大豆抗原蛋白研究

大豆抗原蛋白研究（精选9篇）

大豆抗原蛋白研究 篇1

猪瘟病毒 (classical swine fever virus, CSFV) 自1833年首次发现于美国的俄亥俄州以来已有百余年的历史, 世界上所有养猪国家都曾有过不同程度的流行, 给养猪业造成了极大的经济损失。在我国, 猪瘟是引起养猪业损失的最重要的传染病之一, 在各省市均有流行, 其中以地区性散发为主。

1 猪瘟病毒基因组结构

CSFV的基因组大小约12.3kb, 由5'端非编码区, 开放阅读框和以及3'端非编码区三部分组成。开放阅读框编码一个多聚蛋白, 此多聚蛋白又进一步被加工为4个成熟的结构蛋白和7个非结构蛋白, 由5'~3'分别为Npro、C、E0、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。

CSFV的毒力是多种蛋白共同作用的结果, 并非由某一种蛋白决定。研究发现, 能诱导产生猪瘟病毒抗体的主要是由基因E0、E2以及NS3所编码的蛋白质, 其中E0蛋白和E2蛋白是主要的抗原蛋白, 能引起高水平中和抗体的产生。因此, 研究者常将其作为研究CSFV毒力的靶标。

2 猪瘟病毒毒力基因及功能

2.1 E0蛋白

E0蛋白也称Erns, 由病毒ORF上Glu268~Ala494组成, 共227个氨基酸。它能诱导机体产生中和抗体, 是主要的保护性抗原之一。李艳蕊等表达CSFV的E0蛋白能特异识别CSFV抗体, 且具有很好的反应原性。

E0是一种尿嘧啶特异的核酸酶, 可以表达不同的生物学活性, 已证明的有神经毒性、抗蠕虫和免疫抑制活性, 其活性在pH4.5~6.5时最高, 最适温度为55℃, 酶活性不受Ca2+、Mg2+或EDTA的影响, 但能够被Zn2+离子抑制。E0对DNA没有活性, 只作用于RNA, 对富含U序列活性最高。E0的RNase活性能够影响宿主细胞中病毒RNA的复制, 并且对感染动物早期的免疫防御有一定的抑制作用。Luo等研究认为E0能够结合到外源性的dsRNA上并抑制IFN-β产生, 却不能阻断TRIF介导的IFN-β产生。

E0蛋白在介导病毒入侵易感细胞中发挥关键作用。猪瘟病毒通过与E0和E2的相互作用进入易感细胞。Van Gennip HGP等利用在昆虫细胞表达的E0和E2蛋白进行的抑制试验表明, 猪瘟病毒最初结合到细胞上是通过E0蛋白介导的, 试验还证实, E0 C端的肽段 (480-KKLENKSK-487) 是相互作用所必须的。

2.2 E2蛋白

E2蛋白是CSFV最主要的结构蛋白之一, 也是猪瘟病毒各基因中研究最多的。不同毒株E2核苷酸序列差异常被用于瘟病毒属中不同成员之间区别的依据之一。

近年来, 研究证实了E2分子由四个抗原结构域A、B、C、D组成, 位于E2 N末端的690~866位氨基酸处。A结构域又分为A1、A2和A3三个功能区, 是E2蛋白的中心部位, 为一段保守区, A1亚区能诱导产生中和抗体;A3亚区靠近B、C区, 不能诱导产生中和抗体, 也不具保守性;B和C均为非保守区, 是诱导产生中和抗体的主要部位;D区既不能诱导产生中和抗体也不保守。刘珂等在大肠杆菌中诱导表达E2蛋白, 证明猪瘟病毒E2糖蛋白A/D区是其线性B细胞表位区。

E2是目前研究最热的CSFV候选疫苗靶标。大多数CSFV的疫苗都是根据毒株的主要抗原决定簇E2设计和开发的。目前, 许多研究者针对E2设计出了标记疫苗, 从而有助于从疫苗接种猪群中筛查出野毒感染猪。Van等利用杆状病毒表达了CSFV E2 (不包括跨膜区) , E2的A区及E2的B/C区制成亚单位标记疫苗, 结果均能使免疫猪产生抵抗强毒攻击的保护。

2.3 NS3

NS3蛋白为多功能酶蛋白, 具有RNA激活的解旋酶活性、核苷三磷酸酶活性及丝氨酸蛋白酶活性。NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶和核苷三磷酸酶/RNA解旋酶活性分别位于其N端的1/3区和C端的2/3区, 在NS3蛋白上可能处于两个相对独立的功能结构区。前者主要负责病毒多聚蛋白的翻译后加工, 产生成熟的病毒蛋白, 而NTPase/helicase则主要参与病毒RNA的复制过程。同时, NS3蛋白通过阻断干扰素调节因子-3, 可能阻断了干扰素的产生, 从而避开了机体的先天性免疫而产生了免疫逃避。有研究者报道NS3与瘟病毒体外致细胞病变有关。徐浩利用PK-15细胞系表达非结构蛋白NS3来研究CSFV致细胞病变作用, 结果显示, 转染p EGFP-NS3的阳性细胞出现凋亡, 且凋亡现象与细胞内的NS3蛋白表达量有关。

除此之外, 猪瘟病毒基因组编码的其他蛋白质也在CS-FV入侵及致病方面发挥了重要作用。如Npro在病毒逃避天然免疫的过程中起着一定的作用;NS2由其多聚蛋白前体NS2-3经两个蛋白酶水解切割而释放出来的一种参与病毒基因调控的非结构蛋白;NS4B的疏水区是病毒复制的必需原件;NS5A蛋白参与病毒增殖等。

摘要：猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属成员, 能引起各种年龄段猪的急性、热性和高度致死性的传染病。本文就猪瘟病毒的分类、形态及及病毒的基因组结构进行了综述, 并对其编码的几种主要抗原蛋白E0、E2、NS3的功能等进行了简要介绍。

关键词：CSFV,E0,E2,NS3

参考文献

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大豆抗原蛋白研究 篇2

在福建省大田县进行了高蛋白春大豆与木薯不同行距套种方式试验,结果表明:在固定木薯密度,套种单行、双行和三行大豆3种种植方式中,双行大豆套种木薯,效益最高,即大豆种植密度25×50cm,7280株/667m2;木薯种植密度0.8×1m,800株/667m2,效益465.50元/667m2.

作 者：刘连生 吴新增 林琼 胡润芳 张广庆 林国强 作者单位：刘连生,吴新增(福建省大田县农业局,福建,大田,366100)

林琼(福建省种子总站,福州,350003)

胡润芳,张广庆,林国强(福建省农科院作物所,福州,350013)

大豆抗原蛋白研究 篇3

关键词：大豆分离蛋白；聚集体；界面性质；冰淇淋；应用

中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）08-0043-04

随着人口剧增导致资源供应日趋紧张，食品的蛋白质资源逐渐被研究者立为重点。肉类食品虽蛋白质含量高，但其中含有大量脂肪及固醇。而大豆是“完全蛋白质”的植物来源，其蛋白质含量高达40%以上，氨基酸模式与人体必需氨基酸的需求量比较吻合，且不含胆固醇，其特有的生理活性物质——异黄酮还具有降低胆固醇的作用。

大豆蛋白优质、廉价，可以用于装饰高级糕点和生产冰淇淋及啤酒，作为饮料、冰淇淋及乳化型制品的表面活剂来稳定乳化结构，是水、糖、油脂及其他食品配合物的良好载体。近年来，国内外学者对不同种蛋白质在不同环境条件下及经过各种改性处理后的功能性质进行大量研究，例如：Hemansson等人分析了不同环境条件对蛋白凝胶性质的影响；Sarah等人研究了热致蛋白凝胶的流变学特性；华欲飞等人比较了大豆蛋白与不同多糖的流变性質，并探讨了相分离在凝胶过程中的机理。但是，目前关于蛋白质在不同条件下热致聚合后形成不同微观形貌的聚集体的功能性质的研究少有报道。

李向红等人[1-4]研究表明：在不同的pH值下，不同浓度的大豆分离蛋白会以不同的结构形式（如单体、二聚体、四聚体、八聚体）存在，再通过高温加热，形成不同形状（如纤维状、絮状、块状）的聚集体。因此，本课题以大豆分离蛋白为原料，在一定的条件下制得不同的蛋白聚集体，分析和比较聚集体的界面性质，得到最优聚集体；再用蛋白聚集体以不同的取代率代替脱脂乳粉制备冰淇淋，探讨大豆分离蛋白聚集体对冰淇淋粘度和硬度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

大豆分离蛋白，脱脂乳粉，奶油，白糖，黄原胶，单甘酯，蔗糖酯，SDS，金龙鱼大豆色拉油，6%盐酸溶液，6%氢氧化钠溶液。

1.2 仪器和设备

组织捣碎机，pH测定仪，UV-2000型紫外分光光度计，高速离心机，磁力搅拌器，HH-6型电子恒温水浴锅，NDJ-5S型旋转粘度计，质构仪，以及其他试验用玻璃器皿。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白聚集体的制备 大豆分离蛋白聚集体的制备方法主要参考Utsumi[5]的方法而有所改进。配置浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的大豆分离蛋白溶液，用6%盐酸溶液和7%氢氧化钠溶液调pH值，每个浓度的溶液均调节3个pH值（2.0，3.5，7.0），然后置于80 ℃的水浴锅中加热2 h，制得大豆分离蛋白的不同聚集体。

1.3.2 大豆分离蛋白聚集体界面性质的测定

1） 溶解性的测定。将制备的浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的大豆分离蛋白聚集体以10 000 r/min的转速离心15 min，取上清液并稀释，使浓度为1%和2%的样品料液比为1∶5，浓度为4%和7%的样品料液比为1∶10，然后在波长280 nm处测吸光值。采用蛋白质含量的标准曲线（如图1所示），求出溶液中蛋白质含量，再乘其稀释倍数得到溶液中蛋白质浓度。

2） 起泡性和泡沫稳定性的测定。参照Watanabe等人[6]的方法而有所改进。取浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的样品各40 mL，用转速为6 500

r/min的组织捣碎机捣碎40 s，置于量筒中，记录泡沫的高度V1，静置30 min后记录泡沫高度V2。计算起泡性（FC）及泡沫稳定性（FS）。

3） 乳化性和乳化活性的测定。参照Watanabe等人的方法而有所改进。取5 mL浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的样品各加入5 mL金龙鱼大豆色拉油，用转速为7 500 r/min的组织捣碎机捣碎1 min，制成乳化液，在0 min和10 min时取底部样液50 μL，置于5 mL SDS溶液中稀释，测定500 nm处的吸光值A0和A10。以SDS溶液作为空白。

乳化性用乳化活力指数（EAI）表示：

EAI（m2/g）={（2×2.303）/[C×（1-φ）×104]}×

A500×dilution

乳化稳定性用乳化稳定指数（ESI）表示：

ESI（%）=100×（A10/A0）

式中：N为稀释倍数；C为蛋白质的浓度，g/mL；L为比色池光径，1 cm。

1.3.3 大豆分离蛋白聚集体取代脱脂乳粉制备冰淇淋及其品质的测定 用上述试验确定的最佳大豆分离蛋白聚集体，按照表1的配方，分别以20%，30%，40%，50%的取代率取代脱脂乳粉，制备冰淇淋[7-8]。

1） 冰淇淋粘度的测定。将制备的冰淇淋在4 ℃下老化12 h后，利用NDJ-5S型旋转粘度计，选用2号转子，转速12 r/min，测其粘度。

2） 冰淇淋硬度的测定。利用质构仪的检测探头两次下压测定制备的冰淇淋的质地特征曲线。将样品在冰箱中硬化，取出后迅速测定。参数设定：测试前探头下降速度为2 mm/s，测试速度为3 mm/s；测试后探头回程速度为5 mm/s；测试距离为15 mm；触发力为20×10-2 N；探头类型为P/6。

nlc202309081306

2 結果与分析

2.1 不同种聚集体的溶解性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的溶解性测定结果如图2所示。

由图2可以看出：大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的溶解性随pH值升高呈先降低再升高的趋势；pH值相同时，大豆分离蛋白浓度为4%（W/V）的聚集体的溶解性最高，且在pH值为7.0时其溶解度达到最高、为7.099 mg/mL，而在pH值为3.5时其溶解度最低。这可能是因为蛋白质在等电点时呈电中性，分子间的静电推斥力缺乏，而疏水作用使蛋白质聚集和沉淀，从而降低了蛋白质的溶解性。

2.2 不同种聚集体的起泡性和泡沫稳定性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的起泡性（FC）和泡沫稳定性（FS）测定结果如图3和图4所示。

由图3和图4可以看出：大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的起泡性及泡沫稳定性随pH值升高呈先降低再升高的趋势，在pH值为7.0时最高，起泡性达到40%和泡沫稳定性达到75%，而在pH值为3.5时最低；pH值相同时，起泡性和泡沫稳定性虽变化不明显，但仍能得出起泡性在浓度为7%（W/V）时达到最高，泡沫稳定性在浓度为4%（W/V）时最高。出现这种结果的可能原因，一是蛋白质的内在因素，即蛋白质的组成和结构，如蛋白质分子大小与组成等[10]；二是外在因素，即物理因素，如超声波、有机溶剂等[11]。

2.3 不同种聚集体的乳化性和乳化活性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的乳化性和乳化活性测定结果如图5和图6所示。

由图5和图6可以看出：在大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的乳化性及乳化活性随pH值升高呈先降低再升高的趋势，在pH值为7.0时最高，乳化性为0.07和乳化活性为36%，而在pH为3.5时最低；pH值相同时，乳化性在浓度为7%（W/V）时达到最高，乳化活性在浓度为4%（W/V）时最高。

2.4 大豆分离蛋白聚集体的不同取代率对冰淇淋硬度和粘度的影响

浓度为4%的大豆分离蛋白在pH值为7.0时制备的聚集体的界面性质最佳。用该聚集体以不同的取代率代替脱脂乳粉制备冰淇淋，测定产品硬度和粘度，结果见表2。

由表2可知：随着大豆分离蛋白聚集体取代率的升高，冰淇淋的粘度和硬度均呈升高趋势，在50%的取代率时达到最高，硬度为1 800.03 g左右，粘度为2 152 mg/s左右。这可能是因为大豆分离蛋白聚集体有良好的吸水性，使含有大豆分离蛋白聚集体的冰淇淋混料的粘度升高了，而其良好的持水性又使冰淇淋获得了更高的粘度[12]。

3 结论

上述试验结果表明：不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值条件下制备的大豆分离蛋白聚集体，其溶解性、起泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳化活性均有明显差异。在试验选取的3个pH值和4个浓度中，当大豆分离蛋白浓度为4%（W/V）、pH值为7.0时制备的聚集体界面性质最佳。用制备的性能最佳的大豆分离蛋白聚集体取代脱脂乳粉制备冰淇淋，随着取代率的升高，冰淇淋的粘度和硬度均呈升高趋势。

参考文献

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Abstract： Under the condition of different pH value， soy protein isolated form different microstructures of aggregates after high temperature heating. This paper studied the different kinds of aggregate's interfacial property （solubility， foamability， foam stability， emulsibility， emulsifying activity） and used aggregation prepared instead of dried skim milk with different replacement ratio and measure rigidity and viscosity. The experimental results showed that： with the concentration of 4%（W/V）of the soy protein isolate and the pH value of 7.0 the aggregate's interfacial property is optimum. In the application of ice cream， along with the increase of the replacement rate， the ice cream's rigidity and viscosity rise. When the replacement rate is 50%， the rigidity and viscosity reach the highest.

Key words： soy protein isolate； aggregation； interfacial property； ice cream； application

大豆抗原蛋白研究 篇4

关键词：血清甲胎蛋白,癌胚抗原,糖类抗原199,联合检测,原发性肝癌

原发性肝癌是临床较为常见的一种肿瘤疾病, 该病起病急且致死率高, 严重影响着患者的生活质量[1,2,3]。早发现、早诊断、早治疗是改善原发性肝癌患者预后的关键[4,5]。目前原发性肝癌的主要检测手段为血清甲胎蛋白 (AFP) 、癌胚抗原 (CEA) 、糖类抗原199 (CA199) 检测[6,7]。有研究表明, AFP、CEA、CA199联合检测可显著提高原发性肝癌的诊断准确率[8,9,10]。为了探讨AFP、CEA、CA199联合检测在原发性肝癌诊断中的应用价值, 我院选取2009年1月~2012年6月收治的原发性肝癌患者153例与健康体检人员70例进行血清AFP、CEA、CA199水平检测, 现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年1月~2012年6月将我院收治的原发性肝癌患者153例作为观察组, 经临床病理诊断分为两组, 病理诊断为良性患者94例为观察Ⅰ组, 其中, 男60例, 女34例;年龄43~69岁, 平均 (61.2±9.7) 岁。病理诊断为恶性患者59例为观察Ⅱ组, 其中, 男38例, 女21例;年龄41~73岁, 平均 (63.0±12.4) 岁。患者均符合2001年中国抗癌协会专业委员会制订的肝癌诊断标准。排除患有心肺异常、血液病、复发肝癌的患者。观察Ⅱ组的患者参考美国癌症研究委员会与国际抗癌联盟联合制订的病理学分期标准分为:肿瘤Ⅰ期25例, 肿瘤Ⅱ期21例, 肿瘤Ⅲ期13例。癌细胞转移患者21例。同期健康体检人员70例作为对照组, 其中, 男45例, 女25例;年龄42~70岁, 平均 (62.8±10.3) 岁。各组人员间一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

所有研究对象均抽取空腹静脉血5 m L, 于3 000 r/min转速下离心3 min, 分离血清后于6 h内完成AFP、CEA、CA199检测。均采用Access型全自动化学发光免疫分析仪 (美国贝克曼公司生产) 进行检测, 试剂盒为该公司生产的专用试剂盒, 严格按照说明书进行操作。

1.3 评价标准

AFP正常范围:0~20μg/L。CEA正常范围:0~5μg/L。CA199正常范围:0~34 IU/m L。超出正常范围即为阳性, 否则为阴性。

1.4 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS 16.0统计学软件进行处理, 计量资料数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 计量资料采用t检验和F检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组AFP、CEA、CA199检测结果分析

观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组和观察Ⅰ组, 观察Ⅰ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。见表1。

注:与对照组比较, #P<0.05;与观察Ⅰ组比较, *P<0.05

2.2 观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199与病理参数分析

肿瘤Ⅱ、Ⅲ期患者AFP、CEA、CA199均明显高于肿瘤Ⅰ期患者, 癌细胞转移患者AFP、CEA、CA199均明显高于未转移患者, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。见表2。

2.3 AFP、CEA、CA199的诊断性能分析

AFP、CEA、CA199的诊断性能分析结果显示见表3, 特异性由高到低依次为AFP、CEA、CA199、联合诊断, 敏感性由高到低依次为联合诊断、AFP、CA199、CEA, 准确性由高到低依次为联合诊断、AFP、CEA、CA199, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。

3 讨论

目前, AFP检测是世界公认的原发性肝癌诊断的有效指标之一, 其发生机制可能是由于患者体内的肝细胞大量受损后将会出现快速增生, 而新增生的肝细胞在尚未成熟的情况下容易合成AFP, 使得机体血清中的AFP含量快速升高。及时检测患者体内的AFP水平可以准确掌握患者肝脏的病情变化, 对早期发现和诊治肝癌具有显著的临床价值。

CEA是人体消化系统中的一种特异性抗原, 与机体肝硬化的发生机制密切相关, 肝硬化发展到后期极易发展成为肝癌, 因而CEA也可作为肿瘤标志物的一种检测手段。正常情况下, CEA的主要通过胃肠道实现代谢, 在血清水平显著降低时, 肿瘤状态下的CEA将会大量进入血液和淋巴的循环系统中, 使得血清中的CEA含量迅速升高。因而对CEA水平进行及时检测可以掌握患者的病情变化, 有利于患者后期的治疗。

CA199是人体消化道肿瘤细胞株分泌生成的一种低聚糖类抗原, 在消化道肿瘤患者中会呈现出显著的升高趋势。正常人体内的CA199会经肝脏代谢, 使血清中CA199的含量较低, 当肝癌发生后, 机体的肝功能代谢将会受到抑制和改变, 使CA199的代谢速度明显减慢, 大量的CA199滞留于体内血清中, 使得血清中CA199含量快速上升, 因而对CA199水平的有效监测可以了解患者肝癌发展的病情变化, 也可作为一种诊断原发性肝癌的有效指标。

本次研究表明, 观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组和观察Ⅰ组, 恶性肝癌患者血清中3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平显著上升。观察Ⅰ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组, 说明良性肝癌患者血清中3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平较正常人有所上升, 以体现出病变趋势。肿瘤Ⅱ、Ⅲ期患者AFP、CEA、CA199均明显高于肿瘤Ⅰ期患者, 随着病情的发展, 发展越晚期患者肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平升高越明显。癌细胞转移患者AFP、CEA、CA199均明显高于未转移患者, 说明癌细胞转移后患者病情已发展到了晚期, 其体内的肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平将会显著上升。特异性由高到低依次为AFP、CEA、CA199、联合诊断, 敏感性由高到低依次为联合诊断、AFP、CA199、CEA, 准确性由高到低依次为联合诊断、AFP、CEA、CA199, 说明3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199联合检测可以显著提高诊断原发性肝癌的准确性, 为后期的临床治疗提供了有效的科学依据, 具有显著的临床应用价值。

综上所述, AFP、CEA和CA199联合检测可以显著提高原发性肝癌诊断的准确率, 具有较高的敏感度, 值得临床推广使用。

参考文献

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大豆抗原蛋白研究 篇5

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白, 河南郑州同创益生食品有限公司;菠萝蛋白酶 (2500GDU/g) , 广西南宁杰沃生物制品有限公司;盐酸溶液 (0.1141mol/L) 、Na OH溶液 (1.075mol L) , 河南省洛阳市化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

凯氏定氮仪、碱式滴定管, 天津玻璃仪器厂;90W电动搅拌器, 金坛市金城教学仪器厂;DELTA-320型pH计, 梅特勒公司;HH-4数显恒温水浴锅, 国华电器公司;T-500型电子天平, 上海精密仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白含量测定

参照GB/T 5009.5-2003。

1.3.2 水分含量测定

参照GB 5009.3-2003。

1.3.3 大豆分离蛋白水解度测定方法

大豆分离蛋白水解度采用pH-State法。在大豆分离蛋白水解过程中及时加入NaOH标准溶液维持pH值不变, 随预定的反应时间记录维持反应体系pH值恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数, 最后计算大豆分离蛋白水解度。

1.3.4 大豆分离蛋白水解方法

配制一定浓度 (W/V) 的大豆分离蛋白溶液, 加热至水解温度, 用酸或碱调节溶液pH值至预定值, 按蛋白酶添加量称取蛋白酶加入大豆分离蛋白溶液中, 在反应过程中及时加入NaOH溶液维持pH值不变, 随预定的反应时间记录维持反应体系pH值恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数, 最后计算大豆分离蛋白水解度。

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白成分分析

注:氮换算为蛋白质的系数为6.25。

2.2 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳参数确定

2.2.1 温度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定pH值为7.5、底物浓度为4%、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定不同温度下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 结果如图1所示。

由图1可知:温度45~70℃, 大豆分离蛋白水解度随着温度的增大而增大, 当温度为60℃时, 水解度达到最大, 60℃之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在60℃时最大, 在60℃以下菠萝蛋白酶活性随温度增大而增加, 超过60℃时, 菠萝蛋白酶因温度过高而开始变性失活。

2.2.2 pH值对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、底物浓度为4%、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定不同pH值下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 试验结果如图2所示。

由图2可知:pH值6.5~7.5时, 大豆分离蛋白水解度随着pH值的增大而增大, 当pH值为7.5时, 水解度达到最大, pH值7.5之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在pH值7.5时最大, 在pH值7.5以下菠萝蛋白酶活性随pH值增大而增加, pH值超过7.5时, 菠萝蛋白酶的活性因pH值上升而下降。

2.2.3 底物浓度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定菠萝蛋白酶在不同大豆分离蛋白底物浓度下的水解度, 试验结果如图3所示。

由图3可知:底物浓度从3%~4%时, 大豆分离蛋白水解度随着底物浓度的增大而增大, 当底物浓度为4%时, 水解度达到最大, 底物浓度超过4%时, 大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶水解最佳底物浓度为4%。底物浓度过低, 影响酶和底物结合几率, 水解度下降, 底物浓度过高会抑制大豆分离蛋白的水解。

2.2.4 酶浓度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、底物浓度为4%和时间为30min条件下, 测定不同酶浓度下菠萝蛋白酶水解的水解度, 试验结果如图4所示。

由图4可知:酶浓度2.5%~6%时, 大豆分离蛋白水解度随着酶浓度的增大而快速增加, 当酶浓度达到6%时, 大豆分离蛋白水解度开始增加缓慢。当菠萝蛋白酶的浓度超过5%时大豆分离蛋白水解度增加很小, 这是因为当酶与底物完全作用时, 过量的酶不会增加水解速率, 因此菠萝蛋白酶水解时酶浓度为5%即可。

2.2.5 时间对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、底物浓度为4%和酶浓度为5%, 测定不同时间下菠萝蛋白酶水解的水解度, 试验结果如图5所示。

由图5可知:菠萝蛋白酶水解反应时间10~30min时, 大豆分离蛋白水解度随着反应时间的增加而增加较快, 菠萝蛋白酶水解反应30min之后水解度增加缓慢。当反应时间超过30min时水解度增加很小, 这是因为水解反应超过30min时, 菠萝蛋白酶酶作用点数目所剩很少, 因此考虑反应效率, 菠萝蛋白酶水解时间为30min即可。

2.2.6 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白工艺条件优化

选用L9 (34) 正交表试验方案, 以水解度最大值为评价指标, 在水解时间为30min下, 对温度、pH值、底物浓度和酶浓度进行优化。正交试验方案及结果分析见表2。

由表2可知:影响菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白参数的大小顺序 (即R值大小顺序) 为:酶浓度>温度>底物浓度>pH值;菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳参数组合:酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0。在此条件下验证表明, 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度可以达到8.18%。

3 结论

菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳工艺条件为酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0, 在此条件下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白30min, 水解度为8.18%。

为了增加菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 可延长反应时间, 在此条件下水解4h, 水解度可达11.07%。

摘要：以水解度为指标, 研究了温度、pH值、底物浓度和酶浓度等因素对菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响。影响菠萝蛋白酶水解大豆蛋白的影响因素顺次为酶浓度、温度、底物浓度和pH值。最佳参数组合是酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0。在此条件下, 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度在30min内可以达到8.18%。

关键词：菠萝蛋白酶,大豆分离蛋白,水解度

参考文献

[1]GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定方法[M].

[2]GB5009.3-2003食品中水分的测定方法[M].

[3]Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].New York:Elsevier Applied science Publishers, 1986:74-78.

大豆蛋白非食品应用研究 篇6

关键词：大豆蛋白,应用,生物材料

0 引言

大豆,又名黄豆,原产中国,2000多年前,由我国传播到了朝鲜和日本。至今,已遍及世界各国。大豆作为食品的实用价值高,具有好的加工性,可以生产出多达12000多个品种的大豆产品。大豆加工得到的主要产物是大豆油、脱脂大豆粉、大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白,在副产物中,含量最多而尚未开发的是大豆渣和大豆皮。它们在材料领域中具有巨大的开发应用潜力,是高分子科学工作者感兴趣的领域。大豆蛋白作为一种天然高分子材料,主要在材料粘合剂、生物降解材料、纤维材料和生物材料等几个领域研究较多。大豆产品脱脂大豆粉,大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白在工业上的应用近几年由于社会需求备受关注。

1 大豆蛋白在胶粘剂方面的应用研究

早在20世纪初,大豆蛋白被用于许多工业产品如木材胶粘剂、纸张胶粘剂、涂层和颜料粘合剂。但20世纪60年代后,石油化工产品合成的胶粘剂迅猛占领市场,替代了这些天然胶粘剂。目前,我国对大豆蛋白胶的研究几乎空白[1],原因是建国初期的大豆主要用作食物、饲料。仅见的报道是薛培元利用豆粕作为原料制成蛋白质溶胶,再配合抗水性和消散性试剂,用作木材胶粘剂[2]。

粘合剂的性能与蛋白的粒径,表面性质,蛋白结构,黏度,p H,以及工业加工过程中的条件(如温度,时间和压力)有关。当提高蛋白溶液的p H值时,可以使蛋白质分子分散和展开,增大与被粘结材料的接触面积;可以使更多的极性基团暴露,形成更多的具有粘性的极性基团。实验结果表明:在40℃、p H为12条件下,大豆蛋白具有最好的粘结强度。用作粘合剂的大豆蛋白要求至少有97%的粒径小于325目。蛋白微粒的表面不能太粗糙也不能太光滑,否则粘合效果都不好,因此国内外通过物理、化学等方式改性,改变大豆蛋白的二级,三级和四级结构和蛋白构象从而提高其在粘合剂方面的性能的研究目前比较多见[3]。通常用于变性的方法包括:物理变性(如湿热、干热、冷冻、超声、辐射、高压等手段),化学改性(酸、碱、接枝交联、共混等),暴露于有机溶剂,表面活性剂和脲中,加入贝类蛋白质以及酶法改性等。随着科学技术的发展和分析手段的进步,从微观层次对大豆胶粘剂进行改性分析,并对其结构变化进行设计将能克服目前大豆蛋白胶粘剂难以解决的耐水性差、胶接强度低、抗生物降解能力弱、贮存期短等缺点。

美国杜邦公司早在1930年就研制了大豆蛋白脲醛树脂胶黏剂,但由于黏结强度弱,成本高和耐水性低等问题使其未能广泛使用。美国Du Pont公司在2000年收购了PTI公司,成立的Soy Polymer公司,专门研制非食品用途植物蛋白化工产品。该公司2001年研制成功的Pro-Cote大豆聚合物是一种特别设计的多功能化学改性大豆分离蛋白,可用于涂料、胶合板的粘接等许多领域。Graham等人用水解大豆蛋白或改性的大豆分离蛋白,所得大豆蛋白胶黏剂用于纸张涂布,此胶黏剂是热敏性的,尤其适合铸涂。Hettiarachchy等人用碱改性大豆蛋白(AMSP)和胰蛋白酶改性大豆蛋白(TMSP),发现两种方法改性的大豆蛋白胶的粘接强度和耐水性均比未改性前有明显提高。Kumar等则利用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶等改性大豆分离蛋白(SPI),能显著提高SPI耐水性。Cheng等人研究发现当同时采用尿素、正丁基硫代磷酰三胺、柠檬酸、磷酸二氢钠、硼酸和Na OH等多种试剂进行蛋白改性时,改性修饰后大豆蛋白胶压制的麦秸刨花板获得了最大的力学强度和耐水性,线性膨胀率降到1%[4]。Linda等用酚醛对SPI进行改性,同时调节反应p H为9~12,改性后SPI其粘结性能也有所提高[5]。另外,有机溶剂、表面活性剂、等物质也能相应提高大豆蛋白的黏度和抗水性。

综观国内外大豆蛋白胶黏剂的研究,虽说大豆蛋白改性已经取得一定的成果,但还存在诸多问题,如各改性方法对大豆蛋白的微观结构和分子相互作用机理还不明确,外界因素对大豆蛋白改性分子伸展的影响及其与宏观黏结特性指标的关系尚未阐明;胶黏剂的黏结强度性能指标虽已基本达到实用要求,但其耐水性和实用要求仍有较大的差距,更有效改性方法还有待探索与研究。随着大豆蛋白改性机理研究的深入和改性技术的发展,大豆蛋白基环境友好胶黏剂必将会有广阔的发展前景。

2 大豆蛋白膜的应用研究

在包装材料中,合成薄膜由于其带来的全球性白色污染日益显著,以天然生物材料制成的包装膜逐渐成为科学家的研究首选。大豆蛋白中存在大量的氢键、疏水相互作用、离子键等,使得大豆蛋白具有很好的成膜性,所制成的膜具有良好阻隔性能和机械强度,且具有较好的生物相容性和生物降解性,因此大豆蛋白膜在食品包装及可降解生物材料领域具有很大的应用潜力。

我国是一个农业大国,加大可再生资源的研究利用,增加农产品的附加值尤为重要。蛋白质作为一种可再生、可生物降解天然高分子,越来越多的应用在食品包装、组织工程、环境友好材料以及新型复合材料方面[6]。目前正在研究的天然蛋白质中,大豆蛋白质由于其来源广泛,价格低廉的特点而受到广泛关注。利用现有高分子加工设备,通过物理、化学、生物等方法对蛋白质进行改性,制备出一系列具有优良性能的新型环保型材料,已成为当今生物降解高分子领域的研究热点之一。

蛋白质作为生物材料可追溯到1930年。大豆蛋白膜的吸引力在于其透气性低,机械性能强和营养价值高。如大豆分离蛋白膜的透氧性比低密度PE膜、甲基纤维素膜、淀粉和果胶膜分别低500、260、540、670倍;蛋白质分子的交联作用强烈,膜的机械特性优于多糖和脂肪膜[7]。通常制备大豆蛋白质生物材料的方法是热压、挤出、共混改性或流延成膜等。大豆蛋白质材料具有良好的降解性能。但其脆性和水敏感性限制了他们的应用[8]。大豆蛋白膜的成膜方法主要可分为湿法和干法两种。湿法成膜是通过化学或物理改性将大豆蛋白分散于某溶剂中,采用溶液浇铸或涂布的方式分布在物体的表面,随着溶剂挥发,大豆蛋白分子重新定向排列,得到结构稳定的膜材。干法成膜是采用增塑剂如甘油等小分子对大豆蛋白进行增塑,然后采用热压或滚轴碾磨的方法将大豆蛋白制成膜材。蛋白质的适度变性是成膜的先决条件,通过处理方法不同,蛋白内部相互作用改变形成不同的立体网络结构,网络结构的好坏直接影响膜的性能,在合适的条件下就可以得到具有一定强度和阻隔性的膜。大豆蛋白膜制备工艺是:大豆蛋白适度变性→成膜溶液→加热→倒膜→干燥→揭膜。一般是采用水或乙醇:水=1:4(w/w)的混合物作溶剂配置成膜溶液。成膜工艺如温度、p H、增塑剂、还原剂、交联剂等助剂的用量等会显著影响膜的特性。因此,在大豆蛋白成膜的过程中,常用调节增塑剂种类或用量、调节体系温度和p H、物理和化学改性以及共混改性的方法改善大豆蛋白膜结构和性能。

3 大豆蛋白塑料的研究

早在20世纪初科学家就开始研究大豆蛋白塑料,1913年法国和英国分别申请了大豆蛋白制备半塑料材料的专利。1930年福特和他的团队在Boyer R的领导下,开发了一种添加大豆粉的酚醛树脂塑料,用于汽车部件。二次世界大战后,石油价格下降,石化产品占领了塑料市场,大豆蛋白塑料的研究跌入低谷,上世纪90年代,随着石油资源日趋枯竭、废塑料的污染成为世界关注的问题,以大豆蛋白为原料,可完全生物降解绿色塑料的研发重新活跃起来。

从高分子角度看,蛋白质被认为是无定型的或部分结晶的玻璃态或高弹态物质,不适合做塑料。为改进大豆蛋白质塑料的加工性能并兼顾材料力学性能需对其进行增塑改性,包括水、丙三醇、乙二醇和丙烯二醇等多羟基醇,糖类也是很好的增塑剂,糖类会使材料有更高的玻璃化转变温度和更高的硬度。其它增塑剂如甘油的单乙酸酯、双乙酸酯、三乙酸酯、尿素、山梨醇等主要表现在使材料的断裂伸长率提高,拉伸强度和杨氏模量降低。为降低大豆蛋白塑料的吸水性能而需对其进行酸调(使用盐酸、醋酸、丙酸、磷酸和柠檬酸等)、交联(交联剂:甲醛、乙二醛、二价阳离子的盐硫酸锌)和填充(聚磷酸盐、硅烷偶联剂、淀粉和纤维素等)改性。

目前大豆蛋白塑料主要的问题是与传统塑料比抗水性差,另外,机械性能和加工性能难以满足工业化生产和加工要求,且大豆蛋白塑料的力学性能及体积稳定性受加工条件和助剂的影响很大,尤其是大豆蛋白塑料在加工过程中容易热分解,很难作为热塑性塑料应用。面对环境和资源问题,可再生资源为原料的生物降解塑料存在着广阔的市场前景。

4 纺织用大豆蛋白纤维

大豆蛋白纤维是一种再生植物蛋白纤维,从大豆中提炼出来的蛋白质溶解液经湿法纺丝而成,称为新世纪的“生态纺织纤维”[9]。利用可再生资源大豆替代羊绒或化学纤维,避免了对草原植被的毁坏,改变了对石油资源的依赖和对环境的污染。

早在20世纪40年代,美国和英国就进行了大豆蛋白纤维的研究。1938年日本油脂公司开发了以大豆为原料的纤维;1945年美国和日本研究了大豆蛋白纤维,美国商品名为Soylon,吸水率为11%左右。我国在大豆蛋白纤维研究方面具有世界领先水平,从20世纪90年代开始,由河南省濮阳华康化学生物工程联合集团公司李冠岐等耗资6 000多万元,开发研究大豆蛋白纤维,率先获得成功。2000年3月由河南省遂平华康生物工程有限公司在国际上率先进行工业化实验并成功实现工业化生产[10]。

大豆蛋白纤维是以豆粕为原料,利用生物工程技术提取球蛋白并提纯,提纯的球蛋白经改性改变空间结构,与聚乙烯醇接枝、共聚共混形成纺丝溶液,经熟成后用湿法纺丝工艺纺成单丝0.9~3.0dtex的丝束,通过醛化稳定纤维的性能,再经过牵伸、卷曲、热定型、切断等工序生产出各种长度规格的大豆蛋白短纤维[11]。工艺流程:豆粕水浸→分离→沉淀→水洗→再次沉淀→甩干→溶解→过滤→接枝→二次接枝→熟成→过滤→贮存→过→脱泡→过滤→纺丝→脱水→湿牵伸→浴牵伸→烘干→预热→热定型→冷却→集束→致密→水洗→上油→烘干→卷曲→热定型→切断→打包→入库。

大豆蛋白纤维具有天然纤维和合成纤维的优点,不仅轻、薄、强度高、易于染色、舒适透气,而且手感柔软,有丝般柔和的光泽,有棉纤维的吸湿导热性和羊毛的保暖性等优良性能,而且大豆蛋白纤维与人体皮肤亲和性好,含有多种人体所必须的氨基酸,具有良好的保健作用。同时,大豆蛋白纤维还可与其它天然纤维如毛、丝、棉和化学纤维如改性涤纶、粘胶、人丝、莫黛尔等进行混纺、交织,形成各种独特风格的织物,目前市场上已有各种高档针织内、外衣、衬衫和家用纺织品面料销售[12]。大豆蛋白纤维来自于可再生资源,无污染,且提纯蛋白后留下的残渣还可以作为饲料。因而,对大豆蛋白纤维的开发有利于资源的综合利用,提高农副产品的附加值,大豆蛋白纤维是21世纪的绿色环保新纤维,具有广阔的市场前景。

5 大豆蛋白生物医用材料

在生物医学领域,大豆蛋白一直被视为营养保健物质。研究表明大豆蛋白在胃肠道保养、缓解慢性肾病、预防和治疗骨质疏松症及癌症等医学领域具有重要的价值。近年来,大豆蛋白作为制备生物医用材料的原料备受关注。[13]Vaz等研究了经过明胶、酪素及酪素盐等经交联、热处理和紫外辐射处理后的大豆蛋白材料性能。结果显示,改性后的大豆蛋白材料能满足生物医用材料所需的良好生物相容性。大豆蛋白与热稳定性较好的药物混合物经挤出后注塑成型,制备出具有缓释作用的复合物,可用于药物控制释放系统。[14]Song采用氧化海藻酸钠(ADA)对SPI进行化学交联改性,制备的水凝胶经模拟人体胃肠道,考察了其对5-ASA的释放规律,发现药物的释放率在酸性条件下要比中性条件低。

6 结束语

大豆抗原蛋白研究 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年3月~2009年3月在我院行根治性放疗食管鳞状细胞癌(ESCC)患者72例,其中,男54例,女18例;年龄46~83岁,中位年龄63岁;原发肿瘤部位:胸上段15例,胸中段46例,胸下段11例。根据放疗前影像学检查结果,依照我国《非手术治疗食管癌的临床分期标准(草案)》[4]分期:其中,Ⅰ期8例,Ⅱ期37例,Ⅲ期27例。入组条件符合以下标准:经胃镜病理检查确诊;均为初治患者;无放疗禁忌证;无远处转移;KPS评分≥70分;预计生存期≥3个月;实验室检查主要指标无异常。所有患者采用6 MV-X射线,2.0 Gy次,5次/周,总剂量60~70 Gy,分30~35次完成放疗计划。放疗结束后采用RECIST实体瘤疗效标准进行评价[5],分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD),有效率=[(CR+PR)/总例数]×100%。

1.2 试剂与仪器

淋巴细胞分离液购自上海华精生物科技公司;Trizol细胞裂解液购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒和DNA Marker购自Takara公司;基因引物由上海英骏生物技术公司合成;梯度PCR仪和分光光度计为Eppendorf公司产品;凝胶电泳成像系统为上海培清科技有限公司产品。CEA蛋白水平来自我院核医学科检查报告(≥3.5μg/L为阳性结果),测定仪器为Roche Diagnostics全自动免疫分析仪。

1.3 标本处理及RNA提取

放疗前及放疗结束两周内留取外周血10 ml(EDTA抗凝),采用淋巴细胞分离液分离单核细胞,生理盐水洗涤后置于-80℃冰箱备用。同期收集20例食管良性疾病患者外周血及10例食管癌术后组织标本作为对照。采用Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA,无RNA酶的DNase去除混杂的DNA,紫外分光光度计定量。

1.4 巢式RT-PCR

取1~2μg总RNA,70℃5 min预变性后,依试剂盒说明进行cDNA合成。继而取4μl cDNA行第1轮PCR扩增,取第1轮PCR产物0.5μl行第2轮PCR扩增。PCR反应体系包括10×PCR buffer 2.5μl(含Mg2+,终浓度在1.5 mmol/L),dNTP mixture 2.5μl(终浓度250μM/L),上下游引物各2μl(20 pmol),Taq酶0.15μl,灭菌去离子水补足至25μl。引物序列及反应条件参见文献[6]。取第2轮PCR扩增产物5μl行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,率的比较采取χ2检验或Fisher确切概率法,诊断效能通过受试者特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗前CEA mRNA、蛋白表达

CEA mRNA检测典型PCR结果如图1所示。72例食管癌患者中,放疗前CEA mRNA阳性者为34例(47.2%,敏感性),血清CEA蛋白升高者为16例(22.2%,敏感性);而20例食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性者为0例(100%,特异性),CEA蛋白升高者为2例(90%,特异性)。10例食管癌术后组织标本CEA mRNA表达均为阳性。CEA mRNA与CEA蛋白诊断食管癌的Youden指数(Youden指数是将灵敏度与特异度综合起来评价某种检查方法的真实性的指标,指数范围为0~1,Youden指数越大,真实性越大)分别为0.472与0.122,ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.736与0.561(图2),可见CEA mRNA的诊断效能显著优于血清CEA蛋白。

2.2 CEA mRNA、蛋白表达的临床病理联系

放疗前CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046),与年龄、性别、肿瘤位置、病变长度、分期等因素无关;而血清CEA蛋白水平升高与食管癌临床病理特征均无关。见表1。

2.3 CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效的关系

放疗结束后评价,CR 8例,PR 39例,SD 20例,PD 5例,放疗前CEA mRNA、蛋白水平与放疗有效率无关,而放疗后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关,CEA mRNA由阳性转阴或血清CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好。见表2。

3 讨论

放射治疗是食管癌治疗的主要手段之一,由于食管的组织结构和自身生物学等方面的特点,相当一部分食管癌患者不宜手术或不愿手术而接受放射治疗。但多年来食管癌的放射治疗效果尚不理想,5年生存率不足10%,失败原因主要是局部未控或复发[7],而肿瘤微转移可能在其中起到关键作用。因此,若能及时监测循环肿瘤细胞(CTC),将对食管癌早期诊断及指导临床治疗具有重要价值[2]。由于受到人体免疫系统的清除,存活的CTC数量极少,对检测方法要求较高。RT-PCR技术具有高度灵敏性,可鉴别106~107个正常细胞中的一个肿瘤细胞,是目前最常用的方法[8]。

注:CEA蛋白阳性、阴性分别指≥3.5μg/L与<3.5μg/L

血清CEA是食管癌常用的肿瘤标记物之一,但一直存在敏感性低、特异性差的问题。近年来,以CEA mRNA为标记的CTC检测则展示出较好的前景,在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等多种恶性肿瘤中得到广泛应用[3]。如Qiu等[9]报道,103例胃癌外周血CEA mRNA阳性占36.6%,CEA mRNA表达与肿瘤浸润深度和术后复发有关,并且,CEA mRNA比血清CEA蛋白在预测复发方面具有更好的敏感性。Ishigami等[10]则发现,胃癌外周血CEA mRNA拷贝数而非阳性率与术后复发有关。在食管癌中,Nakashima等[11]报道,外周血CEA mRNA阳性占57.4%(31/54),且CEA mRNA阳性与淋巴结转移、肿瘤分期和术后复发有关,而血清CEA水平与之无关。Liu等[12]应用realtime PCR检测食管癌术前1 d(B-1)、手术当天(B0)和术后3 d(B+3)外周血中以CEA mRNA为标记的CTC数目,发现B-1与B0,B-1与B+3间均有统计学差异,且B+3/B0>0.4预示较高的转移风险;Tanaka等[13]也发现以CEA mRNA和鳞状细胞相关抗原(SCC)mRNA为标记的鳞状细胞癌相关抗原(CTC)是食管癌术后无进展生存的独立预后指标。上述结果都证实外周血CEA mRNA检测在食管癌中的应用价值。

本研究结果表明,食管癌根治性放疗前外周血CEA mRNA阳性与CEA蛋白升高者分别占47.2%(34/72)与22.2%(16/72),而食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性与CEA蛋白升高者分别为0与10.0%(2/20),CEA mRNA的诊断效能显著优于CEA蛋白。且CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046),CEA蛋白升高与食管癌临床病理特征无关,提示以CEA mRNA为标记的CTC在食管癌预后中的潜在价值。同时,笔者发现放疗前后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关,CEA mRNA由阳性转阴或CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好,推测是由于放疗有效地减少肿瘤负荷,从而停止释放癌细胞及癌相关抗原入血。

大豆分离蛋白喷雾干燥的试验研究 篇8

从植物中制成的蛋白质可以补充动物性蛋白质的不足。大豆中含有丰富的蛋白质, 从榨出油后的豆粕中可以制造大豆分离蛋白和浓缩蛋白两种产品。大豆分离蛋白指干基蛋白质含量≥90% 的粉状大豆制品[1]。

目前, 大豆分离蛋白已被应用于食品体系中, 如面包、饮料等。其干燥过程是生产大豆分离蛋白粉末必经环节。喷雾干燥、喷雾造粒组合干燥、喷雾流化床组合干燥、冷冻干燥、箱式干燥和真空干燥是食品干燥的主要方法, 但生产大豆分离蛋白最常用的是喷雾干燥。

1工艺流程

喷雾干燥是利用雾化器将悬浮液、乳浊液、溶液和浆状物料分散成液滴, 依靠热空气、过热蒸汽、氮气等干燥介质与雾滴进行热质交换, 使溶剂迅速蒸发而获得颗粒状、粉状等形状的一种干燥方法。一个完整的喷雾干燥由3个基本过程阶段组成: 原料分散为液滴; 液滴与干燥介质进行干燥; 干燥产品与空气分离。

喷雾干燥具有干燥速度快、产品性质稳定、干燥工艺控制灵活、产品纯度高、效率高、可连续化、操作灵活等优点。喷雾干燥获得产品达数百种, 其干燥的流程也是多种多样的。实验采用开放式系统, 喷雾干燥工艺流程如图1所示。其特征是喷雾的料液全部是水溶液, 干燥介质是来自大气的空气; 空气和原料通过干燥塔后, 干燥后的粉末随气体进入旋风分离器, 粉末落入粉体收集器内, 气体排放到大气中。

2试验方案

2. 1试验仪器

试验仪器有卤素水分测定仪、分析天平、有架盘天平和消化炉等仪器。型号、生产厂商及规格如下:

1) 卤素水分测定仪: HG63, 上海绽兴实业有限公司, 瑞士;

2) 分析天平: FA1004, 上海上平仪器有限公司, 量程为0 ~ 100g, 精度为0. 1mg;

3) 有架盘天平: JYT - 1型, 上海医用激光仪器厂, 量程为0 ~ 100g, 精度为0. 1g;

4) 消化炉: 上海晟声自动化分析仪器有限公司;

5) 标准检验筛: GB / T6003. 1 - 1997, 浙江省上虞市沪江仪器纱筛厂。

2. 2试验地点及气候条件

试验地点: 山东省东营市垦利县。

气候条件: 气温18 ~ 27℃ ; 南风3 ~ 4级。

2. 3试验过程

2.3.1含水量

含水量是检验干燥产品好坏的一项重要指标, 产品的含水量关系到蛋白粉的稳定性、储存条件和保质期。因此, 含水量是大豆分离蛋白在生产过程中严格控制的指标之一。在进风温度一定的条件下, 用水分测定仪分别测量干燥产品在排风温度为50, 60, 70, 80℃ 下的含水量, 对同一排风温度下的同种样品进行3次测量。在分析天平上称取10g产品, 将产品放入卤素水分测定仪中测量大豆分离蛋白的含水量; 时间为30min, 测量温度定为105℃ , 3次测量的平均值取为产品含水量。

2. 3. 2颗粒粒度

颗粒粒度关系着大豆分离蛋白产品的性质和用途, 试验采用筛分法测量粉末粒度的大小, 试验步骤如下:

1) 样品准备。通过圆锥分割法将样品分成4等份, 准确称取100g样品。

2) 将标准筛根据孔径大小依次叠好, 并且装上筛底。

3) 均匀摇动标准筛频率为120次/ min, 每25次将标准筛旋转1 /8圈, 直至筛分终点。

4) 取出样品, 分别记录每个筛子和底盘中样品的质量。

2. 3. 3蛋白质含量分析

蛋白质含量采用凯氏定氮法测量, 对同一样品进行测量3次, 取平均值作为最终的蛋白质含量。在定氮试验开始前, 首先要对样品进行非蛋白氮的干扰性处理。将在分析天平上量取的0. 2g大豆分离蛋白粉末, 小心无损地放入离心管中, 加入6. 2g催化剂和20m L硫酸, 在消化炉中消化120min。在凯式定氮仪上蒸馏6min, 溜出液瓶有紫变绿时保持6min, 将盐酸液滴入溜出液, 一直到颜色变为淡粉红色为止。通过HCI消耗量, 计算蛋白质含量为

式中Wp—蛋白质的质量分数 ( % ) ;

d—盐酸的浓度 ( mol / L) ;

V0—空白的盐酸体积 (mL) ;

V1—盐酸的起始体积 (mL) ;

V2—盐酸的终了体积 (mL) ;

14—氮的相对分子质量;

5. 71—换算系数;

M—样品质量 ( g) 。

3试验结果分析

3. 1含水量结果

产品越干燥, 蛋白粉末含水量月低, 产品在储藏时质量会越稳定。试验中排风温度与粉末含水量的关系如图2所示。

大豆分离蛋白由恒速干燥阶段转入降速干燥阶段时, 排风温度越高, 气体与颗粒间的温差越大, 水分就越容易从颗粒中传递并被蒸发出来。排风温度对大豆分离蛋白的含水量有较大影响, 产品的含水分随着排风温度上升而下降。

3. 2颗粒粒度结果

颗粒粒度是颗粒状、粉状产品最重要的特性之一。颗粒粒度可以采用累积分布等方法来表示。筛分测量数据如表1所示, 筛下累积分布与多项式如图3所示。

3. 3蛋白质结果

对8个样品测得的蛋白质含量如图4所示。

由于蛋白质对温度具有一定的敏感性, 使得大豆分离蛋白中的蛋白质含量有所损减少, 其损失量随着温度的升高而升高。

3. 4进风温度对挂壁的影响

进风温度是喷雾干燥加工大豆分离蛋白粉时热量的主要来源, 雾滴在喷雾干燥室内干燥完全就需要有足够高的温度以提供热量, 但并不是温度越高越好。

进风温度低时, 粒径大的雾滴在干燥室内不能完全进行干燥, 雾滴接触到干燥室四周而粘壁, 此时蛋白粉在塔壁上越积越多; 进风温度高时, 雾滴被完全干燥, 随着温度的不断升高, 发生焦糖化反应的可能性也越大。因此, 进风温度不易太高或者太低。

4结束语

通过实验得到的较优大豆分离蛋白喷雾干燥工艺条件为进风温度155 ~ 165℃ 、出风温度70 ~ 75℃ 、鼓风机电流150 ~ 160A、引风机电流465 ~ 475A、高压泵电流148 ~ 152A、高压泵压力27 ~ 30MPa。

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大豆抗原蛋白研究 篇9

本试验用大豆分离蛋白作为底物, 以中性蛋白酶在不同的条件下微波加热酶解, 测定酶解液中氨基氮含量来判断其水解程度, 通过单因素和正交试验, 确定筛选中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳条件, 为工业化生产大豆多肽提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白 (食品级) , 湖北远成药业有限公司;中性蛋白酶 (食品级) , 武汉嘉发胶原蛋白生物有限公司;所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大豆分离蛋白预处理

大豆分离蛋白分子有极致密的结构, 对酶水解具有很强的抵抗力, 采用预处理使蛋白质大分子变性降解, 结构展开, 增加蛋白酶作用位点, 缩短后处理工艺时间。有试验证明:在85℃下加热15min, 可防止大豆蛋白溶液黏度升高, 大大提高酶解程度。

1.2.2 酶水解试验

称取2.0g大豆分离蛋白, 溶于50mL水中, 经预处理后冷却到酶解反应所需温度, 用稀NaOH调节pH值, 加入适量中性蛋白酶酶解, 保持温度、pH值恒定, 微波加热具有穿透力, 使蛋白质结构松散、伸展, 加速水解。反应结束后, 沸水浴中加热15min灭酶, 冷却并于4 000r/min的速度离心15min, 移取上清液0.5mL于50mL容量瓶中定容, 进行酶解分析。

1.2.3 酶解效率测定

用乙酰丙酮和甲醛荧光法测定酶解液中氨基氮含量 (ANC) 来判断其水解程度, 筛选出中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳试验条件。

2 结果与分析

2.1 温度对氨基氮含量的影响

样品预处理后, 调节溶液pH值7.5, 加入中性蛋白酶10%, 分别在40、45、50、55和60℃, 按照酶水解试验方法酶解16min, 取样测其氨基氮含量, 由表1可知:中性蛋白酶水解的最适温度为50℃。

2.2 pH值对氨基氮含量的影响

在最适温度50℃的条件下, 选取pH值为6.5、7.0、7.5、8.0和8.5, 其他条件不变, 进行酶水解试验, 由表2可知:中性蛋白酶最佳pH值为7.0。

2.3 酶用量对氨基氮含量的影响

在最适温度50℃和pH值7.0条件下, 固定其他条件, 选取酶用量 (酶与底物质量比值) 6%、8%、10%、12%和14%进行酶水解, 在底物浓度一定时, 酶用量越大, 酶催化位点与蛋白分子相应位点接触几率越多, 当位点接近断裂完全时, 继续加酶, 肽健断裂数目增加很缓慢。由表3可知:中性蛋白酶的最佳用量为12%。

2.4 底物浓度对氨基氮含量的影响

在最适温度50℃和pH值为7.0, 酶用量12%条件下, 配制底物浓度 (固液比) 为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30系列溶液, 其他条件不变。由表4可知:中性蛋白酶水解最适底物浓度是5% (S/L 1∶20) 。

2.5 微波作用时间对氨基氮含量的影响

在最适温度50℃和pH值7.0, 酶用量12%, 底物浓度5%条件下, 其他条件不变, 分别在微波中水解8、12、16、20、24和28min。微波具有穿透力, 通过强烈高频作用, 直接作用于蛋白分子或基团, 破坏起稳定作用的物理化学键, 使蛋白质的复杂结构变得松散、伸展, 利于蛋白酶的作用, 加快水解。水解时间长, 效果好, 但一定时间后, 因底物浓度下降和产物浓度升高, 逆反应增加, 递增变缓。由表5可知:中性蛋白酶水解最佳作用时间选为20min。

经单因素试验分析得到中性蛋白酶的最适水解工艺条件:温度50℃、pH值7.0、酶用量为12%、底物浓度5%和酶解时间为20min, 此时氨基氮含量为42.98mmol/L。

2.6 优化碱性蛋白酶酶解条件的正交试验

在单因素试验基础上, 采用了L9 (34) 正交试验, 研究底物浓度、酶用量、反应温度和pH值为4个主要因素对水解的影响, 酶解时间为20min, 试验结果见表6。

由表6可知:各因素对碱性蛋白酶的影响, 其影响效果为酶用量>温度>底物浓度>pH值, 酶用量为此反应的关键, 综合单因素和正交试验的结果, 中性蛋白酶的最适水解工艺条件:温度50℃、pH值为7.0、酶用量12%、底物浓度5%和酶解时间20min, 此时氨基氮含量为42.98mmol/L。

3 结论

用大豆分离蛋白作为底物, 以碱性蛋白酶在不同的条件下酶解, 通过单因素和正交试验, 确定筛选碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最适条件:温度50℃、pH值为7.0、酶用量为12%、底物浓度5%和酶解时间20min, 为工业化生产大豆多肽提供一定的理论依据。

摘要：中性蛋白酶酶解大豆分离蛋白, 利用微波法缩短水解时间, 测定酶解液中氨基氮的含量判断酶解效率。通过单因素和优化酶解条件正交试验, 分析酶用量、pH值、底物浓度、温度和反应时间对酶解的影响, 筛选出中性蛋白酶的最适酶解条件:在温度50℃、pH值7.0、酶用量12%、底物浓度5%和酶解时间20min, 氨基氮含量为42.98mmol/L。

关键词：大豆分离蛋白,中性蛋白酶,酶解,氨基氮含量

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