白蛋白mRNA（共7篇）
白蛋白mRNA 篇1
在试管婴儿技术中, 卵子质量及发育潜能是决定治疗成败的关键性因素之一, 如何准确评估卵子的发育潜能一直是生殖医学领域的重要课题。传统的形态学评分方法具有较强的主观性, 不能完全客观、准确地反映卵子的发育潜能。最近发展起来的“组学”研究, 包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、分泌组学和代谢组学等, 开辟了“分子诊断”的新领域, 提高了胚胎评估的客观性[1]。如果能在众多的分子指标中确定几个最准确、最有效的评估指标用于解决生殖医学领域目前面临的胚胎选择难题, 将对试管婴儿技术的临床工作极具指导意义。
卵泡颗粒细胞可分为壁细胞和卵丘细胞, 后者与卵子在结构上紧密连接, 在功能上具有密切的双向联系, 通过缝隙连接等多种方式进行相互的信息交流及营养物质的传递。近年来研究表明, 卵丘细胞上某些特定基因的表达水平可以用于预测卵子的发育潜能[2,3]。由于卵丘细胞容易获取且检测方便, 并且不影响卵子和胚胎的后续培养和发育, 所以作为一种非侵入性评估卵子发育潜能的方法在临床上具有很好的应用价值。
卵源性因子 (oocyte secreted factors, OSFs) 主要由卵子和颗粒细胞分泌, 包括生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9) 和骨形态蛋白15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15) 。OSFs参与卵泡发育的整个过程, 从始基卵泡的募集一直到排卵发生, 甚至在排卵后的黄体形成过程中都发挥着重要的调节作用[4~7]。研究发现卵泡液中GDF9和BMP15水平越高其卵子成熟和优质胚胎的比例也越高[8,9]。本研究通过检测卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15mRNA的表达水平, 分析其与卵子和早期胚胎发育的关系, 以期为今后挑选优质胚胎探索新的分子指标。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本研究已获得中山大学附属第六医院伦理委员会批准, 所有参与研究的患者均签署知情同意书。研究的对象为因男方因素行卵细胞浆内单精子注射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 治疗的252例女性不孕患者, 患者资料及标本收集于2012年10月至2013年6月, 基本资料见表1。患者的纳入标准为: (1) 促排卵方案为标准长方案; (2) 年龄≤42岁; (3) 体重指数 (BMI) 为17~28 kg/m2; (4) 基础FSH≤12 U/L; (5) 达到绒促性素 (HCG) 注射日的标准 (3个主导卵泡直径≥18 mm) 。排除标准为: (1) 卵巢早衰、卵巢功能减退、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征; (2) 影响胚胎种植的子宫疾病, 如黏膜下子宫肌瘤、宫腔粘连、中隔子宫等; (3) 反复种植失败 (既往3次及以上移植胚胎失败者) ; (4) 明确的输卵管积水。男方精液均为取卵当日射出精, 密度<1×106/ml。
1.2 促排卵方案及卵丘细胞的收集
所有患者促排卵均采用标准长方案。于黄体晚期注射1.25 mg长效曲普瑞林 (达菲林, Ipsen) 进行垂体降调节, 2周后给予150~300 U重组人促卵泡激素 (果纳芬, Serono) 刺激卵泡生长。当有3个优势卵泡≥18 mm, 肌内注射10000 U绒促性素 (HCG, Serono) , 36小时后在B超引导下经阴道穿刺取卵。获得的卵丘复合物于体外培养4小时, 在倒置显微镜下用透明质酸酶消化剥除卵丘细胞, 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗2遍, 离心后贮于-80℃待检。
1.3 卵子受精胚胎质量评估及分组
倒置显微镜下观察卵子成熟情况, 若镜下可见第一极体则定义为成熟期卵子 (MII) 。采用ICSI方法将单个精子注射至卵子胞浆中促使其受精, 受精后18~19小时观察卵子受精情况并进行原核评分, 观察到2个原核定义为正常受精 (2PN) , 则将患者纳入正常受精组。若没有观察到任何原核或观察到1个或多个原核则定义为异常受精, 则将患者纳入异常受精组。受精后43~45小时观察卵裂情况, 正常受精的胚胎进一步发育为4~6细胞定义为正常卵裂, 若停止发育为未卵裂。受精后67~69小时观察胚胎发育情况并进行卵裂期评分, 若卵裂球数目为7~9个, 大小均匀, 碎片比例<10%的胚胎评分则评为优质胚胎。若患者至少有一枚胚胎满足上述条件, 则纳入优质胚胎组。若患者无任何胚胎满足上述条件, 则纳入非优质胚胎组。将受精后第3天胚胎移植入宫腔, 5周后在B超检查下显示孕囊及胎心搏动定义为临床妊娠。
1.4 GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平检测
在收集的卵丘细胞中加入Trizol细胞裂解液, 提取卵丘细胞总RNA, 采用SuperscriptⅢ (Invitrogen, CA) 将其逆转录为c DNA。PCR定量测定采用Taqman荧光探针法, 仪器为ABI Prism 7700检测系统。PCR反应条件为:93℃3分钟, 然后93℃45秒, 55℃1分钟, 共40个循环。探针和引物序列见表2。
1.5 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件, 所有数据均进行正态检验, 非正态分布数据采用对数转化使其形成正态分布。采用Pearson相关法分析GDF9mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子及胚胎发育指标之间的关系。两组间GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平的比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子及胚胎发育指标的相关性
Pearson相关法分析结果显示:GDF9 mRNA表达水平与卵子成熟率、正常受精率和卵裂率呈正相关关系 (r=0.312;r=0.385;r=0.596, P<0.001) , 见图1A。BMP15 mRNA表达水平与卵子成熟率、正常受精率和卵裂率也呈正相关关系 (r=0.336;r=0.392;r=0.597, P<0.001) , 见图1B。
2.2 正常受精组与异常受精组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达差异
252例患者中正常受精183例, 异常受精69例。正常受精组GDF9 mRNA表达水平为5.92±1.71, BMP15 mRNA表达水平为4.36±0.25。异常受精组GDF9 mRNA表达水平为2.65±0.078, BMP15 mRNA表达水平为0.86±0.13。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。
2.3 优质胚胎组与非优质胚胎组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达差异
252例患者中优质胚胎组134例, 非优质胚胎组118例。优质胚胎组GDF9mRNA表达水平为4.89±0.28, BMP15 mRNA表达水平为2.65±0.35;非优质胚胎组GDF9 mRNA表达水平为3.42±0.32, BMP15 mRNA表达水平为1.63±0.35。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.001) 。
2.4 临床妊娠组与未妊娠组GDF9 mRNA和BMP15mRNA的表达差异
252例患者, 临床妊娠130例, 未妊娠122例。临床妊娠组GDF9 mRNA表达水平为4.52±1.32, BMP15 mRNA表达水平为2.81±0.16;未妊娠组GDF9 mRNA表达水平为2.72±0.22, BMP15 mRNA表达水平为1.96±0.27。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mR-NA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨论
本研究通过收集接受ICSI助孕治疗患者的卵丘细胞, 采用PCR技术检测卵丘细胞OSFs中GDF9mRNA和BMP15 mRNA的表达水平, 并分析这两种OSFs的转录水平与卵子及胚胎质量的关系, 旨在为今后挑选优质胚胎探索新的分子指标。
本研究发现, 卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平与卵子的成熟率、正常受精率和卵裂率均呈正相关关系 (P<0.001) 。虽然先前也有研究通过检测卵丘细胞基因表达水平预测卵子发育潜能, 但是之前的研究对象主要为OSFs作用途径的下游基因, 并没有直接对卵丘细胞中OSFs的表达水平进行检测[10,11]。与之不同的是本研究对OSFs本身直接进行检测, 以期能更好地预测卵子的发育潜能。事实上, OSFs既是自分泌因子也是旁分泌因子。研究已证实, GDF9和BMP15不仅存在于卵子胞浆中, 在卵子周围的卵丘细胞上同样也有表达[12]。GDF9和BMP15在卵子发育过程的作用已得到肯定, 二者既可以促进颗粒细胞增殖和代谢, 还可促进颗粒细胞中kit配体的产生, 后者作用于卵子表面的kit受体, 参与对卵子自身生长发育的调控[13]。正因为卵子和卵丘细胞之间存在如此密切的信息交流, 所以通过检测卵丘细胞上GDF9和BMP15表达水平可以客观地反映卵子的质量及后续的发育潜能。
受精发生和卵子成熟度有关, 核成熟的卵子才可能正常受精。本研究发现, GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平与卵子成熟率呈正相关 (P<0.001) , 提示这两种因子的表达水平可能反映促排卵周期中一簇卵泡的总体质量。另外, 受精过程也需要卵子胞浆成熟[14], 本研究中GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子受精率呈正相关 (P<0.001) , 提示这两种因子的表达水平与卵子质量有关;正常受精组两种因子的表达水平高于异常受精组 (P<0.05) , 也从不同角度提示这一结论。卵子质量不仅决定了受精情况, 而且还决定了后续的胚胎发育情况, 质量较差的卵子形成优质胚胎的机会也低于优质卵子。本研究中优质胚胎组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达水平显著高于非优质胚胎组 (P<0.01) , 提示二者的表达水平与胚胎质量关系密切。临床妊娠是评估胚胎质量的一个重要指标, 而卵子质量始终是决定临床妊娠结局的最关键的因素, 优质的卵子往往容易形成优质的胚胎, 临床妊娠机会也相应增加。在本研究中, 临床妊娠组卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平显著高于未妊娠组 (P<0.01) , 提示这两种因子的表达水平与卵子发育潜能有关。总之, 本研究提示卵丘细胞GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平可以作为卵子质量和胚胎发育的评估指标, 这可能为今后预测胚胎质量提供新的有潜力的分子指标。
由于卵丘细胞本身容易获得, 又不影响卵子的继续培养和发育, 并且PCR技术在短时间内就能够精确地检测OSFs mRNA的表达水平, 因此卵丘细胞中的GDF9和BMP15的表达水平可以快速、准确地预测卵子发育潜能, 在临床上具有广阔的应用前景。但是, 本研究的局限在于没有单独收集每个卵子的卵丘细胞, 无法将GDF9和BMP15表达水平与每个卵子及胚胎一一对应, 不能追踪每个卵子的后续发育情况。
白蛋白mRNA 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2008年3月~2009年3月在我院行根治性放疗食管鳞状细胞癌(ESCC)患者72例,其中,男54例,女18例;年龄46~83岁,中位年龄63岁;原发肿瘤部位:胸上段15例,胸中段46例,胸下段11例。根据放疗前影像学检查结果,依照我国《非手术治疗食管癌的临床分期标准(草案)》[4]分期:其中,Ⅰ期8例,Ⅱ期37例,Ⅲ期27例。入组条件符合以下标准:经胃镜病理检查确诊;均为初治患者;无放疗禁忌证;无远处转移;KPS评分≥70分;预计生存期≥3个月;实验室检查主要指标无异常。所有患者采用6 MV-X射线,2.0 Gy次,5次/周,总剂量60~70 Gy,分30~35次完成放疗计划。放疗结束后采用RECIST实体瘤疗效标准进行评价[5],分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD),有效率=[(CR+PR)/总例数]×100%。
1.2 试剂与仪器
淋巴细胞分离液购自上海华精生物科技公司;Trizol细胞裂解液购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒和DNA Marker购自Takara公司;基因引物由上海英骏生物技术公司合成;梯度PCR仪和分光光度计为Eppendorf公司产品;凝胶电泳成像系统为上海培清科技有限公司产品。CEA蛋白水平来自我院核医学科检查报告(≥3.5μg/L为阳性结果),测定仪器为Roche Diagnostics全自动免疫分析仪。
1.3 标本处理及RNA提取
放疗前及放疗结束两周内留取外周血10 ml(EDTA抗凝),采用淋巴细胞分离液分离单核细胞,生理盐水洗涤后置于-80℃冰箱备用。同期收集20例食管良性疾病患者外周血及10例食管癌术后组织标本作为对照。采用Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA,无RNA酶的DNase去除混杂的DNA,紫外分光光度计定量。
1.4 巢式RT-PCR
取1~2μg总RNA,70℃5 min预变性后,依试剂盒说明进行cDNA合成。继而取4μl cDNA行第1轮PCR扩增,取第1轮PCR产物0.5μl行第2轮PCR扩增。PCR反应体系包括10×PCR buffer 2.5μl(含Mg2+,终浓度在1.5 mmol/L),dNTP mixture 2.5μl(终浓度250μM/L),上下游引物各2μl(20 pmol),Taq酶0.15μl,灭菌去离子水补足至25μl。引物序列及反应条件参见文献[6]。取第2轮PCR扩增产物5μl行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析,率的比较采取χ2检验或Fisher确切概率法,诊断效能通过受试者特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 放疗前CEA mRNA、蛋白表达
CEA mRNA检测典型PCR结果如图1所示。72例食管癌患者中,放疗前CEA mRNA阳性者为34例(47.2%,敏感性),血清CEA蛋白升高者为16例(22.2%,敏感性);而20例食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性者为0例(100%,特异性),CEA蛋白升高者为2例(90%,特异性)。10例食管癌术后组织标本CEA mRNA表达均为阳性。CEA mRNA与CEA蛋白诊断食管癌的Youden指数(Youden指数是将灵敏度与特异度综合起来评价某种检查方法的真实性的指标,指数范围为0~1,Youden指数越大,真实性越大)分别为0.472与0.122,ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.736与0.561(图2),可见CEA mRNA的诊断效能显著优于血清CEA蛋白。
2.2 CEA mRNA、蛋白表达的临床病理联系
放疗前CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046),与年龄、性别、肿瘤位置、病变长度、分期等因素无关;而血清CEA蛋白水平升高与食管癌临床病理特征均无关。见表1。
2.3 CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效的关系
放疗结束后评价,CR 8例,PR 39例,SD 20例,PD 5例,放疗前CEA mRNA、蛋白水平与放疗有效率无关,而放疗后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关,CEA mRNA由阳性转阴或血清CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好。见表2。
3 讨论
放射治疗是食管癌治疗的主要手段之一,由于食管的组织结构和自身生物学等方面的特点,相当一部分食管癌患者不宜手术或不愿手术而接受放射治疗。但多年来食管癌的放射治疗效果尚不理想,5年生存率不足10%,失败原因主要是局部未控或复发[7],而肿瘤微转移可能在其中起到关键作用。因此,若能及时监测循环肿瘤细胞(CTC),将对食管癌早期诊断及指导临床治疗具有重要价值[2]。由于受到人体免疫系统的清除,存活的CTC数量极少,对检测方法要求较高。RT-PCR技术具有高度灵敏性,可鉴别106~107个正常细胞中的一个肿瘤细胞,是目前最常用的方法[8]。
注:CEA蛋白阳性、阴性分别指≥3.5μg/L与<3.5μg/L
血清CEA是食管癌常用的肿瘤标记物之一,但一直存在敏感性低、特异性差的问题。近年来,以CEA mRNA为标记的CTC检测则展示出较好的前景,在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等多种恶性肿瘤中得到广泛应用[3]。如Qiu等[9]报道,103例胃癌外周血CEA mRNA阳性占36.6%,CEA mRNA表达与肿瘤浸润深度和术后复发有关,并且,CEA mRNA比血清CEA蛋白在预测复发方面具有更好的敏感性。Ishigami等[10]则发现,胃癌外周血CEA mRNA拷贝数而非阳性率与术后复发有关。在食管癌中,Nakashima等[11]报道,外周血CEA mRNA阳性占57.4%(31/54),且CEA mRNA阳性与淋巴结转移、肿瘤分期和术后复发有关,而血清CEA水平与之无关。Liu等[12]应用realtime PCR检测食管癌术前1 d(B-1)、手术当天(B0)和术后3 d(B+3)外周血中以CEA mRNA为标记的CTC数目,发现B-1与B0,B-1与B+3间均有统计学差异,且B+3/B0>0.4预示较高的转移风险;Tanaka等[13]也发现以CEA mRNA和鳞状细胞相关抗原(SCC)mRNA为标记的鳞状细胞癌相关抗原(CTC)是食管癌术后无进展生存的独立预后指标。上述结果都证实外周血CEA mRNA检测在食管癌中的应用价值。
本研究结果表明,食管癌根治性放疗前外周血CEA mRNA阳性与CEA蛋白升高者分别占47.2%(34/72)与22.2%(16/72),而食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性与CEA蛋白升高者分别为0与10.0%(2/20),CEA mRNA的诊断效能显著优于CEA蛋白。且CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046),CEA蛋白升高与食管癌临床病理特征无关,提示以CEA mRNA为标记的CTC在食管癌预后中的潜在价值。同时,笔者发现放疗前后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关,CEA mRNA由阳性转阴或CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好,推测是由于放疗有效地减少肿瘤负荷,从而停止释放癌细胞及癌相关抗原入血。
白蛋白mRNA 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物
封闭群新生1日龄SD大鼠,雌雄不限,体重8~10 g,由广东省实验动物中心提供。与母鼠同笼,母鼠喂养。母鼠自由饮水,喂以条杆状动物饮料,室温15~25℃,自然采光。
1.2 主要仪器及试剂
Mx-3000P荧光定量仪(美国Stratagene公司);自制有机玻璃常压低氧舱大小为5 L的广口瓶,气孔和出气孔各1个;CY-7指针式测氧仪(成都贝斯达仪器有限公司);总RNA提取试剂盒(美国Promega公司);逆转录PCR试剂盒[Takara宝生物工程(大连)有限公司];PCR反应试剂盒(SYBR GreenⅠ)[Takara宝生物工程(大连)有限公司]。
1.3 实验方法及步骤
1.3.1 实验动物及分组
1日龄SD大鼠共20只,体重8~10 g,分为实验组(n=10)与对照组(n=10)。实验组依照“1.3.2”项下方法暴露在低氧条件下,4 d后断头处死,对照组为空气。
1.3.2 动物模型的制作[3]
先给低氧舱通入99.99%CO2,调节流速,应用CY-7指针式测氧仪,测得舱内的CO2浓度达99%后,放入1日龄新生SD大鼠5 min后取出,迅速向舱内通入99%O2,应用测氧仪使舱内氧浓度达99%,再将低氧后新生鼠放入舱内5 min取出。经处理后所有新生鼠均放回母鼠身边喂养,至第4天断头处死,用眼科剪行剖腹术取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织,-70℃冻存。
1.3.3 染料法(SYBR GreenⅠ法)荧光定量PCR反应
1.3.3. 1 鼠肠组织总RNA提取
总RNA提取试剂盒由Promega公司提供,按照操作说明上的SV Total RNA Isolation System步骤进行总RNA提取,并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,紫外分光光度计测定A260和A280确定RNA质量。28s r RNA条带强烈且A260/280位于1.8~2.0之间的RNA样品用于后续实验。
1.3.3. 2 逆转录反应
逆转录反应使用Takara试剂盒进行,取总RNA 4.0μl,依次加入5×Prime Script TM Buffer 2μl,Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5μl,Oligo d T Primer 0.5μl,Random primers 0.5μl,加无RNase水补足配成总体积10μl的反应液,37℃15 min(逆转录反应),85℃5 s(逆转录酶的失活反应),合成好的c DNA放入-20℃冰箱保存备用。
1.3.3. 3 引物的合成
荧光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成,PAGE纯化级别。引物序列如下:β-actin,F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3',第1 026~1175位核苷酸,片段长150 bp;AQP4,F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3',R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3',第2 615~2 731位核苷酸,片段长117 bp;AQP7,F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3',R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3',第322~468位核苷酸,片段长147 bp;AQP8,F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3',R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3',第292~417位核苷酸,片段长126 bp。
1.3.3. 4 荧光定量PCR反应
以β-actin作为内参基因,采用SYBR GreenⅠ染料法进行PCR反应扩增,在测定目的基因的同时测定内参基因用以标准化标本。反应体系:RT反应液2μl,加SYBR Premix Ex Taq TM 12.5μl,上下游引物各0.5μl,加d H2O补足至25μl总体系。各取样品3μl,使用EASY Dilution按10倍梯度稀释4次(1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000),每个浓度各取2μl,行3个复孔进行PCR反应,制作标准曲线。由于采用相对定量法作比较,标准曲线的横坐标并不要求真实的起始模板拷贝数,故制作标准曲线的时候需要设定模板的相对拷贝数。上述5个梯度的样品对应设定的相对拷贝数分别为5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。反应条件如下:95℃10 s预变性,95℃5 s,60℃30 s,40个循环PCR反应。Mx-3000P荧光PCR仪自动读出待检样品Ct值。另外以样品中起始模板的拷贝数为横坐标,Ct值为纵坐标,并以上述配制的按10倍梯度稀释的样品为5个点,绘制出标准曲线,自动计算出曲线的斜率(slope)及扩增效率(E)。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用REST-2005软件进行统计学处理。
2 结果
对照组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(18.84±0.43)、(19.80±0.43)和(20.68±0.31)。实验组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(21.85±0.45)、(22.62±0.24)和(23.51±0.20)。对照组β-actin基因的平均Ct值为(15.40±0.31),实验组β-actin基因的平均Ct值为(15.30±0.49)。
图1~4中各条线分别表示β-actin、AQP4、AQP7和AQP8标准曲线,横坐标代表相对模板浓度,纵坐标代表Ct值,5个梯度稀释点基本在一条直线上,证明Ct值与相对拷贝数据呈良好的线性关系。荧光定量仪分析软件求得标准曲线方程Y=a X+b,X代表起始模板拷贝数,Y代表Ct值,这样通过标准曲线中方程可求出待检样品的相对拷贝数。见表1。
用Pfaffl[4]推导的数学公式计算目的基因的相对表达量:
Ratio(R)表示目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数,分子部分为目的基因扩增效率,分母部分为内参基因的扩增效率。△Cttarget(control-sample)表示对照组与实验组中目的基因的Ct值之差,△Ctref(control-sample)表示对照组与实验组中内参基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分别表示目的基因和内参基因的扩增效率。如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近100%且相差<5%,也可以将PCR扩增效率默认为100%,这样公式就简化为2-△△Ct,计算结果为R值。R<1表示基因表达下降,R>1表示基因表达上升。
采用Pfaffl等[5]设计的REST-2005软件运行2-△△Ct公式,计算R值。把所有荧光定量资料包括各实验组Ct值、对照组Ct值、模板Ct值和模板浓度倍数输入计算机,运行软件,软件自动计算R值及P值。
根据REST-2005软件计算结果,内参β-actin基因的R值为(1.000±1.079)。AQP4、7、8基因与内参β-actin基因比较,实验组表达下降,R值分别为(0.117±0.129)(P<0.05)、(0.140±0.156)(P<0.05)和(0.134±0.140)(P<0.05)。实验组R<1,与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。用REST-2005软件计算各基因组QPCR反应的反应效率(E)、相对表达差异倍数(R)、样本标准误(SE)、95%可信区间(95%CI)及P值。结果见表2。
3 讨论
目前对AQPs的研究逐渐深入,发现AQPs参与多种消化道疾病的发病过程。主要集中在AQP1~8等几种。研究发现,AQPs与口干症[6]、便秘及大肠内液转运有关[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除实验中发现,剔除AQP5基因的大鼠经毛果芸香碱刺激后其唾液分泌量减少60%以上,而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未见明显减少,说明AQP5在涎腺的分泌中扮演着关键的作用。血管活性肠肽(VIP)神经元广泛分布于回结肠壁内,其递质VIP抑制肠道蠕动,参与便秘的发生。AQPs是VIP作用的最终靶分子之一,VIP能过c AMP依赖的途径上调AQP3及其m RNA的表达[9],可以推测VIP参与便秘发生与上调AQPs的表达,从而促进水分的吸收有关。
小肠大部分切除后出现的腹泻病,可能与AQPs上调有关。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小肠被大部分切除后AQPs m RNA在残留小肠、回肠、结肠中表达的变化,他们选取6周龄SD大鼠(n=15),切除80%远端小肠,残留的小肠、回肠、结肠分别在术后第1、3、5、7天切开,提取残留肠黏膜组织,用Northern blo技术分析AQPs m RNA的表达。结果发现,残留小肠AQP1和AQP3 m RNA在术后1 d表达明显增加,AQP7 m RNA在术后3 d增加,AQP4 m RNA术后无变化;结肠AQP3 m RNA在术后第1、7天表达增加,AQP4 m RNA无改变;AQP8 m RNA表达在术后第7天轻微增加,表明小肠大部分切除后除AQP4外,多种AQPs适应性上调。
Hardin等[11]用硫酸钠葡聚糖(DSS)喂养小鼠制成结肠炎模型,在进食DSS后12 h~7 d,以及从停止进食DSS后的恢复阶段第1天至第15天进行AQPs作用评价,并在实验阶段前3 d对鼠肠水分吸收进行测量。结果显示,DSS组12~24 h后结肠AQP4、7、8表达开始减少并持续至第7天,停止进食DDS后逐渐恢复,且病变肠组织对水分的吸收减弱。从结肠炎、溃疡性结肠炎及感染性结肠炎患者中提取的病理标本发现相似的改变。
新生儿时期严重的肠道疾病NEC虽然病因与成人结肠炎有很大不同,但从病理角度来看有非常相似的病理改变。各种原因引起的肠壁缺血、低氧被认为是发病的直接因素,特别在新生儿时期,窒息、低氧、休克等原因引起机体防御性反射,肠壁血流减少、缺血,肠黏膜屏障损伤情况容易发生。为了探讨AQPs在其中所起到的病理作用,本研究制作鼠模型进行前期研究。
NEC鼠模是采用新生SD大鼠,模拟宫内低氧环境下制作而成,用高纯度CO2在短时间内使鼠窒息,再通入高纯度O2复苏,造成肠道微循环缺血-再灌注损伤的病理过程。受损的肠组织通过荧光定量实验证明,与空白组比较,AQP4、7、8 m RNA在NEC组表达下降,实验仅说明AQPs在NEC鼠模中的表达改变,不能直接说明这些基因在发病中的调节机制。Laforenza等[12]认为APQs能起到使水跨细胞吸收或分泌的作用。肠功能出现障碍后,AQPs表达下降,可能与其蛋白质构象改变或发生移位有关。肠道的消化和吸收功能丧失,肠液大量排出,造成脱水肠液排进第三间隙及腹腔,造成体液丢失,引起内环境紊乱,AQPs的表达变化可能起到维持体液平衡及内环境稳定的作用。
AQPs与NEC的发病关系主要涉及肠腔渗透压的改变。NEC发病过程出现的水代谢障碍可能与AQPs的表达发生变化并引起肠腔渗透压改变有关。由以上可知,水吸收的主要器官是消化道。AQPs表达的变化可以影响水的吸收,使机体出现水代谢障碍,本实验NEC鼠模从外观上分析有脱水的表现。NEC鼠模实验证明AQPs表达下降,提示发生NEC病变时可引起细胞信号改变,导致AQPs合成障碍,从而形成NEC发病机制中的一个因素。目前AQPs在细胞内信号调节机制下出现的表达变化,在肾脏、肝脏已有很多学者阐述清楚,但在消化道方面仍然需要进一步研究。
AQPs参与消化道疾病是可能的,但发病机制较复杂。由于NEC是一种多因素引起的疾病,除AQPs外,还涉及其他如细胞因子、血管内皮素、血小板活性因子等参与发病过程。实验的最终目的是揭示真相,为临床打下基础。希望通过本次实验使相关工作者对AQPs给予足够的重视,认识到AQPs受损是一个引起机体水代谢紊乱的危险因素。
白蛋白mRNA 篇4
近年来, 研究人员发现在一些物种睾丸组织中也有GDF9、BMP15基因的转录, 提示这些生长因子会不会在调节雄性生殖功能方面也有着潜在作用。Peter G.Stanton则于2009年首次研究证明了在大鼠精子发生过程中GDF9、BMP15基因在转录和翻译水平的表达与定位, 并且得出在体外GDF9蛋白可以抑制支持细胞紧密连接的功能和促进抑制素B的产生。本文选择小鼠作为研究对象, 原因是国内尚未有关于小鼠BMP15、GDF9基因在一个生精周期睾丸各时间点mRNA转录水平变化的报道。
一、材料和方法
(一) 实验动物及标本采集。选用清洁级出生后3、9、15、21、28、35、56天雄性ICR小鼠以及雌性性成熟ICR小鼠, 由南京医科大学动物医学中心提供, 购于北京维通利华南京分公司。颈椎脱臼处死ICR雄性小鼠, “V”字形切口剪开皮肤, 暴露胸腔、腹腔等, 取出心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、垂体、下丘脑九种组织。雌性性成熟ICR小鼠取卵巢组织, 步骤同上。
(二) 仪器及试剂。MJ PTC-200型PCR扩增仪 (美国MJ公司) ;ABI7300荧光定量PCR仪 (美国ABI公司) ;EP5604稳压稳流电泳仪 (北京六一仪器厂) ;DYCP-31D水平电泳槽 (北京六一仪器厂) ;FR-200紫外凝胶成像分析系统 (上海医用分析仪器厂) 。提取组织总RNA的试剂:Trizol (Invitrogen, USA) ;DEPC (Bio Sharp, USA) ;氯仿、异丙醇 (上海实验试剂有限公司, 中国) 。总RNA反转录成c DNA试剂:d NTP、逆转录酶、逆转录酶缓冲液、RNA酶抑制剂 (Fermentas, USA) 。PCR检测试剂:d NTP、Mg2+、buffer、Taq M (申能博彩, 中国) 。荧光定量PCR检测试剂:SYBR Premix Ex TaqTM (Ta KaRa, Japan) 。
(三) PCR引物设计。根据Gen Bank中小鼠的BMP15和GDF9 c DNA序列, 利用计算机软件DNAstar, 依照c DNA设计原则, 序列如下:
(四) PCR反应参数。94℃预变性5分钟, 94℃变性30秒, 60℃退火40秒, 72℃延伸45℃, 循环35次, 72℃延伸10分钟。
(五) RT-PCR反应参数。50℃2分钟;95℃10分钟;95℃15秒, 63℃1分钟, 40个循环;95℃1分钟, 60℃30秒, 95℃15秒。
二、结果
注:1.下丘脑;2.睾丸;3.附睾;4.肾脏;5.垂体;6.肺;7.脾;8.肝脏;9.心脏;10.卵巢
(一) BMP15、GDF9基因转录的组织特异性。取成年雄性ICR小鼠, 提取心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、垂体、下丘脑九种组织的RNA, 并逆转录为c DNA, 用PCR技术分析各组织中BMP15、GDF9基因的转录情况, 其中卵巢组织为阳参。结果显示:BMP15基因在小鼠睾丸组织中有转录, 此外在附睾和垂体中也有少量转录。GDF9基因仅在睾丸组织中有转录, 其它组织中均未见转录。
注:1.下丘脑;2.睾丸;3.附睾;4.肾脏;5.垂体;6.肺;7.脾;8.肝脏;9.心脏;10.卵巢
(二) 睾丸BMP15、GDF9基因在睾丸不同发育时期转录水平比较。选取出生后3、9、15、21、28、35天以及性成熟 (8周以上) 的雄性ICR小鼠睾丸, 提取总RNA, 逆转录生成c D-NA。使用real time PCR的方法, 以GAPDH基因作为内参, 对模板中BMP15、GDF9基因的原始拷贝数进行半定量, 以探明小鼠出生后一个生精周期睾丸各时间点BMP15、GDF9基因转录水平的变化情况。结果显示:出生后3天, 睾丸组织中就有着极低水平BMP15基因的转录, 但随着睾丸的发育, 转录水平有了一定程度的升高, 但升高程度不显著。GDF9基因在出生后3天, 睾丸组织中同样有着极低水平的转录, 但伴随着睾丸的发育, 转录水平有了很大程度的升高, 在28天达到峰值, 并在此后保持稳定。
三、讨论
研究发现BMP15、GDF9基因并不仅在女性卵巢中有表达, 在某些物种的睾丸和垂体中也有BMP15和GDF9 mRNA的存在, 提示这些因子在调节睾丸和垂体的功能方面有着潜在作用。本实验以性成熟雄性ICR小鼠作为研究对象, 使用PCR的方法, 发现BMP15基因在小鼠睾丸、附睾和垂体组织中均有转录, 而GDF9基因仅在睾丸组织中有转录。使用real time PCR的方法, 探讨了BMP15、GDF9基因在睾丸中的转录水平随着个体发育, 尤其在出生后一个生精周期中的变化情况, 其中GDF9基因转录水平持续上升, 在出生后28天达到高峰并持续稳定表达, 这一变化趋势与之前Peter G.Stanton在大鼠中的报道情况比较吻合。今后还将利用原位杂交的方法对小鼠精子发生过程中GDF9、BMP15基因在转录水平的定位做进一步的研究。
参考文献
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白蛋白mRNA 篇5
1 材料与方法
1.1 实验动物
10~12周龄健康雄性清洁级SD (Sprasue Dawley) 大鼠, 体质量 (210±34) g, 共35只, 购自上海斯莱克景达实验动物有限公司长沙分公司, 动物合格证号:SCXK (湘) 2009-0004, 在湘雅医学院实验动物学部饲养, 在室温18~25℃、相对湿度50%~60%、人工12h昼/夜循环照明环境中用全价营养、分笼饲养, 每日定时清洗笼舍, 大鼠能自由摄食及饮水。
1.2 主要的仪器和试剂
BX-50生物光学显微镜、全自动紫外分光光度计、PCR仪、水平电泳槽、SP免疫组织化学试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;凋亡检测试剂盒 (天津灏阳公司) ;Trizol RNA抽提试剂盒 (北京天根生化科技有限公司) ;溴化乙啶 (美国Sigma公司) ;琼脂糖 (西班牙Biowest公司) 逆转录试剂盒 (日本东洋纺公司) ;DNA Marker (北京天根生化科技有限公司) ;蛋白提取试剂盒 (上海申能博彩生物技术公司) ;BCA蛋白定量试剂盒 (江苏碧云天生物技术公司;PMSF (江苏碧云天生物技术公司) ;PDVF膜 (苏州广惠科技有限公司) ;引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;虫夏草提取液由江西济民有限制药公司 (浓度为200 g/L) 惠赠。
1.3 动物模型的复制及分组
实验动物术前12 h禁食, 自由进水, 术前均用10%水合氯醛溶液 (3.5 m L/kg) 腹腔注射麻醉。沿腹部正中线在中腹部正中切口, 逐层切开分离皮肤、肌肉、腹白线进入腹腔后, 用止血钳拉开两侧皮肤及腹部肌肉, 用无菌纱布包裹腹腔内胃肠等脏器并拉向左侧, 术中注意保护大血管, 暴露右侧肾脏, 可见右侧肾脏位于腹膜后, 小心分离右侧的肾蒂后结扎, 切除右侧肾脏 (作为正常组) , 于结肠脾曲外侧切开后腹膜, 暴露左侧肾脏, 游离左输尿管和肾上腺避免损伤, 再游离左肾蒂。稳定10 min后将大鼠随机分成3组, 持续夹闭左肾动脉60 min后恢复灌注。缺血-再灌注组 (I/R组, n=15) :恢复灌注后予以生理盐水[2 m L/ (d·只) ]灌胃;冬虫夏草组 (CS组) :恢复灌注后予以冬虫夏草提取液[5 g/ (kg·d) ]灌胃;假手术组 (sham组, n=15) :分离肾蒂但不夹闭左肾动脉, 术后予以生理盐水[2 m L/ (d·只) ]灌胃;以上3组组内分为再灌注后24、48和72 h 3个时间点 (n=5) , 分别在上述时间点处死大鼠。
1.4 检测指标
1.4.1 各组大鼠肾脏病理改变
取左侧肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中, 将标本按顺序作固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色, 每张切片在高倍镜下取外髓质部10个视野, 以如下方法作半定量分析并计算其均值[4]:无病变为0分;≤10%为1分;11%~25%为2分;26%~45%为3分;46%~75%为4分;>75%为5分。按上述方法制备石蜡切片后, 光学显微镜下 (×20) 观察各肾脏标本病理切片的病理形态改变, 分析各组大鼠肾小管病理损伤程度。
1.4.2 RT-PCR检测各组大鼠肾组织Caspase-12m RNA的表达
取各组大鼠肾组织约100 mg并迅速剪碎, 按照Trizol法抽提肾组织总RNA, 吸取2μL所提取的RNA溶液, 稀释至100μL后, 用紫外分光计分别测定其在260 nm和280 nm波长处的吸光度值后, 对RNA的纯度进行鉴定, 其纯度符合要求后再进入下一步实验。各引物序列、产物长度及退火温度如下:Caspase-12引物上游5'-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3', 下游5'-AGTTCACCTGGGACCTCA-3', 扩增片段为438 bp;GAPDH引物上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 扩增片段为450 bp。根据逆转录试剂盒说明书合成c DNA, 之后取c DNA 2μL配成25μL体系, 按下述条件进行PCR反应, 94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 退火 (Caspase-12和GAPDH均为55℃) 30 s, 72℃延伸1 min, 72℃总延伸10 min, 共35个循环。取PCR产物5μL, 经2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙淀染色, 凝胶分析系统摄像, 条带用IPP图像分析软件检测其OD值, 以OD目的基因/ODGAPDH代表Caspase-12和GAPDH m RNA的相对量。
1.4.3 免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织Cas-pase-12蛋白的表达
常规脱蜡至水, 3%双氧水阻断灭活内源性过氧化物酶, 0.01 mol枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原, 羊血清工作液封闭, 分别滴加Notch2多克隆抗体 (1︰150) 、Hes-1多克隆抗体 (1︰150) , 37℃孵育30 min, 4℃过夜。DAB显色5~20 min, 显微镜下观察大鼠肾组织蛋白表达的量及部位。
1.4.4 Western blotting检测肾组织Caspase-12蛋白的表达情况
取新鲜肾组织50~100 mg提取总蛋白后, 测蛋白浓度, 经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜, Caspase-12多克隆抗体 (1︰300) 孵育过夜, 辣根过氧化酶标记的羊抗兔Ig G孵育 (用含0.5%脱脂奶粉的TBET稀释1︰10 000) , 最后化学发光, 得到胶片, 蛋白条带用凝胶光密度分析软件测其OD值, 用β-actin蛋白作为内参照, 通过计算比值 (OD目的蛋白/ODβ-actin蛋白) , 即目的蛋白的表达量来分析目的蛋白表达的相对水平, 分析两组大鼠肾组织的Caspase-12蛋白的表达。
1.4.5 原位末端标记法 (TUNEL) 检测细胞凋亡
切片常规脱蜡至水, 经双氧水处理、蛋白酶K室温消化后, 加入Td T和Digd UTP, 在37℃下温育2 h, 用体积分数为3%的牛血清白蛋白封闭, 再加生物素化抗地高辛抗体洗涤;加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素, 3, 3’-二氨基联苯胺 (DAB) 显色, HE衬染。镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。每张切片观察10个视野, 计算阳性细胞数/总细胞数比值×100%, 取其平均值作为各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡数。
1.5 统计学方法
采用SPSS 15.0软件进行单因素方差分析, 数据以均数±标准差 (±s) 表示, 如方差齐性, 组间比较用 (ANOVA) 及LSD多重比较, 如方差不齐, 则用非参数检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠肾脏病理改变
HE染色结果显示, 正常组和sham组肾小球、肾小管间质均未见明显病变;缺血再灌注后, 大鼠肾小管可见刷状缘丢失、小管扩张、管腔内管型、间质炎症细胞浸润等肾小管坏死改变;经CS处理后, 肾小管结构较I/R组明显完整清晰, 管腔内容物较I/R组明显减少, 炎症细胞浸润较I/R组明显减轻。半定量评分结果表明, 正常组计分为 (0.16±0.09) , sham组为 (0.17±0.10) , I/R后24 h计分最高, 为 (3.44±0.21) , 48 h为 (2.90±0.71) 逐渐降低, 72 h为 (2.48±0.19) 仍较高, 与sham组相比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。与I/R组相同时间点比较, CS组24 h计分 (2.84±0.19) , 48 h计分 (1.90±0.21) , 72 h计分 (1.14±0.11) , 均明显下降, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图1。
1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R相同时间点比较, P<0.01
2.2 各组大鼠肾组织Caspase-12 m RNA表达
RT-PCR结果显示, 正常组 (0.10±0.01) 和sham组 (0.11±0.01) 肾组织有少量的Caspase-12 m RNA表达;I/R组Caspase-12 m RNA表达明显上调, 24 h (0.77±0.08) 达高峰, 48 h (0.36±0.02) 逐渐下降, 72h (0.25±0.01) 仍可见到较高的表达。与sham组各时间点比较, Caspase-12 m RNA表达的相对水平差异均有统计学意义 (P<0.01) 。CS组24 h (0.65±0.07) 、48 h (0.24±0.04) 、72 h (0.13±0.03) 各时间点Caspase-12 m RNA表达均下调, 与I/R组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图2、3。
2.3 各组大鼠肾组织Caspase-12蛋白表达
免疫组织化学结果表明, 正常组和sham组大鼠肾小管可见少量的Caspase-12阳性蛋白表达, 肾I/R后24 h可见肾小管大量的Caspase-12阳性蛋白表达, 尤以受损的远端肾小管着色最深, 主要表达在胞浆, 胞核也可见少量阳性蛋白表达, 管腔中脱落的细胞也可见阳性表达, 48 h后阳性蛋白面积减少, 着色变弱, 72 h仍可见阳性蛋白表达。冬虫夏草处理后, 24 h肾小管阳性蛋白面积减少, 着色变浅, 随后阳性细胞数逐渐减少, 着色变浅。Western blotting结果与免疫组织化学类似。与sham组 (0.08±0.01) 比较, I/R组24 h (0.79±0.03) 、48 h (0.52±0.10) 、72h (0.35±0.01) 的Ccaspase-12蛋白表达上调, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。与I/R组比较, CS组24h (0.54±0.17) 、48 h (0.36±0.1) 、72 h (0.19±0.06) 各时间点Caspase-12蛋白表达下调, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图4~5。
2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡
TUNEL结果显示, sham组肾小管上皮细胞凋亡稍增加 (3.16±0.32) , I/R组大鼠发生凋亡的肾小管上皮细胞明显增多, 部分凋亡细胞自基底膜脱落至管腔中, 多数是远端小管上皮细胞, 少数在近曲小管, 肾间质、肾小球中均未见凋亡细胞, 凋亡细胞在I/R后24 h (28.3±0.92) 达高峰, 48 h (16.52±1.31) 后逐渐减少, 72 h (13.06±0.46) 仍可见到较多的凋亡细胞, 与sham组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) ;与I/R组各同时间点比较, 冬虫夏草组大鼠24h (24.3±1.00) 、48 h (13.72±0.57) 、72 h (9.34±0.93) 凋亡细胞比例均减少, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。见图6、7。
1~2分别代表正常组和sham组;3~5分别代表I/R组24、48和72h;6~8道分别代表CS组24、48和72 h
1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R相同时间点比较, P<0.01
1) 与sham组比较, P<0.01;2) 与I/R组相同时间点比较, P<0.01
3 讨论
内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 是真核细胞胞浆中重要的细胞器, 在细胞内分布广泛, 参与蛋白质的合成和转运、信号肽的识别、糖基化修饰、钙离子的贮存和调节、信号传导等一系列重要生理功能的维持。当细胞因钙稳态失衡、氧化损伤、缺血缺氧及某些药物作用等造成未折叠或折叠错误的蛋白质在内质网内大量堆积时, 可诱导细胞发生内质网应激 (endoplasmic reticulum stress, ERS) 。强烈持续续害。
近年的研究表明, ERS凋亡途径是急性肾损伤肾小管上皮细胞凋亡的重要途径, 有望作为细胞凋亡治疗的靶目标[4]。Caspase-12属于凋亡蛋白酶Caspase家族, 在肾、肌肉和肝组织均有高水平表达, 是唯一位于内质网膜上的凋亡蛋白酶[5]。正常生理情况下, Caspase-12以无活性的酶原形式存在。持续高强度的ERS将激活Caspase-12[6], Caspase-9前体是Caspase-12的底物, 活化的Caspase-12在不需要线粒体释放细胞色素-C的情形下即可直接切割活化Caspase-9, 活化的Caspase-9再切割Caspase-3, Caspase-3作为效应分子启动凋亡。研究发现[7], 当发生ERS导致细胞发生凋亡时, Caspase家族中仅有Caspase-12在内质网膜上表达, 并且内质网分子伴侣蛋白Bip表达增加, 提示Caspase-12可能在ERS凋亡中起关键作用。另有研究表明, Caspase-12基因敲除的大鼠发生ERS反应时, 细胞凋亡可明显减少, 进一步证实了Caspase-12是ERS时细胞发生凋亡的标志[8]。肾I/R损伤后, 缺血、缺氧及钙超载等可诱导肾小管上皮细胞内质网伴侣分子GRP-78表达增多, 提示细胞发生ERS[9], 并且GRP-78表达与肾小管损伤、血肌酐水平呈正相关关系, 证实了ERS可能在急性肾损伤发病中起重要作用[10]。而进一步的研究表明, I/R损伤后, 肾组织内质网Caspase-12表达上调, 通过缺血预适应减少Caspase-12表达, 肾小管细胞凋亡明显减少, 证实ERS凋亡途径参与肾I/R损伤[11]。另有研究表明, Caspase-12可能对正常发育或肿瘤形成并不重要, 因此Caspase-12可能是较理想的抗凋亡治疗靶点[12]。
冬虫夏草 (cordyceps sinensis, CS) 是一种名贵的中草药, 药性温和, 能补肾润肺、益气生血, 阴阳并补, 治劳嗽膈症, 诸虚百损, 临床研究表明, 金水宝胶囊能显著降低BUN、Scr、血磷、三酰甘油及胆固醇, 能改善患者肾功能, 提高慢性肾衰患者血浆总蛋白及白蛋白, 改善营养不良和钙磷代谢的紊乱状况, 纠正脂质代谢紊乱, 从而明显提高患者的生活质量[13]。冬虫夏草又可减轻2型糖尿病大鼠肾组织细胞凋亡而发挥肾保护作用[14]。目前在临床上广泛应用于治疗各种急慢性肾脏疾病, 但冬虫夏草抗凋亡作用是否与影响肾组织Caspase-12表达有关?国内尚未见相关报道。
白蛋白mRNA 篇6
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康雌性SD大鼠30只 (山西医科大学生理实验室提供) , 体重180 g～200 g。链脲佐菌素 (Streptozotocin, STZ, 美国Sigma 公司) , Exendin-4针剂 (东莞宝丽健生物工程研究开发有限公司提供) , 尿蛋白 (ALB) 测定试剂盒 (南京建成公司) , 兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) , DAB试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) , 血糖仪及试纸 (美国强生公司) , 723可见分光光度仪 (山东高密彩虹分析仪有限公司) , 贝克曼-2000型全自动生化分析仪 (美国贝克曼公司) , B2-2000医学图像分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 2型糖尿病肾病模型的建立和实验分组
30只SD大鼠均以高糖高脂饲料 (常规饲料66.5%, 10%猪油, 20%蔗糖, 2.5%胆固醇, 1.0%胆酸盐) 喂养4周后, 一次性腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素, 于注射后1周尾静脉采血测随机血糖16.65 mol/L者为糖尿病模型成功。造模过程中所有大鼠均不使用胰岛素, 4周后测定血糖、24 h尿蛋白定量。若随机血糖>16.67 mmol/L、24 h 尿微量白蛋白>30 mg/ (kg·d) , 确定糖尿病肾病模型成立[1]。实验过程中死亡2只, 造模不成功4只, 余24只随机分为糖尿病肾病模型组 (DN) 、Exendin-4低剂量治疗组 (EL) 、Exendin-4高剂量治疗组 (EH) , 每组8只。
1.2.2 给药方法
糖尿病肾病模型成功后第2天, 低剂量治疗组、高剂量治疗组分别给予Exedin-4 4 μg/ (kg·d) 、20 μg/ (kg·d) 皮下注射, 糖尿病肾病模型组1.5 mL/ (180 g·d) 皮下注射, 共6周, 每周测体重1次, 依体重调整药物剂量。
1.2.3 标本收集
给药6周后, 用代谢笼收集24 h尿液, 留取少量标本测24 h尿蛋白, 处死前尾静脉采血测空腹血糖 (FBS) , 测体重, 用乌拉坦0.4 mg/kg腹腔麻醉, 腹腔静脉采血, 并离心后留取标本测血三酰甘油 (TC) 、胆固醇 (TG) 、低密度脂蛋白 (LDL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 。取双侧肾脏, 左肾置于10%中性甲醛中固定, 用于光镜及免疫组化研究, 另一肾脏标本放于-70 ℃冰箱中保存用于RT-PCR研究。
1.2.4 生化指标测定
尿蛋白测定采取分光光度仪检测, 血糖由强生血糖仪及试纸检测, TC、TG、LDL、HDL由自动生化分析仪检测。
1.2.5 肾组织病理学观察
肾组织经中性甲醛固定, 常规石蜡包埋, 切片行HE染色, 光镜下观察肾组织的形态学改变。
1.2.6 免疫组化检测TGF-β1蛋白表达
肾组织经中性甲醛固定, 常规石蜡包埋切片2 μm, 70 ℃烤箱烤片1 h, 后脱蜡至水, 3%双氧水灭活内源性过氧化物酶15 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次, 柠檬酸盐缓冲液进行抗原高压热修复2 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次, 取封闭液室温下封闭10 min, 滴加兔抗大鼠TGF-β1 (1∶100) 抗体, 37 ℃孵育2 h, 取出后室温下10 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次, 滴加聚合HRP标记抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min, PBS缓冲液冲洗2 min×3次, DAB室温下显色, 苏木素轻度复染、脱水、封片、观察。采用B2-2000医学图像分析系统测定每个视野中免疫组化阳性表达的光密度值, 然后计算平均值。
1.2.7 RT-PCR法检测TGF-β1mRNA表达
每个样品取肾组织约50 mg, 按照经典方法用Trizol试剂、氯仿和异丙醇进行抽提总RNA。检测纯度, 按反转录试剂盒的说明进行反转录, 反应体系20 μL , 条件为37 ℃, 15 min×3 (反转录反应) , 85 ℃, 5 s (反转录酶的失活反应) 。引物由上海生工合成, 序列如下, β- actin:上游5′- TGGCTCCTAGCACCATGAAG- 3′, 下游5′- GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA - 3′, 产物长度307kb;TGF-β1:上游5′- GAACCAAGGAGACGGAATACAGG- 3′;下游5′-CCTCGACGTTTGGGACTGATC-3′, 产物111kb;采用两步法PCR 程序:预变性Stage 1:预变性 95 ℃ 30 s;PCR反应 95 ℃ 5 s ;延伸60 ℃ 30 s, 40个循环;反应以β- actin CT值为内参照, 目的基因扩增用Ct 值, 应用2-△△CT法进行定量分析。△CT (目的基因) = CT 目的基因-CT 内对照基因, △△CT =△CT 目的基因-△CT 标准值, 使用2-△△CT计算基因表达情况。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 一般状况
糖尿病肾病模型组大鼠于注射STZ 7 d后即出现多尿、多饮、多食症状。在4周时症状糖尿病肾病模型组已明显, 到10周时大鼠糖尿病肾病模型组毛发色泽黯淡, 精神萎靡, 活动减少。
2.2 各组大鼠生化指标的比较
大鼠糖尿病肾病模型组注射STZ 7 d后血糖显著增高。经Exendin-4治疗6周后, 与DN组相比, EL组、EH组血糖、24 h尿蛋白、TG下降 (P<0.05) 。与EL组相比, EH组下降更为明显 (P<0.05) 。详见表1。
2.3 肾组织的HE染色光镜下病理形态改变
模型组肾小球的基质增多, 毛细血管袢受压, 肾小管管腔变窄, 管壁增厚。Exendin-4治疗组上述改变较DN组减轻, 以高剂量治疗组明显。
2.4 肾组织的免疫组化结果
TGF-β1在模型组大鼠肾小球肾小管着色明显增多呈棕黄色, 以肾小管表达为著, 低剂量组上述表达减弱, 高剂量组上述表达明显减弱。
应用B2-2000医学图像分析系统分析每个视野的阳性表达的光密度值后进行统计学分析, 结果治疗组与模型组相比, TGF-β1的光密度值减低, 以高剂量组明显。详见表2。
2.5 RT-PCR结果
TGF-β1mRNA在模型组表达活跃, 在治疗组表达与模型组比较减少, 以高剂量组明显。详见表2。
3 讨 论
糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一, 对人类和社会的危害日益明显, 大约10%的患者因肾衰竭死亡[2]。它的主要特点是肾小球基底膜增生导致细胞外基质的堆积, 进而导致肾小球硬化, 肾小管间质纤维化, 肾功能丧失。正常情况下, 细胞外基质的合成和降解处于动态平衡中, 糖尿病状态下, 这种平衡被打破, 造成基质合成增多和 (或) 降解减少。张莉等[3]发现在早期 (4周) 糖尿病模型中肾组织TGF -β1既有显著增高。这证明TGF-β1参与了糖尿病肾病肾脏肥大和硬化的发生、发展。TGF -β1可通过多种途径引起细胞外基质的重构:①可通过促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号转导通路传递细胞信号, 促进细胞外基质合成[4]。②抑制纤溶酶原激活剂活性, 使纤溶酶原激活物抑制剂产生增多, 抑制金属蛋白酶的生成, 增加组织金属蛋白酶 (TIMP) 抑制物的产生, 减少Ⅳ型胶原降解, 导致细胞外基质堆积[5,6,7]。因此, 通过干预糖尿病肾病状态下TGF-β1的升高, 阻断其信号转导过程, 以阻止肾脏疾病的进展将有重要意义[8]。
Exendin -4 是一种GLP-1的激动剂, 产生于蜥蜴唾液腺中, 其生物学功能与人体的GLP-1作用相似, 可以改善胰岛细胞的功能, 呈血糖依赖的胰岛素分泌, 对2型糖尿病患者可恢复第一时相胰岛素的分泌, 抑制胰高血糖素的分泌, 延缓胃排空和食物的摄取从而减轻体重[9]。Park等[10]研究Exendin-4可使db/db鼠肾脏TGF-β1的表达减少, Ⅳ型胶原合成减少;通过增强PPAR-α的表达改善脂代谢紊乱对糖尿病肾病有潜在的保护作用。
本研究结果显示, 糖尿病肾病模型组中24 h的尿蛋白排泄率增多, 血脂血糖增高, TGF-β1mRNA的表达增多, Exendin-4对糖尿病肾病模型大鼠干预治疗6周后上述指标有相应的改善, TGF-β1mRNA的表达下降, 且呈剂量依赖的趋势。但对于TC、HDL治疗组与模型组比较差异却无统计学意义, 考虑与标本过少有关。此研究提示Exendin-4对糖尿病的肾脏损害有潜在的保护作用。其机制可能包括:可平稳降低血糖, 减轻体重, 改善胰岛素抵抗, 消除了糖毒性所带来的肾脏损害;改善了脂代谢紊乱, 减轻了脂毒性引起的肾脏损害;使TGF-β1mRNA和蛋白的表达下降, 细胞外基质的合成减少, 延缓了肾小球硬化, 肾小管间质纤维化的进程。近年有研究报道在中等肾功能损害中应用Exendin-4可加重肾脏的损害[11], 故在糖尿病肾病的不同阶段应用Exendin-4是否均有保护作用还有待进一步研究[12]。
摘要：目的 通过Exendin-4对糖尿病肾病 (DN) 大鼠进行干预治疗, 观察其对肾组织转化生长因子1 (TGF-β1) mRNA和蛋白表达的影响。方法 用高糖高脂饲料结合小剂量的链尿佐菌素建立糖尿病肾病模型, 随机分为糖尿病肾病模型组、Exendin-4低剂量治疗组[4μg/ (kg.d) ]和Exendin-4高剂量治疗组[20μg/ (kg.d) ], 治疗6周后测定各组大鼠24h蛋白尿、血糖、血脂, HE染色光镜下观察肾组织的病理变化, 用免疫组化法及RT-PCR两种方法检测TGF-β1的表达。结果 与糖尿病肾病模型组相比, Exendin-4治疗组的血糖、血脂、24h尿蛋白定量均下降 (P<0.05) , 高剂量治疗组改善更明显 (P<0.05) 。与糖尿病肾病模型组相比, Exendin-4治疗组大鼠肾组织的TGF-β1表达明显下降 (P<0.05) , 高剂量治疗组大鼠肾组织的TGF-β1表达下降更明显 (P<0.05) 。结论 Exendin-4对糖尿病肾病大鼠具有一定的肾脏保护作用, 且有剂量依赖性, 其机制可能与降低TGF-β1mRNA和蛋白的表达进而抑制细胞外基质的堆积有关。
白蛋白mRNA 篇7
关键词：抗纤复方,HSC-LI90,I型、IV型前胶原、TIMP-1,mRNA,Northern印迹杂交
抗纤复方是临床治疗肝纤维化的有效药物, 由黄芪、丹参、紫河车、郁金等药物组成[1]。以往的实验研究表明, 该药不仅能够抑制肝内多种细胞外基质的合成, 而且能够抑制肝纤维化大鼠肝星形细胞TGFβ1的表达, 减少胶原产生[2,3]。我们为了研究该复合方剂抗肝纤维化作用机制, 以不同剂量抗纤复方含药血清进行实验室研究, 以Northern印迹杂交方法进一步观察抗纤复方对HSC-LI90细胞I型 (CoL-I) 、IV型前胶原 (CoL-IV) 、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 (TIMP-1) mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 抗纤复方的制备
其无菌制剂由上海曙光医院制剂中心制备, 以蒸馏水分别稀释成0.025、0.05、0.10、0.3g/mL等不同浓度。
1.2 细胞系
星形细胞系HSC-LI90由日本佐贺医科大学肝病中心惠赠, 系表型为活化的人肝星形细胞 (HSC) , 表达高水平的CoL-I、MMP-II、TIMP-l、TGFβ1 mRNA等[4]。
1.3 动物
用于制备含药血清的大鼠, 清洁级, 雌雄各半, 体质量300～350g, 购自上海中医药大学实验动物中心。
1.4 抗纤复方含药血清的制备
大鼠随机分为5组, 每组5只, 其中4组按体质量灌胃给予抗纤复方水溶液1.0mL/100g体质量, 2次/d, 剂量依次为0.5、2.0体质量、4.0g/kg体质量, 于给药后90min分别以1.5%的苯巴比妥钠腹腔注射麻醉, 无菌条件下, 从腹主动脉采血约10mL, 存放于4℃冰箱中, 待血浆凝固血清析出后, 于高速离心机中以3000rpm离心10min, 留取血清。另设一组作为空白对照组。所有血清均经56℃、30min灭活后, 置-20%冰箱中保存备用。
1.5 细胞培养
HSC-LI90细胞以1×106细胞/100mm的浓度接种于培养皿, 24h后, 分别加入10%抗纤复方含药血清10mL, 同时设空白对照组。培养48h后, 提取细胞总RNA, 检测HSC-LI90细胞I型、IV型前胶原、TIMP-1mRNA表达。
1.6 CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA的Northern印迹杂交
运用AGPC法, 从HSC-LI90细胞中提取总RNA。每20μg总RNA加入1%琼脂糖凝胶中, 电泳后, 将变性的RNA转移至硝酸纤维素滤膜 (AmershamJapan) 然后用32P-dCTP标记的cDNA探针与之杂交16h, 杂交浓度65℃, 洗膜2次以后, 放射自显影。定量用BAS2000测定分析。用CoL-I (CoL-III、TIMP-1) /GAPDH的比值表示CoL-I、CoL-III、TIMP-1表达水平。每项实验至少重复3次, 数据用mean±SD表示, 用单因素方差分析进行统计学处理。
2 结果
不同浓度的抗纤复方含药血清均有降低CoL-I、CoL-IV、TIMP-1mRNA水平的作用, 并呈一定剂量依存关系, 统计学处理P<0.05或0.01, 结果见图1。
3 讨论
肝纤维化为诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化, 是影响肝病预后的重要环节, 在尚无有效方法根治原发疾病的情况下, 减缓或阻止肝纤维化的进程, 是相当重要的治疗对策。肝纤维化、肝硬化的病理基础是细胞外基质在肝脏异常的沉积, 这种异常的沉积, 和 (或) 胶原合成、降解的动态平衡失调有关。研究肝纤维化的发生、发展及其治疗对策时, 应对细胞外基质合成和降解两方面同时加以观察, 凡是能够影响胶原合成及/或胶原降解代谢的手段, 都是阻断和逆转肝纤维化和肝硬化的有效方法[5]。
肝星形细胞是ECM的主要来源, 肝星形细胞激活并转化为肌纤维样细胞, 各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞, 正常情况下, 肝星形细胞处于静止状态, 当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时, 肝星形细胞被激活, 其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星形细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建, 另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。肝星形细胞的激活是肝纤维化发生、发展的关键环节。肝 (HSC) 是肝脏间质细胞之一, 是肝纤维化时细胞外基质 (ECM) 过多产生和沉积的主要细胞来源[6]。针对HSC活化的不同环节进行抗肝纤维化治疗已形成了共识, 如果能够抑制胶原等细胞外基质的合成和 (或) 促进ECM的降解, 则有可能缓解、阻止甚至逆转肝纤维化、早期肝硬化。
肝星形细胞HSC-LI90系表型为活化的人星形细胞, 表达高水平的CoL-I、MMP-2、TIMP-1 mRNA等, HSC-LI90是体外研究肝纤维化发生机制、观察抗肝纤维化药物作用的较为理想的模型[4]。我们采用中药组方抗纤复方取其不同浓度的含药血清观察了其对HSC-LI90细胞mRNA表达的影响。
Ⅰ型、Ⅳ型胶原是纤维化时病变部位沉积的主要胶原蛋白, Ⅵ型胶原是肝基底膜的主要成分, 肝纤维化时含量明显增高, 血中Ⅵ型胶原的水平与肝纤维化程度成正相关。在实验性肝纤维化模型中, Ⅰ型、Ⅳ型胶原mRNA表达增强, 导致其产物过度沉积, Ⅰ型、IV型胶原mRNA在一定程度上可以反映ECM的沉积。我们实验结果表明, 抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞I型、Ⅳ型胶原mRNA表达水平, 从而减少胶原的沉积。
TIMP-1是一种糖蛋白, 是ECM主要结构蛋白降解特异酶MMPS的抑制剂, 肝纤维化时间质胶原酶活性下降而TIMP-1的表达增加, 且与PⅢP、LN正相关, 与肝纤维化程度相关。其主要作用是抑制MMP酶原的活化及其对ECM的降解, 血清TIMP-1水平反映了慢性肝病肝内炎症和纤维化的一些重要特征, 在目前情况下, 是一种肝纤维化无创诊断和随访指标。TIMP-1是抑制基质金属蛋白酶活性的一组多功能因子家族的主要成员之一, 能结合除14、19以外的所有MMPs而使其活性减弱, 是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素。许多实验研究表明, 肝损伤激活HSC, 表达MMPs和TIMPs, 在肝损伤早期阶段, 体外培养的HSC一过性表达MMP3、MMP13等, 之后, HSC表型发生变化, 前MMP2和MT-MMP表达, MMP2活化, 降解局部正常的肝脏基质;并且TIMP-1表达明显, 抑制间质胶原酶 (MMP1/MMP13) 对胶原的降解。而在肝损伤停止后, TIMP-1迅速减少, 胶原酶活性增加, 降解ECM, 纤维化逆转[7]。可以证明, TIMP-1在调节胶原的降解代谢中发挥着重要的作用。通过研究我们认为不同浓度抗纤复方含药血清作用HSC-LI90细胞48h后0.5、2.0、4.0g/kg含药血清有降低TIMP-1 mRNA水平的作用, 提示抗纤复方具有促进胶原降解的作用。
抗纤复方可明显降低HSC-LI90细胞CoL-I、CoL-IV、TIMP-1mRNA表达水平, 从而干预肝纤维化及肝硬化时的胶原合成、降解代谢, 发挥其抗肝纤维化的作用。
参考文献
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[2]张斌, 王灵台, 陈建杰.抗纤复方影响大鼠肝贮脂细胞生成I、III型胶原的比较研究[J].中国实验方剂学杂志, 2000, 6:33-35.
[3]王灵台, 张斌, 陈建杰.抗纤复方药物血清对肝纤维化大鼠肝细胞生成胶原的影响[J].中华消化杂志, 1999, 19:391-393.
[4]Ozaki I, Zhao G.Hepatocyte growth factor induces collagenase via the transcription factor Ets-1in human hepatic stellatc cell line[J].J Hepatol, 2002, 36:169-178.
[5]王宝恩.肝纤维化[J].中华肝脏病杂志, 2000, 8 (4) :179.
[6]王宝恩.肝纤维化时细胞外基质的合成与降解[J].中华肝脏病杂志, 1997, 5 (2) :65.