S100B蛋白表达

S100B蛋白表达（通用7篇）

S100B蛋白表达 篇1

有关损伤时间推断的课题历来都是法医病理学者研究的热点, 尤其是颅脑损伤时间的推断。脑挫裂伤 (brain contusion, BC) 是法医学上常见的原发性闭合性/开放性脑损伤, 它是指在颅脑受到暴力作用后而直接造成脑组织点片状出血、水肿及坏死性变化的器质性损伤。BC后可引起多种蛋白、细胞因子的改变。本研究通过大鼠建立脑挫裂伤模型, 在不同时间点对脑损伤区、损伤周边脑组织取材, 并以阴性组和正常组作为对照, 运用免疫组织化学方法检测蛋白的动态变化, 了解S100B标记的胶质细胞对脑挫裂伤的反应, 并以此来推断脑外伤后所经过的时间, 探讨其发生机制及其在法医学上的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

健康、清洁的SD大鼠80只, 雌雄不限, 体重在250g左右, 购自重庆医科大学动物实验中心。按照随机的原则将大鼠分为实验组、阴性对照组和正常对照组, 其中实验组又分为损伤后4h, 12h, 1d, 3d, 5d, 7d, 10d共7组, 每组10只, 正常对照组5只, 阴性对照组5只。

1.2 主要试剂

浓缩型DAB试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;鼠SP通用型免疫组化染色试剂盒 (美国ZYMED公司, 北京中杉金桥生物技术有限公司分装) ;鼠抗S100B单克隆抗体 (博士德生物工程有限公司) 。

1.3 实验方法

(1) 大鼠脑挫裂伤模型的建立。参照高燕、孙骏谟等[1]报道的方法, 实验大鼠用3%戊巴比妥钠 (0.12mL/100g) 腹腔注射麻醉后, 俯卧位固定于脑立体定向仪上。消毒皮肤, 头皮正中切开, 切口长2cm, 剥离骨膜, 暴露前囟和左顶骨, 用牙科钻在冠状缝后2mm、矢状缝左侧2mm处钻一直径5mm圆形骨窗, 保持硬脑膜完整。将撞杆置于硬膜上, 用20g砝码20cm高处沿外周导管坠落, 撞击撞杆从而撞击硬脑膜, 致左顶叶发生脑挫裂伤。打击后切口内滴注4万单位硫酸庆大霉素4～5滴, 骨蜡封闭骨窗, 缝合头皮。阴性对照组仅开颅窗后用骨蜡封闭, 不施加打击。正常对照组不作任何处理直接处死取材。

(2) 取材及标本处理。分别于伤后相应时间断颈处死, 取出全脑放入4%多聚甲醛中固定24h后, 切取损伤区及其周边区组织, 常规组织连续切片, 切片厚3μm, 作HE染色及S100B蛋白免疫组织化学染色。

(3) 免疫组织化学染色。具体步骤参照北京中杉公司SP试剂盒说明进行, 以PBS液作阴性对照。

(4) 显微镜观察。在Olympus显微镜下观察各组常规HE切片、S100B蛋白免疫组化切片。重点观察免疫组化的着色范围、强度情况。

(5) 免疫组化染色结果判定标准。S100B在哺乳动物中枢神经系统中, 主要由神经胶质细胞合成和分泌, 特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞;正常脑组织中仅有微量的S100B蛋白表达。如脑细胞胞浆中出现明显的棕黄色染色应判定为阳性表达。故根据神经组织内是否出现棕黄色颗粒及范围半定性划分等级为:细胞和间质无染色或微染 (1级) ;细胞和/或间质有染色, 染色浅, 呈小灶性 (2级) ;染色中等强度, 呈斑片状 (3级) ;染色深, 呈广泛分布 (4级) 。以PBS代替一抗作阴性对照的各切片均无棕黄色染色颗粒出现。

(6) 图像分析。采用北京天地公司TD2000真彩色图像分析系统, 对切片进行定性和半定量分析。在20×20倍镜下, 按照着色色调的一定阈值分割阳性细胞, 每个点取5张片, 每张片取连续不重复的10个视野, 平均计数阳性细胞。

1.4 统计分析

使用SPSS 11.0软件包对所得数据进行分析, 所得实验数据以珚x±s表示, 多组间比较采用方差分析, 两组间的比较采用LSD法;同一时间点的实验组与对照组比较采用配对t检验;以P<0.05表示差异存在显著性。

2 结果

2.1 常规HE染色

脑损伤后4h, 损伤区及其周围小血管和毛细血管扩张、淤血并见出血, 组织水肿;神经细胞和胶质细胞肿胀, 胞核着色浅, 部分神经细胞核深染。伤后12h, 损伤灶及其周围神经细胞皱缩、胞核固缩, 尼氏体消失, 胞浆呈嗜伊红色;星形胶质细胞肿胀, 核固缩、碎裂或溶解, 并出现炎性细胞浸润。伤后1d, 损伤灶周围出现小胶质细胞。伤后3d, 损伤区脑组织出现坏死, 神经细胞数量减少, 并可见胶质细胞增生。伤后7～10d, 损伤区形成软化灶。 (见图1、图2)

(损伤灶周围出现胶质细胞增生, 仍可见陈旧性脑组织出血, HE×400) (神经细胞数量明显减少, 胶质细胞增生明显, HE×400)

(神经细胞数量明显减少, 胶质细胞增生明显, HE×400)

2.2 免疫组化染色镜下观察

实验组大鼠在脑损伤后4～12h, 损伤区周围即可见S100B蛋白表达增多, 但着色较浅。损伤后1d, 损伤区周围开始出现较多的S100B蛋白表达, 染色明显加深。伤后3～5d, 损伤区周围有很明显的S100B蛋白表达, 染色较深。随后逐渐减少, 伤后10d阳性细胞数量与假手术组已无明显差别。阳性细胞主要为损伤周围星形胶质细胞。各实验组结果之间有统计学差异 (P<0.01) (见表1、图3、图4) 。阴性及正常组偶见S100B蛋白阳性细胞。

注:*与阴性对照组比较P<0.01;△与脑挫裂伤组伤后4h、12h、1d、7d、10d比较P<0.01。

(阳性细胞数量进一步增多, SP×200)

(损伤周围区域有很明显的S100B蛋白阳性表达, 染色较深;这些阳性表达主要为神经胶质细胞, SP×200)

大鼠脑挫裂伤后S100B蛋白阳性细胞表达时序变化见图5。

3 讨论

有研究表明, S100B蛋白不但是迄今最能反映颅脑损伤程度和预后的特异性蛋白[2], 而且在颅脑损伤后继发性脑炎性损伤中扮演着重要的角色[3]。

S100B蛋白是神经组织蛋白中的一种, 为一种不含糖、脂和磷的酸性钙结合蛋白, 可溶解于pH7.0的饱和硫酸铵溶液, 其基因定位于染色体1q21, 而且其氨基酸序列在不同种属中的一致性说明该蛋白具有重要功能。由α和β两个亚单位以反向平行的方式组成同源二聚体 (S100αα, S100ββ) 或异源二聚体 (S100αβ) , 形成S100αα、S100ββ、S100αβ三种组合形式, S100αβ和S100ββ常被统称为S100B蛋白[4]。S100B蛋白主要分布于中枢神经系统和周围神经系统的神经胶质细胞、Schwann细胞以及某些神经元、黑色素细胞、软骨细胞和脂肪细胞中。脑内生理量的S100B蛋白 (3500mg/mg蛋白) 主要由星形胶质细胞产生, 作用于神经元及其生长环境, 成为胶质细胞和神经元之间相互作用的桥梁, 主要具有以下功能[5]: (1) 胶质源性营养作用; (2) 调节细胞的可塑性; (3) 参与信息传递; (4) 调节细胞代谢; (5) 调节钙离子浓度; (6) 其他, 促进胰岛β细胞、垂体瘤细胞分泌胰岛素和催乳素;参与炎症反应等。

但高水平的S100B具有神经毒性:低浓度 (1～10ng·mL-1) S100B保护培养的神经元免于谷氨酸诱导的损害[6], 但高浓度 (>10ng·mL-1) 可导致星形胶质细胞和培养的神经元死亡。

本研究采用免疫组化染色法检测S100B蛋白在大鼠脑挫裂伤后脑组织的表达, 结果表明:大鼠脑挫裂伤后损伤周围脑组织S100B蛋白水平在造模4～12h即开始增高, 在伤后3～5d达到高峰, 随后逐渐下降, 到伤后10d与对照组无明显差别。引起S100B蛋白在颅脑损伤时分泌增加的机制可能有以下几个方面: (1) 脑挫裂伤后继发炎性反应, 小胶质细胞增生, 分泌IL-1增多, IL-1能强烈刺激星形细胞活化和增殖, 产生大量S100B蛋白, 有研究表明:在体和离体实验中IL-1能显著上调S100B蛋白水平, 使其升高较正常3倍以上[7]; (2) S100B蛋白自身液能促进星形胶质细胞的肥大和增殖产生更多的S100B蛋白, 从而形成正反馈调节 (Positive feed back regulation) [8]; (3) 其他炎性因子如IL-6、TNF-α、FGF-2、5-HT对S100B蛋白的表达亦有促进作用; (4) S100B蛋白的表达增加与凋亡的关系:神经细胞和胶质细胞的凋亡的发生可能促进S100B蛋白分泌增加, 但目前尚无深入探讨, 需要进一步实验予以证实。

综上所述, 大鼠颅脑损伤后S100B蛋白的表达具有一定的规律性, 呈现出逐渐升高—高峰期—下降期的变化, 其表达水平在伤后3～5d达到高峰。因此认为S100B蛋白可作为法医学颅脑损伤时间推断的一个补充指标。

摘要：目的:观察大鼠在脑外伤后损伤周围脑组织S100B蛋白的表达, 并探讨其在损伤时间推断上的法医学意义。方法:实验参照Feeney'S自由落体模型装置并制作大鼠脑挫裂伤模型, 在伤后不同时间点取损伤周围脑组织, 对其取材脑组织石蜡切片进行HE染色光镜观察和采用免疫组织化学染色法进行S100B蛋白染色, 使用SPSS 11.0软件包对所得数据进行统计学分析。结果:脑损伤后4～12h, 损伤区周围即可见S100B蛋白表达增多, 但着色较浅;损伤后1d, 损伤区周围开始出现较多的S100B蛋白表达, 染色明显加深;伤后3～5d, 损伤区周围有很明显的S100B蛋白表达, 染色较深;随后逐渐减少, 伤后10d阳性细胞数量与阴性对照组已无明显差别。阳性细胞主要为损伤周围星形胶质细胞。结论:大鼠颅脑损伤后S100B蛋白的表达具有一定的规律性, 呈现出逐渐升高-高峰期-下降期的变化, 其表达水平在伤后3～5d达到高峰。因此, S100B蛋白可作为法医学颅脑损伤时间推断的一个补充指标。

关键词：脑挫裂伤,S100B蛋白,免疫组化染色

参考文献

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S100B蛋白表达 篇2

1资料与方法

1.1一般资料

方便选择在河南省精神病院精神科门诊及住院治疗的EOS患儿90例作为观察组。其中,男46例,女44例;儿童型30例,青少年型60例。并选取同期健康儿童67名为对照组。其中,男39名,女28名;儿童20名,青少年47名。两组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2纳入标准和排除标准

纳入标准[6]:1符合ICD-10精神分裂症诊断标准;2年龄9~18岁;3PANSS总分≥60分;4该研究经该院医学伦理委员会批准,经患儿监护人知情同意自愿加入。排除标准[7]:1母孕期及出生史异常、围产期疾患;伴有严重躯体疾病的患者;2伴有其它重性精神障碍者、精神发育迟滞者;3入组前4周内接受过抗精神病药物治疗或无抽搐电休克治疗的患者;4取样前剧烈运动史。

1.3方法

采用Elisa法对两组儿童血清S100B水平进行检测。取外周静脉血2 m L,1 500 r/min离心,取上清液,依据试剂盒说明书检测S100B。采用WCST评价患儿认知功能,共包括6个维度。

1.4统计方法

2结果

2.1两组血清S100B水平比较

观察组血清S100B水平为(0.163±0.040)μg/L显著性高于对照组的(0.129±0.033)μg/L(P<0.05)。结果见表1。

2.2两组WCST评分比较

观察组WCST评分显著差于对照组(P<0.05)。结果见表2。

2.3患儿血清S100B与WCST评分的相关性分析

经pearson相关性分析发现,血清S100B与WCST的非持续性错误、持续性应答、数错误应答数呈正相关性(r=0.403、0.368、0.364;P<0.05)。

3讨论

S100B蛋白是一种脑神经星形胶质细胞的标记性蛋白,低浓度S100B对神经有着营养的作用,可通过刺激人体神经轴突,使其生长而对神经退化进行调节,但高浓度S100B则对神经存在一定的毒损害,并在人体神经退化中发挥重要作用。当前一些研究发现S100B蛋白可作为诊断脑血管疾病、颅脑损伤的指标,并可用于预后判断。而且,血清检测S100B操作方便,因此在脑损伤,包括精神分裂症患者临床诊断、检测中受到重视。S100B蛋白升高的机制可能为[8,9,10]:1精神分裂症可引起神经胶质细胞损害,释放细胞中的蛋白;2神经细胞受损后,神经胶质细胞分泌大量S100B以促进神经细胞的恢复,高浓度S100B造成神经细胞的损伤,这也是精神分裂症患者存在症状难治的原因。陈大春等[4]研究发现首发精神分裂症患者血清S100B水平(134.70±99.85)ng/L显著高于正常人群的(59.80±99.85)ng/L。该组中,观察组血清S100B水平为(0.163±0.040)μg/L显著性高于对照组的(0.129±0.033)μg/L(P<0.05),结果提示精神分裂症患儿S100B水平显著高于正常儿童,该结果与陈大春等[10]的结果一致。

当前,很多研究显示S100B和认知功能密切相关,发现过度S100B可引起学习能力的缺失以及行为问题[11,12]。陶永红等[12]的研究显示首发精神分裂症患者WCST的指标均显著性低于正常人群。该组中,观察组WCST的指标均明显差于对照组,(P<0.05),结果提示了精神分裂症患儿有着显著的认知功能损害,该结果与陶永红等的结论一致。进一步的我们对血清S100B蛋白和WCST的相关性进行了分析,发现血清S100B与WCST的非持续性错误、持续性应答、数错误应答数呈正相关性(r=0.403、0.368、0.364;P<0.05)。WCST的这几个指标均反映大脑的认知功能障碍,也验证了S100B蛋白和患儿认知功能障碍关系密切。

综上所述,早发精神分裂症患儿血清S100B水平明显高于正常儿童,并与认知功能障碍呈正相关。

参考文献

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S100B蛋白表达 篇3

我们在前期工作基础上以早产儿体液中S100B蛋白变化结合其它已有检测方法,观察早产儿脑损伤情况及糖皮质激素促胎儿肺成熟,改善脑损伤的效果。

1 资料与方法

1.1 观察对象和分组

从2009年5月至2010年10月,我们应用检测脐血和新生儿尿液S100B浓度的方法,观测了产前母亲给予糖皮质激素对新生儿神经系统的影响。研究分2组:GC组:妊娠(34±1.38)孕周并在7d内有早产危险或因合并症需要提前终止妊娠的孕妇。对照组:妊娠(34±1.26)周急诊入院早产未给地塞米松治疗即顺产的孕妇,同样采集脐血、尿液,测定S100B蛋白含量(两组孕周无比较显著差异)。排除标准:多胎、胎儿或新生儿有心脏、血液系流疾病、胎儿畸形染色体异常如唐氏综合征。

1.2 给药方法

GC组母亲在将自娩前或剖宫产前地塞米松5mg肌内注射,12h 1次,共4次。用药指征,胎儿宫内窘迫(RDS)、胎儿宫内发育迟缓(IUGR)、早产、妊娠高血压疾病。

1.3 观察指标

S100B检测:胎儿分娩时取脐血样本,尿液在5个规定时间内采集:0、24、48、72、96、120h。

新生儿常规检测动脉血气分析、超声脑血流图检测;并与对照组比较。此观测征得患者父母同意,并签字。

神经系统超声检测脑室内出血程度与尿检同时进行。

新生儿神经系统状况按2005年中华医学会儿科学分会新生儿学组修订的缺血缺氧脑病诊断标准[2]分为正常、可疑、不正常三级。婴儿不正常的表现有:多动症或少动症;肌张力过高或过低;偏身协同动作障碍;淡漠症或过度兴奋。请儿科同一观察者观测所有婴儿以为防人为偏差。

分娩时在新生儿呼吸建立前钳夹脐带取血样检测S100B;剖宫产手术前产妇均无宫缩。

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定S100B蛋白含量。

1.4 数据分析

采用PEMS3.1统计软件,计数资料采用卡方检验,计量资料以表示,采用t检验;以折线图比较GC组和对照组及有神经系统症状新生儿尿S100B蛋白动态变化。

2 结果

两组产妇和新生儿一般状况总结见表1、表2。胎窘、脑室内出血及神经系统异常,需机械通气功支持。产前母亲未用糖皮质激素的婴儿与对照组比较住院时间长(P<0.001),10例对照组新生儿发生脑室内出血。GC组无1例发生脑室内出血。

对照组有脑损伤新生儿脐血S100B蛋白(3.79±0.43)μg/L比无脑损伤新生儿脐血S100B蛋白(1.2±0.21)μg/L浓度高;GC组新生儿S100B蛋白(1.0±0.12)μg/L,较对照组低,与对照脑损伤亚组比较(P<0.001)。

血气分析显示,GC组CO2分压、碱剩余负值、pH值、乳酸较对照组(脑损伤)明显降低,差异有显著性;与对照组(无脑损伤)比较无显著性差异(表3)。

对照组(脑损伤)新生儿尿液S100B蛋白明显示增高;从出生时2.4μg/L到120h时4.6μg/L;GC组尿S100B动态变化不明显,从出生时0.11μg/L到120h时0.23μg/L,所有GC组预设检测时间尿S100B都较对照组低(图1)。

3 讨论

胎儿早产是产科常见的合并症,因为此时各器官发育不成熟,胎儿宫内窘迫(RDS)、胎儿宫内生长受限(FGR)、脑室内出血、脑瘫等发生率增高。但目前及早发现胎儿/新生儿胎儿宫内窘迫、脑损伤无论是检测方法还是改善其病症的手段都十分有限,使得一旦发生胎儿宫内窘迫,出生后突发窒息甚至死亡,医务工作者不能早期查觉,分娩时发现为时已晚,变得束手无策,因而风险高,医患矛盾突出。各种原因所致的早产是围生儿病率和新生儿死亡的主要原因[3]。

胎儿监护是采用生物物理和生物化学手段胎儿宫内安危进行评价的方法。分为:产前监护和产时监护如电子胎心监护(FHR)、异常胎儿头皮血样检查、羊水混浊、多普勒超声等。有效的监护手段应该能尽可能减少产前和产时窒息所致的不良围生儿结局,但目前仍然没有任何一种方法是降低围生儿患病率和病死率、改善远期预后的理想方法[4]。

用于脑损伤的标志物应满足的标准[5]:(1)进行测定简单,具有良好的重现性;(2)在许多生物体液中均可测定;(3)可能用于纵向监测;(4)有早期诊断价值。

S100B在脑组织中含量丰富,正常人由于血脑屏障的存在,血浆中S100B蛋白含量极低,但在病理情况下可透过血脑屏障,进入血液。脑组织损伤后,神经胶质细胞的坏死导致血脑屏障功能障碍,脑脊液中升高的S100B通过受损的血脑屏障进入血液。

S100B蛋白作为脑部发育的监测指标,特别是在围生儿脑损伤的监测中预测脑损伤有以下优点:便于操作,重复性好;半衰期为1h,便于动态监测;对围生儿脑损伤的早期诊断是一很好的定性、定量指标。

本研究结果表明,有脑损伤新生儿脐血S100B蛋白比无脑损伤新生儿脐血、尿液浓度显著升高。血气分析碱剩余负值、pH值、乳酸也相应升高。

尿液S100B呈动态变化。大鼠缺血再灌注0.5h后血脑屏障的紧密连接开放,血清S100B蛋白就开始升高,再灌注2~12h内皮细胞膜通透性开始增大,S100B蛋白维持在较高水平,再灌注12~24h血脑屏障的各组结构发生了严重损害,S100B达到最高值,48h后组织修复,S100B下降。故我们采用尿液120h内5个规定点检测尿液S100B蛋白含量[6]。

产前给予糖皮质激素促早产儿胎儿肺成熟、减少呼吸窘迫综合征,脑室内出血和坏死性小肠结肠炎的发生,故得到广泛应用。本研究显示GS治疗新生儿血、尿S100B蛋白水平明显降低,与血气分析结果相一致。动物实验和人体观测,产前给予GC降低血脑屏障渗透性,保护大脑,促进胎儿成熟。Sannia A等[7]对早产儿行病例对照观察,结果显示产前应用GC新生儿尿液中S100B蛋白呈现剂量依赖性,减少GC疗程不影响促胎肺成熟疗效,而对神经系统影响更小。

S100B蛋白在较低水平是一种神经营养因子而较高水平有神经毒作用。给予GC后较低的S100B蛋白水平为研究GC发挥S100B蛋白作为神经营养因子作用提供了新方法。由于GC因某些情况下影响细胞因子产物,在产生S100B蛋白的细胞中发现了GC受体。GC对中枢的作用可能是GC调节和(或)释放神经系统S100B蛋白产物。这也为其它更有效治疗胎儿脑损伤药物的发现与研发提供了工具[8]。

总之,研究表明产前给予GC有促胎儿或新生儿肺成熟,改善脑损伤的作用,S100B蛋白作为产前用药效果检测的标志物,可能为其他更有效治疗胎儿脑损伤药物的发现与研发提供了工具。

摘要：目的 观察脑损伤引起早产儿的血、尿S100B蛋白变化及糖皮质激素(GC)改善胎儿脑损伤效果。方法 研究分2组:GC组:妊娠(34±1.38)周并在7d内有早产危险或因合并症需要提前终止妊娠的孕妇,产前使用糖皮质激素激素(GC)促胎儿成熟:地塞米松5mg肌内注射,12h 1次,共4次。新生儿出生后采集脐血、尿液样品,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定S100B蛋白含量。对照组:妊娠(34±1.26)周急诊入院早产未给地塞米松治疗即分娩的孕妇,同样采集脐血、尿液,测定S100B蛋白含量。二组新生儿行颅脑超声、Apgar评分等,研究结果采用PEMS3.1统计软件分析。结果 GC治疗组新生儿脐血、尿液S100B蛋白水平明显低于对照组,降低脑损伤胎儿出生S100B蛋白水平。结论 S100B蛋白作为胎儿围生期神经损伤的早期重要诊断和预后判定的重要指标,并对糖皮质激素激素对促早产儿成熟情况给以量化评价。

关键词：糖皮质激素,S100B蛋白,早产儿

参考文献

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S100B蛋白表达 篇4

1材料与方法

1.1 动物及分组

选SPF级健康SD大鼠160只, 雌雄各半, 体重 (280±20) g, 由第四军医大学实验动物中心提供, 动物合格证号:SCXK (军) 2007-007。依次编号后按照随机原则分成4组, 即:假手术组、模型对照组、吡拉西坦治疗组 (西药对照组) 、健脑益智胶囊治疗组;每组再按照标本采集时间随机分为4个亚组, 每组10只。

1.2 主要仪器和试剂

FJ-2003PS型γ放射免疫计数器:西安核仪器厂;大鼠立体定位仪:陕西中医学院基础课部实验中心;自由落体打击架:自制。S100B蛋白ELISA试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 药物

吡拉西坦:湖北宜昌人福药业有限公司生产, 批号:100415;健脑益智胶囊:陕西中医学院附属医院制剂中心提供。

1.4 造模方法

10%水合氯醛 (3.8ml/kg) 行大鼠腹腔注射麻醉后固定大鼠在鼠板上, 头部剃毛、皮肤消毒后, 沿正中线切开头皮并剥离骨膜, 切口长2cm, 暴露右顶骨, 用牙科钻于冠状缝后1.5mm, 中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗, 保持硬脑膜完整。假手术组不予打击, 直接缝合头皮;其余各组安装自由落体打击架后, 参考Feeney法[1]用20g击锤从30cm高处自由落下, 造成右顶叶脑组织损伤, 骨蜡封闭骨窗, 缝合头皮, 伤口涂抹红霉素软膏, 放回鼠笼喂养。

1.5 给药处理

动物造模24小时后开始给药。假手术组和模型组给予常规喂养, 西药组给予吡拉西坦 (3.6g/kg·d-1) 灌胃, 治疗组给予健脑益智胶囊 (6.0g/kg·d-1) 灌胃。

1.6 观察指标及测定

1.6.1 大鼠一般情况

一般状况的评价 (自拟) 标准:活动度 (反应敏捷计4分, 反应较迟钝计3分, 反应迟钝计2分, 自主活动差计1分) ;进食量 (进食量不少于30g计4分, 进食量小于30g大于10g计3分, 进食量小于10g但能进食计2分, 无自主进食计1分) ;精神状态 (精神正常计4分, 精神欠佳计3分, 精神萎靡计2分, 嗜睡计1分) 。

1.6.2 血清S100B蛋白含量测定

ELISA法检测。1天时于大鼠尾部采血, 3、5、7、10天各时间点处死大鼠前心脏采血, 按试剂盒说明操作。

1.7 统计方法

应用SPSS13.0软件进行分析与检验, 各组计量资料以undefined表示, 两组间样本均数比较用t检验。

2结果

2.1 各组大鼠一般情况

实验过程中共死亡大鼠45只, 其中23只在造模后24小时内死亡 (考虑与打击有关) , 治疗过程中模型组死亡15只, 西药组死亡3只, 胶囊治疗组死亡4只 (死亡原因考虑与脑水肿反应和灌胃时误吸有关) 。样本数最少的亚组6只, 故在结果统计时各亚组选样本均为6只, 其余剔除。大鼠精神状态、进食量、活动度评分见表1～3。

与假手术组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与阳性组比较#P<0.05 (下同)

2.2 各组大鼠血清S100蛋白含量的变化

结果见表4。

与假手术组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05;与阳性组比较#P<0.05

3讨论

中医学认为:“脑为髓之海”、“元神之府”、“诸阳之泉”、“五脏六腑精气皆上注于脑”, 故颅脑外伤后, 伤及脑髓, 脑之经络、血脉受损, 脑内气血运化失常, 脑脉受损, 血溢脉外而成瘀血, 经络被伤, 气机不畅, 气滞血瘀, 水运不畅, 留而为痰浊、瘀血, 痰瘀互结是颅脑损伤的根本病机之所在。根据临床经验, 拟定豁痰利水、化瘀开窍的方药——健脑益智胶囊, 方中水蛭咸、苦、平而归肝经, 破血、逐瘀、通经, 使溢于脉外之血消散, 闭阻之经络畅通;白茅根甘、寒, 凉血止血、清热利水, 使热散而血止, 湿渗则水利;郁金辛、苦、寒而归肝、胆、心经, 活血行气, 助水蛭活血以祛瘀, 并且能解郁清心, 为解郁安神第一品, 与开窍豁痰、醒神益智之石菖蒲合用, 能使心神安定、情志调畅;葛根活血化瘀之功古人虽描述不多, 但现代药理研究证明葛根有扩管通脉之效[2]。全方共奏豁痰开窍、活血化瘀、通脉益智之效。

本项研究中4个亚组进行了5次采血, 在造模后24小时时在第4亚组大鼠尾部采血, 10天再次处死该组大鼠采血进行检测。有研究表明, 颅脑损伤大鼠在10天进行两次采血对于检测结果没有影响[3]。

S100B是S100蛋白家族成员之一, 主要由神经胶质细胞合成和分泌, 特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞;在外周神经的雪旺细胞和卫星细胞中也富含S100B蛋白;另外S100B蛋白也存在于非神经系统中, 包括黑色素细胞、朗格汉斯细胞、软骨细胞、肾上腺卫星细胞等[4]。血清S100B蛋白的浓度与以下三种因素有关[5,6]: (1) 脑损伤的严重程度及范围; (2) 巨噬细胞或蛋白酶引起的降解作用; (3) 血-脑脊液屏障被破坏的程度。S100B蛋白虽然具有神经营养作用, 但是高浓度的S100B蛋白却有神经毒性作用, 参与神经退化机制, 如Scot-to等[7]研究发现细胞外高浓度的S100B蛋白可以刺激致炎细胞因子表达, 导致细胞凋亡, 并能通过一氧化氮 (NO) 依赖途径诱导神经元细胞死亡;Sandler等[8]的临床研究表明, 脑损伤死亡病人血清高浓度S100B蛋白可能参与了创伤后的神经变性过程。S100是星形胶质细胞激活的标志之一。在各种脑损伤中, 反应性星形胶质细胞增生和活化产生大量的S100, S100本身也刺激星形胶质细胞的增殖, 从而形成正反馈作用。

本项研究结果表明, 颅脑损伤后大鼠血清的S100B蛋白含量均高于假手术组, 这与Lo等[9,10]报道是一致的。本研究中只观察到一次表达高峰, 出现在第5天。有研究表明, 由原发性损伤所致的高峰发生在24小时以内, 第二次高峰发生在第5天, 为继发性损伤所致。本项研究由于在24小时内未设观察点, 所以未能观察到第1个高峰的出现。

本项研究结果表明, 两用药组大鼠一般状况评分均较模型组明显改善, 在第3、5、7、10天, 治疗组血清S100B蛋白的含量均低于模型组, 说明健脑益智胶囊对血清S100B蛋白具有降低作用, 健脑益智胶囊的作用明显优于吡拉西坦, 表明健脑益智胶囊对颅脑损伤具有保护作用, 降低S100B蛋白含量可能是其作用机制之一, 其他作用机制有待进一步探讨。

综上所述, 健脑益智胶囊在颅脑损伤后能抑制TBI后大鼠血清S100B蛋白含量的增高, 改善TBI后临床症状, 可能与其能减轻脑组织及神经细胞的继发性损伤和促进血脑屏障的修复有关。

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S100B蛋白表达 篇5

S100B蛋白是一种酸性钙结合蛋白, 主要存在于中枢神经系统星状神经胶质细胞的胞质中。中枢神经系统细胞损伤时, S100B蛋白从胞质中渗出, 进入脑脊液, 再经血脑屏障进入血液, 故血清酸性钙结合蛋白是反映脑组织病理性损伤的特异生化指标。为了在出现明显的临床症状前, 早期发现胆红素脑病, 为早期干预提供依据, 我们进行了新生儿高胆红素血症S100B蛋白与血清胆红素及脑损伤相关性的研究。旨在探讨S100B蛋白对胆红素脑病早期诊断的价值和意义, 为其在临床诊疗的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择于2011年8月1日~2012年4月30日在我科住院的足月新生儿高胆红素血症90例为观察对象。男48例, 女42例, 各组病例均除外新生儿缺氧缺血性脑病、颅内出血、颅内感染、代谢性异常等疾病。胎龄体重、病因分布情况:ABO血型不和性溶血性病33例, 葡萄糖6磷酸酶缺乏12例, 感染因素36例, 其中肺炎8例, 败血症10例, 脐炎9例, 脓疱疮6例。原因不明9例。治疗:光疗或换血加光疗。其他根据情况予以抗炎等处理。诊断标准及光疗及换血标准符合[2,3,4]。

1.2 检测指标

所有患儿入院时静脉采血3 m L, 离心留取血清。3 500 r/min, 15 min, 采用全自动生化分析仪重氮法检测血清胆红素, 包括总胆红素、未结合胆红素、结合胆红素及肝功能。剩下血清存储在-80度。S100B含量的测定采用ELISA法, 试剂盒购自生物医学技术公司, 操作严格按其说明书进行。

神经检查包括肌张力、肢体运动、及凝视、生理反射。分组方法参考[5]分为:正常组和脑功能障碍组。脑功能障碍包括:姿势异常、反射不对称、高频的抖动、肌腱反射异常、肌张力增高、明显不对称。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量数据用均数 (±s) 表示, 组间均数比较采用方差分析。特异性、敏感性采用Receive operation相关分析。

2 结果

将S100B与血清胆红素进行相关分析, 胆红素越高, S100B越高。相关性分析, 血清胆红素与S100B有一定相关性, 相关系数为0.867。见附图。

血清胆红素大于342μmol/L的婴儿与小于342μmol/L组相比, S100B差异有显著性, 进一步提示S100B与血清胆红素进行有一定相关关系。见表1。

注:两组比较, 差异有显著性, P<0.05

所有对象, 共有轻度神经功能异常26个, 均集中在大于342μmol/L组, 而有轻度神经症状婴儿的胆红素、S100B均值差异有显著性。提示胆红素、S100B可作为脑功能障碍标志。三个月复查, 轻度脑功能障碍等神经症状消失。见表2。

注:1) 有无神经功能障碍患儿总胆红素比较, t=8.847, 差异有显著性, P<0.05;2) 有无神经功能障碍患儿S100B比较, t=4.637, 差异无显著性, P<0.05

Receive operation分析发现:胆红素376μmol/L出现脑功能障碍的特异性和敏感性分别为72.9%和83.4%。而S100B大于32.6 pg/m L, 出现脑功能障碍的特异性和敏感性68.3%和82.2%。见表3。

3 讨论

胆红素毒性反应包括了基底节及脑干细胞核, 引起了一系列临床症状称之为胆红素脑病。病理上有脑干细胞核胆红素黄染, 是一种病理性诊断。双侧基底节异常高信号形成是胆红素脑病的特征性表现, 脑干诱发电位提示神经障碍和脑损伤。结合胆红素脑病的临床症状及肌张力异常, 常作为胆红素脑病的诊断。而新生儿在疾病早期临床表现极不典型、且滞后。早期诊断多依靠临床表现而缺乏客观的、广泛接受的血清学诊断指标。因此, 仅凭临床表现很难准确诊断胆红素增高导致的脑病。临床上很难准确界定血清胆红素值的安全范围, 没有一个血清胆红素值能明确诊断是否发生胆红素脑病。早期诊断和治疗胆红素脑病尤为重要。

S100B是新型胶质和施旺氏细胞中一种神经营养因子及神经发育中重要生存作用的蛋白质。S100B水平是脑损伤严重程度的生化指标, 可对缺氧缺血性脑病、急性缺血及创伤性脑损伤的病情判断和预后估计。间接判断神经元损伤的程度, 对早期准确了解脑损伤有重要意义。动物实验观察了胆红素脑病仔鼠血清S100B水平及不同时间点脑组织S100B蛋白水平, 分析显示S100B蛋白可反映胆红素脑病仔鼠神经胶质的损伤程度[6]。所以, 本项目研究了血清胆红素与S100B蛋白及胆红素脑病早期脑损伤的相关性, 并发现脑损伤发生的预测参考值。为临床早期诊断和治疗提供参考。

高胆红素是新生儿脑损伤常见问题, 但临床及实验室、影像检查对肯定和早期诊断均有不足和不实际。而且发生胆红素脑病的精确胆红素值不可预测, 对安全的胆红素值、以及胆红素对组织损伤的病理机制引起高度关注, 多年来医生尽量避免足月和近足月儿胆红素大于20 mg/d L。本研究发现:随着胆红素的上升, S100B亦明显上升, 胆红素大于342μmol/L组及小于342μmol/L组, S100B差异有显著性。对出现脑功能障碍者, S100B及胆红素值均有显著性差异, 提示S100B是评估高胆红素血症可能的脑损伤的一个重要指标。胆红素376μmol/L预测神经功能障碍的敏感性和特异性分别为83.4%和72.9%, S100B 32.6 pg/m L预测神经功能受损的敏感性和特异性分别为82.2%和68.3%。因此, 血清酸性钙结合蛋白S100B可作为高胆红素血症患儿脑功能受损的早期预测指标。这与张玉晶[7]相同, 与OKUMUS[3]的研究有点相似, OKUMUS N发现:发现S100B与总胆红素高度相关, 胆红素大于19.1mg/d L后S100B稳定上升, 大于22 mg/d L脑功能障碍发生率明显上升, 于24 mg/d L脑电图异常, 而大于25 mg/d L听性脑病的发生明显上升。提示血清胆红素大于19.1 mg/d L可能出现胆红素毒性反应, 19.1 mg/d L是要积极干预的胆红素值, 大于19.1mg/d L的新生儿一半有轻度脑功能障碍, 而没有脑功能障碍、脑电图正常及无特殊神经临床表现者一般血清胆红素小于19.1 mg/d L。OZMEN等[8]发现新生儿胆红素大于20 mg/d L 12 h、20 h, 神经异常的发生率为18.1%和26.0%, 大于20 mg/d L是胆红素脑损伤的早期证据, 但NEWNAN等[9]对140例胆红素大于25 mg/d L的新生儿进行2~5岁追踪研究发现:没有发现因为胆红素毒性反应导致认知行为神经异常。但是, 这些婴儿出生早期均进行了早期干预, 如换血和光疗, 可能是这些治疗阻断了胆红素的毒性反应。本研究也发现:新生儿阶段的神经症状在3个月时均消失, 也可能归功于治疗及时。

综合以上分析, 本研究发现:S100B与胆红素脑损伤的早期阶段密切相关, 可作为评估脑损伤的早期指标, 避免胆红素超过342μmol/L特别是避免大于376μmol/L。S100B大于32.6 pg/m L是高胆红素血症脑损伤发生的高危因素。对临床治疗和预后判断具有重要的意义。遗憾的是, 本研究没有进行脑电图检查, 也没有进行脑干听觉诱发电位的检查, 有待将来进行S100B、脑电图、诱发电位与胆红素及胆红素脑病的进一步研究。

摘要：目的 为了早期预测重型高胆红素血症的新生儿发生胆红素脑病的可能性。方法 通过ELISA法检测了90例新生儿高胆红素血症患儿血清酸性钙结合蛋白S100B的变化, 并对所有新生儿在新生儿住院及三个月大时进行了神经检查。结果 酸性钙结合蛋白S100B与血清总胆红素具有相关性, 住院时有无神经功能障碍组酸性钙结合蛋白S100B差异具有显著性。胆红素376μmol/L预测神经功能障碍的敏感性和特异性分别为83.4%和72.9%, S100B 32.6 pg/mL预测神经功能受损的敏感性和特异性分别为82.2%和68.3%。结论 血清酸性钙结合蛋白S100B可作为高胆红素血症患儿脑功能受损的早期预测指标。

关键词：酸性钙结合蛋白,胆红素脑病

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S100B蛋白表达 篇6

关键词：颅脑损伤,血清,脑脊液,S100B蛋白

随着社会的发展, 发生颅脑创伤的人数也在逐渐的增高, 其高致命性和致残率给社会和家庭带来了沉重的负担。自S100B蛋白被发现以来, 科研和临床工作者投入了大量的时间和精力对其进行研究, 而其中的大部分研究表明, S100B蛋白作为中枢神经系统 (central nervous system, CNS) 的特异性标志物, 可用于评估CNS损伤的有效指标[1]。与格拉斯哥昏迷评分 (glasgow coma scale, GCS) 、瞳孔反射和计算机断层扫描 (computed tomography, CT) 这些指标相比, S100B蛋白具有这些指标所没有的高灵敏度, 在一定的时间段内检测TBI患者脑脊液、血液或尿液中S100B蛋白水平的变化, 可以预测TBI的病情变化、预后及其继发性损伤[2]。目前大量研究证实血清S100B蛋白对颅脑损伤 (traumatic brain injure, TBI) 有高度的敏感性和特异性, 其水平变化与临床症状、体征及影像学改变密切相关[3]。

然而, 目前国内外学者有对脑外伤后1, 6-二磷酸果糖早期治疗及外周静脉血白细胞水平与SIRS等相关之间的研究, 却没有进行CSF和血清S100B蛋白水平时间关系研究[4,5]。因此, 本研究通过测定CSF和血清S100B蛋白水平, 研究TBI后CSF和血清S100B蛋白的时间分布情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院神经外科2013年1月-2014年6月间收治的不同外伤原因所致的96例中重度 (依据GCS评分) TBI患者为研究组, 男58例, 女38例, 年龄18~62岁, 平均 (33.5±11.6) 岁。详细记录患者的年龄、住院号、GCS评分、血清及脑脊液采集时间等。纳入标准: (1) 年龄≥16岁; (2) 入院有明确的头颅外伤史; (3) GCS 6~12分; (4) 无其他严重复合伤的患者。排除标准:GCS≤5分、入院前心脏或呼吸骤停、入院前存在长期的缺氧或低血压、伤后3 d内脑死亡、贯通性TBI。对照组:选择无CNS疾病、无TBI、年龄18~65岁、长骨骨折内固定术后3~6个月取钢板48例患者作为“正常”人群, 作为健康对照组。治疗:根据TBI治疗指南进行治疗。

1.2 方法

标本的采集与保存:全部病例均采集CSF和血清样本。血清及CSF采集时间为入院后第1、3、5、7、14、21天。健康对照组每人采集一次CSF和血清, 血清和脑脊液样品在3000 rpm下离心分离, 至少为5 min, 并等分, 然后保存在-80℃, 直到批量分析, CSF和血清样本在伤后特定时间点匹配采集。

S100B蛋白的检测:使用S100B蛋白酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒, 试剂盒由DRG公司生产, 严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析, 数据相关性采用Spearman相关分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 96例患者各时间点脑脊液和血清S100B蛋白水平

CSF和血清S100B蛋白峰值均发生在伤后第1天和第3天, 各时间点CSF和血清S100B蛋白水平均高于健康对照组 (P<0.05) [健康对照组:CSF (0.08±0.01) ng/m L;血清 (0.31±0.12) pg/m L]。脑脊液和血清浓度随着时间逐渐下降, 在脑脊液中, 第1天值显著高于第3天值, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;与脑脊液比较, 血清值下降的并不显著, 但是第1天值显著高于第3天值, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 第3天值也显著高于第5天值, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

注:健康对照组:CSF (0.08±0.01) ng/m L;血清 (0.31±0.12) pg/m L

2.2 同一时间点脑脊液和血清S100B蛋白水平的相关性分析

伤后各时间点CSF和血清S100B蛋白水平存在一定的相关性。脑脊液/血清相关性在第1天最强 (r=0.78) , 其次为第3天 (r=0.67) , 随着时间的推移, CSF和血清S100B蛋白水平的相关性逐渐下降, 在第5天后这种相关性不显著, 见图1。

另外, 血清S100B蛋白的均值和峰值均与创伤严重程度评分 (injury severity score, ISS) 评分显著相关 (r=0.27、0.26, P<0.05) , 但是脑脊液S100B蛋白的均值或峰值与ISS评分不存在相关性。

3 讨论

3.1 S100蛋白

是一组低分子酸性钙结合蛋白, 相对分子质量21 000, 因其可溶解在p H值为7.0的饱和硫酸铵溶液中, 故命名为S100蛋白, 由α和β两种亚基组成。S100B蛋白主要存在于中枢神经系统的神经胶质细胞、施万细胞中, 其重要的生物学作用是调节神经胶质细胞及神经元中纤维蛋白及中间丝的合成, 参与细胞内的分化、凋亡等生理过程[6]。此外, 其还具有神经营养、信号调节因子等作用[7,8]。

目前认为正常人由于脑细胞及血脑屏障的完整性, 血液中、脑脊液中S100B的水平极低, 但由于某些疾病、TBI或某些原因 (如脑血管出血、病毒性脑炎、儿童脑震荡、新生儿缺氧、脑肿瘤、神经炎症、神经退行性变等) 可以使细胞内的S100B释放到细胞外, 进入到脑脊液中, 或者透过受损的血脑屏障进入到血液中, 从而使血液和脑脊液中S100B浓度升高[9,10,11,12,13,14]。然而, 部分科研人员通过研究发现, 关于血清S100B蛋白水平的来源还没有得到充分的理解, S100B蛋白作为与TBI病理生理有关的损害或神经保护的标识物的作用目前尚不完全清楚[3,15]。由于这些问题, 研究TBI脑脊液和血清中S100B蛋白水平是十分重要的。

3.2 笔者的研究资料

显示脑脊液和血清的峰值通常发生在伤后第一个24 h内。在伤后早期脑脊液和血清S100B蛋白水平彼此密切相关, 而在稍后的时间点, 彼此的相关性逐渐减弱。这种S100B蛋白相关性减弱的原因可能是多因素的, 可能与血脑屏障完整性的动态变化以及从脑外来源的S100B蛋白有关。这与其它研究相一致[16,17]。

血清S100B蛋白不能较好地评估预后的原因可能是多因素的。在采样早期, S100B蛋白的脑脊液/血清比是最佳的, 这支持了动态血脑屏障 (Blood brain barrier, BBB) 和颅外来源的观点。其它研究也显示了S100B蛋白可能的脑外来源, 包括长骨骨折、肌肉和脂肪创伤和烧伤。Kleindienst等[15]发现, 长骨骨折引起的S100B蛋白水平升高可能是短暂的, 并且发生在伤后早期。在笔者的研究中, 不到10%存在长骨骨折, 从而限制了这种因素的作用。另外, 血清S100B蛋白峰值比CSF峰值低约500倍, 这表明中枢神经系统是血清S100B蛋白的主要来源。

一个完整的BBB通常可防止大于500 Da水溶性蛋白质的正常扩散, 如S100B蛋白 (9~13 k Da) [18]。然而, TBI后BBB破坏允许其从脑脊液渗到血清。CSF和血清S100B蛋白水平的相关性与Blyth等[17]的观点相似, 并且支持BBB外渗是血清S100B蛋白水平的一个主要来源的观点, 特别是在伤后第24~48小时。脑脊液和血清S100B蛋白时间分布上有所不同, 可能是由于各自的动态改变和不同来源所致。

3.3 展望

S100B蛋白表达 篇7

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

4%多聚甲醛、10%水合三氯乙醛、RT-PCR试剂盒、DEPC 、 Trizol液、引物(大连宝生物) 和DNA marker。兔抗大鼠S100b抗体(SANTA CRUZ),辣根酶标记羊抗兔二抗(中杉金桥),内参β-actin,蛋白质marker,PVDF膜(碧云天)。大鼠S100b基因片段扩增的引物序列,上游5’-GCCCTCATTGATGTCTTCC-3’;下游3’-TCCTTTAGTTTCTCGTCCTTC-5’,扩增引物长度为130bp;β-actin基因片段扩增的引物序列,上游5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’;下游3’-GCAACTGTAGGCATTTCTGG-5’, 扩增引物长度为652bp。电泳仪、PCR仪、DU-800蛋白核酸分析仪、PAGE凝胶电泳仪、凝胶成像系统、转膜仪、联科发光试剂盒等。

1.2 方法

①将Wistar大鼠腹腔麻醉,备皮消毒。断尾取血0.3mL,经环枕膜垂直进针2.5mm后缓慢注入枕大池,注血速度控制在0.lmL/min以内,缝合切口,消毒。假手术组,用等量的生理盐水做相同处理。术后大鼠尽量保持头低俯卧位为0.lmL/min,缝合切口,消毒。

②3d后断髓处死大鼠,通过后颈部取出含有脑干的基底动脉,一部分放置在液氮中保存,用于基因和蛋白的检测,另一部分放置在多聚甲醛中固定1d。经过固定、浸润、脱水、透明后包埋,每组各标本均切4张,厚度为7μm,进行HE染色。

③基底动脉组织一部分用于组织匀浆的制备;一部分立即放入液氮速冻后,在-80℃保存备用。取基底动脉组织100mg于无菌匀浆器中,加冰生理盐水1mL,置于冰上匀浆。离心后,取上清液制成1%的组织匀浆。S100b基因的表达:RT-PCR法。大鼠基底动脉组织RNA,测280nm/260nm OD值后即进行逆转录合成cDNA。 扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离,TB染色,凝胶成像仪成像后用Tannon Gis软件分析。 基底动脉组织中S100b蛋白的表达: Western Blot法检测检。提取大鼠基底动脉组织总蛋白,检测蛋白含量:采用BCA法,通过PAGE凝胶电泳分离蛋白,各孔上样体积20μL,电泳约1.5h后取胶,根据Marker,切取10KD大小蛋白位置的胶,半干法在转膜仪上转膜,100mA流,60min。 转膜后将膜置于5%脱脂奶粉中封闭1.5h,经过一抗孵育,4℃冰箱过夜,取出后用TBST洗涤3次,各10min,二抗室温孵育1.5h后, TBST洗涤3次,各10min, ECL发光液显色,曝光,通过Tannon Gis 软件分析,测光密度值。

1.3 统计学分析

实验数据以undefined表示,采用SPSS17.0统计分析软件,分别对对照组和假手术组及假手术组和模型组进行组间t检验,P<0.01差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规HE染色镜下观察

大鼠基底动脉经HE染色后发现:正常对照组,生理盐水组可见动脉内膜完整,内皮细胞排列紧密;手术组出现内皮细胞褶皱、变性,平滑肌细胞肥大,可见炎性细胞浸润,且管腔直径明显小于正常对照组和生理盐水组,见图1。

2.2 各组大鼠基底动脉中S100B基因及蛋白表达情况

S100b mRNA及蛋白在对照组和假手术组中均有微量表达,且差异不显著(P>0.05);与假手术组相比,手术组表达明显(P<0.01)。

注:图中C代表对照组;A代表假手术组;M代表模型组,余图同。

注※与对照组比较,P>0.05;# 与假手术组比较,P<0.01。

3 讨论

S100b蛋白是Moore等[2]人在1965年首先在牛的脑组织发现的,此种蛋白能完全溶解在中性饱和硫酸铵中而因此得名。高浓度的S100b具有神经毒性,浓度大小与脑血管疾病,颅脑外伤及其他神经系统疾病密切相关。我们的实验发现S100b基因表达与蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛密切相关。

目前蛛网膜下腔出血动物模型的制备主要有:穿刺法[3]是阻断颈总动脉后通过颈总动脉进入颈内动脉并刺破分叉处制作而成,手术成熟,简单,无需开颅,但手术过程中易造成短暂性脑缺血,诱发脑梗塞,术后动物死亡率高;血管撕裂法,穿刺法以及注血法。血管撕裂法主要是撕裂大脑中主要大动脉来模拟蛛网膜下腔出血,该方法的出血时间,出血速度,出血量不易被控制,且模型制备过程中破损了蛛网膜的完整性,导致硬膜下血肿;而注血法[4]无需破坏动脉壁,通过脑池如枕大池,视交叉池,将血液直接注入蛛网膜下腔,该方法具有操作简单、直接、重复性高,出血量可控制的优点。因此本实验利用枕大池注血法建立蛛网膜下腔出血模型,通过术后3d对大鼠基底动脉进行HE染色,镜下发现血管管腔狭窄、内皮细胞变性、平滑肌细胞肥大,同时伴有外膜炎性细胞浸润的病理变化。 S100b是一种酸性钙结合蛋白,广泛存在于哺乳动物的中枢神经系统内的星型角质细胞中,正常体内含微量S100b蛋白,通过和钙离子结合,激活脑果糖1,6-2磷酸醛缩酶和葡萄糖磷酸变位酶,进而调节神经细胞的能量代谢,对神经的生长和修复起到促进作用[5];高浓度的S100b在中枢神经系统内具有神经毒性,通过激活神经胶质细胞内的一氧化氮介导的死亡途径引起神经元的死亡。S100b通过促进细胞内PI(磷脂酰肌醇)水解,其分解产物IP3(三磷酸肌醇)作用于肌浆网和滑面内质网上的钙通道,使钙通道开放,释放Ca2+。Ca2+一方面和S100b结合引起其构象改变进而和细胞膜结合,使平滑肌纤维染色增强;另一方面和钙调蛋白(CaM)结合,通过磷酸化肌球蛋白轻链激酶(MLCK)使其失去对肌动蛋白ATP酶的抑制,促使α-action肌丝滑行,引起脑血管平滑肌收缩,痉挛[6]。综上所述,蛛网膜下腔出血后S100b的表达上调,高浓度的S100b蛋白通过激活神经胶质细胞内的一氧化氮介导的死亡途径引起神经元的死亡,脑血管平滑肌痉挛。但是有关于蛛网膜下腔出血后通过何种机制引起脑血管痉挛还有待于进一步的研究。

摘要：目的:观察蛛网膜下腔出血(SAH)模型大鼠基底动脉中S100b基因表达的情况,探讨S100b与SAH后血管痉挛(CVS)的相关性。方法:健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为对照组、假手术组和模型组。将模型组大鼠断尾取血0.3mL经环枕膜注入枕大池,假手术组以同样方法注入等量生理盐水。3d后断髓处死取基底动脉,通过HE染色观察基底动脉的病理变化;采用RT-PC法检测S100b mRNA表达量,蛋白质印迹(Western Blot)染色法测定S100b蛋白含量。结果:模型组大鼠基底动脉的管腔明显变小,对照组和假手术组无明显改变;S100b在对照组和假手术组都有少量表达,但两组无显著性差异(P>0.05);与假手术组相比,模型组大鼠基底动脉中S100b mRNA及蛋白的表达显著增高(P<0.01)。结论:蛛网膜下腔出血后S100b基因表达显著增高,并且和血管痉挛的发生成正相关。

关键词：蛛网膜下腔出血,血管痉挛,S100b基因

参考文献

[1]D ietrich H H, Dacey R C Jr. Molecu lar keys to the problems of cerebral vasospasm [J]. Neurosurgery,2000,46(3):517-530

[2]Moore BM.A solube protein characteristic of the nervous system[J].Biochem Biophys Res Commun,1965,19(6):739-744

[3]Weir B.VasosPasm in response to repeated subarachnoid hemor-rhage in the monkey[J].J NeurosUrg,1970,33:395

[4]Piepgras A.Characterization of an anterior circulation rat sub-araehnoid hemorrhage model[J].Stroke,1995,26:395

[5]Donato R. Intracellular and extracellular roles of S100 protein[J].Microsc Res Tech, 2003,60(6):540-551