蛋白和mRNA表达

蛋白和mRNA表达（共7篇）

蛋白和mRNA表达 篇1

摘要：目的 探讨乳腺癌组织中bcl-w基因mRNA及蛋白表达情况及其临床意义。方法 应用Re-al-time PCR及Western blotting等分子生物学技术检测抗凋亡基因bcl-w的转录及翻译水平(即mRNA及蛋白表达水平)。结果 ①mRNA表达情况:bcl-w的mRNA表达水平在各期乳腺癌组中均高于正常乳腺组(P<0.05);而乳腺癌TNM临床分期中,II期、III期和IV期均高于I期(P<0.05),而前三者之间差异无显著性(P>0.05);②蛋白表达情况:bcl-w的蛋白表达水平在各期乳腺癌组中均高于正常乳腺组(P<0.05);而乳腺癌TNM临床分期中,II期、III期和IV期均高于I期(P<0.05),而前三者之间差异无显著性(P>0.05)。结论bcl-w在乳腺癌发生及发展恶化过程发挥着重要作用,抑制bcl-w表达水平,可作为乳腺癌的一种潜在治疗方法。

关键词：乳腺癌,凋亡,bcl-w

乳腺癌是女性罹患的主要恶性肿瘤之一,且因其对女性本身及家庭所造成的多重问题,而严重危害女性的身体及家庭健康!近年来,关于乳腺癌的研究表明,凋亡相关基因bcl-w与乳腺癌的发生、发展关系密切[1,2],但均仅限于细胞实验研究。本研究采用实时定量PCR(Real-time PCR)及Western blotting方法检测乳腺癌组织中bcl-w基因的m RNA及蛋白表达情况及其与乳腺癌临床分期的关系,探讨其在乳腺癌发生发展过程中的作用。

1 临床资料与方法

1.1 标本来源

收集我院2011年3月2日~2012年6月30日手术切除的27例乳腺癌组织,患者均为女性,其中:TNM分期I期6例,II期6例,III期6例,IV期3例(临床病例比较少,收集不易),正常乳腺组织6例。均取用1 cm见方的组织块,经液氮中暂存,随后置于-80℃保存备用。

1.2 材料与试剂

1.2.1 Western blotting

RIPA裂解液购自碧云天公司;BCA定量试剂盒购于珠海健康元公司;兔抗人Bcl-w的[Bcl-w(31H4)Rabbit m Ab,#2724]采购自美国Cell signaling公司,内参鼠源性的beta-actin抗体购于北京博奥森公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均采购自武汉博士德公司,Super Signal ECL化学发光液购自美国Pierce公司。

1.2.2 Real-time PCR

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,DEPC购自深圳晶美公司,Poly A、DNA polymerse I、RNase inhibitor、RNase H均购于加拿大Fermantas公司,EXScript TMRT reagent Kit、SYBR Green荧光染料购自Ta Ka Ra公司;Bcl-w的引物序列:前引物为CACCCAGGTCTCCGATGAAC,后引物:TTGTTGACACT CTCAGCACAC。

1.3 实验方法

1.3.1 Real-time PCR

采用Real-time PCR方法检测乳腺癌组织中的bcl-w基因的m RNA表达水平。将癌组织用研钵研磨制成组织匀浆;加入Trizol试剂进行消化、裂解,室温放置5 min使充分裂解;加入氯仿/异丙醇/75%乙醇抽提总RNA;应用EXScript TMRT reagent Kit进行RT-PCR,获得m R-NA;应用Real-time PCR仪,对获得的m RNA进行实时定量PCR反应,以测定乳腺癌组织中bcl-w基因的m RNA表达水平。

1.3.2 Western blotting

应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测乳腺癌组织中的bcl-w基因的蛋白表达水平。将癌组织用研钵研磨制成组织匀浆;加入含蛋白酶抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,冰上裂解20~30 min,12 000 r/min离心20 min,提取上清即为所需要的蛋白质;应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量;配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳;转印至硝酸纤维素膜(NC膜)上;用脱脂牛奶进行封闭;加入Bcl-w抗体/beta-actin抗体,4℃过夜;加入HRP标记的山羊抗兔/山羊抗鼠的二抗,2~3 h;加ECL化学发光液,应用凝胶成像系统,拍照记录。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行ANOVA分析等统计学处理。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 bcl-w基因在正常乳腺及各期乳腺癌组织中的m RNA表达水平

Real-time PCR的结果显示:bcl-w的m RNA表达水平在各期乳腺癌组中均高于正常乳腺组(P<0.05);而乳腺癌TNM临床分期中,II期、III期和IV期均高于I期(P<0.05),而前三者之间差异无显著性(P>0.05)。结果见表1。

2.2 bcl-w基因在正常乳腺及各期乳腺癌组织中的蛋白表达水平

Western blotting的结果显示:Bcl-w的蛋白表达水平在各期乳腺癌组中均高于正常乳腺组(P<0.05);而乳腺癌TNM临床分期中,II期、III期和IV期均高于I期(P<0.05),而前三者之间差异无显著性(P>0.05)。详见表2和附图。

3 讨论

肿瘤是机体细胞增殖与凋亡的失衡破坏组织自稳态而引发了不同部位的疾病。bcl-2是细胞凋亡中最早发现的基因,Bcl-2家族也因此命名,其家族成员在细胞凋亡过程中起着决定性的作用。bcl-w基因,即B细胞淋巴瘤基因w,是Bcl-2超家族中抗凋亡基因的比较新的成员之一[3],与抗凋亡基因bcl-2具有较高的同源性。

近年的临床资料研究表明,bcl-w与大肠癌[4]、胃癌[5]、肝癌[6]及胆囊癌[7]等多种肿瘤的发生发展有着密切关系;抗雌激素是对雌激素受体阳性的乳腺癌的有效治疗手段,而细胞实验发现,bcl-w可与其他多种抗凋亡份子bcl-2、bcl-xl等共同被抑制,回复乳腺癌细胞的抗雌激素敏感性,而发挥一定的治疗作用[1,8,9]。

本研究显示:bcl-w在正常的乳腺组织中有一定的表达量,而与正常组对比,乳腺癌各期均表现较高的m RNA水平和蛋白水平;而II、III和IV期患者乳腺癌组织中均高于I期患者,提示随着肿瘤的发展严重,bcl-w的翻译及蛋白表达水平均表达增高,说明bcl-w与肿瘤的发展恶化有一定的正相关关系。

细胞实验发现:CRAWFORD等[1]研究发现bcl-w和bcl-2同时抑制能够有效地促进MCF-7乳腺癌细胞系的死亡;而SHEN等[2]发现在MCF-7乳腺癌细胞系中,mi R-497能够通过调节bcl-w而诱发细胞凋亡;可见bcl-w的低表达或失表达在乳腺癌细胞的凋亡过程在发挥着重要作用[2,8,9,10]。

总之,抗凋亡基因bcl-w在乳腺癌组织中的m RNA和蛋白表达情况表明bcl-w基因参与了乳腺癌的凋亡过程,其表达可能影响乳腺癌的临床预后,可作为乳腺肿瘤潜在的治疗靶点,具有重要的临床意义。

参考文献

[1]CRAWFORD AC,RIGGINS RB,SHAJAHAN AN,et al.Co-inhibitionof BCL-W and BCL2 restores antiestrogen sensitivity through BECN1and promotes an autophagy-associated necrosis[J].PLoS One,2010,5(1):e8604.

[2]SHEN L,LI J,XU L,et al.MiR-497 induces apoptosis of breast cancercells by targeting Bcl-w[J].Exp Ther Med,2012,3(3):475.

[3]GIBSON L,HOLMGREEN SP,HUANG DC,et al.Bcl-w,a novelmember of the bcl-2 family,promotes cell survival[J].Oncogene,1996,13(4):665.

[4]张隽,乔岐禄,赵建勋,等.Bcl-w在大肠癌中的表达及临床意义(英文)[J].中国现代医学杂志,2007,17(12):1413-1417.[4]ZHANG J,QIAO QL,ZHAO JX,et al.Bcl-w expression and its clinicalsignificance in colorectal adenocarcinoma[J].China Journal of ModernMedicine,2007,17(12):1413-1417.Chinese

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[6]吴国强,徐宏勇,李开宗,等.bax、bcl-w基因在肝细胞癌中表达及其临床意义[J].山东医药,2002,42(22):8-9.[6]WU GQ,XU HY,LI KZ,et al.Expression and its significance of baxand bcl-w in hepatocellular carcinoma[J].Shandong Medical Journal,2002,42(22):8-9.Chinese

[7]徐宏勇,李开宗,付由池,等.Bcl-w蛋白在原发性胆囊癌中的表达及意义[J].第四军医大学学报,2000,21(11):1349-1351.[7]XU HY,LI KZ,FU YC,et al.Expression and its significance of anti-apoptosis protein Bcl-w in primary gallbladder carcinomas[J].J FourthMil Med Univ,2000,21(11):1349-1351.Chinese

[8]NING Y,RIGGINS RB,MULLA JE,et al.IFN gamma restores breastcancer sensitivity to fulvestrant by regulating STAT1,IFN regulatoryfactor 1,NF-kappaB,BCL2 family members,and signaling to cas-pase-dependent apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2010,9(5):1274.

[9]OAKES SR,VAILLANT F,LIM E,et al.Sensitization of BCL-2-ex-pressing breast tumors to chemotherapy by the BH3 mimetic ABT-737[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(8):2766.

[10]ALTONSY MO,HABIB TN,ANDREWS SC.Diallyl disulfide-in-duced apoptosis in a breast-cancer cell line(MCF-7)may be causedby inhibition of histone deacetylation[J].Nutr Cancer,2012,64(8):1251.

蛋白和mRNA表达 篇2

1 材料与方法

1.1 实验动物

10~12周龄健康雄性清洁级SD (Sprasue Dawley) 大鼠, 体质量 (210±34) g, 共35只, 购自上海斯莱克景达实验动物有限公司长沙分公司, 动物合格证号:SCXK (湘) 2009-0004, 在湘雅医学院实验动物学部饲养, 在室温18~25℃、相对湿度50%~60%、人工12h昼/夜循环照明环境中用全价营养、分笼饲养, 每日定时清洗笼舍, 大鼠能自由摄食及饮水。

1.2 主要的仪器和试剂

BX-50生物光学显微镜、全自动紫外分光光度计、PCR仪、水平电泳槽、SP免疫组织化学试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;凋亡检测试剂盒 (天津灏阳公司) ;Trizol RNA抽提试剂盒 (北京天根生化科技有限公司) ;溴化乙啶 (美国Sigma公司) ;琼脂糖 (西班牙Biowest公司) 逆转录试剂盒 (日本东洋纺公司) ;DNA Marker (北京天根生化科技有限公司) ;蛋白提取试剂盒 (上海申能博彩生物技术公司) ;BCA蛋白定量试剂盒 (江苏碧云天生物技术公司;PMSF (江苏碧云天生物技术公司) ;PDVF膜 (苏州广惠科技有限公司) ;引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;虫夏草提取液由江西济民有限制药公司 (浓度为200 g/L) 惠赠。

1.3 动物模型的复制及分组

实验动物术前12 h禁食, 自由进水, 术前均用10%水合氯醛溶液 (3.5 m L/kg) 腹腔注射麻醉。沿腹部正中线在中腹部正中切口, 逐层切开分离皮肤、肌肉、腹白线进入腹腔后, 用止血钳拉开两侧皮肤及腹部肌肉, 用无菌纱布包裹腹腔内胃肠等脏器并拉向左侧, 术中注意保护大血管, 暴露右侧肾脏, 可见右侧肾脏位于腹膜后, 小心分离右侧的肾蒂后结扎, 切除右侧肾脏 (作为正常组) , 于结肠脾曲外侧切开后腹膜, 暴露左侧肾脏, 游离左输尿管和肾上腺避免损伤, 再游离左肾蒂。稳定10 min后将大鼠随机分成3组, 持续夹闭左肾动脉60 min后恢复灌注。缺血-再灌注组 (I/R组, n=15) :恢复灌注后予以生理盐水[2 m L/ (d·只) ]灌胃;冬虫夏草组 (CS组) :恢复灌注后予以冬虫夏草提取液[5 g/ (kg·d) ]灌胃;假手术组 (sham组, n=15) :分离肾蒂但不夹闭左肾动脉, 术后予以生理盐水[2 m L/ (d·只) ]灌胃;以上3组组内分为再灌注后24、48和72 h 3个时间点 (n=5) , 分别在上述时间点处死大鼠。

1.4 检测指标

1.4.1 各组大鼠肾脏病理改变

取左侧肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中, 将标本按顺序作固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色, 每张切片在高倍镜下取外髓质部10个视野, 以如下方法作半定量分析并计算其均值[4]:无病变为0分;≤10%为1分;11%~25%为2分;26%~45%为3分;46%~75%为4分;>75%为5分。按上述方法制备石蜡切片后, 光学显微镜下 (×20) 观察各肾脏标本病理切片的病理形态改变, 分析各组大鼠肾小管病理损伤程度。

1.4.2 RT-PCR检测各组大鼠肾组织Caspase-12m RNA的表达

取各组大鼠肾组织约100 mg并迅速剪碎, 按照Trizol法抽提肾组织总RNA, 吸取2μL所提取的RNA溶液, 稀释至100μL后, 用紫外分光计分别测定其在260 nm和280 nm波长处的吸光度值后, 对RNA的纯度进行鉴定, 其纯度符合要求后再进入下一步实验。各引物序列、产物长度及退火温度如下:Caspase-12引物上游5'-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3', 下游5'-AGTTCACCTGGGACCTCA-3', 扩增片段为438 bp;GAPDH引物上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 扩增片段为450 bp。根据逆转录试剂盒说明书合成c DNA, 之后取c DNA 2μL配成25μL体系, 按下述条件进行PCR反应, 94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 退火 (Caspase-12和GAPDH均为55℃) 30 s, 72℃延伸1 min, 72℃总延伸10 min, 共35个循环。取PCR产物5μL, 经2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙淀染色, 凝胶分析系统摄像, 条带用IPP图像分析软件检测其OD值, 以OD目的基因/ODGAPDH代表Caspase-12和GAPDH m RNA的相对量。

1.4.3 免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织Cas-pase-12蛋白的表达

常规脱蜡至水, 3%双氧水阻断灭活内源性过氧化物酶, 0.01 mol枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原, 羊血清工作液封闭, 分别滴加Notch2多克隆抗体 (1︰150) 、Hes-1多克隆抗体 (1︰150) , 37℃孵育30 min, 4℃过夜。DAB显色5~20 min, 显微镜下观察大鼠肾组织蛋白表达的量及部位。

1.4.4 Western blotting检测肾组织Caspase-12蛋白的表达情况

取新鲜肾组织50~100 mg提取总蛋白后, 测蛋白浓度, 经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜, Caspase-12多克隆抗体 (1︰300) 孵育过夜, 辣根过氧化酶标记的羊抗兔Ig G孵育 (用含0.5%脱脂奶粉的TBET稀释1︰10 000) , 最后化学发光, 得到胶片, 蛋白条带用凝胶光密度分析软件测其OD值, 用β-actin蛋白作为内参照, 通过计算比值 (OD目的蛋白/ODβ-actin蛋白) , 即目的蛋白的表达量来分析目的蛋白表达的相对水平, 分析两组大鼠肾组织的Caspase-12蛋白的表达。

1.4.5 原位末端标记法 (TUNEL) 检测细胞凋亡

切片常规脱蜡至水, 经双氧水处理、蛋白酶K室温消化后, 加入Td T和Digd UTP, 在37℃下温育2 h, 用体积分数为3%的牛血清白蛋白封闭, 再加生物素化抗地高辛抗体洗涤;加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素, 3, 3’-二氨基联苯胺 (DAB) 显色, HE衬染。镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。每张切片观察10个视野, 计算阳性细胞数/总细胞数比值×100%, 取其平均值作为各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行单因素方差分析, 数据以均数±标准差 (±s) 表示, 如方差齐性, 组间比较用 (ANOVA) 及LSD多重比较, 如方差不齐, 则用非参数检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏病理改变

HE染色结果显示, 正常组和sham组肾小球、肾小管间质均未见明显病变;缺血再灌注后, 大鼠肾小管可见刷状缘丢失、小管扩张、管腔内管型、间质炎症细胞浸润等肾小管坏死改变;经CS处理后, 肾小管结构较I/R组明显完整清晰, 管腔内容物较I/R组明显减少, 炎症细胞浸润较I/R组明显减轻。半定量评分结果表明, 正常组计分为 (0.16±0.09) , sham组为 (0.17±0.10) , I/R后24 h计分最高, 为 (3.44±0.21) , 48 h为 (2.90±0.71) 逐渐降低, 72 h为 (2.48±0.19) 仍较高, 与sham组相比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。与I/R组相同时间点比较, CS组24 h计分 (2.84±0.19) , 48 h计分 (1.90±0.21) , 72 h计分 (1.14±0.11) , 均明显下降, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图1。

1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R相同时间点比较, P<0.01

2.2 各组大鼠肾组织Caspase-12 m RNA表达

RT-PCR结果显示, 正常组 (0.10±0.01) 和sham组 (0.11±0.01) 肾组织有少量的Caspase-12 m RNA表达;I/R组Caspase-12 m RNA表达明显上调, 24 h (0.77±0.08) 达高峰, 48 h (0.36±0.02) 逐渐下降, 72h (0.25±0.01) 仍可见到较高的表达。与sham组各时间点比较, Caspase-12 m RNA表达的相对水平差异均有统计学意义 (P<0.01) 。CS组24 h (0.65±0.07) 、48 h (0.24±0.04) 、72 h (0.13±0.03) 各时间点Caspase-12 m RNA表达均下调, 与I/R组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图2、3。

2.3 各组大鼠肾组织Caspase-12蛋白表达

免疫组织化学结果表明, 正常组和sham组大鼠肾小管可见少量的Caspase-12阳性蛋白表达, 肾I/R后24 h可见肾小管大量的Caspase-12阳性蛋白表达, 尤以受损的远端肾小管着色最深, 主要表达在胞浆, 胞核也可见少量阳性蛋白表达, 管腔中脱落的细胞也可见阳性表达, 48 h后阳性蛋白面积减少, 着色变弱, 72 h仍可见阳性蛋白表达。冬虫夏草处理后, 24 h肾小管阳性蛋白面积减少, 着色变浅, 随后阳性细胞数逐渐减少, 着色变浅。Western blotting结果与免疫组织化学类似。与sham组 (0.08±0.01) 比较, I/R组24 h (0.79±0.03) 、48 h (0.52±0.10) 、72h (0.35±0.01) 的Ccaspase-12蛋白表达上调, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。与I/R组比较, CS组24h (0.54±0.17) 、48 h (0.36±0.1) 、72 h (0.19±0.06) 各时间点Caspase-12蛋白表达下调, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图4~5。

2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡

TUNEL结果显示, sham组肾小管上皮细胞凋亡稍增加 (3.16±0.32) , I/R组大鼠发生凋亡的肾小管上皮细胞明显增多, 部分凋亡细胞自基底膜脱落至管腔中, 多数是远端小管上皮细胞, 少数在近曲小管, 肾间质、肾小球中均未见凋亡细胞, 凋亡细胞在I/R后24 h (28.3±0.92) 达高峰, 48 h (16.52±1.31) 后逐渐减少, 72 h (13.06±0.46) 仍可见到较多的凋亡细胞, 与sham组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) ;与I/R组各同时间点比较, 冬虫夏草组大鼠24h (24.3±1.00) 、48 h (13.72±0.57) 、72 h (9.34±0.93) 凋亡细胞比例均减少, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图6、7。

1~2分别代表正常组和sham组;3~5分别代表I/R组24、48和72h;6~8道分别代表CS组24、48和72 h

1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R相同时间点比较, P<0.01

1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R组相同时间点比较, P<0.01

3 讨论

内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 是真核细胞胞浆中重要的细胞器, 在细胞内分布广泛, 参与蛋白质的合成和转运、信号肽的识别、糖基化修饰、钙离子的贮存和调节、信号传导等一系列重要生理功能的维持。当细胞因钙稳态失衡、氧化损伤、缺血缺氧及某些药物作用等造成未折叠或折叠错误的蛋白质在内质网内大量堆积时, 可诱导细胞发生内质网应激 (endoplasmic reticulum stress, ERS) 。强烈持续续害。

近年的研究表明, ERS凋亡途径是急性肾损伤肾小管上皮细胞凋亡的重要途径, 有望作为细胞凋亡治疗的靶目标[4]。Caspase-12属于凋亡蛋白酶Caspase家族, 在肾、肌肉和肝组织均有高水平表达, 是唯一位于内质网膜上的凋亡蛋白酶[5]。正常生理情况下, Caspase-12以无活性的酶原形式存在。持续高强度的ERS将激活Caspase-12[6], Caspase-9前体是Caspase-12的底物, 活化的Caspase-12在不需要线粒体释放细胞色素-C的情形下即可直接切割活化Caspase-9, 活化的Caspase-9再切割Caspase-3, Caspase-3作为效应分子启动凋亡。研究发现[7], 当发生ERS导致细胞发生凋亡时, Caspase家族中仅有Caspase-12在内质网膜上表达, 并且内质网分子伴侣蛋白Bip表达增加, 提示Caspase-12可能在ERS凋亡中起关键作用。另有研究表明, Caspase-12基因敲除的大鼠发生ERS反应时, 细胞凋亡可明显减少, 进一步证实了Caspase-12是ERS时细胞发生凋亡的标志[8]。肾I/R损伤后, 缺血、缺氧及钙超载等可诱导肾小管上皮细胞内质网伴侣分子GRP-78表达增多, 提示细胞发生ERS[9], 并且GRP-78表达与肾小管损伤、血肌酐水平呈正相关关系, 证实了ERS可能在急性肾损伤发病中起重要作用[10]。而进一步的研究表明, I/R损伤后, 肾组织内质网Caspase-12表达上调, 通过缺血预适应减少Caspase-12表达, 肾小管细胞凋亡明显减少, 证实ERS凋亡途径参与肾I/R损伤[11]。另有研究表明, Caspase-12可能对正常发育或肿瘤形成并不重要, 因此Caspase-12可能是较理想的抗凋亡治疗靶点[12]。

冬虫夏草 (cordyceps sinensis, CS) 是一种名贵的中草药, 药性温和, 能补肾润肺、益气生血, 阴阳并补, 治劳嗽膈症, 诸虚百损, 临床研究表明, 金水宝胶囊能显著降低BUN、Scr、血磷、三酰甘油及胆固醇, 能改善患者肾功能, 提高慢性肾衰患者血浆总蛋白及白蛋白, 改善营养不良和钙磷代谢的紊乱状况, 纠正脂质代谢紊乱, 从而明显提高患者的生活质量[13]。冬虫夏草又可减轻2型糖尿病大鼠肾组织细胞凋亡而发挥肾保护作用[14]。目前在临床上广泛应用于治疗各种急慢性肾脏疾病, 但冬虫夏草抗凋亡作用是否与影响肾组织Caspase-12表达有关?国内尚未见相关报道。

蛋白和mRNA表达 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物

封闭群新生1日龄SD大鼠,雌雄不限,体重8~10 g,由广东省实验动物中心提供。与母鼠同笼,母鼠喂养。母鼠自由饮水,喂以条杆状动物饮料,室温15~25℃,自然采光。

1.2 主要仪器及试剂

Mx-3000P荧光定量仪(美国Stratagene公司);自制有机玻璃常压低氧舱大小为5 L的广口瓶,气孔和出气孔各1个;CY-7指针式测氧仪(成都贝斯达仪器有限公司);总RNA提取试剂盒(美国Promega公司);逆转录PCR试剂盒[Takara宝生物工程(大连)有限公司];PCR反应试剂盒(SYBR GreenⅠ)[Takara宝生物工程(大连)有限公司]。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 实验动物及分组

1日龄SD大鼠共20只,体重8~10 g,分为实验组(n=10)与对照组(n=10)。实验组依照“1.3.2”项下方法暴露在低氧条件下,4 d后断头处死,对照组为空气。

1.3.2 动物模型的制作[3]

先给低氧舱通入99.99%CO2,调节流速,应用CY-7指针式测氧仪,测得舱内的CO2浓度达99%后,放入1日龄新生SD大鼠5 min后取出,迅速向舱内通入99%O2,应用测氧仪使舱内氧浓度达99%,再将低氧后新生鼠放入舱内5 min取出。经处理后所有新生鼠均放回母鼠身边喂养,至第4天断头处死,用眼科剪行剖腹术取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织,-70℃冻存。

1.3.3 染料法(SYBR GreenⅠ法)荧光定量PCR反应

1.3.3. 1 鼠肠组织总RNA提取

总RNA提取试剂盒由Promega公司提供,按照操作说明上的SV Total RNA Isolation System步骤进行总RNA提取,并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,紫外分光光度计测定A260和A280确定RNA质量。28s r RNA条带强烈且A260/280位于1.8~2.0之间的RNA样品用于后续实验。

1.3.3. 2 逆转录反应

逆转录反应使用Takara试剂盒进行,取总RNA 4.0μl,依次加入5×Prime Script TM Buffer 2μl,Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5μl,Oligo d T Primer 0.5μl,Random primers 0.5μl,加无RNase水补足配成总体积10μl的反应液,37℃15 min(逆转录反应),85℃5 s(逆转录酶的失活反应),合成好的c DNA放入-20℃冰箱保存备用。

1.3.3. 3 引物的合成

荧光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成,PAGE纯化级别。引物序列如下:β-actin,F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3',第1 026~1175位核苷酸,片段长150 bp;AQP4,F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3',R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3',第2 615~2 731位核苷酸,片段长117 bp;AQP7,F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3',R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3',第322~468位核苷酸,片段长147 bp;AQP8,F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3',R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3',第292~417位核苷酸,片段长126 bp。

1.3.3. 4 荧光定量PCR反应

以β-actin作为内参基因,采用SYBR GreenⅠ染料法进行PCR反应扩增,在测定目的基因的同时测定内参基因用以标准化标本。反应体系:RT反应液2μl,加SYBR Premix Ex Taq TM 12.5μl,上下游引物各0.5μl,加d H2O补足至25μl总体系。各取样品3μl,使用EASY Dilution按10倍梯度稀释4次(1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000),每个浓度各取2μl,行3个复孔进行PCR反应,制作标准曲线。由于采用相对定量法作比较,标准曲线的横坐标并不要求真实的起始模板拷贝数,故制作标准曲线的时候需要设定模板的相对拷贝数。上述5个梯度的样品对应设定的相对拷贝数分别为5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。反应条件如下:95℃10 s预变性,95℃5 s,60℃30 s,40个循环PCR反应。Mx-3000P荧光PCR仪自动读出待检样品Ct值。另外以样品中起始模板的拷贝数为横坐标,Ct值为纵坐标,并以上述配制的按10倍梯度稀释的样品为5个点,绘制出标准曲线,自动计算出曲线的斜率(slope)及扩增效率(E)。

1.4 统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示,采用REST-2005软件进行统计学处理。

2 结果

对照组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(18.84±0.43)、(19.80±0.43)和(20.68±0.31)。实验组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(21.85±0.45)、(22.62±0.24)和(23.51±0.20)。对照组β-actin基因的平均Ct值为(15.40±0.31),实验组β-actin基因的平均Ct值为(15.30±0.49)。

图1~4中各条线分别表示β-actin、AQP4、AQP7和AQP8标准曲线,横坐标代表相对模板浓度,纵坐标代表Ct值,5个梯度稀释点基本在一条直线上,证明Ct值与相对拷贝数据呈良好的线性关系。荧光定量仪分析软件求得标准曲线方程Y=a X+b,X代表起始模板拷贝数,Y代表Ct值,这样通过标准曲线中方程可求出待检样品的相对拷贝数。见表1。

用Pfaffl[4]推导的数学公式计算目的基因的相对表达量:

Ratio(R)表示目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数,分子部分为目的基因扩增效率,分母部分为内参基因的扩增效率。△Cttarget(control-sample)表示对照组与实验组中目的基因的Ct值之差,△Ctref(control-sample)表示对照组与实验组中内参基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分别表示目的基因和内参基因的扩增效率。如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近100%且相差<5%,也可以将PCR扩增效率默认为100%,这样公式就简化为2-△△Ct,计算结果为R值。R<1表示基因表达下降,R>1表示基因表达上升。

采用Pfaffl等[5]设计的REST-2005软件运行2-△△Ct公式,计算R值。把所有荧光定量资料包括各实验组Ct值、对照组Ct值、模板Ct值和模板浓度倍数输入计算机,运行软件,软件自动计算R值及P值。

根据REST-2005软件计算结果,内参β-actin基因的R值为(1.000±1.079)。AQP4、7、8基因与内参β-actin基因比较,实验组表达下降,R值分别为(0.117±0.129)(P<0.05)、(0.140±0.156)(P<0.05)和(0.134±0.140)(P<0.05)。实验组R<1,与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。用REST-2005软件计算各基因组QPCR反应的反应效率(E)、相对表达差异倍数(R)、样本标准误(SE)、95%可信区间(95%CI)及P值。结果见表2。

3 讨论

目前对AQPs的研究逐渐深入,发现AQPs参与多种消化道疾病的发病过程。主要集中在AQP1~8等几种。研究发现,AQPs与口干症[6]、便秘及大肠内液转运有关[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除实验中发现,剔除AQP5基因的大鼠经毛果芸香碱刺激后其唾液分泌量减少60%以上,而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未见明显减少,说明AQP5在涎腺的分泌中扮演着关键的作用。血管活性肠肽(VIP)神经元广泛分布于回结肠壁内,其递质VIP抑制肠道蠕动,参与便秘的发生。AQPs是VIP作用的最终靶分子之一,VIP能过c AMP依赖的途径上调AQP3及其m RNA的表达[9],可以推测VIP参与便秘发生与上调AQPs的表达,从而促进水分的吸收有关。

小肠大部分切除后出现的腹泻病,可能与AQPs上调有关。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小肠被大部分切除后AQPs m RNA在残留小肠、回肠、结肠中表达的变化,他们选取6周龄SD大鼠(n=15),切除80%远端小肠,残留的小肠、回肠、结肠分别在术后第1、3、5、7天切开,提取残留肠黏膜组织,用Northern blo技术分析AQPs m RNA的表达。结果发现,残留小肠AQP1和AQP3 m RNA在术后1 d表达明显增加,AQP7 m RNA在术后3 d增加,AQP4 m RNA术后无变化;结肠AQP3 m RNA在术后第1、7天表达增加,AQP4 m RNA无改变;AQP8 m RNA表达在术后第7天轻微增加,表明小肠大部分切除后除AQP4外,多种AQPs适应性上调。

Hardin等[11]用硫酸钠葡聚糖(DSS)喂养小鼠制成结肠炎模型,在进食DSS后12 h~7 d,以及从停止进食DSS后的恢复阶段第1天至第15天进行AQPs作用评价,并在实验阶段前3 d对鼠肠水分吸收进行测量。结果显示,DSS组12~24 h后结肠AQP4、7、8表达开始减少并持续至第7天,停止进食DDS后逐渐恢复,且病变肠组织对水分的吸收减弱。从结肠炎、溃疡性结肠炎及感染性结肠炎患者中提取的病理标本发现相似的改变。

新生儿时期严重的肠道疾病NEC虽然病因与成人结肠炎有很大不同,但从病理角度来看有非常相似的病理改变。各种原因引起的肠壁缺血、低氧被认为是发病的直接因素,特别在新生儿时期,窒息、低氧、休克等原因引起机体防御性反射,肠壁血流减少、缺血,肠黏膜屏障损伤情况容易发生。为了探讨AQPs在其中所起到的病理作用,本研究制作鼠模型进行前期研究。

NEC鼠模是采用新生SD大鼠,模拟宫内低氧环境下制作而成,用高纯度CO2在短时间内使鼠窒息,再通入高纯度O2复苏,造成肠道微循环缺血-再灌注损伤的病理过程。受损的肠组织通过荧光定量实验证明,与空白组比较,AQP4、7、8 m RNA在NEC组表达下降,实验仅说明AQPs在NEC鼠模中的表达改变,不能直接说明这些基因在发病中的调节机制。Laforenza等[12]认为APQs能起到使水跨细胞吸收或分泌的作用。肠功能出现障碍后,AQPs表达下降,可能与其蛋白质构象改变或发生移位有关。肠道的消化和吸收功能丧失,肠液大量排出,造成脱水肠液排进第三间隙及腹腔,造成体液丢失,引起内环境紊乱,AQPs的表达变化可能起到维持体液平衡及内环境稳定的作用。

AQPs与NEC的发病关系主要涉及肠腔渗透压的改变。NEC发病过程出现的水代谢障碍可能与AQPs的表达发生变化并引起肠腔渗透压改变有关。由以上可知,水吸收的主要器官是消化道。AQPs表达的变化可以影响水的吸收,使机体出现水代谢障碍,本实验NEC鼠模从外观上分析有脱水的表现。NEC鼠模实验证明AQPs表达下降,提示发生NEC病变时可引起细胞信号改变,导致AQPs合成障碍,从而形成NEC发病机制中的一个因素。目前AQPs在细胞内信号调节机制下出现的表达变化,在肾脏、肝脏已有很多学者阐述清楚,但在消化道方面仍然需要进一步研究。

AQPs参与消化道疾病是可能的,但发病机制较复杂。由于NEC是一种多因素引起的疾病,除AQPs外,还涉及其他如细胞因子、血管内皮素、血小板活性因子等参与发病过程。实验的最终目的是揭示真相,为临床打下基础。希望通过本次实验使相关工作者对AQPs给予足够的重视,认识到AQPs受损是一个引起机体水代谢紊乱的危险因素。

蛋白和mRNA表达 篇4

关键词：进展期胃癌,切除修复交叉互补基因1,化疗,高海拔地区

胃癌在中国属高发肿瘤,其死亡率占所有恶性肿瘤的23.02%,青海、宁夏、甘肃3 省的胃癌死亡率超过35/10 万。青海省西宁市海拔2 295 m,地处西北地区,胃癌具有发病率高、手术切除率低、生存期短、死亡率高等特点。大部分患者就诊时已属进展期,无手术机会;化疗是胃癌治疗的重要手段之一,是胃癌综合治疗的重要组成部分[1]。目前为止,铂类及5- 氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为治疗胃癌的基本用药。本研究探讨高海拔地区进展期胃癌切除修复交叉互补基因1 (excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)m RNA和蛋白表达水平,及其与化疗疗效的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2010 年12 月-2013 年12 月本院经病理学检查确诊的进展期胃癌70 例进行研究。入选标准:(1)经证实具有可测量肿瘤病灶;(2)距离最后一次放化疗≥3 个月;(3)化疗前血常规、肝、肾功能在正常范围内;(4)心电图正常;(5)美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG) 评分≤2 分。排除标准:(1)ECOG评分≥3 分;(2)肿瘤病灶不可测量;(3)风湿瓣膜性心脏病及器质性心脏病。入选患者手术切除的肿瘤组织置于-196℃液氮中保存,部分组织经过梯度酒精及二甲苯脱水后包埋于石蜡中,制备组织的石蜡标本。

所有患者有CT、B超及MRI证实的可测量肿瘤病灶。其中4 例失访,3 例不能按规定评估疗效,3例因不良反应未完成规定的治疗方案。最终60 例患者符合标准,进行统计学分析。60 例患者中,男性39 例(65%),女性21 例(35%);年龄<55 岁22 例(36.7%),≥55 岁38 例(63.3%);体力评价:0 分40例(66.7%),1、2 分20 例(33.3%)。病理类型:腺癌46 例(76.7%),黏液癌5 例(8.3%),印戒细胞癌7 例(11.7%),其他2 例(3.3%);分化程度:中、高分化23例(38.3%),低分化34 例(56.7%),其他3 例(5.0%);民族:汉族49 例(81.7%),回族6 例(10%),藏族3 例(5%),蒙古族2 例(3.3%)。所有患者系长期居住高海拔地区(海拔2 200 m左右)。

1.2 方法

1.2.1化疗方案和疗效评价

所有患者采用FOL-FOX4方案治疗。奥沙利铂(连云港江苏恒瑞医药股份有限公司,商品名:艾恒)85 mg/m2,第1天静脉滴注2 h;亚叶酸钙200 mg/m2,第1、2天化疗前静脉滴注2 h;5-氟尿嘧啶400 mg/m2,第1、2天静脉冲入;5-氟尿嘧啶600 mg/m2,第1、2天静脉持续泵入,14d为1个周期。治疗前l周完成各项基线检查。近期疗效的评价按照实体瘤的疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST),分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(complete response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)和疾病进展(progressive disease,PD)。以CR+PR为客观缓解率(objective response rate,ORR)。肿瘤无进展生存期(progress free survival,PFS)从治疗开始计算,终止日期为局部区域复发/远处转移或末次随访日。每两个周期评价疗效1次,若出现可能为病情进展的临床表现可提前评价疗效。所有患者进行随访。

1.2.2 ERCC1蛋白检测

采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidinperosidase,SP)检测胃癌石蜡切片组织中ERCC1的表达。ERCC1鼠抗人多克隆抗体为ab43(美国Abcam公司)。组织切片经高压处理,修复暴露抗原。每批染色设阳性和阴性对照,以已知阳性切片作阳性对照组,以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)代替一抗作空白对照组,严格按照试剂盒说明书进行操作,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色。免疫组织化学结果判断标准参照文献[2],采用二级评分法进行,由2位病理医师判定。每张切片随机观察5个高倍镜视野,每个视野计数100个癌细胞。按显色强度分为4级:阴性(不着色)、弱阳性(着淡黄色)、阳性(着棕黄色)及强阳性(着棕褐色或者出现粗大的棕褐色颗粒),0~3分分别代表不同显色强度。同时计算阳性肿瘤细胞百分数,对阳性肿瘤细胞比例评分(阳性细胞0%为0.0分,1%~9%为0.1分,10%~49%为0.5分,>50%为1.0分),用阳性强度评分乘以阳性肿瘤细胞比例评分得到最后的半定量H值来衡量最终的蛋白表达强度。按照每个指标各自中位H值来确定胃癌组织中指标表达的高低。

1.2.3 ERCC1 m RNA检测

逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测ERCC1 m RNA的表达。Trizol试剂一步法提取胃癌组织总RNA,检测组织总RNA浓度及完整度,c DNA第一链合成,PCR扩增ERCC1和内参基因β-actin。ERCC1正向引物:5'-GCCTCCGCTACCACAACCT-3',反向引物:5'-TCTTCTCTTGATGCGGCGA-3',产物长度313 bp;β-actin正向引物:5'-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3',反向引物:5'-TCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',产物长度545 bp。引物由上海英骏生物工程公司合成。反应体系为25μl,其中2μl c DNA模板,正、反向引物各1μl,2×PCR Master Mix 12.5μl,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性2 min,96℃变性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35个循环,72℃继续延伸10 min。反应结束后,取5μl PCR反应产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。紫外光下观察电泳结果,使用凝胶成像系统拍照记录。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析,计数资料用 χ2检验,生存分析用Kaplan-Meier法,各因素水平的比较用Log-rank法,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 进展期胃癌ERCC1 蛋白及m RNA的表达

ERCC1 蛋白阳性表达定位于肿瘤细胞核内,呈棕黄色或棕红色颗粒,偶见于胞浆内。60 例标本中,ERCC1 蛋白阳性表达率为35%。见图1。

以一个内体间标记60 例进展期胃癌ERCC1m RNA的表达变量,ERCC1/β-actin比率为0.160~0.821,中位比率为0.290。60 例患者以中位值为界,分为ERCC1 m RNA高、低表达两组。进展期胃癌组织ERCC1 m RNA与 β-actin表达见图2。

(免疫组织化学法×400)

2.2 ERCC1 蛋白及m RNA表达与进展期胃癌临床特征的相关性

60 例胃癌检测标本中,ERCC1 蛋白及m RNA的表达与进展期胃癌患者临床病理参数,如不同年龄、性别、组织学类型及分级比较,差异无统计学意义(P >0.05)。见表1、2。

2.3 进展期胃癌ERCC1 蛋白与m RNA表达

青海地区60 例进展期胃癌患者中,ERCC1 蛋白阳性患者ERCC1 m RNA高表达为40%,ERCCm RNA低表达为30%;ERCC1 蛋白与m RNA的阳性表达比较差异无统计学意义(P >0.05)。见表3。

例(%)

例(%)

2.4 ERCC1 蛋白及m RNA表达与FOLFOX4 化疗疗效的相关性

所有60 例患者完成≥4 个周期的化疗后进行疗效评价并4 周后确认。进展期胃癌ERCC1 蛋白表达与化疗疗效无关(P =0.089)(见表4);ERCC1蛋白阳性表达者ORR为19.0%,阴性者为43.6%。ERCC1 m RNA高表达ORR为20.0%,低表达为50.0%,ERCC1 m RNA的表达与化疗疗效呈负相关(P =0.038)(见表5)。

2.5 进展期胃癌ERCC1 蛋白及m RNA表达与FOLFOX4 治疗无进展生存期的疗效分析

对完成化疗方案的患者进行随访。ERCC1 蛋白阳性表达者无进展生存期(6.24 个月)较阴性者(7.23 个月)短,差异有统计学意义(P =0.039)。以ERCC1 m RNA表达水平中位值为界,将患者分为高表达组和低表达组。ERCC1 m RNA低表达组的中位PFS为7.32 个月,与高表达组的6.3 个月比较,差异有统计学意义(P =0.032)(见图3)。Cox比例回归模型将年龄、性别、淋巴结转移、分化程度、ECOG评分等可能影响的因素进行多步骤校正后发现,ERCC1蛋白及m RNA表达仍然与PFS有关(P <0.05)。

例

例(%)

例(%)

3 讨论

ERCC1 是第1 个被发现的人类DNA损伤修复基因,是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶。定位于染色体19q13.2~13.3,包含10 个外显子,基因全长15×10 bp,编码含297 个氨基酸的蛋白质[3]。化学药物造成的DNA损伤主要通过核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)途径修复,目前已明确ERCC1 基因是核苷酸切除修复的关键基因[4]。

奥沙利铂是第3 代铂类抗癌药物,其形成的铂-DNA复合物体积更大,能有更效地抑制DNA合成。然而肿瘤患者个体对草酸铂的敏感性迥然不同,耐药者与敏感者比较,生存期减少几倍甚至十几倍[5]。铂类耐药是因DNA的修复能力造成,其包含减少细胞毒的铂-DNA复合物形成,以及与铂-DNA复合物形成后防止细胞死亡[6]。其通过NER去除铂类药物导致DNA链内加合物被认为是铂类药物耐药的主要机制[7],NER增强是导致顺铂耐药的一个重要机制。肿瘤细胞的DNA损伤修复能力不同会导致其对草酸铂的敏感性差异。

Kwon等[8]对韩国进展期胃癌患者接受奥沙利铂联合5- 氟尿嘧啶化疗的研究显示,ERCC1 蛋白阳性率为70.3%,ERCC1 蛋白阴性表达者有更好的化疗反应率及长的无进展总生存期(P =0.045 和0.040)。Yun等[9]的一项对韩国进展期胃癌患者行一线铂类为基础的疗效及生存研究提示,ERCC1 阳性表达率为66%,ERCC1 阴性较ERCC1 阳性患者有更高的治疗反应率(44% vs 28%),但差异无统计学意义(P =0.420),ERCC1 的表达与总生存期无关(P =0.570)。但是也有不一致的研究,Baek等[10]对韩国>Ⅱ期胃癌患者行铂类术后辅助化疗的研究表明,ERCC1 蛋白阳性组的无病生存期和总生存期明显较阴性组长。本研究结果显示,ERCC1 蛋白表达阳性率为35%;进展期胃癌ERCC1 蛋白表达与化疗客观有效率无关,与无进展生存期呈负相关;青海地区ERCC1 蛋白阳性率表达较低,其治疗反应差可能与本实验入组患者分期晚及低分化腺癌比例较高有关,以及与不同地区胃癌的发病因素、发病机制及肿瘤的异质性相关,需要在以后的研究中扩大病例、分层分析。

黄朝晖等[11]在苏州地区用半定量RT-PCR检测62 例胃癌组织ERCC1 m RNA表达水平的中位值为0.672;ERCC1 m RNA高表达组的无复发生存率和总生存率显著低于低表达组(P <0.05)。多因素分析结果显示,ERCC1 m RNA水平是影响患者预后的独立危险因素(P <0.05),与本研究结果相似,没有显示区域的差异。

Matsubara等[12]报道,140 例进展期胃癌患者中43 例接受铂类为基础的一线化疗,结果表明,ERCC1m RNA低表达化疗反应率为55.6%,高表达化疗反应率为18.8%(P =0.008),所有患者多变量生存分析显示,ERCC1 m RNA高表达可预测不良预后。本研究显示,在高海拔地区,进展期胃癌ERCC1 m RNA表达与化疗客观有效率、PFS呈负相关。但是也有不同的报道,Huang等[13]研究长沙地区实施DCF方案化疗的48 例进展期胃癌患者,TUBB3、TS和ERCC1m RNA采用多通路Branched-DNA液态芯片技术测定,ERCC1 m RNA的表达高低与化疗反应率、中位疾病进展时间及中位总生存期无关。

蛋白和mRNA表达 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年4月至2011年2月大连医科大学附属第一医院收治的相关患者。恶性肿瘤组55例:男31例, 女24例, 年龄30~77岁;其中腺癌40例, 鳞癌14例, 大细胞癌1例。所有病例均经病理检查证实。患者采血前均未行化疗或放疗。对照组包括肺部良性病变组30例:男18例, 女12例, 年龄23~74岁;其中肺炎19例, 肺结核球4例, 炎性假瘤7例。正常健康对照组30例:男15例, 女15例, 年龄21~69岁, 均无心、肝、肺等器质性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

在Gene Bank查找Survivin m RNA、CK19m RNA和β-actin m RN (内参) 基因序列, 经Primer5.软件辅助设计引物。引物由大连宝生物公司合成。

1.2.2 标本采集及Total RNA的提取

用枸橼酸钠抗凝经去酶处理的采血管, 取患者晨空腹肘静脉血2.0 ml。

淋巴细胞分层液分离核细胞, RNAiso Plus细胞裂解液裂解, 氯仿、异丙醇进一步抽提总RNA。总RNA用紫外分光光度计定量, 并行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 加入适量RNase-free灭菌水分装-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR

逆转录反应条件42℃30 min、95℃5 min、5℃5 min。在PCR反应仪中进行。反应产物-20℃保存备用。PCR扩增反应条件94℃5 min, 变性94℃30 s, 72℃延伸1 min, 共进行30个循环, 最后72℃延伸5 min, Survivin m RNA复性62℃30 s, CK19 m RNA63℃30 s, β-actin m RNA56℃30 s。

1.2.4 RT-PC产物结果鉴定

取PCR产物5μL及5μl DNA Marker, 1%琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 经紫外凝胶荧光成像系统分析, CK19 m RNA表达阳性者在460bp处出现条带, Survivin m RNA表达阳性者在439 bp处出现条带, β-actin产物在260 bp出现条带。

1.3 统计学方法

应用SPSS V17.0统计软件包处理, 用χ2检验分析计数资料之间的比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA鉴定

实验中所抽提取的总RNA, 其检测的OD260/OD280值为1.8~2.2之间。用1.0%琼脂糖凝胶电泳及EB染色分析可见28 s、18 s、5 s三条带, 表明完整性良好。

2.2 RT-PCR扩增图

用大连宝生物公司的DNA Marker D (100 bp-2 000 bp) 作为相对分子量的质量标准, 电泳结果可显示5条带 (100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp) 。指标Survivin m RNA的扩增产物为439bp;CK19 m RNA大小为460bp;以β-actin m RNA268bp作为内参照, 其在本实验所有标本中均稳定表达。阳性表达电泳图表现为439bp或460bp处出现亮带。

2.3 3组外周血Survivin m RNA的表达情况比较

在55例非小细胞肺癌组中有34例可见Survivin m RNA表达, 表达率为61.82%;肺良性病变组仅2例Survivin m RNA表达, 表达率6.7% (2/30) ;健康对照组无阳性表达 (0/30) 差异有统计学意义 (P=0.00) 。Survivin m RNA在TNM分期差异具有统计学意义 (P=0.004) 。不同病理类型中, Survivin m RNA的阳性率差异无统计学意义 (P=0.446) 。不同年龄组, Survivin m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.701) 。不同性别组的非小细胞肺癌患者, Survivin m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.193) 。详见表1。

2.4 3组外周血CK19 m RNA的表达情况比较

非小细胞肺癌组CK19 m RNA的表达阳性率为49.09%, 良性病变组CK19 m RNA的表达率为16.67%, 健康对照组均未见CK19m RNA的表达, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。CK19 m RNA的表达与TNM分期有关 (P=0.009) 。组织不同病理类型中, CK19 m RNA的阳性率差异无统计学意义 (P=0.214) 不同年龄组CK19 m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.891) 。不同性别组, CK19 m RNA阳性率差异无统计学意义 (P=0.333) 。见表1。

2.5 Survivin m RNA联合CK19 m RNA检测的灵敏性、特异性和准确性

单一Survivin m RNA、CK19 m RNA灵敏性分别为61.82%和49.09%, 两者联合检测的灵敏性为80%, 准确性85.22%, 高于任一单一指标的检测。各组之间灵敏性、准确性的差异有统计学意义 (P<0.05) , 特异性无统计学意义 (P>0.05) 。有一定的临床意义。见表2。

3 讨论

肿瘤早期发现和早期诊断是肿瘤防治的关键, 肿瘤标志的研究与应用对肿瘤诊断及指导临床治疗有重要价值。检测外周血中肿瘤分子标志物, 有可能提高肿瘤的早期诊断率。有研究证实, 非小细胞肺癌患者血循环中微转移阳性的, 生存期明显缩短, 预后差[2]。因此在外周血中能找到有助于非小细胞肺癌早发现、早诊断的肿瘤标志物具有重要的临床意义。

Survivin是一种凋亡抑制蛋白, 是目前发现的最具特异性的凋亡抑制因子之一[3]。其特异性高表达于肿瘤组织, 正常分化的组织则不表达[4]。该特性决定了其可能为理想的肿瘤标记物, 并成为肿瘤鉴别诊断以及判断预后等研究的新热点。Yie等[5]研究发现, Survivin表达阳性者具有较高的复发率, 生存期较短;通过多因素分析, Survivin是癌症复发的独立预测因子。CKl9是上皮及上皮性细胞肿瘤的较为敏感、特异性的标记物[6]。90年代开始, CK19 m RNA被广泛用来检测源于上皮组织的肿瘤患者微转移的研究, 特别是非小细胞肺癌患者[7,8]。本研究发现Survivin、CKl9 m RNA的阳性率在NSCLC组、肺良性病变组, 健康对照组中均存在显著性差异, 二者显示了其在肿瘤早期诊断中的潜在价值。Survivin m RNA灵敏性明显高于CKl9 m RNA。随着TNM分期的增高, Survivin或CKl9 m RNA阳性表达率也显著增加, 提示其与患者的预后息息相关。但单一肿瘤标记物的检测存在一定的局限性, 通过同时检测多种特异性标志物, 可能避免出现假阴性和假阳性。本实验联合检测Survivin m RNA和CK19 m RNA在外周血中表达情况, 分析它们与临床病理因素之间的关系。联合检测的灵敏性达78.19%, 准确性达85.22%。故选择适宜的联合检测, 可提高NSCLC早期检出率, 及早发现微转移。

摘要：目的 通过对非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer, NSCLC) 患者外周血生存素 (Survivin) mRNA及细胞角蛋白19 (CK19) mRNA的检测;探讨其对NSCLC诊断的临床价值和意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应法 (RT-PCR) 检测55例非小细胞肺癌患者、60例对照组的外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的表达情况。结果 Survivin mRNA和CK19 mRNA在NSCLC组的阳性率显著高于对照组 (P<0.01) 。阳性表达率与临床TNM分期有关 (P<0.01) , 与性别、年龄、病理组织类型无关 (P>0.05) 。Survivin mRNA和CK19 mRNA联合检测, 高于任一单一指标的检测 (P<0.05) 。结论 外周血Survivin、CK19 mRNA可作为早期辅助诊断NSCLC及微转移的一个有价值的肿瘤标志物。联合检测有较高的检出率。

关键词：Survivin mRNA,CK19 mRNA,非小细胞肺癌

参考文献

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蛋白和mRNA表达 篇6

关键词：抗纤复方,HSC-LI90,I型、IV型前胶原、TIMP-1,mRNA,Northern印迹杂交

抗纤复方是临床治疗肝纤维化的有效药物, 由黄芪、丹参、紫河车、郁金等药物组成[1]。以往的实验研究表明, 该药不仅能够抑制肝内多种细胞外基质的合成, 而且能够抑制肝纤维化大鼠肝星形细胞TGFβ1的表达, 减少胶原产生[2,3]。我们为了研究该复合方剂抗肝纤维化作用机制, 以不同剂量抗纤复方含药血清进行实验室研究, 以Northern印迹杂交方法进一步观察抗纤复方对HSC-LI90细胞I型 (CoL-I) 、IV型前胶原 (CoL-IV) 、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 (TIMP-1) mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 抗纤复方的制备

其无菌制剂由上海曙光医院制剂中心制备, 以蒸馏水分别稀释成0.025、0.05、0.10、0.3g/mL等不同浓度。

1.2 细胞系

星形细胞系HSC-LI90由日本佐贺医科大学肝病中心惠赠, 系表型为活化的人肝星形细胞 (HSC) , 表达高水平的CoL-I、MMP-II、TIMP-l、TGFβ1 mRNA等[4]。

1.3 动物

用于制备含药血清的大鼠, 清洁级, 雌雄各半, 体质量300～350g, 购自上海中医药大学实验动物中心。

1.4 抗纤复方含药血清的制备

大鼠随机分为5组, 每组5只, 其中4组按体质量灌胃给予抗纤复方水溶液1.0mL/100g体质量, 2次/d, 剂量依次为0.5、2.0体质量、4.0g/kg体质量, 于给药后90min分别以1.5%的苯巴比妥钠腹腔注射麻醉, 无菌条件下, 从腹主动脉采血约10mL, 存放于4℃冰箱中, 待血浆凝固血清析出后, 于高速离心机中以3000rpm离心10min, 留取血清。另设一组作为空白对照组。所有血清均经56℃、30min灭活后, 置-20%冰箱中保存备用。

1.5 细胞培养

HSC-LI90细胞以1×106细胞/100mm的浓度接种于培养皿, 24h后, 分别加入10%抗纤复方含药血清10mL, 同时设空白对照组。培养48h后, 提取细胞总RNA, 检测HSC-LI90细胞I型、IV型前胶原、TIMP-1mRNA表达。

1.6 CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA的Northern印迹杂交

运用AGPC法, 从HSC-LI90细胞中提取总RNA。每20μg总RNA加入1%琼脂糖凝胶中, 电泳后, 将变性的RNA转移至硝酸纤维素滤膜 (AmershamJapan) 然后用32P-dCTP标记的cDNA探针与之杂交16h, 杂交浓度65℃, 洗膜2次以后, 放射自显影。定量用BAS2000测定分析。用CoL-I (CoL-III、TIMP-1) /GAPDH的比值表示CoL-I、CoL-III、TIMP-1表达水平。每项实验至少重复3次, 数据用mean±SD表示, 用单因素方差分析进行统计学处理。

2 结果

不同浓度的抗纤复方含药血清均有降低CoL-I、CoL-IV、TIMP-1mRNA水平的作用, 并呈一定剂量依存关系, 统计学处理P<0.05或0.01, 结果见图1。

3 讨论

肝纤维化为诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化, 是影响肝病预后的重要环节, 在尚无有效方法根治原发疾病的情况下, 减缓或阻止肝纤维化的进程, 是相当重要的治疗对策。肝纤维化、肝硬化的病理基础是细胞外基质在肝脏异常的沉积, 这种异常的沉积, 和 (或) 胶原合成、降解的动态平衡失调有关。研究肝纤维化的发生、发展及其治疗对策时, 应对细胞外基质合成和降解两方面同时加以观察, 凡是能够影响胶原合成及/或胶原降解代谢的手段, 都是阻断和逆转肝纤维化和肝硬化的有效方法[5]。

肝星形细胞是ECM的主要来源, 肝星形细胞激活并转化为肌纤维样细胞, 各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞, 正常情况下, 肝星形细胞处于静止状态, 当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时, 肝星形细胞被激活, 其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星形细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建, 另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。肝星形细胞的激活是肝纤维化发生、发展的关键环节。肝 (HSC) 是肝脏间质细胞之一, 是肝纤维化时细胞外基质 (ECM) 过多产生和沉积的主要细胞来源[6]。针对HSC活化的不同环节进行抗肝纤维化治疗已形成了共识, 如果能够抑制胶原等细胞外基质的合成和 (或) 促进ECM的降解, 则有可能缓解、阻止甚至逆转肝纤维化、早期肝硬化。

肝星形细胞HSC-LI90系表型为活化的人星形细胞, 表达高水平的CoL-I、MMP-2、TIMP-1 mRNA等, HSC-LI90是体外研究肝纤维化发生机制、观察抗肝纤维化药物作用的较为理想的模型[4]。我们采用中药组方抗纤复方取其不同浓度的含药血清观察了其对HSC-LI90细胞mRNA表达的影响。

Ⅰ型、Ⅳ型胶原是纤维化时病变部位沉积的主要胶原蛋白, Ⅵ型胶原是肝基底膜的主要成分, 肝纤维化时含量明显增高, 血中Ⅵ型胶原的水平与肝纤维化程度成正相关。在实验性肝纤维化模型中, Ⅰ型、Ⅳ型胶原mRNA表达增强, 导致其产物过度沉积, Ⅰ型、IV型胶原mRNA在一定程度上可以反映ECM的沉积。我们实验结果表明, 抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞I型、Ⅳ型胶原mRNA表达水平, 从而减少胶原的沉积。

TIMP-1是一种糖蛋白, 是ECM主要结构蛋白降解特异酶MMPS的抑制剂, 肝纤维化时间质胶原酶活性下降而TIMP-1的表达增加, 且与PⅢP、LN正相关, 与肝纤维化程度相关。其主要作用是抑制MMP酶原的活化及其对ECM的降解, 血清TIMP-1水平反映了慢性肝病肝内炎症和纤维化的一些重要特征, 在目前情况下, 是一种肝纤维化无创诊断和随访指标。TIMP-1是抑制基质金属蛋白酶活性的一组多功能因子家族的主要成员之一, 能结合除14、19以外的所有MMPs而使其活性减弱, 是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素。许多实验研究表明, 肝损伤激活HSC, 表达MMPs和TIMPs, 在肝损伤早期阶段, 体外培养的HSC一过性表达MMP3、MMP13等, 之后, HSC表型发生变化, 前MMP2和MT-MMP表达, MMP2活化, 降解局部正常的肝脏基质;并且TIMP-1表达明显, 抑制间质胶原酶 (MMP1/MMP13) 对胶原的降解。而在肝损伤停止后, TIMP-1迅速减少, 胶原酶活性增加, 降解ECM, 纤维化逆转[7]。可以证明, TIMP-1在调节胶原的降解代谢中发挥着重要的作用。通过研究我们认为不同浓度抗纤复方含药血清作用HSC-LI90细胞48h后0.5、2.0、4.0g/kg含药血清有降低TIMP-1 mRNA水平的作用, 提示抗纤复方具有促进胶原降解的作用。

抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞CoL-I、CoL-IV、TIMP-1mRNA表达水平, 从而干预肝纤维化及肝硬化时的胶原合成、降解代谢, 发挥其抗肝纤维化的作用。

参考文献

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蛋白和mRNA表达 篇7

关键词：碘酸钾,碘化钾,调节因子沉默调节蛋白1mRNA表达

血脂异常是心血管疾病最重要的危险因素, 主要指血浆中的胆固醇或甘油三酯水平升高。我们前期研究发现高碘饮水会导致人群出现apoA1和血浆HDL胆固醇 (HDL-C) 异常[1]。此外, 动物实验表明大大鼠鼠在在摄摄入入高高剂剂量量的的碘碘酸酸钾钾后后血血清清总总胆胆固固醇醇 ( (ttoottaall cchhoolleesstteerrooll, , TTCC) ) 和和甘甘油油三三酯酯 ( (ttrriiggllyycceerriiddee, , TTGG) ) 明明显显升升高高[]。。这这些些结结果均提示摄入高剂量的碘酸钾会造成机体的血脂异常。碘酸钾和碘化钾是目前世界上普遍使用的食盐碘化剂, 有研究报道与碘化钾相比, 高剂量碘酸钾会导致机体血脂异常和抗氧化能力下降[4,5,6,7], 但碘酸钾是通过何种机制影响机体血脂水平的, 目前还尚不清楚。最新研究表明, 调节因子沉默调节蛋白1 (silent information regulator 1, SIRT-1) 参与了胆固醇逆向转运和游离脂肪酸、胆固醇及胆汁的代谢过程, 在维持机体正常血脂水平中发挥了重要作用[8,9,10,11]。SIRTl在高碘致血脂异常中的角色目前国内外均未见报道, 高碘是否会通过调节SIRT1的表达起作用还不明确。本研究在现有文献的基础的上, 进一步观察不同剂量碘酸钾和碘化钾对大鼠肝脏SIRT1 mRNA表达的影响, 初步探讨了高碘对机体血脂水平影响的机制。

1 材料方法

1.1 实验动物与分组

实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物房许可证书编号:SYXK (京) 2009-0032。饲养条件:温度为22℃~24℃, 湿度为55%~65%。选用断乳两周, 体重为120g~140g的SPF (specific pathogen free) 健康Wistar大鼠104只。根据摄入碘剂、剂量不同将大鼠随机分成8组, 适碘组 (KI、KIO3) , 10倍高碘组 (10KI、10KIO3) 、50倍高碘组 (50KI、50KIO3) , 100倍高碘组 (100KI、100KIO3) 。检测水及饲料中基础碘含量, 在饮水中加入不同剂量的KIO3或KI并控制各组中每只大鼠每日碘的总摄入量分别为:6μg/d (KI、KIO3) 、10倍高碘组60μg/d (10KI、10KIO3) 、50倍高碘组300μg/d (50KI、50KIO3) 和100倍高碘组600μg/d (100KI、100KIO3) , 为监测实验动物模型是否达到设计要求, 喂养期间每2个月检测一次各组大鼠的尿碘。

1.2 样品采取

大鼠经饲养6个月后, 禁食12小时, 其间自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛麻醉, 腹主动脉取血后, 取出肝脏, 经生理盐水清洗后, 取0.5g肝组织, 迅速置于液氮中备用。

1.3 尿碘测定

尿样的收集:每两个月将每组大鼠分为3笼放入代谢笼收集清晨3小时尿液, 连续收集3天, 4℃冰箱保存待测。尿碘测定采用过硫酸胺消化-砷铈催化分光光度法[12]。测定样品管碘含量C (μg/L) 。

1.4 实时荧光定量PCR (Real-timePCR)

利用试剂盒提取大鼠肝脏总R N A (promega) , 取2μg反转录成cDNA (promega) , 进行实时荧光定量PCR分析。Real-time PCR反应体系按照试剂盒配置 (promega) , 同时做三个平行样。GAPDH的上游引物序列为:5′-GATGCTGGTGCTGAGTATGRCG-3′, 下游为:5′-GTGGTGCAGGATGC ATTGCTCTGA3′;SIRT1上游引物序列为:5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′, 下游为:5′-TGA AGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′。PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性5s, 60℃退火30s, 40个循环;4℃保存。扩增结束后对SIRT1的mRNA表达水平进行分析。

2 结果

2.1 大鼠尿碘水平分析

每两个月收集每只大鼠尿液进行尿碘水平检测。见表1, 经6个月喂养, 各高碘组大鼠的尿碘水平显著高于适碘组 (P<0.01) 。尿碘与碘剂量相关性分析表明, 大鼠尿碘水平与碘剂量呈正相关 (r=0.95, P<0.01) , 碘剂量越高, 尿碘水平也越高。尿碘水平是反应碘营养状况的重要指标, 因此动物模型尿碘检测的结果说明碘过量动物模型建立成功。

2.2 Real-time PCR分析结果

每组随机选取8-16只大鼠, 雌雄各半。用Real-time PCR对大鼠肝脏SIRT1基因表达水平进行分析。结果显示 (图1) , 适碘组中, SIRT1在KI组中的mRNA表达量高于KIO3组 (P<0.05图1.A) ;10倍剂量组中, SIRT1在10KI组中的基因表达水平明显高于10KIO3 (P<0.01图1.B) ;50倍和100倍剂量组中, SIRT1的基因表达量在两种不同碘剂组中没有统计学差异 (P>0.05图1.C、D) ;在碘酸钾喂养条件下 (图1.E) , SIRT1基因表达水平随碘酸钾剂量的上调而增高, 且各高剂量组与适碘组相比有统计学差异 (P<0.01) , 100倍剂量组与50倍和10倍剂量组相比较均具有统计学差异 (P≤0.05) , 但10倍和50倍剂量组之间无差异 (P>0.05) 。在摄入碘化钾的情况下 (图1.E) , SIRT1在3个高剂量组中的基因表达量与适碘组相比明显升高 (P<0.05) , 与碘酸钾喂养组不同是SIRT1基因表达量随剂量的增高呈现出先升高后下降的趋势, 即SIRT1在100倍和50倍剂量组中的表达量与10倍剂量组相比明显下降 (P<0.05) , 且100倍剂量组和50倍剂量组之间无统计学差异 (P>0.05) 。

总之, 在适量碘和10倍剂量碘的条件下, 碘酸钾摄入组中肝脏SIRT1基因表达量明显低于碘化钾摄入组, 但当摄入剂量达到50倍和100倍, SIRT1基因在两种碘剂组间的表达无差异;从剂量效应来看, 不论摄入何种碘剂, SIRT1在高剂量碘组中的基因表达量均高于适碘组。

(数字代表大鼠编号:适宜碘组中1-4为雌鼠, 5-8为雄鼠;其余各剂量组均为:1-8为雌鼠, 8-16为雄鼠) 。A:SIRT1mRNA表达量在KI组中比KIO3组高, *P<0.05。B:SIRT1 mRNA表达量在10KI组中比10KIO3组高1, **P<0.01。C:SIRT1 mRNA表达量在50KI组育50KIO3组无统计学差异, P>0.05。D:SIRT1 mRNA量在100KI和100KIO3组之间无统计学差异, P>0.05。E:SIRT1 mRNA水平 (平均值) 随碘剂剂量增加的变化。各高剂量组与适碘组相比均有统计学差异*P<0.05。

3 讨论

我国早在上世纪50年代已经开始在碘缺乏病病区供应加碘食盐, 90年代后逐步采用碘酸钾代替碘化钾加工碘盐, 1995年实施了全民食盐加碘政策 (USI) , USI的推行使我国大部分省区的碘缺乏得到了纠正。但近年来有关碘的剂型和剂量安全性研究逐渐引起人们关注。本实验室的前期研究发现高碘饮水会导致人群出现血浆apoA1和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 异常, 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 呈升高趋势。此外, 有动物实验表明与相同剂量的碘化钾相比, 碘酸钾可减弱机体抗氧化能力。高碘酸钾使大鼠血清总胆固醇 (total cholesterol, TC) 和甘油三酯 (triglyceride, TG) 明显升高, 长期可能导致高脂血症及动脉粥样硬化 (AS) 。肝脏是游离脂肪酸、胆固醇和胆汁合成和代谢的首要场所, 研究发现沉默调节蛋白1 (silent information regulator1, SIRT-1) 在这些过程中起到重要的调节作用。

SIRT-1是一种依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶, 广泛地表达在哺乳动物的肝、脑、肾、脂肪、肌肉组织中。SIRTl参与了机体众多基因转录、能量代谢以及细胞复制性衰老等过程, 尤其在糖代谢和脂代谢中发挥着重要作用。研究表明, SIRTl的过表达能够下调固醇调节元件结合蛋白的乙酰化水平, 进而降低血清甘油三酯水平[8]。在SIRTl基因敲除小鼠中, 肝x受体的靶基因表达水平下降, 胆固醇逆向转运受到抑制, 从而不利于胆固醇代谢为胆汁排出体外[10]。这说明SIRT1能够有效促进机体血清中甘油三酯和胆固醇的代谢, 维持着机体正常血脂水平。但SIRT1是否参与了高碘致高脂血症的过程目前未见报道。