白蛋白超声微泡（精选4篇）
白蛋白超声微泡 篇1
用高分子材料构建的纳米微粒做基因转染载体,是近年来兴起的一种新方法,白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料[1]。本研究以白蛋白为纳米载体材料,采用一步法包裹组织型纤溶酶原激活物基因(tissue-type plasminogen activator,tPA)真核表达质粒制备成白蛋白-tPA基因药物,并与制备的蔗糖白蛋白超声微泡交联形成超声靶向转基因体系转染兔多种组织。现将研究结果报告如下:
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
纯种新西兰白兔25只,雄性,体重2.3~2.5 kg,由南方医科大学动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
质粒pSecTag 2B、感受态细胞E.Coli JM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供;限制性内切酶HindⅢ、KpnⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ购自宝生物工程有限公司;VentDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自New England Biolabs公司;羊抗人t PA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白和t PA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。全氟丙烷气体(Halocarbon-218)由广东佛山捷锐公司提供。
1.1.3 主要仪器
超声波发生器(宁波新芝生物科技有限公司);治疗性超声仪(US-700,德国)。
1.2 方法
1.2.1 基因质粒的构建和表达
根据3个EST序列及t PA基因序列设计3对引物以之将t PA的3段序列从3个EST克隆质粒中扩增出来,并且在3对引物末端分别引入酶切位点。分别用含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基扩增培养3个EST克隆菌株,提取3个EST克隆质粒作为PCR扩增模板并扩增3条t PA片断,回收扩增产物并测序鉴定。质粒pSecTag 2B和3条t PA片断t PA-1、t PA-2、t PA-3分别经HindⅢ和XhoⅠ、HindⅢ和KpnⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化,经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化,T4DNA连接酶14℃连接过夜,将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞,经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落,PCR检测重组质粒,提取重组质粒测序鉴定。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至CHO细胞,用间接免疫荧光法检测t PA表达。
1.2.2 一步法制备载基因白蛋白纳米粒
100 mg牛血清白蛋白加入5 m L双蒸水溶解,用0.1 N HCl调整pH值至5.5。将已构建的1 mg t PA质粒加入上述白蛋白溶液中,孵育30 min后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇(乙醇∶水=2∶1),直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液30μL,适当搅拌,室温下静置2 h。减压使残余的乙醇挥发后,所得溶液17 000 r/min离心30 min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件:180 W,固定频率20 kHz,30 s)分散成乳胶状,4℃下储存备用。取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、做包封率检测和凝胶阻滞实验,并用Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.3 氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡的制备方法
无菌制备含10%蔗糖的5%(g/mL)牛血清白蛋白液体10 m L;并置于有盖50 m L塑料离心管中,依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量:6 m L/min),约10 min,超声波发生器处理1 min(条件:180 W,固定频率20 kHz);将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态、测量大小并计数;Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.4 载基因纳米白蛋白微泡靶向超声造影剂制备
将一次制备的白蛋白纳米粒(含1 mg质粒)加至5m L白蛋白微泡中,加入50%戊二醛10μL溶液4℃下孵育2 h进行交联(戊二醛溶液终浓度为0.1%)。用生理盐水洗涤、离心、分层,离心速度200 r/min,1min,取上浮泡沫悬液即得载基因的纳米白蛋白微泡靶向超声造影剂(载体)。调整微泡浓度使5 m L靶向造影剂中含微泡0.8~1.8×109个/m L,基因质粒含量为1 mg。4℃下保存备用。
1.2.5 载t PA基因纳米白蛋白微泡靶向超声治疗方法
兔用5%戊巴比妥钠静脉麻醉(20~25 mg/kg);用二维超声观察心、肝等脏器显影。经耳缘静脉注入载t PA基因纳米白蛋白微泡剂5 m L,并观察到相关脏器显影明显增强。分组:(1)实验组(n=16):进一步分心脏组6例、肝脏组6例和肌肉组4例。静脉注入载t PA基因纳米白蛋白微泡剂5 m L后立即经胸前壁正对心脏前壁及肝区、经皮肤左后腿内收肌群等超声照射30 min并观察到将微泡击碎(二维超声观察),超声频率1 MHz;强度1.5 W/cm2。(2)对照组(n=9):单纯微泡组3例,经耳缘静脉注入载t PA基因纳米白蛋白微泡剂5 m L,不用超声照射;纳米基因组3例,静脉输入白蛋白纳米t PA基因及超声照射;空白对照组3例,静脉输入5 m L生理盐水和超声治疗。超声治疗条件同前。后2组靶器官为肝脏。术后普通饲料喂养,观察期4周。
1.2.6 病理和免疫组织化学观察
动物经常规饲养和观察4周后分别处死,取心脏、肝脏、大腿内收肌组织以及超声场通过的胸壁肋软骨组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规切片和HE染色病理检查;间接免疫组织化学法染色检测t PA基因在各组织和细胞中的表达,阳性反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。取肺脏、肾脏组织作为对照。动物于术前和观察结束分别取血液检测D-二聚体含量并用ELISA法检测血t PA含量。
1.2.7 统计学分析
所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示,各组间数据的比较采用t检验或方差分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 p SecTag2B-t-PA重组质粒的构建与表达
转染CHO细胞后免疫荧光反应结果如图1所示,被转染的CHO细胞胞浆荧光素呈强阳性反应,对照组一抗用β-catenin抗体为阴性。
A:对照组t PA抗体反应阴性;B:pSecTag2B-t-PA plasmid转染CHO细胞t PA抗体反应强阳性(免疫荧光法×400)
2.2 载tPA基因白蛋白纳米粒粒径、形态和包封率的测定
扫描电镜结果显示,白蛋白纳米粒球形,大小较均匀且分散良好。Zetasizer 3000仪粒度分析显示,白蛋白粒径大小呈正态分布,平均粒径大小为132.0nm,最大粒径为152.4 nm,最小粒径为49.1 nm。多分散指数平均0.33。表面Zeta平均(+31.32~+41.42)m V。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测,测量加入的总的质粒DNA含量。将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA,包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:的加入量;W游:上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为73.58%,符合实验要求。
2.3 凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验
0.9%琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示,可见经白蛋白纳米包裹后的DNA完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA∶白蛋白为1∶100)。未被白蛋白纳米粒包裹的质粒DNA经DNaseⅠ消化后降解,电泳未见条带显现。这表明纳米粒对质粒DNA具保护作用。
1.DNA分子量标记;2.质粒DNA;3.白蛋白纳米粒+质粒DNA;4.白蛋白纳米粒+质粒DNA+DNA酶
2.4 超声微泡形态的物理特征
普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡呈圆球形囊泡状,大小较一致,分散良好,直径最小0.9μm,最大9.8μm,95%以上微泡直径2.0~5.0μm,可满足微血管超声造影需求。含10%蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30 d形态学上未发生改变,且对热稳定性良好(40℃,30 min)。与白蛋白纳米粒交联后上述性状亦未发生明显变化。
2.5 超声显像和靶向治疗
经兔耳缘静脉注入载t PA基因纳米白蛋白微泡剂5 m L后超声显像心脏、肝脏等设定的靶组织,观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。经超声波治疗30 min后组织显像回复至注射前水平。非超声治疗的单纯微泡组、纳米基因组和空白对照组超声显像无明显改变(图3、4)。
A:输入微泡前;B:输入微泡后心脏显影增强;C:超声波治疗后
A:输入微泡前;B:输入微泡后肝脏显影增强;C:超声波治疗后
2.6 组织病理学改变和tPA基因表达
超声靶向处理的心肌细胞、骨骼肌细胞和肝细胞等体积增大,细胞浆深染,细胞核增大,骨骼肌细胞核增多。部分细胞胞浆可见空泡。未经超声照射的组织和细胞未见明显改变;对照组织如肾组织、肺组织等未见明显异常。超声靶向转染4周后可见心脏、肝脏、骨骼肌组织和骨组织中的实质细胞表达t PA抗原。t PA抗原表达阳性心肌和骨骼肌细胞呈散在分布,这些细胞体积增大,胞浆横纹减少或消失呈细颗粒状,部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应。t PA反应阳性的肝细胞呈散在或放射状分布,主要分布在肝小叶门管区,其他细胞未见阳性反应。骨组织中阳性反应细胞主要分布在软骨生发层细胞、骨髓造血细胞和部分间质细胞(图5~8)。
A:对照组心肌组织t PA抗体阴性反应;B:实验组心肌组织t PA抗体阳性反应
A:对照组骨骼肌组织t PA抗体阴性反应;B:实验组骨骼肌组织t PA抗体阳性反应
2.7 血D-二聚体和tPA含量
靶向转基因前后血D-二聚体和t PA含量检测结果如附表所示,转基因后4周血液2项反映纤溶活性的指标均显著增高。
注:覮与术前比较,P<0.05
3 讨论
t PA是纤溶系统主要激活因子,是机体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成,在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入血,作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解[2]。自t PA的c DNA克隆成功,人们已能够构建其逆转录病毒载体并在体外转导内皮细胞获得t PA蛋白的高表达[3]。动物实验证实,将这种转导的内皮细胞贴附于球囊支架表面或动脉桥吻合口可防止支架术后或血管搭桥术后血栓形成和再狭窄的发生,明显提高手术的远期效果[4]。人重组t PA作为生物制剂已应用于冠心病急性心肌梗死、脑栓塞、肺梗死等的溶栓治疗[5]并取得了显效,但由于价格昂贵未能广泛应用。这些研究成果使笔者设想构建真核t PA基因表达质粒并选择适当的载体将其转导机体细胞获得有效和持续t PA的产生,以达到长期抗凝和防止血栓形成作用。本实验体系里,以3个EST克隆质粒为模板分别扩增3条t-PA片断并将之克隆于质粒pSecTag 2B中构建成pSecTag2B-t-PA重组质粒,扩增后体外转染CHO细胞获得了t PA的高效表达。
白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料,它的生物相容性好,生物可降解,无免疫原性和细胞毒性,基因转移效率较高。由于它有精确的纳米结构和表面与内部可携带分子的特性,使之成为一个很好的DNA导入细胞的载体[6]。白蛋白纳米粒携载基因的方式包括表面静电吸附和物理包裹两种方式,具体在结合过程中采取哪种方式取决于载基因纳米粒的制备方法[7]。一步法是在白蛋白形成纳米粒前先与基因质粒混合,这种方法将基因物理包裹于白蛋白纳米粒中。其主要优点是携带被转基因量较高;药物缓释和转基因时间较长;具有较好的酶保护和防止体内DNA酶降解作用;容易设计成靶向载体,应用于体内研究或制备成纳米药物应用更具优越性。二步法是先制备白蛋白纳米粒并调整介质酸碱度使之表面含有较多正电荷,借助静电吸附原理将富含负电荷的质粒DNA吸附于表面携带。主要特点是制备过程温和简易,不易破坏DNA;纳米粒径均一和容易调整粒径大小,但载药量相对小,不释控,无酶保护作用,设计靶向载体较为复杂。本实验采取一步法制备载t PA基因质粒白蛋白纳米粒,扫描电镜和粒度分析结果显示,粒径132.0 nm左右,大小较均匀,分散性好;包封率73.58%;凝胶电泳分析显示具有较好的DNA酶保护作用,符合实验要求。
基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织,如心血管疾病多采用心肌内直接注射或心导管注入质粒DNA或腺病毒载体。本实验室曾构建了高表达t PA基因质粒并用外科涤纶缝线作为载体制备了基因缝线,直接缝合于心肌组织[8];用壳聚糖做原料制备了纳米t PA基因载体并直接注射于心肌均获得t PA的有效表达[9]。但这种方法存在有创性,限制了其临床应用。自超声造影剂应用以来,在利用微泡增强超声显像的同时,还发现微泡具有靶向运载作用,可以靶向传输基因或药物,达到治疗疾病的目的,并可能建立一种安全、有效、无创的超声介导靶向传输系统[10]。超声靶向治疗的基本原理为:声场内的超声波破坏微泡造影剂后,其产生的空化或机械效应可使靶细胞膜轻度可逆性损害和通透性增加,并致直径≤7 mm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽。靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内。同时,利用超声波在特定时间和空间内击碎靶组织内的微泡,从而使细胞对基因或药物的摄入增强,达到在靶器官定向治疗的目的并降低了携带基因或药物的全身不良反应和毒性[11]。
目前,以白蛋白作为液膜的微泡研究较多,它具有无毒性、易于制备等优点,缺点是稳定性较差。有学者在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入一定量(40%)蔗糖,结果发现微泡的热稳定性增强且存放时间明显延长,从未含蔗糖的16 d延长至含40%蔗糖的半年以上[12]。本实验体系中发现40%的蔗糖白蛋白液体黏滞性强,制备时超声较困难且所需能量较大,容易导致微泡液温度增高;另外,高含量蔗糖的输入机体难以接受。为此,实验选择10%的蔗糖构成糖蛋白,不但避免上述情况发生且微泡的稳定性良好。惰性气体氟碳是目前最常用的制备超声微泡时使用的气体。有学者发现含全氟碳的微泡如果同时加有少量氧气会进一步促进微泡在血液中的稳定性,从而取得更强的心肌显影效果。根据超声微泡的这些特性和靶向原理,本实验使用蛋白交联剂戊二醛将构建的白蛋白纳米t PA基因质粒连接到制备的蔗糖白蛋白超声微泡表面,在超声场的存在下,靶向将t PA基因质粒导入相应组织并获得t PA基因的有效表达。本实验体系中,设定兔心脏、肝脏、腿部肌肉和胸壁肋软骨组织为靶组织。其中,以肝脏、骨髓细胞和肋软骨基层生发细胞表达明显,可能是白蛋白本身具有趋肝性以及增长活跃和分裂旺盛的细胞更易被转染。在获得靶组织表达t PA的同时检测到血t PA含量增高以及D-二聚体含量增高,反映了t PA抗凝活性明显增强。
本文的初步研究结果发现,采用超声触发破坏微泡造影剂的方式,可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强,这种方法是一种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。虽然该方法使目的基因在体内实现高效、稳定、可调控的表达还有待进一步深入研究,但随着分子生物学和超声医学的不断发展,这将为人类疾病防治的研究提供一种新的途径。
摘要：目的 观察构建的白蛋白纳米组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因质粒超声微泡载体的体内转染效果。方法 选择兔为实验对象,构建高表达tPA基因质粒;以白蛋白为原料制备载tPA基因质粒纳米粒;用蔗糖和白蛋白制备糖蛋白超声微泡并与载tPA基因质粒纳米粒进行交联形成靶向超声微泡转基因载体。免疫组织化学法检测心脏、肝脏、腿部骨骼肌和肋骨组织的靶向转染及tPA的有效表达,同时用ELISA法检测血tPA含量和D-二聚体含量。结果 构建的白蛋白纳米tPA基因质粒超声微泡载体系统超声靶向转染心脏、肝脏、骨骼肌和肋骨组织后可见有效tPA表达,同时伴有血tPA和D-二聚体含量增高和tPA功能增强,两者从术前的(0.20±0.05)μg/L和(81.76±9.84)μg/L增高至术后4周的(0.44±0.05)μg/L和(669.28±97.74)μg/L。结论 成功建立了白蛋白纳米tPA基因质粒超声微泡载体系统,为纳米靶向转基因提供了理论和实验方法。
关键词：组织型纤溶酶原激活物,白蛋白纳米粒,超声微泡,靶向转染
参考文献
[1]ARNEDO A,I RACHE JM,MERODIO M,et al.Albuminnanoparticles improved the stability,nuclear accumulation andanticytomegaloviral activity of a phosphodiester oligonucleotide[J].Journal of Controlled Release,2004,94:217-227.
[2]WU ZJ,YANG SF,ZHENG SS,et al.Construction ang bio-logical activities of human tPA eukaryotic expression plasmid[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2004,3(4):511-515.
[3]PODRAZIK RM,WHITEHILL TA,EKHTERAE D,et al.High-level expression of recombinant human tPA in cultivatedcanine endothelial cells under varying conditions of retroviralgene transfer[J].Ann Surg,1992,216(4):446-452.
[4]EKHTERAE D,STANLEY JC.Retroviral vector-mediated transferand expression of human tissue plasminigen activator gene inhuman endothelial and vascular smooth muscle cells[J].J VascSurg,1995,21(6):953-962.
[5]ALBERS GW,AMARENCO P,EASTON JD,et al.An-tithrombotic and thrombolytic therapy for ischemic stroke:theSeventh ACCP Conference on Antithrombotic and ThrombolyticTherapy[J].Chest,2004,126(3 Suppl):483-512.
[6]王恺,马光辉.白蛋白纳米球药物载体的制备备及表征[J].过程工程学报,2004,4(2):155-159.[6]WANG K,MA GH.Preparation and characterization of albuminnanospheres as drug carrier[J].The Chinese Joumal of ProcessEngineering,2004,4(2):155-159.Chinese
[7]LANGER K,BALTHASAR S,VOGEL V,et al.Optimization ofthe preparation process for human serum albumin(HSA)nanopar-ticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2003,257:169-180.
[8]季军,张浩伟,张宗久,等.转染组织型纤溶酶原激活物基因质粒预防狗冠脉搭桥术后吻合口再狭窄[J].中国现代医学杂志,2007,17(14):1683-1686.[8]JI J,ZHANG HW,ZHANG ZJ,et al.Transfection of tissue-typeplasminogen activator gene to prevent vascular anastomoticrestenosis after coronary bypass[J].China Journal of ModernMedicine,2007,17(14):1683-1686.Chinese
[9]姬尚义,季军,杨晓涵,等.纳米重组tPA基因质粒构建及对狗机械瓣膜置换术后血栓形成的预防[J].中国现代医学杂志,2009,19(19):2919-2923.[9]JI SY,JI J,YANG XH,et al.Study on construction of nanotPA plasmid to prevent thrombosis after mechanical valve re-placement in dogs[J].China Journal of Modern Medicine,2009,19(19):2919-2923.Chinese
[10]任建丽,王志刚.超声微泡造影剂在心血管疾病基因治疗中的应用[J].中国医学影像学杂志,2007,23(8):1257-1259.[10]REN JL,WANG ZG.Application of ultrasound microbubblecontrast agent in gene therapy of cardiovascular disease[J].ChinJ Medicine Imaging Technol,2007,23(8):1257-1259.Chinese
[11]劳翼,修建成.超声微泡造影剂携带基因和药物靶向治疗的研究进展[J].医学影像学杂志,2007,17(12):1359-1361.[11]LAO Y,XIU JC.Progress of ultrasound microbubble contrastagent with gene and drug targeting therapy[J].J MedicineImaging,2007,17(12):1359-1361.Chinese
白蛋白超声微泡 篇2
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
纯种德国牧羊犬14只,雄性,体质35～40 kg。
1.1.2 主要试剂
质粒pSecTag 2B、感受态细胞E.Coli JM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供;限制性内切酶Hind III、Kpn I、BamHI和Xho I购自宝生物工程有限公司;VentDNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司;羊抗人t PA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白、t PA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供;全氟丙烷气体(Halocarbon-218)由广东佛山捷锐公司提供。
1.1.3 主要仪器
超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品;治疗性超声仪(US-700)系德国产品。
1.2 方法
1.2.1 基因质粒的构建和表达
根据3个EST序列及t PA基因序列设计3对引物将t PA的3段序列从3个EST克隆质粒中扩增出来,并且在3对引物末端分别引入酶切位点。分别用含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基扩增培养3个EST克隆菌株,提取3个EST克隆质粒作为PCR扩增模板并扩增3条t PA片断,回收扩增产物并测序鉴定。质粒pSec Tag 2B和3条t PA片断t PA-1、t PA-2、t PA-3分别经Hind III和Xho I、Hind III和Kpn I、Kpn I和BamHI、BamHI和Xho I双酶切消化,经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化,T4 DNA连接酶14℃连接过夜,将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞,经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落,PCR检测重组质粒,提取重组质粒测序鉴定(如图1)。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至CHO细胞,用间接免疫荧光法检测t PA表达。
1.2.2 一步法制备载基因白蛋白纳米粒
100 mg牛血清白蛋白加入5 m L双蒸水溶解,用0.1 NHCl调整pH值至5.5。将已构建的1 mg t PA质粒加入上述白蛋白溶液中,孵育30 min后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇(乙醇∶水=2∶1),直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液30μL,适当搅拌,室温下静置2 h。减压使残余的乙醇挥发,所得溶液17 000 r/min离心30 min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件:180 W,固定频率20 kHz,30 s)分散成乳胶状,4℃下储存备用。取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、做包封率检测和凝胶阻滞实验,并用Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.3 氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡的制备方法
无菌制备含10%蔗糖的5%(g/m)牛血清白蛋白液体10 m L;并置于有盖50 m L塑料离心管中,依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量:6 m L/min),约10 min,超声波发生器处理1 min(条件:180 W,固定频率20 kHz);将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态、测量大小并计数;Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.4 载基因白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂制备
将一次制备的白蛋白纳米粒(含1 mg质粒)加至5m L白蛋白微泡中,加入50%戊二醛10μL溶液4℃下孵育2 h进行交联(戊二醛溶液终浓度为0.1%)。用生理盐水洗涤、离心、分层,离心速度200 r/min,1min,取上浮泡沫悬液即得载基因的白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂(载体)。调整微泡浓度使10 m L靶向造影剂中含微泡0.8×109～1.8×109/m L,基因质粒含量为2 mg。4℃下保存备用。
1.2.5 载t PA基因白蛋白纳米微泡靶向超声治疗方法
实验组(n=7)于三尖瓣膜置换术后胸壁表面二维超声观察心脏显影。经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,并观察到心脏显影明显增强后经胸前壁正对心脏前壁右室流出道局部超声照射30 min,并观察到将微泡击碎(二维超声观察),超声频率1 MHz,强度1.5 W/cm2。对照组(n=7)于常规体外循环下行三尖瓣机械瓣膜置换术后静脉输入10m L生理盐水并超声照射(条件同前)。术后给予抗生素预防伤口感染,常规饮食,各组均无抗凝治疗。动物于术前和观察结束后(4周)分别取血液检测D-二聚体含量并用ELISA法检测血t PA含量。
1.2.6 病理和免疫组织化学观察
观察期4周结束或动物死亡后,取其心脏,沿血流方向打开心腔观察血栓形成情况;取心房和心室肌壁尤其是左室前壁右室流出道局部靶向治疗处心肌组织,10%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,做HE染色和免疫组织化学间接法染色,观察病理改变、检测t PA抗原表达和转基因效果。免疫组织化学一抗为羊抗人t PA多克隆抗体;二抗为兔抗羊多克隆抗体,操作方法按试剂说明书进行,阳性反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。另取肝脏、肾脏和肺脏用上述方法检测,观察基因药物的组织分布和毒性。
1.3 统计学方法
用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据进行正态性检验后以均数±标准差表示,采用两组独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 p SecTag2B-tPA重组质粒的构建与表达
转染CHO细胞后免疫荧光反应结果如图2所示,加入荧光素标记t PA抗体后被转染的CHO细胞胞浆呈强阳性反应;未加荧光素标记t PA抗体被转染的CHO细胞胞浆呈阴性反应;一抗用荧光素标记β-catenin抗体取代后反应为阴性。
2.2 载tPA基因白蛋白纳米粒粒径、形态和包封率的测定
扫描电镜结果显示,白蛋白纳米粒球形、大小较均匀且分散良好。Zetasizer 3000仪粒度分析显示,白蛋白粒径大小呈正态分布,平均粒径为132.0 nm,最大粒径为152.4 nm,最小粒径为49.1 nm。多分散指数平均0.33(图3)。表面Zeta平均(31.32±41.42)m V。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测,测量加入的总的质粒DNA含量。将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA,包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:总的加入量;W游:上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为73.58%,符合实验要求。
2.3 凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验
0.9%琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示,第1加样孔为分子量标记(Marker)。第2加样孔为质粒DNA,未经纳米粒包裹,可见明显条带。第3加样孔为经白蛋白纳米包裹后的质粒DNA,完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA:白蛋白为1/100)。第4加样孔为质粒DNA经白蛋白纳米粒包裹并用DNaseⅠ消化后降解,电泳亦未见条带显现,表明纳米粒对质粒DNA具有保护作用。
2.4 超声微泡形态的物理特征
普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡圆球形囊泡状,大小较一致,分散良好,直径最小0.9μm,最大9.8μm,95%以上微泡直径2～5μm,可满足微血管超声造影需求。含10%蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30 d形态学上未发生改变,且对热稳定性良好(40℃,30 min)。与白蛋白纳米粒交联后上述性状亦未发生明显变化(图5)。
2.5 超声显像和靶向治疗
实验组经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,超声显像心脏靶组织,观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。经超声波治疗30 min后组织显像回复至注射前水平。对照组未见治疗前后超声影像变化(图6)。
2.6 术后各组动物状况
术后各组动物均观察28 d(4周)。对照组7只,其中1只于术后19 d死亡。观察期死亡动物的主要症状为食欲差、体重明显减轻、咳痰和呼吸困难等,心功能衰竭是主要死亡原因。实验组7只,存活时间均达到观察期4周,动物的一般情况良好,术后1周左右出现轻度食欲差和体重减轻,经治疗和调理后恢复正常。
2.7 心脏和其他脏器的病理学改变
大体:各组死亡和观察结束后处死的动物心脏心包膜局部均可见轻度黏连。沿血流方向切开心脏,见三尖瓣机械瓣膜缝合良好,无瓣周漏现象。对照组包括观察第19天死亡1只在内共7只动物机械瓣膜心房和心室表面有不同程度的血栓形成,血栓形成率为100%,死亡动物心脏血栓形成最为明显,从瓣环与瓣叶交界处开始沿瓣膜房室两面向瓣中央发展,阻碍瓣膜活动,并向上发展填充右房;向下发展,沿右室至肺动脉。实验组经靶向转染t PA质粒,7只动物心脏瓣膜表面及心腔内均未见血栓形成(图7、8),4周血栓抑制率100%,各组心肌肉眼上无明显改变。镜下:对照组心腔和瓣膜表面血栓均为混合性血栓,偶伴有轻度感染可见有炎症浸润和局部血栓溶解。死亡动物见轻度肺水肿和间质性肺炎性改变;肝、肾等有不同程度淤血,肝细胞周围型脂肪变性,肾近曲小管上皮细胞轻度水变性。实验组心脏和相应脏器未见明显异常。两组经超声处理的心肌组织心肌细胞体积轻度增大,细胞浆深染,细胞核增大。部分细胞胞浆可见空泡;其余未见明显异常。
2.8 心肌tPA抗原表达
超声靶向转染后4周可见局部心肌细胞表达t PA抗原阳性,这些心肌细胞呈散在分布,体积轻度增大,胞浆横纹减少,呈棕褐色细颗粒状,部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应(图9)。
2.9 血D-二聚体和tPA含量
靶向转基因前和术后4周血D-二聚体和t PA含量检测结果如附表所示,实验组于转基因后4周血液2项反应纤溶活性的指标均较转基因前、对照组术前和术后显著增高;实验组术前与对照组术前和术后相比差异均无统计学意义。
注:覮与对照组术前、术后及实验组术前比较,P<0.01
3 讨论
t PA是纤溶系统主要激活因子,是机体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成,在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入血,作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解[2]。人重组t PA作为生物制剂已应用于冠心病急性心肌梗死、脑栓死、肺梗死等的溶栓治疗[6]并取得了显著疗效,但由于价格昂贵未能广泛应用。这些研究成果使笔者设想构建真核t PA基因表达质粒并选择适当的载体将其转导机体细胞获得有效和持续t PA的产生,以达到长期抗凝和防止血栓形成的目标。笔者实验体系里,以3个EST克隆质粒为模板分别扩增3条t PA片断并将之克隆于质粒pSecTag 2B中构建成pSecTag 2B-t PA重组质粒,扩增后体外转染CHO细胞获得了t PA的高效表达。
白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料,它的生物相容性好,生物可降解,无免疫源性和细胞毒性,基因转移效率较高。它有精确的纳米结构、表面与内部可携带分子的特性,使之成为一种很好的DNA导入细胞的载体[7]。白蛋白纳米粒携载基因的方式包括表面静电吸附和物理包裹两种方式,具体在结合过程中采取哪种方式取决于载基因纳米粒的制备方法[8]。一步法是在白蛋白形成纳米粒前先与基因质粒混合,这种方法将基因物理包裹于白蛋白纳米粒中。其主要优点是携带被转基因量较高;药物缓释和转基因时间较长;具有较好的酶保护和防止体内DNA酶降解作用;容易设计成靶向载体,应用于体内研究或制备成纳米药物应用更具优越性。二步法:先制备白蛋白纳米粒并调整介质酸碱度使之表面含有较多正电荷,借助静电吸附原理将富含负电荷的质粒DNA吸附于表面携带。主要特点是制备过程温和简易,不易破坏DNA;纳米粒径均一,容易调整粒径大小,但载药量相对小,不释控,无酶保护作用,设计靶向载体较为复杂。笔者实验采取一步法制备载t PA基因质粒白蛋白纳米粒,扫描电镜和粒度分析结果显示,粒径132.0 nm左右,大小较均匀,分散性好;包封率73.58%;凝胶电泳分析显示具有较好的DNA酶保护作用,符合实验要求。
基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织,如心血管疾病多采用心肌内直接注射或心导管注入质粒DNA或腺病毒载体。笔者实验室曾构建了高表达t PA基因质粒并用外科涤纶缝线作为载体制备了基因缝线,直接缝合于心肌组织[9];用壳聚糖做原料制备了纳米t PA基因载体并直接注射于心肌均获得t PA的有效表达[10]。但这种方法存在有创性,限制其临床应用。自超声造影剂应用以来,在利用微泡增强超声显像的同时,还发现微泡具有靶向运载作用,可以靶向传输基因或药物,达到治疗疾病的目的,并可能建立一种安全、有效、无创的超声介导靶向传输系统[11]。超声靶向治疗的基本原理:声场内的超声波破坏微泡造影剂后,其产生的空化或机械效应可使靶细胞膜轻度可逆性损害和通透性增加,并致直径≤7 mm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽。靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内。同时,利用超声波在特定时间和空间内击碎靶组织内的微泡,从而使细胞对基因或药物的摄入增强,达到在靶器官定向治疗的目的并降低了携带基因或药物的全身不良反应和毒性[12]。
目前,以白蛋白作为液膜的微泡研究较多,它具有无毒性、易于制备等优点,缺点是稳定性较差。有学者在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入一定量(40%)蔗糖,结果发现微泡的热稳定性增强且存放时间明显延长,从未含蔗糖的16 d延长至含40%蔗糖的半年以上[12]。笔者实验体系中,发现40%的蔗糖白蛋白液体黏滞性强,制备时超声较困难且所需能量较大,容易导致微泡液温度增高;另外,高含量蔗糖的输入机体难以接受。为此,实验选择10%的蔗糖构成糖蛋白,不但避免上述情况发生且微泡的稳定性良好。惰性气体氟碳是目前最常用的制备超声微泡时使用的气体。有学者发现含全氟碳的微泡如果同时加入少量氧气会进一步增加微泡在血液中的稳定性,取得更强的心肌显影效果。根据超声微泡这些特性和靶向原理,实验使用蛋白交联剂戊二醛将构建的白蛋白纳米t PA基因质粒连接到制备的蔗糖白蛋白超声微泡表面,在超声场的存在下,将t PA基因质粒靶向导入心肌组织,获得了t PA基因的有效表达并有效预防了狗三尖瓣机械瓣膜置换术血栓的形成。在获得心肌靶组织表达t PA增强的同时,检测到血t PA含量增加以及D-二聚体含量增高,反应了t PA抗凝活性明显增强。
笔者的初步研究结果发现,采用超声触发破坏微泡造影剂的方式,可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强,这种方法是一种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。虽然该方法使目的基因在体内实现高效、稳定、可调控的表达还有待进一步深入研究,但随着分子生物学和超声医学技术的不断发展,将为人类疾病防治的研究提供一种新的途径。
参考文献
[1]GILLINOV AM,COSGROVE DM.Current status of mitral valverepair[J].Am Heart Hospital J,2003,1(1):47-54.
[2]WU ZJ,YANG SF,ZHENG SS,et al.Construction ang biologi-cal activities of human tPA eukaryotic expression plasmid[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2004,3(4):511-515.
[3]EKHTERAE D,STANLEY JC.Retroviral vector-mediated transferand expression of human tissue plasminigen activator gene inhuman endothelial and vascular smooth muscle cells[J].J VascSurg,1995,21(6):953-962.
[4]KUZMANY H.Raman spectroscopy of fullerences andfullerene-nanotube composites[J].Philos Transact A Math PhysEng Sci,2004,362(1824):2375-2406.
[5]ARNEDO A,IRACHE JM,MERODIO M,et al.Albuminnanoparticles improved the stability,nuclear accumulation andanticytomegaloviral activity of a phosphodiester oligonucleotide[J].Journal of Controlled Release,2004,94:217-227.
[6]ALBERS GW,AMARENCO P,EASTON JD,et al.Antithrom-botic and thrombolytic therapy for ischemic stroke:the SeventhACCP Conference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy[J].Chest,2004,126(3 Suppl):483S-512S.
[7]王恺,马光辉.白蛋白纳米球药物载体的制备及表征[J].过程工程学报,2004,4(2):155-159.[7]WANG K,MA GH.Preparation and Characterization of AlbuminNanospheres as Drug Carrier[J].The Chinese Journal of ProcessEngineering,2004,4(2):155-159.Chinese
[8]LANGER K,BALTHASAR S,VOGEL V,et al.Optimization ofthe preparation process for human serum albumin(HSA)nanoparticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2003 257:169-180.
[9]季军,张浩伟,张宗久,等.转染组织型纤溶酶原激活物基因质粒预防狗冠脉搭桥术后吻合口再狭窄[J].中国现代医学杂志,2007,17(14):1683-1686.[9]JI J,ZHANG HW,ZHANG ZJ,et al.Transfection of tissue-typeplasminogen activator gene to prevent vascular anastomoticrestenosis after coronary bypass[J].China Journal of ModernMedicine,2007,17(14):1683-1686.Chinese
[10]姬尚义,季军,杨晓涵,等.纳米重组tPA基因质粒构建及对狗机械瓣膜置换术后血栓形成的预防[J].中国现代医学杂志,2009,19(19):2919-2923.[10]JI SY,JI J,YANG XH,et al.Study on construction of nanotPA plasmid to prevent thrombosis after mechanical valve re-placement in dogs[J].China Journal of Modern Medicine,2009,19(19):2919-2923.Chinese
[11]REN JL,WANG ZG.Application of ultrasound microbubblecontrast agent in gene therapy of cardiovascular disease[J].Chi-nese Journal of Medical Imaging Technology,2007,23(8):1257-1259.Chinese
白蛋白超声微泡 篇3
1 资料与方法
1.1 研究对象
2008-08~2009-12在昆明医学院第二附属医院就诊的、经常规超声或增强CT、MRI检查确诊的胰腺占位性病变患者42人, 其中男性31例, 女性11例;年龄19~78岁, 平均年龄58.3±14.7岁。病灶位于胰头33例, 胰体6例, 胰尾3例。病灶大小0.9~8.3cm, 平均4.2±1.6cm。根据病变性质, 良性8例, 恶性34例。本研究已除外超声造影未成功病例。
1.2 超声仪器和分析软件
使用Philips IU22彩色多普勒超声诊断仪, C5-2探头, 频率为3.5MHz, 具有超声造影功能, 并配有即时超声微泡造影定量分析软件QLab-Region of Interest (ROI) Quantifi cation Plug-in/Tool (感兴趣区域量化插件) 。造影结果可自动储存于仪器硬盘内, 可在脱机、机动态及逐帧回放。
1.3超声造影剂
意大利米兰Bracco公司生产的超声微泡造影剂六氟化硫微泡 (声诺维, Sono Vue) , 每瓶造影剂 (59mg冻干粉) 用5ml生理盐水制成混悬液, 每例患者用3.6ml。
1.4 检查方法
检查前向患者简要介绍超声微泡造影技术及目的, 并征得患者同意。①入选患者检查前空腹8h以上。②患者取平卧位, 先行常规彩超检查。对可疑病灶进行仔细观察并做详细的文字及图像记录, 包括病灶的位置、大小、边界、内部回声情况、病灶与毗邻组织的结构关系及彩色多普勒超声提供的病灶内相关血流信息。③超声造影检查, 再次确定满意的二维灰阶图像切面, 即同时显示胰腺病灶区域与非病灶区域胰腺实质 (以下简称实质区) 的切面。④开启造影条件, 将仪器条件设置在低机械指数 (MI=0.06) 条件下。每次经肘静脉团注造影剂混悬液3.6ml, 同时启动超声仪内置计时器, 并同步记录即时动态图像, 不间断地观察病灶区及实质区动态灌注过程及增强强度变化, 直至造影剂从病灶区及实质区完全廓清后1~2min, 总观察时间为3~4min。
1.5 超声造影结果分析方法及观察内容
造影结束后, 由2名有超声造影经验的医师共同完成对原始图像资料的观察分析。
1.5.1 分析方法
启动Q-Lab软件, 逐帧回放原始图像资料, 每例均分别在病灶区及实质区设定感兴趣区ROI, 对所存储原始数据进行量化分析, 由Q-Lab软件自动生成造影剂灌注定量曲线, 即时间-强度曲线 (time lntensity curve, TIC) 后进行量化分析。
1.5.2 造影剂灌注时相界定
根据胰腺为完全动脉供血器官的特点, 将胰腺CEUS增强时相分为2期:0~30s为实质灌注早期 (early parenchymatous perfusion phase, EPPP) ;31~120s为实质灌注晚期 (delay parenchymatous perfusion phase, DPPP) 。
1.5.3 观察指标及结果判定
每一观察指标均包括病灶区及正常胰腺实质区。
增强形态:指造影剂微泡分布的形态, 由即时观察及原始记录图像逐帧回放时目测获得。
增强时间:由TIC测得。①始增时间:指造影剂开始增强的时间。②达峰时间:指造影剂达到最大增强强度的时间。③始-峰时间:指造影剂开始增强至达到最大增强强度需要的时间。
增强速度:指病灶增强速度。判断方法是以实质增强时间为基准, 病灶增强时间早于实质为早增强, 与实质同时增强为同增强, 晚于实质为晚增强。
增强水平:由TIC测得。病灶处增强强度高于胰腺实质为高增强, 与正常胰腺实质相等为等增强, 低于正常胰腺实质为低增强。
增强模式:指造影剂微泡分布的形态及强度随时间变化的规律。由目测及Q-LAB软件获得。
1.6 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理, 正态分布的数据采用均数±标准差 () 表示, 两组间比较采用t检验, 多组间比较采用方差分析;诊断性试验采用敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性表示, 采用Youden指数比较不同诊断指标的诊断价值。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 临床病理结果
42例患者中, 经手术病理证实的占位性病变33例, 临床诊断9例。后者中2例诊断为胰腺癌并发肝转移 (CA19-9≥800 U/ml) , 2例术中探查发现胰腺癌广泛转移 (CA19-9≥1000U/ml) , 2例伴有胆总管下段癌, 临床考虑胰头病灶为胆总管下段癌侵犯所致 (CA19-9≥500U/ml) , 上述6例均未能手术切除;1例CT及MRI均诊断为胰腺占位, 因患者伴有低血糖症状, CA19-9为21.18U/ml, 经过半年以上随访病灶无变化, 临床考虑胰岛细胞瘤;2例CT诊断为胰腺占位病变, 患者曾有急性胰腺炎病史, CA19-9未增高, 且经半年以上随访病灶无变化, 临床诊断为局限性胰腺炎。最终确诊结果:胰腺癌34例, 其中腺癌28例, 胰头囊腺癌1例, 胰体部微小囊腺癌1例, 未能分型4例;胰腺良性病变8例, 包括良性内分泌瘤3例, 局限性胰腺炎5例 (其中3例伴有假性囊肿形成) 。
2.2常规超声检查结果
本研究42例患者中, 常规超声诊断胰腺癌24例, 诊断准确率为57.1%;不能确定性质者15例, 误诊2例。
2.3 超声造影检查结果
42例患者超声造影均明确胰腺占位性病变。
2.3.1 造影剂增强形态
①34例胰腺恶性肿瘤中, 29例表现为由周边向中心的逐渐增强;2例表现为由周围向中央的轮辐样增强;3例表现为病灶中心向周围的结节样增强。②3例胰腺良性内分泌肿瘤均表现为周围向中央的逐渐较均匀增强。③5例局限性胰腺炎中3例表现为周边向中央的逐渐增强, 2例表现为外周向中央的结节样增强。
2.3.2 造影剂增强时间
胰腺良、恶性病变与胰腺实质CEUS增强时间比较见表1。
注:不同时间恶性病变组与胰腺实质灌注组比较, 均P<0.05
2.3.3 造影剂增强模式
42例患者超声造影增强模式有5种类型。Ⅰ型:EPPP和DPPP均保持低增强。Ⅱ型:EPPP和DPPP均保持等增强。Ⅲ型:EPPP和DPPP均保持高增强。Ⅳ型:EPPP呈高增强, DPPP呈低增强。Ⅴ型:EPPP呈等增强, DPPP呈低增强。①胰腺癌的增强模式:34例胰腺腺癌中, 30例表现为EPPP及DPPP呈整体不均匀低增强, 其中19例 (55.9%) 病灶周边及内部可见走行迂曲的高增强滋养血管, DPPP造影剂退出时间早于周围胰腺实质;2例表现为EPPP等增强, DPPP低增强;另2例表现为EPPP不均匀高度增强, DPPP低增强。②内分泌肿瘤的增强模式:3例胰腺内分泌肿瘤中, 2例表现为EPPP及DPPP不均匀高增强, 1例表现为EPPP及DPPP等增强。③胰腺炎的增强模式:5例局限性胰腺炎4例表现为EPPP及DPPP不均匀高度增强, 1例表现为EPPP及DPPP呈等增强 (表2) 。
2.3.4 不同指标诊断胰腺癌的价值
通过计算Youden指数发现, 不同的观察指标及两指标组合诊断胰腺癌的准确性不同 (表3) 。
注:CEUS.超声造影;PPV.阳性预测值;NPV.阴性预测值
由表3看出, 始-峰时间:诊断准确性81%, Youden指数最低 (0.514) ;增强模式Ⅰ型:诊断胰腺癌的敏感性和特异性最佳, Youden指数最高 (0.632) , 诊断准确率也较高 (83.3%) ;增强速度:病变区呈慢增强时, 诊断胰腺癌的敏感性和特异性与增强模式接近, Youden指数为0.603, 诊断准确率为85.7%。把不同的诊断指标进行组合, 结果显示增强模式Ⅰ型与增强速度 (慢增强) 组合, Youden指数与增强模式相同, 诊断准确率最高。
2.4 常规超声、CEUS、增强CT及MRI诊断结果比较
常规超声与CEUS、增强CT及MRI间差异均有统计学意义, CEUS与增强CT间差异无统计学意义 (表4) 。
注: (1) 与常规超声比较P=0.000;与增强CT比较, P=0.006;与MRI比较, P=0.02
3 讨论
胰腺占位性病变是临床常见病, 但由于胰腺位置深在, 且体积相对较小, 影像学检查对其早期病灶的检出率不满意, 对病灶性质的鉴别诊断困难。近年来, 虽然影像仪器的进展提高了胰腺占位性病灶的检出率, 但当病变无明显血管侵犯、边界不清时, 良、恶性鉴别诊断仍困难。常规超声检查是胰腺占位性病变最常用的筛查方法, 但检查效果易受腹腔内肠气、患者体型等的影响, 难以发现<2cm的胰腺占位。超声造影剂作为真正的血池示踪剂的特点及即时超声造影技术 (CEUS) 在肝肿块鉴别诊断中成功应用的经验表明, 该技术能灵敏显示组织器官或肿瘤内的血管及微循环灌注情况, 这一优势架起了胰腺超声造影与胰腺占位性病变组织病理学血管生成机制之间的桥梁, 使超声造影在胰腺的应用成为可能[1~8]。
3.1 胰腺良、恶性病变造影剂增强时间的意义
造影剂在器官组织及病灶的增强时间及增强模式反映了器官组织及病灶内血流灌注的速度、微血管分布的形态及特点。本研究结果经统计学分析显示, 造影剂始增时间及始-峰时间在良性病变与实质间、恶性病变与实质间、良性病变与恶性病变间的差异均有统计学意义;而达峰时间在良性病变与实质间、恶性病变与实质间、良性病变与恶性病变间的差异均无统计学意义。①恶性病变共同特点为造影剂在恶性肿瘤内始-峰时间短于胰腺实质, 始增时间晚于正常胰腺实质。胰腺恶性肿瘤细胞释放血管内皮生长因子, 促发内皮细胞增生, 刺激诱发新生毛细血管;肿瘤中有的血管为被肿瘤组织侵犯的残留血管, 血管结构紊乱或易形成动静脉短路[9、10], 可能是造成肿瘤内造影始-峰时间明显短于肿瘤外相对正常胰腺实质的原因。胰腺癌病灶内可见不同分化程度的导管样结构肿瘤组织分散于纤维间质和残存的胰腺组织内, 根据肿瘤组织与残存胰腺组织比例的不同及纤维化程度的高低, 肿瘤内的血供有所不同, 但由于代替了正常胰腺组织的肿瘤组织的微血管少于正常胰腺组织, 所以胰腺癌病灶表现为增强晚于正常胰腺实质的低增强灶[11、12]。常规超声显示为低回声肿块的良性病变造影后60%表现为与胰腺实质同步均匀增强、同步减退。②胰腺良性病变如局限性胰腺炎与胰腺癌的常规超声表现较相似, 但超声造影表现不同。由于局限性胰腺炎病灶内虽可见不同程度的间质纤维化和炎细胞浸润, 但病灶内微血管属于正常的组织血管, 且未受破坏, 其数量和分布与正常胰腺实质大致相同, 所以病灶多与正常胰腺组织同时增强。胰岛细胞瘤增强早于实质, 可能与胰岛细胞瘤间质内有丰富的血窦, 其血供比胰腺实质更丰富有关。本组3例胰岛细胞瘤中2例CEUS表现为肿瘤动脉期明显早于胰腺实质, 退出晚于胰腺实质, 造影剂始-峰时间明显长于正常胰腺。
3.2 胰腺良、恶性病变造影剂增强模式及形态的分析
①恶性肿瘤的造影剂增强模式:34例胰腺恶性肿瘤中, 30例表现为EPPP及DPPP呈整体不均匀低增强, DPPP造影剂退出时间早于周围胰腺实质;3例表现为EPPP等增强, DPPP低增强;另2例表现为EPPP不均匀高度增强, DPPP低增强;从造影剂增强形态看, 有的恶性肿瘤仅见内部散在点片状增强, 有的为肿瘤整体增强。34例胰腺恶性肿瘤中, 29例表现为由周边向中心的逐渐增强, 其中19例病灶周边及内部可见走行迂曲的高增强滋养血管;2例表现为由周围向中央的轮辐样增强;3例表现为病灶中心向周围的结节样增强。②良性病变的造影剂增强模式:如局限性胰腺炎造影后增强程度与胰腺实质一致, 呈较均匀的整体增强;胰岛细胞瘤则表现为由周围向中央的逐渐较均匀高增强或等增强。③肿瘤微血管的分布特点:即造影增强特征与其生物学行为相关。胰腺恶性肿瘤多呈不规则状生长, 与周围组织界限不清, 肿瘤滋养血管常位于肿瘤周边, 距血管近的肿瘤细胞生长活跃, 造影后呈增强表现, 远离血管的肿瘤细胞容易退化和坏死, 表现为不增强或弱增强;肿瘤内坏死、陈旧性出血、囊性变多表现为不规则无增强区, 故同是恶性肿瘤, 造影剂增强的模式和形态也可有所不同。局限性胰腺炎与胰实质增强相似的原因、胰岛细胞瘤的增强表现如上所述;部分局限性胰腺炎内部出现无增强区, 且界限较清晰、规则, 可能系坏死区域。
3.3 不同超声造影定量指标诊断胰腺占位病变的价值
为了增加诊断的准确性, 我们采用不同的诊断指标及组合用于诊断胰腺癌, 结果显示:增强模式与始增-峰值时间或增强速度比较, 对于胰腺癌诊断敏感性和特异性最佳, Youden指数最高 (0.632) , 且诊断的准确性也较高 (83.3%) , 而始增-峰值时间的Youden指数则最低 (0.514) 。把不同的诊断指标进行组合, 发现增强模式Ⅰ型与增强速度 (慢增强) 组合的诊断价值最高, 而包含始增-峰值时间这项诊断指标的组合诊断敏感性和准确性都偏低。因此, 在超声造影定量参数中, 应用多指标参数进行诊断可能更能客观反映病变的真实血流灌注情况, 从而提高诊断准确率, 但更有效的组合指标仍需进一步研究。
3.4 CEUS与其他影像学方法对胰腺癌的诊断价值的比较
本组动态增强螺旋CT诊断准确率为80.5%, CEUS诊断准确率为83.3%, 两种方法差异无统计学意义;MRI诊断准确率、常规超声诊断的准确率分别为73.5%, 57.1%, 低于CEUS。导致这一结果的原因不除外病例数较少, 我们将加大样本量进一步研究。
我们认为, 尽管目前超声造影技术对胰腺占位性病变仍不能做出“非此即彼”的诊断, 但仍有可能成为早期诊断胰腺癌的另一种有效的影像学检查方法, 因此, 值得深入研究。
参考文献
[1]Hocke M, Ignee A, Dietrich CF.Contrast-enhanced endoscopic ultrasound in the diagnosis of autoimmune pancreatitis.Endoscopy, 2011, 43 (2) :163-165.
[2]Hohmann J, Albrecht T, Oldenburg A.Liver metastases in cancer:detection with contrastenhanced ultrasonography.Abdominal Imaging, 2004, 29 (6) :669-681.
[3]Harvey CJ, Blomley MJ, Eckersley RJ, et al.Pulse-inversion mode imaging of liver specific microbubbles:improved detection of subcentimetre metastases.Lancet, 2000, 355 (9206) :807-808.
[4]孟晓春, 刘卫敏, 唐文杰, 等.肝移植术后移植肝非肿瘤性实质病变的MRI诊断.磁共振成像, 2010, 1 (6) :448-455.
[5]Ding H, Wang WP, Huang BJ, et al.Imaging of focal liver lesions:low-mechanical-index real-time ultrasonography with SonoVue.J Ultrasound Med, 2005, 24 (3) :285-297.
[6]罗娅红, 于韬, 王洋, 等.联合应用CT、MRI增强扫描鉴别诊断胰腺癌与慢性胰腺炎.磁共振成像, 2011, 2 (1) :42-46.
[7]王文平, 丁红, 齐青, 等.动态灰阶超声造影在肝肿瘤鉴别诊断中的应用.中华超声影像学杂志, 2003, 12 (2) :101-104.
[8]陈敏华, 戴莹, 严昆, 等.超声造影对肝硬化合并小肝癌的早期诊断价值.中华超声影像学杂志, 2005, 14 (2) :116-120.
[9]Youk JH, Kim CS, Lee JM.Contrast-enhanced agent detection imaging:value in the characterization of focal hepatic lesions.J Ultrasound Med, 2003, 22 (9) :897-910.
[10]吕云福.现代胰腺外科学.北京:人民军医出版社, 2003.452-481.
[11]Nagase M, Furuse J, Ishii H, et al.Evaluation of contrast enhancement patterns in pancreatic tumors by coded harmonic sonographic imaging with a microbubble contrast agent.J Ultrasound Med, 2003, 22 (8) :789-795.
白蛋白超声微泡 篇4
关键词：超声造影剂,载药,微泡
超声造影是利用造影剂使后散射回声增强, 明显提高超声诊断的分辨力、敏感性和特异性的技术, 由于其能无创、便携、实时地提供机体软组织和血液流动情况, 为临床诊断提供病理信息, 已成为应用最广泛的医疗检测技术之一。超声造影剂在病灶超声诊断与鉴别方面发挥着十分重要的作用, 目前是超声造影领域研究的热点。
1 超声造影剂概述
超声造影剂的工作机理是增强背向散射信号的能量。理想的造影剂必须具备以下条件: (1) 在循环中具有较强的稳定性, 使灌注后保持足够时间; (2) 能通过肺循环; (3) 有稳定的剂型与浓度; (4) 可以静脉给药; (5) 微气泡的粒径大小均一, 一般为3~8mm, 有良好稳定的显影效果; (6) 无毒副作用。由于直径小于10μm的微泡在正常表面张力值的液体中只能维持几秒钟, 所以需要一个外壳来保证微泡造影剂的稳定性, 既能延长微泡在体内循环的寿命, 又能产生良好的显影效果。目前使用较多的外壳材料有蛋白质、脂质体等。随着高分子化学的发展, 用高分子材料包裹空气或者氟烷气体制备超声微泡造影剂成为一个重要的研究方向。高分子材料微泡具有粒径均一、抗压性能好、稳定性高、显影时间较长等优点, 而且具有生物相容性好和降解产物无毒无害等特点。
造影剂发展经历了三个阶段[1], 第一代微泡为空气或者惰性气体, 无包膜, 显影时间短 (几秒钟) , 不稳定, 尺寸大;第二代微泡由蛋白质、脂质体等包裹空气组成的, 显影时间为5min左右, 尺寸小, 稳定性较好;第三代微泡为膜壳包裹氟碳气体, 因为氟碳气体在血液中溶解度低和弥散度较低, 提高了稳定性, 显影时间延迟到15min左右。
2 PLGE载药微泡造影剂的制备及体外超声显影实验
聚合物材料由于具有良好的生物相容性和亲和性, 降解速度可以调节等优点, 常用作药物的载体, 所以载药微粒体既有超声显影的作用, 又可在聚合物上引入抗体或识别基团, 在血液循环的过程中识别和诊断病变组织, 实现靶向治疗作用, 并通过超声控制药物的释放, 达到诊断和治疗相结合的目的。加入亲水基团PEG可延长微泡的显像时间、增加稳定性, 因为亲水性PEG使微泡表面形成一层水化膜, 遮盖了其表面的疏水结合位点, 从而防止血浆渗入微泡, 降低了对网状内皮细胞的识别和摄取[2]。
2.1 试剂与仪器
乙交酯:PURAC Netherlands, 重结晶后, 乙醚洗涤后干燥冷藏备用。L-丙交酯:PURAC Netherlands, 重结晶, 乙醚洗涤后干燥冷藏备用。聚乙二醇:C.P分子量2 000, 北京益利精细化学品有限公司, 直接使用。异辛酸亚锡:Sigma公司, 直接使用。二氯甲烷:A.R北京益利精细化学品有限公司, 直接使用。西门子ACUSON X150超声诊断仪;真空恒温干燥箱DZF6500。
2.2 PLGE载药微泡造影剂的制备
按一定比例将LA、GA和PEG装入聚合管中, 加入0.05% (wt) 的催化剂异辛酸亚锡, 并用氩气置换聚合管中的空气, 真空封管, 在170~180℃条件下反应24h。用氯仿溶解, 真空抽虑, 干燥恒重, 得到白色PLGE聚合物。用W/O/W溶剂挥发法制备PLGE载药微泡:先将药物水溶液加入到PLGE的二氯甲烷的溶液中, 通过超声均化得到初乳。将初乳在剧烈搅拌条件下逐渐滴加到含有PVA和吐温60的大量外水相中, 形成W/O/W双乳液。降低搅拌速度, 使有机溶剂充分挥发。洗涤, 离心, 干燥, 得到多孔PLGE载药微粒体。
2.3 体外超声显影效果
为了观察PLGE多孔载药微泡造影剂对超声信号的显影效果, 对其体外超声效应进行了测试。取10mg载药微粒体, 分散在40mL蒸馏水中, 用50mL规格的注射器吸取微粒体水溶液, 通过恒流泵调节流速, 用L7探头 (探头频率2W) 检测超声信号, 用Siemens超声仪分析图像, 观察超声成像效果。见图1。
注:红色代表粒子向探头运动, 蓝色代表粒子离探头而去
由图1可以清楚地观察到造影剂能反映管内流体流动情况的超声图像, 实验结果表明, 该造影剂具有良好的超声显影效果, 而且在循环中维持时间达到0.5h。因为用W/O/W双乳液溶剂挥发法制备的PLGE载药微粒体是多孔结构, 由于溶剂挥发形成的许多通道贯穿整个微粒体, 实际上是一种包封空气的微粒体, 这种结构有利于微粒体在超声作用下做有规律的收缩和振动运动, 产生高于固体和液体几个数量级的背向散射能量, 因而会产生良好的超声造影效果。
3 载药聚酯微泡造影剂在药物治疗中的应用
3.1 载药或基因
药物或基因可以通过载体包裹、非共价键连接、直接黏附等方式被载体携带, 其中高分子聚酯材料包裹药物或基因制成微泡是应用比较广泛的承载方式。Chumakova等[3]用带负电的PLGA和带正电的PEI/DNA质粒结合, 制备载基因微粒体, 并通过人体实验施加低频率超声辐照, 研究表明增强了肿瘤细胞的转染率。
3.2 靶向治疗
载药聚酯微泡造影剂在药物靶向治疗方面常用的有三个途径:一是将聚酯载体的表面进行修饰, 连接一些识别一些组织的特异性受体的配体或者特异性抗原的抗体, 微泡通过静脉进入人体后能选择性地与相应受体或配体结合, 增强靶区的超声信号, 达到靶向治疗和诊断的目的[4]。二是携带药物或基因的微泡注入人体后, 用低频超声照射特定组织, 超声的瞬间空化作用可以使微泡产生剧烈振动而破裂, 释放出药物或基因到特定靶区, 降低药物对全身的副作用, 实现靶向治疗[5]。三是制备纳米级载药微泡, 与微米级微泡相比, 其粒径小, 穿透力强, 可穿透血管内皮, 可用于血管外肿瘤组织的显影和治疗。Rapoport等[6]制备PLLA-PEG包裹紫杉醇的纳米乳剂, 与吉西他滨合用, 对治疗动物胰腺癌疗效显著。
4 展望
载药聚酯超声微泡造影剂在超声显影和载药靶向释放领域都取得一定的进展, 但也存在一些问题亟待解决, 如微泡的稳定性, 临床应用的复杂机制, 超声治疗的相关参数优化等。相信载药聚酯微泡造影剂在重大疾病的治疗和诊断方面会有很广阔的前景。
参考文献
[1]赵金花, 惠春, 陈亚珠.超声微泡造影剂的发展及最新临床应用研究[J].中国医学物理学杂志, 2010, 27 (2) :1802-1805.
[2]刘学兵, 许川山.载药脂质超声微泡造影剂的制备及应用研究[J].中国介入影像与治疗学, 2008, 5 (2) :156-159.
[3]CHUMAKOVA OV, LIOPO AV, ANDREEV VG, et al.Composition of PLGA and PEI/DNA nano-particles improves ultrasound-media-ted gene delivery in solid tumors in vivo[J].Cancer Lett, 2008, 261 (2) :215-225.
[4]王志刚.超声微泡造影剂在疾病诊断与治疗中的研究进展[J].中国医学影像技术, 2005, 21 (8) :1148-1150.
[5]逯敏飞, 程永清, 李丽君等.微泡超声造影剂:一种新型的药物靶向载体[J].中国医学影像技术, 2005, 21 (4) :513-515.