone receptor modulator asoprisnil down-regulates collagen synthesis in cultured human uterine leiomyoma cells through up-regulating extracellular matrix metalloproteinase inducer[J]. Human Reproduction，2008，23（4）：944-951.

[4] Kim HJ，Kim TY. Regulation of vascular endothelial growth factor expression by insulin-like growth factor-II in human keratinocytes，differential involvement of mitogen-activated protein kinases and feedback inhibition of protein kinase C[J]. Br J Dermatol，2005，152（3）：418-425.

[5] 高伟，李连宏，等. IGF-2、Ki-67在乳腺癌中的表达及其意义[J]. 大连医科大学学报，2010，32（1）：22-25.

[6] Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death[J]. J Cell Biol，1994，124（1）：1-6.

[7] Jiang H，Xia D，Wu LJ，et al. Inhibition of Bcl-2 enhances the efficacy of epirubicin chemotherapy in PC-3 prostate cancer cells[J]. Chin Med J（Engl），2011，124（23）：4018-4021.

蛋白表达系统研究论文 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

所有40例胰腺癌石蜡包埋标本取自本院病理科2009~2012年外检档案。所有标本术前均未行放化疗。患者中男23例, 女17例, 年龄25~78岁, 平均56.3岁。按WHO标准病理分级, 高分化腺癌10例, 中分化腺癌16例, 低分化腺癌14例。根据2002年TNM分期标准Ⅰ~Ⅱ期14例, Ⅲ~Ⅳ期26例。有淋巴结转移及远处转移的18例。取20例胰腺外伤患者手术切除后取下正常胰腺组织, 作为阳性对照, 其中男11例, 女9例, 年龄22~75岁, 平均54.8岁。两组一般资料比较, 差异无显著性 (P>0.05) 。

1.2 主要试剂及其方法

实验用的Claudin-1, 3, 4, 7由海南一鼎生物技术有限公司代购。SP试剂盒、DAB显色液购自武汉博士德生物技术公司。标本经10%中性甲醛固定, 石蜡包埋, 制成4μm厚的切片, 分别行HE和免疫组织化学染色。免疫组化技术采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接 (SP) 法, 检测Claudin-1, 3, 4, 7在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达, 光学显微镜下观察结果。 (严格按试剂说明书操作, 具体染色步骤略, 由专人具体操作) 。

1.3 判断标准

细胞中含棕黄色颗粒者为阳性细胞。计数方法:选低倍光镜下5个含Claudin-1, 3, 4, 7数量最多的区域, 高倍镜下计数5个视野内Claudin-1, 3, 4, 7数量, 其均值为Claudin-1, 3, 4, 7计数;以北京中杉生物公司提供的阳性切片作为阳性对照, 以PBS液替代一抗作为阴性对照。

1.4 统计学方法

数据处理采用SPSS 15.0 for Windows统计软件, 计数资料采用Pearson Chi-square Test分析处理, 相关分析采用Spearman等级相关分析, 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Claudin-1, 3, 4, 7的阳性表达及在胰腺癌组织中四者相关性

Claudin-1和Claudin-7在胰腺癌组织中表达的阳性率明显低于正常胰腺组织, Claudin-3和Claudin-4在胰腺癌组织中表达的阳性率明显高于正常胰腺组织, 差异均有显著性 (P<0.01) 。在胰腺癌组织中, 采用Spearman等级相关分析, Claudin-1与Claudin-3、Claudin-4与Claudin-7分别两两比较呈负相关 (P<0.05) , Claudin-1与Claudin-7、Claudin-3与Claudin-4比较呈正相关 (P<0.05) 。见表1。

注:1) 与同组比较, P>0.05;2) 与同组比较, P<0.05

2.2 Claudin-1, 3, 4, 7的阳性表达与胰腺癌的临床病理特征的关系

Claudin-1, 3, 4, 7的阳性表达与年龄、性别均无关 (P>0.05) ;Claudin-1, 3, 7的阳性表达与分级、分期及有无转移明显相关 (P<0.05) , Claudin-4表达与分期明显相关 (P<0.05) 而与分级和转移无明显相关 (P>0.05) 。见表2。

3 讨论

Claudin属于一类相对分子质量为17×103~27×103的跨膜紧密连接蛋白, Claudin并不局限于紧密连接中, 它们可以沿着上皮细胞侧面和基底细胞质膜分布, 其家族成员具有相同的结构, 一个完整的跨膜蛋白含有4个疏水跨膜区域, 形成两个细胞外的环状结构 (第1个环大于第2个) 。大多恶性肿瘤发生、发展和转移时, Claudin家族多数成员水平明显变化, Claudin表达下调或缺失已被公认为是细胞间黏附性丢失的机制和肿瘤细胞发生及转移的重要因素, 从而限制支持肿瘤细胞的营养和生长因子的供应, 使癌细胞的降低凝聚力、分化变差及侵袭性增加。目前发现文献中Claudin-1, 3, 4, 7, 16等与胃肠道、泌尿系和妇科研究较多。其中, Claudin与胰腺癌发生发展的关系也逐渐受到重视。

Claudin-3, 4蛋白是产气荚膜梭菌肠毒素的受体, 与此细菌结合后, 导致细胞溶解坏死, MICHL等[4]曾描述了用产气荚膜梭菌肠毒素瘤内注射异种嫁接的胰腺癌细胞, 结果引起肿瘤细胞大面积坏死, 明显延缓了肿瘤生长, 同时证实了产气荚膜梭菌肠毒素的细胞毒性仅限于Claudin-4高表达的癌细胞, 并呈剂量依赖性。RANGEL等[5]使用含4 992个人类基因的c DNA微阵列分析胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤, 发现Claudin-4等基因上调, 提示Claudin-4可能参与了早期胰腺癌的形成。Claudin-4在胰腺癌中的阳性表达率较高, 与胰腺炎相比, 其表达与胰腺癌显著相关[6,7]。

以上研究表明, Claudin与胰腺癌有一定的相关性。基于此, 本研究综合检测了Claudin-1, 3, 4, 7在胰腺癌患者中表达情况, 并分析其彼此之间的相关性。结果证实, Claudin-1, 7在胰腺癌组织中表达的阳性率明显低于胰腺正常组织, Claudin-3, 4在胰腺癌组织中表达的阳性率明显高于胰腺正常组织, 分别与正常对照组两两比较, 差异均有显著性;Claudin-1, 3, 4, 7的阳性表达与年龄、性别均无关;Claudin-1, 3, 7的阳性表达与分级、分期及有无转移有明显相关, Claudin-4与分期有明显相关而与分级和转移无明显相关。在胰腺癌组织中, 采用Spearman等级相关分析, Claudin-1、Claudin-7与Claudin-3、Claudin-4分别两两分析, 呈负相关, Claudin-1与Claudin-7, Claudin-3与Claudin-4分析, 呈正相关。这与以上引用文献基本一致。

综上所述, Claudin-1, 3, 4, 7的表达异常与胰腺癌可能密切相关。但是, 目前对Claudin的认识仍然处于起步阶段, 其不同成员结构、功能的特异性、调节机制等仍未完全明了, Claudin在胰腺癌的发生、发展过程中及其诊断与治疗中可能有重要作用, 具体机制有待于进一步探讨。

摘要：目的 探讨紧密连接骨架蛋白-1, 3, 4, 7 (Claudin-1, 3, 4, 7) 在胰腺癌发生发展及转移中的作用。方法 应用免疫组织化学染色SP法检测40例胰腺癌组织及20例正常胰腺组织中蛋白的表达情况, 并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果 Claudin-1, 7在胰腺癌组织中表达的阳性率明显低于正常胰腺组织, Claudin-3, 4在胰腺癌组织中表达的阳性率明显高于正常胰腺组织, 差异均有显著性 (P<0.05) ;Claudin-1, 3, 7的阳性表达与分级、分期及有无转移有明显相关, Claudin-4与分期有明显相关, Claudin-4与分级及有无转移无明显相关。在胰腺癌组织中, Claudin-1与Claudin-3、Claudin-4与Claudin-7分别两两比较呈负相关 (P<0.05) , Claudin-1与Claudin-7、Claudin-3与Claudin-4两两比较呈正相关 (P<0.05) 。结论 Claudin-1, 3, 4, 7可以作为胰腺癌的早期诊断、预测胰腺癌的侵袭深度、淋巴结转移及术后复发情况, 以评估预后的生物学指标。

关键词：胰腺癌,免疫组织化学,紧密连接骨架蛋白-1, 3, 4, 7

参考文献

[1]彭杰, 蒋重骅, 龙泓羽, 等.癌胚抗原相关细胞黏附分子6在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志, 2013, 23 (2) :62-65.[1]PENG J, JIANG CY, LONG HY, et al.Expression of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 in pancreatic carcinoma tissues and its relationship with clinicopathological characteristics[J].China Journal of Modern Medicine, 2013, 23 (2) :62-65.Chinese

[2]CHAN AO, LAM SK, CHU KM, et al.Soluble E-cadherin is availed prognosis marker in gastric carcinoma[J].Gut, 2001, 48:808-811.

[3]LEE JH, KIM KS, KIM TJ, et al.Immunohistochemical analysis of claudin expression in pancreatic cystic tumors[J].Oncol Rep, 2011, 25 (4) :971-978.

[4]MICHL P, BUCHHOLZ M, ROLKE M, et al.Claudin-4:a new target for Pancreatic cancer treatment using clostridium perfring ensente rotox-in[J].Gastroenterology, 2001, 121 (3) :678-684.

[5]RANGEL LB, AGARWAL R, DC SOUZA T, et al.Tight junction proteins claudin-3 and claudin-4 are frequently over expressed in ovarian cancer but not in ovarian cystadenomas[J].Clin Cancer Res, 2003, 9 (7) :2567-2575.

[6]YAMAGUCHI H, KOJIMA T, ITO T, et al.Effects of Clostridium perfringens enterotoxin via claudin-4 on normal human pancreatic duct epithelial cells and cancer cells[J].Cell Mol Biol Lett, 2011, 16 (3) :385-397.

蛋白表达系统研究论文 篇5

通过电击转化法,将带有gfp标记基因的`pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段.

作 者：朱红梅 周涵韬 张赛群 曹宜 刘波 ZHU Hong-mei ZHOU Han-tao ZHANG Sai-qun CAO Yi LIU Bo 作者单位：朱红梅,ZHU Hong-mei(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005)

周涵韬,张赛群,ZHOU Han-tao,ZHANG Sai-qun(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;福建省农业科学院生物技术中心,福建,福州,350003)

曹宜,刘波,CAO Yi,LIU Bo(福建省农业科学院生物技术中心,福建,福州,350003)

蛋白表达系统研究论文 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组研究对象来自2003年8月~2007年4月本院消化内科慢性乙型病毒性肝炎和乙肝后肝硬化患者。46例慢性乙型病毒性肝炎患者中,26例活动期,20例为静止期。男性30例,女性16例,年龄15~41岁。37例肝硬化患者中,21例代偿性期,16例失代偿期。其中,男性26例,女性11例,年龄26-57岁。40例健康人来自本院体检科。慢性乙型病毒性肝炎的诊断按照2000年西安会议“病毒性肝炎诊断标准”[1]。肝硬化包括失代偿期诊断标准按照中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会2000年西安会议联合修订的病毒肝炎防治方案和有关文献[1,2]。所有病例血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均为阴性。

1.2 主要试剂 Trizol RNA

提取液为GIBCO公司产品。MMLV逆转录酶、Oligo(dT)18、dNTP、RNAsin和Taq酶系Promega公司产品。Ficoll淋巴细胞分离液为中科院生物医学工程研究所产品。HBVDNA定量检测试剂盒购自科华生物技术有限公司。甲、乙、丙型肝炎血清标志物检测试剂盒由厦门新创公司提供,戊、庚型肝炎病毒抗体检测试剂盒由北京万泰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

空腹采集慢性乙型肝炎、肝硬化和健康人不抗凝静脉血和枸橼酸钠抗凝血各3mL,不抗凝血分离血清;抗凝血采用Ficoll梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。血清和PBMC沉淀置-20℃保存备用。

1.3.2 HBV DNA提取

取100 μL血清加入等量DNA提取液,混匀后100℃煮沸10min,离心取上清2 μL用于PCR反应。

1.3.3 总RNA提取 PBMC

沉淀中加入1mL Trizol RNA 提取液,0.2mL氯仿,旋涡振荡30s,室温静置5min,12000 rpm/min,离心10min。取上清加入等体积异丙醇,室温静置10min,离心,弃上清。沉淀用75%乙醇洗涤1次,置恒温金属浴上烘干后溶于适量DEPC水中。取1μL提取的RNA溶液加入1%琼脂糖凝胶中电泳,观察条带,以确保RNA提取有效。

1.3.4 HBV DNA检测

采用实时荧光定量PCR检测慢性乙型病毒性肝炎和肝硬化患者血清HBV DNA含量 ,具体操作按说明书。

1.3.5 cDNA合成反应

10mmol/L dNTP 2μl,5×RT缓冲液5μL,Oligo(dT)18 0.5μg,RNAsin 25U,MMLV逆转录酶200U,RNA 2μL,用DEPC水补充至总体积25μL。37℃ 1h,94℃,3min,cDNA置4℃保存备用。

1.3.6 筑巢式PCR

扩增白蛋白cDNA基因,引物由英韦创津公司合成。白蛋白引物序列[3]:外引物:5,-AGA AAG TAC CCC AAG TGT CAA(+),5,-AGC TGC GAA ATC ATC CAT AAC(-);内引物:5,-ACT ATC TAT CCG TGG TCC TGA(+),5,-TCT TGA TTT GTC TCT CCT TCT(-)。内参照β肌动蛋白引物[4]:5,-TCT ACA ATG AGC TGC GTG TGG(+),5,-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG(-)。PCR反应:10×PCR缓冲液3μL,2mmol/L dNTP3μL,15mmol/LMgCl23μL,TaqDNA聚合酶1U,cDNA2μL ,0.5μmol/L正、负链引物各1μL,用DEPC水补充至总体积30μL。PCR循环条件:95℃预变性30s,95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,循环30次后72℃延伸5min。白蛋白内、外引物和β肌动蛋白循环条件均相同。白蛋白外引物扩增422bp片段,内引物222bp。β肌动蛋白扩增498 bp片段。

1.3.7 肝炎血清标志物检测

包括:甲、丙、戊、庚型肝炎病毒抗体,具体操作按照说明书。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0软件处理数据,采用x2检验。

2 结果

2.1 慢性乙型病毒性肝炎患者血清HBVDNA和外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA基因表达。

46例慢性乙型病毒性肝炎患者血清HBVDNA阳性26例,阳性率为56.5%。外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性17例,阳性率为40.0%。其中,26例慢性乙型病毒性肝炎活动期患者血清HBVDNA全部阳性,HBVDNA含量为(3.6±3.4)×108copies/mL,阳性率为100%。15例外周血单个核细胞中白蛋白mRNA阳性且患者肝脏炎症反应较重,阳性率为57.7%(15/26);20例慢性乙型病毒性肝炎静止期患者中,血清HBVDNA<1×103copies/mL (阴性),2例外周血单个核细胞中白蛋白mRNA阳性,阳性率为10%(2/20)。

2.2 乙肝后肝硬化患者血清HBVDNA和外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA基因表达。

37例肝硬化患者血清HBVDNA阳性28例,阳性率为75.7%。HBVDNA浓度为(4.7±2.8)×108copies/mL。外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性12例,阳性率为32.4%。其中,21例代偿期肝硬化患者血清HBVDNA阳性率为67%(14/21),HBVDNA含量为(4.3±2.1)×106copies/mL。外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性率为14.3%(3/21)。16例失代偿期肝硬化患者血清HBVDNA阳性率为87.5%(14/16),HBVDNA含量为(5.1±3.4)×107copies/mL; 外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性率为56.3%(9/16)。40例健康人外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性率为5%(2/40)。

3 讨论

影响慢性肝病转归的因素包括宿主、HBV感染和环境因素等。其中HBV持续感染、HBV C基因型和HBV DNA 高水平复制是导致肝硬化的最重要的病原因素[5]。乙型肝炎病毒与人染色体基因整合使临床治疗复杂化[6]。实时荧光定量PCR监测乙型肝炎病毒载量的动态变化可客观评价肝病的临床进程,意义重大。但由于HBV感染的阶段性波动, 血清HBV DNA水平对慢性肝病的预测存在局限性。

人血清白蛋白(ALB)的主要生理作用包括维持血浆胶体渗透压、结合和运输内源性与外源性物质、清除自由基、抑制血小板聚集、抗凝血和营养支持等。ALB主要由肝细胞合成分泌进入血液,临床上主要用于治疗大量失血、创伤、烧伤等所致休克,水肿和低蛋白血症。1991年Carr等[7]首次报告晚期肝癌患者外周血中存在白蛋白mRNA表达。2002年牛瑞芳等亦报道[3]肝癌患者外周血单个核细胞中白蛋白mRNA阳性表达且其中21例出现肝外转移。提示外周血单个核细胞中存在白蛋白基因表达[8]。

46例慢性乙型病毒性肝炎患者中,26例活动期患者血清中HBVDNA阳性,HBVDNA含量高达108,说明病毒活跃复制;20例静止期患者药物治疗后复查血清中HBVDNA均阴性, 说明药物治疗抑制乙型肝炎病毒复制。慢性乙型病毒性肝炎活动期和静止期患者血清中HBVDNA含量比较有统计学意义(P<0.01)。26例慢性肝炎活动期患者中,15例外周血单个核细胞中白蛋白mRNA阳性,阳性率为57.7%(15/26)。阳性患者肝脏炎症反应明显,临床症状较重。20例慢性肝炎静止期患者中,2例外周血单个核细胞中白蛋白mRNA阳性,阳性率为10%(2/20),患者肝脏炎症反应消失,临床治愈。慢性肝炎活动期和静止期患者外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性率有显著性差异(P<0.01)。结果表明:外周血PBMNC中白蛋白mRNA基因表达与肝脏损害密切相关,检测外周血PBMNC中白蛋白mRNA表达可作为肝脏损害严重程度和疗效评价的无创伤的有效指标。

37肝硬化患者中,血清HBV DNA阳性28例,阳性率为75.7%。病毒含量均超过106copies/mL, HBV感染与肝硬化发生的密切关系。21例肝硬化代偿期患者HBV DNA含量为(4.3±2.1)×106copies/mL;16例肝硬化失代偿期患者HBV DNA含量为(5.1±3.4)×107copies/mL。结果表明:多数肝硬化失代偿期患者HBV活跃复制,血中HBV DNA水平高达107,提示HBV持续活动与肝硬化的临床进程密切相关。

37例肝硬化患者中,外周血PBMNC中白蛋白mRNA的阳性率为32.4%(12/37),明显高于健康人5%的阳性率(2/40),提示肝硬化患者由于肝细胞炎症导致大量细胞破坏及肝脏纤维化的后果,引起肝脏合成白蛋白能力下降,从而启动肝外细胞合成白蛋白的代偿机制。21例肝硬化代偿期患者中,白蛋白mRNA的阳性率为14.3%(3/21),与健康人份比较无显著性差异(P>0.05)。在肝硬化代偿期,肝脏强大的代偿能力可弥补部分肝细胞破坏造成合成白蛋白能力下降的影响。16例肝硬化失代偿期患者中,白蛋白mRNA的阳性率为56.3%(9/16),与代偿期比较有显著性差异(P<0.05)。在失代偿期,由于肝细胞大量破坏,残余肝细胞合成白蛋白的能力无法满足正常生理功能的需求,必须启动肝外代偿机制以补充白蛋白的不足,但这种代偿功能是有限的,不能根本解决白蛋白的缺乏。通过外周血PBMNC中白蛋白mRNA的表达,可间接反映肝细胞的损害程度,可作为慢性肝病进展、疗效评价的无创性参考指标,较常规的肝活检有积极的意义。

目前,除了已知肝细胞合成白蛋白外,尚不清楚外周血单个核细胞中何种细胞合成白蛋白,有必要进一步研究白蛋白合成细胞的组织来源和影响因素。临床白蛋白来源主要依靠献血员,数量受限且存在病原微生物感染风险。而基因重组白蛋白很难解决异种蛋白的不良反应。外周血单个核细胞采集

方便,来源丰富,如果能控制其大量合成白蛋白,将为临床白蛋白来源和药物研究提供良好平台,创造巨大的社会经济效益。

摘要：目的 研究慢性肝病患者外周血白蛋白mRNA表达与病变进程的关系。方法 采用荧光定量PCR检测慢性肝病患者血清HBVDNA;采用逆转录巢式荧光定量PCR检测慢性肝病患者外周血单个核细胞(PBMNC)中白蛋白mRNA基因表达。结果 46例慢性乙型肝炎患者中,血清HBVDNA阳性26例,阳性率为56.5%。HBVDNA浓度为(3.6±3.4)×108copies/mL;而外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性17例,阳性率为40.0%。37例肝炎肝硬化患者中,血清HBVDNA阳性28例,阳性率为75.7%。HBVDNA浓度为(4.7±2.8)×108copies/mL;外周血单个核细胞白蛋白mRNA阳性12例,阳性率为32.4%。40例健康人外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性2例,阳性率为5%。慢性肝炎肝硬化患者血清HBVDNA明显高于慢性乙型肝炎患者(Р<0.05);慢性乙肝活动期和肝硬化失代偿期外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA阳性率显著升高。结论 血清HBVDNA与慢性肝病患者病变活动和进展密切相关;外周血单个核细胞中的白蛋白mRNA表达与肝脏损害相关,二者可作为慢性肝病病情进展临床疗效评价的重要指标。

关键词：慢性乙型肝炎,HBVDNA,白蛋白mRNA,肝硬化

参考文献

[1]中华医学会传染病与寄生虫病学分会,肝脏学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志,2000,8:324-329.

[2]病毒性肝炎的防治方案[J].中华传染病杂志,2001,19(1)∶56-62.

[3]牛瑞芳,杨毅,魏熙胤,等.肝细胞癌在血中微小转移的检测[J].中华消化杂志,2002,22(9):543-545.

[4]智慧,詹俊,邓庆丽,等.外周血甲胎蛋白mRNA和白蛋白mR-NA在评估肝癌微小转移中的比较研究[J].临床检验杂志,2003,21(5):259.

[5]Friedman SL,Rockey DC,Bissell DM.Hepatic fibrosis2006:re-port of the Third AASLD Single Topic Conference[J].Hepatolo-gy,2007,45(1):242-249.

[6]张定凤.乙型肝炎的治疗面临新的挑战[J].中华肝脏病杂志,2005,13(7):481.

[7]Kar S,Carr BI.Detection of liver cells in peripheral blood of pa-tients with advanced-stage hepatocellular carcinoma[J].Hepa-tology,1995,21(2):403-407.

蛋白表达系统研究论文 篇7

p6.9基因在杆状病毒AcMNPV基因组86712-86877区域,其对应的ORF含55个氨基酸残基,翻译产物为约6.9 kDa的强碱性蛋白质P6.9[3]。P6.9中碱性精氨酸残基可中和DNA双螺旋磷糖骨架负电荷并与DNA结合形成核小体样结构,使DNA分子压缩以便包装在核衣壳中。P6.9蛋白紧密地与病毒DNA结合在一起,从而使遗传物质高度浓缩并包装至核衣壳中,P6.9因其特殊的氨基酸组成而与鱼精蛋白更为类似。从目前已经测序的杆状病毒基因组来看,均含有p6.9的同源基因,这意味着它在杆状病毒的感染过程中可能起着重要作用[4]。

为了研究P6.9蛋白的功能,我们克隆表达了AcMNPV p6.9基因并制备了P6.9抗血清,经pull-down实验检测P6.9自身的互作。为进一步深入研究P6.9与其他蛋白质相互作用共同发挥功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株和质粒

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)来自于中科院武汉病毒研究所。 E.coli菌株BL21(DE3)和DH5α为扬州大学病毒学实验室保存。表达载体pMAL-c2x、pGEX-4T-1、pET28a分别购自NEB、GE、NOVAGEN公司。克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。

1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂

Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司;Amylose Resin亲和层析柱购自NEB公司;碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG和BCIP/NBT显色试剂盒购自天根生化科技有限公司;其它生化试剂为国产分析纯。引物合成和测序由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及PCR扩增

根据AcMNPV p6.9基因序列设计两对引物,引物对p6.9-F1和p6.9-R1 的5’端分别加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,引物对p6.9-F2和p6.9-R2的5’端分别加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

p6.9-F1:5’-TGAATTCATGGTTTATCGTCGCCGTC-3’;

p6.9-R1:5’-GAAGCTTGGTTGTTAATAGTAGCGTG-3’;

p6.9-F2:5’-GGATCCATGGTTTATCGTCGCCG-3’;

p6.9-R2:5’-GAATTCTTAATAGTAGCGTGTTCTG-3’。

以AcMNPV DNA为模板PCR扩增目的片段。条件为:94℃预变性5min;94℃ 40s,56℃ 45s,72℃ 1min,25个循环;最后72℃ 延伸8min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化。

1.2.2 原核表达载体的构建

将PCR产物插入pMD19-T载体,转化DH5α感受态,测序正确后,将p6.9基因扩增片段分别用EcoRⅠ和HindⅢ、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,前者插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切的pMAL-c2x载体,后者插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的pGEX-4T-1和pET28a载体,转化DH5α感受态,酶切鉴定正确后转化BL21(DE3)。

1.2.3 融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化

将含有重组质粒pET-p6.9、pGEX-p6.9、pMAL-p6.9的BL21(DE3)细菌单克隆分别接种到LB液体培养基中,37℃振荡培养,当OD600达到0.4时,加入1mmol/L的IPTG诱导6h。三种重组质粒pET-p6.9、pGEX-p6.9、pMAL-p6.9表达的P6.9融合蛋白分别为HIS-P6.9、GST-P6.9和MBP-P6.9。诱导表达后离心收集菌体,PBS重悬(含pMAL-p6.9重组质粒的菌体用Rmylose Resin缓冲液重悬),超声波破碎,离心后分别收集上清和沉淀。取少量上样12% SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的表达和可溶性。将含重组质粒pMAL-p6.9的菌体裂解液上清进行Rmylose Resin亲和层析纯化,收集洗脱液,取少量进行12%SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 抗体制备

取含500μg MBP-P6.9蛋白的溶液加入弗氏佐剂,混匀后采用皮内多点注射免疫新西兰白兔,初次免疫1个月后再加强免疫2次,2次加强免疫间隔1w。最后一次加强免疫后2w取血,收集血清。

1.2.5 Pull-down实验

纯化后的MBP-P6.9和MBP溶液分别加入10kDa的50ml超滤管(Millipore)中,9 000 r/min、4℃离心30min去除麦芽糖并浓缩蛋白溶液5倍。取1ml的去除麦芽糖的MBP-P6.9和MBP溶液分别与25ml HIS-p6.9蛋白溶液混合,4℃摇动孵育3h。然后过Amylose Resin亲和层析柱,收集洗脱液。

1.2.6 Western blotting分析

取pull-down实验收集的洗脱液少许进行SDS-PAGE凝胶电泳,用半干电转仪将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上,用脱脂奶粉封闭膜,然后将膜放入含有P6.9抗血清的缓冲液中反应2h,再洗膜3次,后将膜移入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG的缓冲液中,室温反应2h,洗膜3次后,将膜移入10ml含NBT和BCIP溶液的缓冲液中反应,当阳性条带颜色达到要求后,终止显色反应。

2 结果与分析

2.1 p6.9基因的克隆与表达载体构建

用PCR从AcMNPV基因组DNA中扩增p6.9基因片段,将片段插入pMD19-T,转化DH5α。鉴定为阳性的重组质粒测序结果正确。随后再将p6.9基因片段用相应的限制性内切酶从T载体上切下,分别插入表达载体pET28a、pGEX-4T-1和pMAL-c2x中。转化DH5α,提取质粒PCR鉴定。结果显示,PCR扩增片段长度在100～250bp之间,与预期产物大小168bp接近,表明p6.9基因片段成功克隆到表达载体中(图1)。

2.2 P6.9蛋白的诱导表达与可溶性分析

将含重组质粒的BL21菌加入IPTG诱导蛋白表达,收集菌体后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果显示,在加诱导剂和不加诱导剂的情况下,条带变化明显。含 pET-p6.9、pGEX-p6.9或pMAL-p6.9的BL21菌经诱导后分别在12.5kDa、32.9kDa和49.4kDa处有明显的蛋白表达,且分别与P6.9融合蛋白预期的分子量相同(图2A和图2C),表明在大肠杆菌中成功表达了3种标签的P6.9融合蛋白。分离裂解液上清和沉淀后进行SDS-PAGE分析,MBP-P6.9可溶性好可以用来亲和纯化(图2C),HIS-P6.9可溶性次之(图2B),GST-P6.9最差主要以包涵体存在,不适合过柱纯化(图2B)。

M.DL2000 DNA marker;1.pMAL-p6.9;2.pET-p6.9;3.pGEX-p6.9.

A:1.Marker;2.pET28a-p6.9 before induction;3.pET28a-p6.9 after induction;4.pGEX-p6.9 before induction;5.pGEX-p6.9 after induction. B:1.Marker;2.pET-p6.9 before induction;3.pET-p6.9 supernatant after induction;4.pET-p6.9 sediment after induction;5.pGEX-4T-1-p6.9 before induction;6.pGEX-p6.9 supernatant after induction;7.pGEX-p6.9 sediment after induction. C:1.Marker;2.pMAL-P6.9 before induction;3.pMAL-P6.9 supernatant after induction;4.pMAL-P6.9 sediment after induction;5.pMAL-P6.9 after induction.

2.3 表达产物的纯化

参照NEB公司说明书对表达产物进行Amylose Resin亲和层析。将纯化后的MBP-P6.9和MBP蛋白进行SDS-PAGE检测,结果表明纯化后的蛋白只有一条带,蛋白纯化效果较好(图3)。将纯化后的MBP-P6.9免疫家兔获得抗血清。

1.The purification of MBP-P6.9;2.The purification of MBP.

2.4 Pull-down实验及Western blot检测

将纯化后并去除麦芽糖的MBP和MBP-P6.9蛋白质溶液和HIS-P6.9裂解液上清混匀,4℃孵育后经Amylose Resin亲和层析纯化,收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳。同时利用MBP-P6.9抗血清进行Western blot分析。SDS-PAGE(图4A)和Western blot(图4B)结果显示,MBP和HIS-P6.9细胞裂解液孵育后过柱收集液只有1条带,为MBP。MBP-P6.9和HIS-P6.9细胞裂解液孵育后过柱收集液有2条带(图4),上面一条带代表MBP-P6.9,下面一条带代表HIS-P6.9,说明P6.9自身存在相互作用。

A:SAS-PAGE analysis of the pull-down products.M.Protein marker;1.MBP input;2.MBP-P6.9 input. B:Western blot analysis of the pull-down products.1.MBP-P6.9 input;2.MBP input.

3 讨论

杆状病毒颗粒之中并不含有组蛋白,而只含有单一的碱性DNA结合蛋白P6.9。杆状病毒由自身编码的核心蛋白P6.9与基因组DNA形成病毒染色质。Marijo E,Wilson等的研究结果表明,亲本病毒基因组和复制后的子代病毒基因组均在感染早期形成了核小体样结构。感染后24h,宿主细胞组蛋白的合成停止;而显示一种富含精氨酸的碱性蛋白(即P6.9)开始合成,并逐渐取代组蛋白参与形成上述的亚核小体结构[6]。目前,已经有研究证明杆状病毒的p6.9基因主要功能是对DNA分子压缩以便包装在核衣壳中,并且是病毒复制的必须基因,缺失p6.9基因无法形成完整的病毒粒子[5]。但是P6.9的缺失并不影响病毒DNA在细胞中的复制[5]。另外,P6.9的C端存在一个可能与核衣壳蛋白相互作用的关键结构域[5]。另外,P6.9能上调病毒基因的转录,其调控病毒基因的表达可能通过与病毒编码的RNA聚合酶相互作用有关[4]。目前P6.9的结构还没有阐明,是否如组蛋白一样形成多聚体后发挥作用还不清楚。我们的结果显示,P6.9蛋白能在体外相互作用形成多聚体,这表明该蛋白在发挥功能可能以多聚体的形式起作用。其调控病毒基因表达也可能通过多聚体的形式实现。至于该多聚体如何与其他蛋白以及病毒DNA相互作用还有待下一步研究。

原核表达是非常强大的蛋白表达工具,能获得足量的表达产物。我们利用pMAL、pGEX、pET三种表达载体,分别表达了P6.9融合蛋白,并制备抗血清。利用表达的蛋白进行Pulldown实验成功鉴定了P6.9蛋白的相互作用,这表明,该蛋白相互作用方法简单可行,值得借鉴。

摘要：目的:在大肠杆菌中表达苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒P6.9蛋白并制备抗体,研究P6.9的自身互作。方法:用PCR方法扩增p6.9基因,将其分别克隆到原核表达载体pMAL-c2x、pGEX-4T-1、pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。选取可溶性较好的融合蛋白纯化后免疫家兔制备抗体。然后利用该抗体进行Western blot检测、分析P6.9的自身互作。结果:构建了pMAL-P6.9、pGEX-P6.9、pET-P6.9三种原核表达质粒,分别在大肠杆菌中经IPTG诱导表达产生了与预期分子量相符的MBP-P6.9(49.4kDa)、GST-P6.9(32.9kDa)、HIS-P6.9(12.5kDa)融合蛋白。制备了P6.9的多克隆抗体,能与P6.9蛋白发生特异反应。Pull-down结果表明P6.9自身互作。结论:获得了兔抗P6.9的多克隆抗体,为深入研究P6.9的功能提供了检测工具。证明了P6.9之间的互作,说明该蛋白功能的发挥可能是通过多聚体起作用的。

关键词：苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒,P6.9蛋白,原核表达,抗体,Pulldown

参考文献

[1]Miele S A,Garavaglia M J,Belaich M N,et al.Baculovirus:molecular insights on their diversity and conservation[J].Int J Evol Biol.,2011,2011:379424.

[2]van Oers M M,Vlak J M.Baculovirus genomics[J].Curr Drug Tar-gets.,2007,8(10):1051-1068.

[3]Wang R,Deng F,Hou D,et al.Proteomics of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus budded virions[J].J Virol.,2010,84(14):7233-7242.

[4]Peng Y,Li K,Pei R J,et al.The protamine-like DNA-binding pro-tein P6.9 epigenetically up-regulates Autographa californica multiple nu-cleopolyhedrovirus gene transcription in the late infection phase[J].VirolSin.,2012,27(1):57-68.

[5]Wang M,Tuladhar E,Shen S,et al.Specificity of baculovirus P6.9 bas-ic DNA-binding proteins and critical role of the C terminus in virion for-mation[J].J Virol.,2010,84(17):8821-8828.

蛋白表达系统研究论文 篇8

关键词：胃癌,PTEN,临床生物学行为,免疫组织化学

胃癌的发生、发展是一个多因素和多步骤的过程,涉及到多方面机制,癌基因的激活和抑癌基因的失活是该过程中的重要分子机制之一。与张力蛋白同源、在10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphataseand tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是近年发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因。研究发现PTEN基因突变、缺失及异常表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关[1~3]。本研究通过检测PTEN基因在胃癌组织中的表达,分析其与胃癌临床生物学行为的关系,探讨其在胃癌发生、发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

2005年10月~2006年8月我院行手术切除的胃癌标本73例,另取正常胃黏膜标本(距癌灶边缘>5.0 cm的阴性残端)30例作对照。73例患者中男53例,女20例,年龄21~76岁,中位年龄为62岁。术前均未行放疗或化疗。按“胃癌诊治规范”[4]进行统计分组。

1.2 方法

手术切除的胃癌组织、正常胃黏膜用10%中性缓冲福尔马林液中固定24小时,常规石蜡包埋。行4μm连续切片,每例取1张作HE染色,另取2张行免疫组织化学染色。采用SP法,一抗为鼠抗人PTEN单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司),SP免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司),以已知阳性切片为阳性对照;以PBS代替一抗为阴性对照。染色过程按试剂盒说明操作。

1.3 结果判定

胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。随机观察5个高倍视野,每个视野计数100个细胞,先根据阳性细胞所占的百分数计分:<5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;再根据阳性细胞染色强度计分:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;然后根据两者相加所得的总分进行结果判定:0、1分为阴性(-),2、3分为弱阳性(+),4、5分为中度阳性(++),6、7分为强阳性(+++)[5]。

1.4 统计方法

数据应用SPSS 12.0软件进行统计学分析,采用计数资料χ2检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 P TEN蛋白在正常胃黏膜及胃癌组织中的表达

PTEN蛋白在正常胃黏膜中的阳性表达率为100%,在胃癌组织中的阳性表达率为53.42%,低于在正常胃黏膜中的表达,二者比较差异有显著性(P<0.05)。

2.2 胃癌组织中P TEN蛋白的表达与临床生物学行为的关系

注:1)P<0.05,2)P<0.01

3 讨论

PTEN蛋白具有双特异性磷酸酶活性,对酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸有脱磷酸化作用,又可去除磷脂酞肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)上的磷酸基团。通过降低PIP3水平,阻断PI3K/Akt信号通路,实现对细胞凋亡的调控[6]。PTEN蛋白促使p27kip1与Cyclin E/CDK2复合物结合后,显著抑制CDK2活性,并使p Rb磷酸化下调,低磷酸化的p Rb不能释放转录因子E2F,使DNA复制酶表达抑制,细胞停滞于G1期而不能进入S期[7]。研究发现PTEN基因的突变率在原发性胶质母细胞瘤为17.00%,乳腺癌为6.00%,前列腺癌为100%[1];在食管癌和结肠癌中PTEN蛋白呈低表达[8,9];说明PTEN基因的表达异常参与了肿瘤的发生。本研究结果显示,PTEN蛋白在正常胃黏膜中全部呈阳性表达,而胃癌组织表达的阳性率为53.42%,二者比较差异有显著性(P<0.05),说明PTEN基因表达异常参与了胃癌的发生。

把PTEN基因导入缺失PTEN的成胶质细胞瘤细胞系U87MG细胞中,发现细胞生长、侵袭、转移受到抑制[10];PTEN通过调控MMPs而抑制细胞外基质和基底膜降解[11,12]。研究发现PTEN蛋白表达高低与胃癌的病理分级及患者预后有关,预后越差,恶性程度越高,PTEN蛋白表达水平越低[13]。本研究结果显示,PTEN蛋白在长径≥5 cm癌组织中的阳性表达率(43.14%)显著低于<5 cm(77.27%);浸润型的阳性表达率(32.61%)显著低于局限型(88.89%);低分化癌的阳性表达率(41.03%)显著低于高中分化癌(67.65%);浸润深度T3+T4的阳性表达率(48.44%)显著低于T1+T2(88.89%);有淋巴结转移的阳性表达率(36.36%)显著低于无转移者(79.31%);临床分期Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率(39.13%)显著低于Ⅰ、Ⅱ期(77.78%)。说明PTEN蛋白低表达在胃癌的增殖、浸润、转移等过程中起到了促进作用。而胃癌组织中PTEN蛋白表达与患者性别、年龄及肿瘤部位均无关。

蛋白表达系统研究论文 篇9

研究发现,HER2 m RNA在加工过程中可通过选择性地剪接,产生一种天然的可溶性蛋白———Herstatin[8],主要在胚胎早期发育过程中表达。近年来,在一些肿瘤组织中叶发现Herstatin的存在[9,10]。Herstatin的N末端包含HER2胞外区第Ⅰ、第Ⅱ结构域,C末端由HER2基因第八内含子编码的79个氨基酸构成[11],能与HER2和EGFR高亲和力结合,抑制erbB家族成员形成异源或同源二聚体,降低受体酪氨酸磷酸化水平,抑制肿瘤细胞生长[12,13]。同位素竞争抑制试验发现,C末端的79个氨基酸也能与HER2结合,亲和常数为61 nmol/L;吸附实验证实,C末端的79个氨基酸亦能与EGFR结合[8]。因而,Herstatin C末端的79个氨基酸可作为一个理想的肽段与EGFR单抗融合,为EGFR单抗提供结合HER2的位点。而且关于全长抗体基因的重组腺病毒治疗肿瘤的研究证实,应用腺病毒介导的全抗体基因治疗是一种可行的肿瘤治疗新方案。为此,选择美国食品药品管理局(FDA)批准上市的治疗实体瘤的单抗cetuximab(商品名:爱必妥c-225]作为全抗体治疗基因,与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合后,利用腺病毒系统来表达该抗体,并对抗体在体外表达剂量、生物学性状及功能进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

携带cetuximab全长基因的质粒pDC339-AT2由第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室改造保存。腺病毒E1区转化人胚肾细胞株293购自加拿大Microbix Biosystem公司,EGFR高表达而Her2阴性的人皮肤基底细胞癌A431细胞株和Her2高表达卵巢癌细胞株SK-OV-3购自美国ATCC公司。质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司,实验用限制性内切酶及连接酶均购自NEB公司,回收试剂盒Nucleospin ExtractⅡ购自MACHER-EY-NAGEL公司,高保真PCR试剂盒购自TOYO-BO公司。细胞培养基购自Gibco公司,96孔板细胞培养皿购自美国Cloning公司,RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自TOYOBO公司。蛋白质测定仪购自Eppendorf公司,PCR仪购自BIOMETRA公司,倒置荧光显微镜TE300购自日本Nikon公司,XDS-1B倒置相差显微镜购自重庆光电仪器有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据引物设计原则,应用Vector NTI软件中的primer design程序,获得引物序列1—9,并且分别在引物3和5的5'端引入酶切位点Nsi I和BamHI。具体序列如下:引物1:5'CG

AGGTACCCACTCACTGC3';引物2:5'TCAGC-CTTCATACCGGGAC3';引物3:5'ACGTGCGGATC-CTTATCAGCCTTCATACCGGGAC3';引物4:5'CAC-TACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTAAA GGTACCCACTCACTGC3';引物5:5'ACTGTTATG-CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAG CC3';引物6:5'CATGCCATGGAAGGATCTGCGATC GCTC3';引物7:5'CGCGGATCCGTAGGCGCCGGT-CACAGCTTG3';引物8:5'CTGGCCAATACCAAC-CTTA3';引物9:5'ATATGAGCTCACAATGCTTC3';以上引物均由Invitrogen公司合成,并在使用前配置成10μM备用。

1.3 腺病毒穿梭质粒载体p DC339-AT2-Herin的构建

取对数生长期SK-OV-3细胞铺六孔板,370C二氧化碳培养箱孵育24小时后,用TOYOBO公司RNA提取试剂盒提取RNA,并用反转录试剂盒反转录(具体步骤参见试剂盒说明书),以反转录产物为模板,引物1和2为进行聚合酶链式反应,并用MA-CHEREY-NAGEL公司回收试剂盒回收扩增产物(具体步骤参见试剂盒说明书);以此产物为模板,引物3和4再次进行PCR,在第一次扩增产物的基础上延伸,得到研究需要的序列,并回收扩增产物;以第二次扩增产物为模板,引物3和5再次进行PCR,并在两端加上酶切位点Nsi I和BamHI,并回收扩增产物,得到目的基因Herin。以Nsi I和BamHI双酶切Herin及携带表达EGFR全长抗体的载体pDC339-AT2,电泳,回收后,用SolutionI链接酶链接,16℃水浴10 h后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态,铺带Amp抗性的琼脂板后,37℃生化培养箱内培养12 h。挑取单克隆,在含Amp的LB溶液中,37℃摇床扩增12 h,PCR法筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA,PCR鉴定及测序正确后命名为p DC339-AT2-Herin。

1.4 腺病毒Ad5-AT2-Herin的重组及扩增

75 cm2培养瓶中培养293细胞,将质粒pDC339-AT2-Herin与腺病毒骨架质粒pBGHE3(包含除188 bp-1339 bp以外的整个5型腺病毒基因)利用Lipofectamine2000共转染至293细胞,通过同源重组的方法获得病毒。共转染(9—14)d将出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,即得到表达AT2-Herin的重组腺病毒,应用QIAamp DNA Kit提取重组腺病毒DNA,PCR方法对重组病毒及野生型腺病毒进行鉴定(分别用引物3和5;6和7;8和9),正确克隆命名为Ad5-AT2-Herin。用Ad5-AT2-Herin感染293细胞,48 h候后,经80℃和37℃反复冻融3次,收集病毒上清。

1.5 ELISA检测AT2-Herin融合蛋白的表达

1.5.1 抗体标本收集

293细胞铺24孔板,5×104/孔,CO2孵箱培养24 h;换用无血清培液,每孔分别按MOI=20,40,80加入病毒Ad5-AT2-Herin,2 h后换5%FBS培养液,CO2孵箱培养;分别在第3 d、5 d吸取细胞培液用于双抗夹心ELISA方法检测;实验重复三次,结果用平均值±标准差来表示。

1.5.2 双抗夹心ELISA法检测AT2-Herin融合蛋白的表达

(1)用包被稀释液将鼠抗人IgG1抗体稀释到1.0μg/m L浓度,100μL/孔包被酶标反应板,4℃孵育过夜。(2)洗涤液洗涤5遍,拍干,每次3 min。(3)每孔加入封闭液100μL/孔,37℃孵育60 min。(4)洗涤液洗涤5遍,拍干,每次3 min。(5)加入样品(经样本稀释液适当稀释)及标准品Herceptin(倍比稀释)。每孔100μL,设复孔,37℃孵育40 min。(6)洗涤液洗涤5遍,拍干,每次3 min。(7)加入HRP标记的鼠抗人Ig G1抗体1μg/m L,100μL/孔,37℃孵育60 min。(8)洗涤液洗涤5遍,拍干,每次3 min。(9)加入底物液A、B混合液(按1∶1混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液),50μL/孔,37℃避光显色。(10)当显色满意后,每孔加入2 m L硫酸终止液终止反应,酶标仪测A450 nm的OD值。最后绘制标准曲线,计算出样品的表达量。

1.5.3 Western Blot法检测融合蛋白AT2-Herin的表达

(1)抗体标本收集方法同前ELISA操作。(2)取1 m L 10%分离胶溶液,加5μL TEMED后混匀,加入玻璃板内底部聚合封口;(3)将槽内多余液体倒去,水洗3次,剩余9 m L分离胶溶液加5μL TEMED混匀,注入玻璃板内,加水覆盖;(4)聚合完成后倒掉水覆盖物,以10%的积层胶4 m L,加入5μL TEMED混匀,注入分离胶上端;(5)插入加样梳,将凝胶玻璃板放入电泳槽,聚合(5—6)min,缓慢拔去加样梳,水洗加样孔;(6)将样品(包括蛋白分子标记物)和2×SDS加样缓冲液等比混合,100℃加热3 min使蛋白变性,按顺序加样;(7)50 V,20 m A电泳,至染料抵达分离胶与积层胶交界处;(8)70 V,25 m A电泳,至染料抵达分离胶底部;(9)将硝酸纤维薄膜漂浮于转移缓冲液,借毛细作用湿润,做好标记;(10)将3 MM滤纸浸泡于转移缓冲液,取下凝胶置于硝酸纤维薄膜上,再置于6张3 MM滤纸中间,3 V,90 m A,电转移1.5 h至硝酸纤维薄膜上;(11)丽春红S染液染色2 min,观察转膜情况,去离子水清洗,1×TBST平衡3次,每次5 min;(12)封闭液封闭1 h,1×TBST洗膜3次,每次5 min;(13)加Ⅰ抗反应,室温1 h,1×TBST洗膜3次,每次5 min;(14)加Ⅱ抗,室温反应1 h,1×TBST洗膜三次,每次5 min;(15)加入显色液,并转至显影胶片。

1.5.4 间接免疫荧光实验(IFA)检测Ad5-AT2-

Herin表达AT2-Herin融合蛋白的特异性

用HER2(+)的细胞SK-OV-3和HER2(-)而EGFR高表达的细胞A431,分别计数铺96孔板,1×104/孔,CO2孵箱24 h;将96孔板中的液体吸去,1×PBS洗2次;加多聚甲醛,30μL/孔,放置(5—10)min;将96孔板中的液体吸去,1×BSA洗3次,最后一次至少放置2 min;加入以上实验收集的标本,30μL/孔,商品化Hercptin作为阳性对照;冰浴2 h;加入带有荧光素的鼠抗人Ⅱ抗,30μL/孔,冰浴1 h,避光放置;将96孔板中的液体吸去,1×BSA洗3次,最后一次至少放置2 min。将96孔板中的液体吸去,加1×BSA,30μL/孔,荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 腺病毒Ad5-AT2-Herin插入基因PCR鉴定电泳图

(N:阴性对照;P:阳性对照;M:MIX marker;1-5:Ad5-AT2-Herin 1-5号克隆)

2.2 ELISA方法检测Ad5-AT2-Herin在293细胞中的AT2-Herin融合蛋白表达情况

重组腺病毒Ad5-AT2、Ad5-AT2-Herin分别按MOI=10、50、100、200、800感染24孔板细胞72 h和96 h后收集上清,通过双抗体夹心ELISA方法检测抗体的表达量,并取三次检测结果的平均值,结果如下(单位:ng/m L):Ad5-AT2与Ad5-AT2-Herin的表达量分别是:321.2±4和313.3±4;

2.3 Western Blot法检测融合蛋白AT2-Herin的表达情况

Ad5-AT2、Ad5-AT2-Herin所表达抗体的Western Blot检测轻重连一致(如图2)。

(S:标准品Cetuximab;1:Ad5-AT2;2:Ad5-AT2-Herin)

2.4 间接免疫荧光实验(IFA)检测Ad5-AT2-Her-in表达融合蛋白AT2-Herin的特异性

2.4.1 AT2-HERIN与EGFR特异性结合

荧光显微镜显示抗体融合蛋白AT2-HERIN与EGFR阳性的A431细胞表面抗原结合,荧光强度与商品化Cetuximab相似,表明该腺病毒表达的抗体可以与EGFR呈特异性结合(见图3)。

2.4.2 AT2-HERIN与HER2特异性结合

荧光显微镜显示抗体融合蛋白AT2-HERIN能与HER2阳性、EGFR阴性的SK-OV-3细胞表面抗原结合,荧光强度与商品化Herceptin相似,而Ad5-AT2表达的AT2(Cetuximab)抗体在SK-OV-3细胞表面未见明显荧光。

3 结论

成功构建了cetuximab全长抗体Fc段与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合的双特异性抗体的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin;ELISA检测显示融合了Herin的全长抗体cetuximab与单一cetuximab表达一致,表明融合了Herin后AT2的表达量不受影响;Western Blot检测显示全长抗体cetuximab与Herin融合后,抗体Cetuximab的轻重链表达仍然平衡,表明此抗体Fc段融合Herin后,轻重链的平衡不受影响;间接免疫荧光实验(IFA)检测显示结果表明,Ad5-AT2-Herin表达的融合蛋白与EGFR(+)的A431细胞表面受体呈高亲和力结合,与HER2(+)的SK-OV-3细胞表面受体也呈高亲和力结合,而单一的cetuximab与SK-OV-3细胞表面受体几乎无结合。也证明了Herin与抗体Cetuximab的Fc段融合后,与HER2受体结合的能力不受影响,从而证明cetuximab全长抗体Fc段与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合后既能与EGFR结合又能与HER2结合。

4 讨论

Herstatin是EGFR家族的天然抑制因子,特别是C末端的HER2第八内含子编码的79个氨基酸,能与HER2和EGFR呈高亲和力特异性结合,抑制erbB家族成员形成异源或同源二聚体,降低受体酪氨酸磷酸化水平,抑制AKT活化[8]。cetuximab是许多类型恶性肿瘤临床治疗的一线药物。实验将cetuximab抗体全长基因与Herstatin C末端的编码的79个氨基酸的基因(Herin)融合,装入腺病毒载体,构建重组腺病毒Ad5-AT2-Herin,通过该腺病毒载体表达该双特异性抗体融合蛋白,以达到同时靶向EGFR和HER2目的。通过ELISA、Western bolt及IFA实验从表达量、轻重链平衡性及双靶向三个方面来验证,并达到了预期。

但全长抗体通过Fab段与靶细胞表面抗原决定簇特异性结合后,其Fc段可与NK细胞表面FcγRIII结合,从而使NK细胞对靶细胞产生非特异性杀伤作用,发挥抗体介导的细胞毒效应(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。ADCC效应是抗体杀伤肿瘤细胞的一个主要方式,而在体外这一效应无法体现,因而抗体在体外的抗肿瘤作用不强,在初步实验也证实Ad5-AT2-Herin对肿瘤细胞A431、SK-BR-3的杀伤作用不明显。为明确Ad5-AT2-Herin的抗肿瘤作用,目前正准备通过皮下接种,建立携带EGFR、HER2双阳性的肝癌细胞Hep3B的荷瘤小鼠模型,检测Ad5-AT2-Herin的体内抗肿瘤作用。

摘要：构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力。通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。ELISA检测分析表明,Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL—317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。

蛋白表达系统研究论文 篇10

哺乳动物细胞表达系统中,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO) 作为真核表达系统能对表达的蛋白进行翻译后加工,是目前生产重组糖基蛋白的首选体系[5,6]。天然存在的hBMP7是一种二聚体化的糖蛋白,因此本文选择CHO细胞进行重组表达hBMP7,探讨其在CHO细胞中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

pOptivECTM-TOPO® TA Vector Kit(12744-017)和二氢叶酸缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)购自Invitrogen公司;含有编码人骨形态发生蛋白7 cDNA序列的重组质粒pBluescript-hBMP7保存于作者实验室。

1.1.2 试剂

Mouse anti-rhBMP7 antibody 购自R&D公司,Rabbit anti Mouse IgG-AP购自福州中杉金桥生物技术有限公司。Plasmid Midi Kit 购自QIAGEN公司。硝酸纤维素薄膜购自Whatman公司,ELISA 96孔板购自Canda JET Biochemical公司。

1.1.3 仪器

Gene Genius凝胶成像系统及Genes snap凝胶分析软件(Bio Imaging System);T-GRADIENT PCR仪(Biometra,Gottingen,Germany);二氧化碳恒温培养箱(Thermo);电转仪(BTX2001);0.2ml电转化杯(BIO-RAD,U.S.A);96孔酶标板;Elx800酶标仪(BIO-TEK,U.S.A)。

1.1.4 培养基

LB培养基(Yeast Extract 0.5%,Trypton 1%,NaCl 1%,pH 6.5～7.0,固体培养基含2%琼脂粉);完全培养基CD DG44 Medium购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 pOptivECTM-TOPO®-hBMP7重组表达质粒的构建

以实验室保存的 pBluescript-hBMP7 质粒为模板,通过引物(上游:5’CGGAATTCGCGATGCACGTGCGC 3’,下游:5’CGGAATTCCTAGTGGCAGCCACAGGC 3’)扩增hBMP7全长cDNA。按pOptivECTM-TOPO® TA质粒试剂盒操作说明将扩增的hBMP7全长cDNA片段连接到CHO细胞表达载体pOptivECTM-TOPO®上。连接产物转化大肠杆菌TOP10,用载体上的CMV上游引物(5’CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3’)和hBMP7 cDNA的下游引物(5’CTAGTGGCAGCCACAGGC 3’)进行PCR筛选阳性转化子。筛选到的阳性转化子最终测序确定表达序列和阅读框的正确性。

1.2.2 重组CHO/DG44细胞株的构建

构建好的重组表达质粒pOptivECTM-TOPO®-hBMP7用PVUⅠ酶进行线性化。用BTX2001 电转化仪和0.2ml电转化杯将10μg纯化后的线性化DNA电转(电压120V,电击时间5ms,脉冲次数7)到8 ×106个CHO/DG44细胞中。37℃水浴10min之后将细胞转入完全培养基,待细胞恢复正常生长状态后传代。提取细胞基因组PCR鉴定hBMP7 表达质粒是否成功导入到CHO/DG44细胞中,PCR的引物为载体上的通用引物(上游:5’CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3’,下游:5’ CCTTATTCCAAGCGGCTTCG 3’)。反应条件为:95℃ 5min,94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 1min,共30个循环,72℃延伸10min。

1.2.3 RT-PCR检测hBMP7 在CHO/DG44 细胞中的转录

用Trizol 法提取重组CHO/DG44细胞总RNA。提取过程简要如下:1 000r/min离心5min收集约5×106个重组CHO/DG44细胞,PBS洗涤1次后加入800μl Trizol,吹吸裂解细胞,室温静置10min。酚/氯仿抽提去除蛋白,上清用2倍体积异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤沉淀1次,RNA沉淀用30μl DEPC处理的水溶解。提取的总RNA用逆转录酶制备成cDNA,并用hBMP7成熟肽上设计的一对引物(上游:5’TCCACGGGGAGCAAACAG 3’,下游:5’CTAGTGGCAGCCACAGGC 3’)进行PCR检测。

1.2.4 rhBMP7表达产物的DOT-BLOT和ELISA分析

DOT-BLOT检测时,取10μl的培养上清点在0.45μm醋酸纤维膜上,醋酸纤维膜随后用3%的BSA 4℃封闭过夜。封闭后的膜在hBMP7一抗溶液(1:1 000稀释在TTBS中)中37℃孵化1h之后用TTBS洗涤3次,每次15min。再将膜放入偶合有碱性磷酸酶的二抗溶液中37℃孵化1h之后用TTBS洗涤3次,每次15min。最后用NBT/BCIP进行显色。

ELISA检测时,取50μl的培养上清进行包被。每个样品做3个复孔,4℃包被过夜。以未导入重组表达载体的细胞培养液作阴性对照。一抗的稀释度为5ng/μl,每孔加50μl。二抗为偶合有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1:1 000稀释)。

2 结果与分析

2.1 hBMP7重组表达质粒的构建

PCR扩增出全长hBMP7 cDNA后连接到pOptivECTM-TOPO®载体上并转化Top10大肠杆菌。用CMV启动子引物和hBMP7的全长cDNA下游引物进行PCR鉴定各转化子,结果如图1所示,从图中可以看出泳道1产生了大小约1 400bp的片段,符合预期结果,是连接正确的转化子。同时测序表明该重组质粒中hBMP7序列和阅读框均正确。

2.2 hBMP7重组CHO/DG44细胞株的构建

重组hBMP7表达质粒经内切酶酶切线性化后电转CHO/DG44细胞。提取细胞基因组DNA,用序列特异性引物鉴定hBMP7是否整合到细胞的基因组上。PCR结果如图2所示,未转染质粒的细胞基因组没有扩增出目的片段(泳道1),转染了重组质粒pOptivECTM-TOPO®-hBMP7细胞基因组扩增出了大小约1 550bp的特异性片段(泳道2),此结果表明hBMP7已经成功整合到细胞基因组上。

M:DNA Marker; Lane 1:CHO/DG44 cells untransfected with recombinant plasmids; Lane 2:CHO/DG44 cells transfected with recombinant plasmids.

2.3 hBMP7在CHO/DG44细胞中的表达检测

M:DNA Marker; Lane 1:CHO/DG44 cells transfected with recombinant plasmids; Lane 2:CHO/DG44 cells untransfected with recombinant plasmids.

hBMP7重组表达质粒已经整合到细胞基因组上,但能否在细胞中表达?作者从转录水平和蛋白水平进行分析。首先提取细胞总RNA进行RT-PCR鉴定外源基因是否成功转录成mRNA。用 hBMP7成熟肽的上下游引物进行 RT-PCR,结果如图3所示。从转染重组质粒的细胞中扩增出了大小与预期一致的片段,未转染质粒的细胞没有扩增出相应大小的片段,说明hBMP7表达序列在CHO/DG44细胞中得到成功转录。

取10μl培养7d后的培养液上清进行点杂交和ELISA检测,结果表明重组CHO/DG44细胞能表达rhBMP7。

A:Dot blot分析;B:ELISA分析rhBMP7 的表达(1:未导入重组表达载体的细胞培养上清; 2:导入重组表达载体的细胞培养上清)。

A:Dot blot analysis;B ELISA analysis (1:Supernatant of CHO/DG44 cells untransfected with recombinant plasmids; 2:Supernatant of CHO/DG44 cells transfected with recombinant plasmids).

3 讨论

BMP7是骨形态发生蛋白家族的成员之一,具有诱导成骨、促进成骨细胞增殖分化、诱导软骨细胞分化的作用[7],并具有肾脏保护作用[8]。BMP7具有的这些生理功能使之成为重组表达的研究热点[9,10]。BMP7是一种二聚体化的糖蛋白,需要翻译后加工过程。原核表达系统没有翻译后加工机制,显然不适合这种蛋白的表达。毕赤酵母是真核生物,能对表达的蛋白进行翻译后加工。但hBMP7并不适合在毕赤酵母中表达,原因是毕赤酵母只能表达单体形式的重组hBMP7,不能形成天然构象的二聚体蛋白,这极大的影响了其生理活性[9]。CHO是哺乳动物细胞表达系统,与人类细胞最为接近,目前在CHO中已成功表达了许多有生理活性的人类蛋白[11,12,13]。

CHO表达系统是否适合hBMP7的表达?本研究采用CHO/DG44细胞对hBMP7的表达进行研究。利用Invitrogen公司的pOptivECTM-TOPO®表达载体构建了重组质粒pOptivECTM-TOPO®-hBMP7,将重组质粒电转染到CHO/DG44细胞中构建重组细胞株,RT-PCR检测到hBMP7成功转录其mRNA。DOT-BLOT和ELISA进一步分析表明CHO/DG44细胞能成功表达rhBMP7。但hBMP7在CHO/DG44细胞中的表达量还较低,这也是今后研究中需要进一步解决的问题。

摘要：目的:构建重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP7)表达质粒,并研究其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达。方法:将hBMP7重组表达质粒电转到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,并用DOT-BLOT和ELISA方法分析检测rhBMP7在重组CHO细胞中的表达。结果:hBMP7 cDNA整合到CHO细胞基因组中并被转录。点杂交和ELISA检测证实rhBMP7在CHO细胞中得到表达。结论:hBMP7成功在CHO表达系统中得到表达。