表达系统（共11篇）
表达系统 篇1
在畜牧业和人类医学领域, 抗生素的乱用、滥用及细菌的抗性, 对动物与人类的危害很大。安全无害的抗菌制剂越来越受到科学工作者的重视。抗菌肽这类具有抗菌活性的小分子多肽, 最初来源于生物体的先天免疫成分, 因其多样性、安全性被寄希望成为抗生素的替代物。生物工程化是生产抗菌肽的有效途径之一。对于抗菌肽的生物表达, 人们更倾向于选择高产的、能进行胞外表达的表达系统, 而且表达分泌的产物以目的蛋白为主, 目的蛋白对宿主菌没有抑制作用, 分泌出的外源蛋白容易实现与工程菌分离, 毕赤酵母表达系统无疑具有这样的潜质。自J.M.Cregg等人首次用毕赤酵母 (Pichia pastoris) 表达外源蛋白开始, 一些外源蛋白在毕赤酵母中的表达产量已超过10 g/L级水平, 而在毕赤酵母中成功表达的抗菌肽的表达量超过1 g/L级水平的很少。自21世纪以来, 抗菌肽在毕赤酵母中表达的研究日渐增多, 毕赤酵母表达系统的功能也越来越强, 本文就此对抗菌肽在毕赤酵母系统表达的一些相关影响因素及研究结果进行分析总结, 以期更多了解已有的酵母系统与抗菌肽表达的经验, 为未来抗菌肽的规模化、高效化生产提供依据。
1 酵母载体及其关键元件
1.1 载体类型
载体主要是由启动子、终止子、外源基因克隆位点、选择标记、报告基因和复制起点等基本元件构成。在毕赤酵母系统表达抗菌肽, 选用最多的载体有p PIC9、p HIL-D2、p PIC9K等p PICα系和p GAPZα系载体, 这些载体共同特点是均为组成型载体, 可进行分泌型表达。抗菌肽的胞内毕赤酵母表达较少, 有一例是由绵羊生殖道抗菌肽胞内表达载体p PIC3.5K-ORTAP4构建的[1]。p PIC系是开发较早的载体组, 其中使用最多的是p PIC9K载体, 含强有力的启动子AOX1, 且能快速筛选高拷贝整合转化株, 属于表达外源蛋白最高的载体系列。L.Li等[2]构建了p PIC9K-Ch-penaeidin载体, 抗菌肽产量达到100 mg/L。Z.Chen等[3]表达的新型抗菌肽也用p PIC9K构建了p PIC9K-h PAB-β多拷贝表达载体, 分子质量为6.1 ku, 抗菌肽表达量为 (241.2±29.5) mg/L。后来出现的具有兼容通道的表达载体p PICαA、B、C系也很适用, 有一些抗菌肽的表达就是用此系载体成功构建的, 如p PICαA-Cecropin B、p PICZαC-PR、环状抗菌肽p PICZa C-Cyclopsychotride、p PICZαA-plectasin等, 抗菌肽表达浓度分别为487μg/L、284 mg/L、245 mg/L和150 mg/L。
尽管肽链结构的复杂性不同, 经过合理设计还是能成功表达的, 但表达量差别比较大。载体p GAPZα系统是H.R.Waterham等人于1997年克隆的, 构成的载体多为组成型, 最初是将GAP启动子目的基因插到含启动子载体 (如p HWO10) 的多克隆位点上构建的载体, 然后转到酵母基因里进行组成型载体表达;后来可以以质粒为模板, 将GAP启动子的基因片段扩增, 以PIC系载体上的AOX1启动子替代GAP。由于启动子不再需要甲醇启动表达, 尽管现在获得高表达量的载体还需要摸索, 用p GAPZα表达抗菌肽将会更容易实现工程化。最近抗菌肽成功表达的研究有K.H.Hsu等[4]构建的p GAPZαA-HD5、孟硕[5]用p GAPZαA构建的OncorhyncinⅡ载体、C.Guo等[6]构建的p GAPZαA-Cecropin D载体, 其表达量不及p PICα系高, 但也有扩大应用面的可能, 如在饲料和食品发酵方面的应用。
1.1.1 载体中的启动子
启动子可在转录水平上调控基因表达, AOX1、GAP、FLD1、PEX8、YPT1启动子是毕赤酵母表达载体中的常见类型, 但以AOX1、GAP型在抗菌肽表达上应用最多。
1) AOX启动子。AOX是醇氧化酶启动子, AOX严格依赖甲醇启动。目前, 有AOX1和AOX2两种类型, 以AOX1应用较多, 其形成的载体多为PIC系。AOX1的分子质量为960 u, 调控的表达量可达到细胞可溶性蛋白总量的30%以上, 当有其他醇类 (如乙醇) 时AOX也表达, 产量也很高。因此, AOX形成的毕赤酵母体系也较多。作为研究抗菌肽的工具, 由AOX1启动子组成的载体具有可操作性强、方便、高产、高效等特征。周玉珍[7]调控猪小肠抗菌肽cecropin P1基因的表达, 以及张素芳等[8]杂合抗菌肽Cec A-mil的高效表达, 构建的载体均使用AOX1启动子, 从研究的角度满足了AOX1表达需要的条件, 容易获得所追求的目的蛋白。但是, AOX1表达需要甲醇作为唯一诱导碳源, 这给工程发酵系统的稳定性和安全性带来局限, 无论生产外源蛋白 (抗菌肽) , 还是生产活性菌都有局限因素存在。
2) GAP启动子。GAP启动子为三磷酸甘油醛脱氢酶启动子, 三磷酸甘油醛脱氢酶最早是从面包酵母中分离出来的, 后来发现很多生物都有GAP, 但不同生物源的GAP分子质量不同, 调控功能不同。在生物工程领域中应用的GAP启动子, 最大优势就是使用甘油或葡萄糖作为启动碳源, 具有安全性、可操作性。而且GAP分子质量较小, 为477 u, 增大了毕赤酵母表达载体进行表达盒设计的空间, 为小分子抗菌肽的高通量表达提供了潜在空间。而且GAP启动表达的条件不再是难以控制的甲醇诱导, 从某种意义来说是放宽了工程化条件, 明显扩大了应用优势。据报道, GAP可以缩短发酵周期, 是另一个提高抗菌肽表达生产效率的因素[9]。目前, GAP生产可以用酶切的方法从载体上获得, 再将其亚克隆到另一表达载体上进行表达。
3) FLD1启动子。1998年, S.Shen等人发现了一种新型的谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶基因启动子, 已成型的序列分子质量达597 u。FLD1易在以甲醇和硫酸铵为唯一碳氮源, 或葡萄糖和甲胺为唯一碳氮源时被强烈诱导时, 表达水平与AOX1启动子功能相当。受甲基诱导时, 特别是用甲醇和甲胺共存诱导时, 表达水平比甲醇和硫酸铵共存诱导更高效, 也就是有可能超过AOX启动子的诱导表达水平。因此, FLD1在抗菌肽的表达方面可能具有潜在优势。但在我国, 抗菌肽表达研究中还未见到使用该启动子系统的例子, 可能的原因是为避免对甲基的依赖。
1.1.2 信号肽的选择和改造
在分泌型表达系统中, 信号肽是重要的标志之一。利用信号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来的困难。信号肽位于分泌蛋白的N端, 它对外源蛋白的分泌起主导作用。选择合适的信号肽对外源蛋白表达量的提高有重要作用。一般抗菌肽在毕赤酵母中表达, 偏爱使用载体中已有的信号肽, 可获得较高的蛋白表达量。目前, 毕赤酵母系统应用于抗菌肽表达的多为α因子, α因子含有83个氨基酸残基的前导肽, 跟其后面的是一段由Lys-Arg (Glu-Ala) 或其他氨基酸序列组成的间隔肽。由于α因子对引导小分子质量蛋白的分泌尤其有效, 不仅可减轻宿主细胞的代谢负荷, 还可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解, 能很好地达到高效要求[10]。据报道, 一般信号肽的专一性不是很强, 人们在设计蛋白时为了提高蛋白的表达量, 常常在原来序列基础上进行适当改变, 以提高蛋白分泌量。如S.Singh等[11]通过启动子和目的基因连接处寡核苷酸定向缺失诱变导致了含有N天然端的成熟目的蛋白的释放。大多数天然抗菌肽都有自己的信号肽, 但是完全用原来的信号肽构建表达载体的情况, 目前不是多见。对α因子序列做一些改良应该对表达效率的提高有益。Z.Chen等[3]表达抗菌肽h PAB-β时, 对信号肽进行了融合设计, 结果抗菌肽产量达到241.2 mg/L。L.Li等[2]表达Ch-penaeidin时, 只在AOX1启动子下游的α因子框内插入1个片段, 结果产量达到108 mg/L。C.Guo等[6]克隆p GAPZαA-cecropin D表达时, 也在α因子位置插入1个与其相似的片段, 结果获得的表达量相对较高, 达到485.24 mg/L。这几种抗菌肽的分子质量都在4 000 u左右, 信号肽克隆时都做了一点改良, 改良的方式不同, 表达量差别很大。说明抗菌肽表达在α因子信号肽序列处进行适当改良, 可提高抗菌肽表达效率。
1.2 抗菌肽基因优化设计策略
1.2.1 毕赤酵母密码子偏爱性
毕赤酵母在对外源基因表达时, 密码子的设计要尽量避免稀有密码子和高含量AT碱基的出现, 按照宿主的偏爱性合理调整GC碱基含量, 尽量使碱基优化以达到高效表达。刘静[12]根据毕赤酵母偏爱密码子推导昆虫抗菌肽DCA的基因序列, 将其导入含有α因子信号肽和AOX1基因的载体p PIC9K中, 在宿主菌GS115中表达, 最终得到的总分泌蛋白含量为35.2%~57.2%。顾春华[13]和徐晓红[10]根据随机突变原理, 用含GAP启动子的表达载体实现了抗菌肽DCD-1L不同突变体在SMD1168菌株中的表达, 前者所得基因突变体库容量达104, 并筛选出活性更强的抗菌肽。但是, 密码子的偏爱性并不是恒定不变的。当采用SOEing PCR法获得目的基因时, 需考虑引物设计时的特异性。若选择大量低频率或对宿主有害 (如毒性) 的密码子, 蛋白表达量将会很低, 甚至不表达。因此, 在以密码子偏爱性为前提的情况下, 选择合适的优良密码子是获得抗菌肽基因高效表达的先决条件之一。
1.2.2 基因融合与抗菌肽序列优化
融合表达是指将外源蛋白基因与另一基因的3'端融合形成一个基因盒进行表达的方法, 这是当前基因工程生产中普遍采用的技术。在充分了解抗菌肽基因特性的前提下, 选择利于融合和表达的外源基因及穿梭质粒载体, 所获得的基因工程产品可能具有预测的双重效果, 更能满足人们的多种需要。如标签蛋白GST和His的使用, 在很大程度上改善了抗菌肽小、难以电泳分离识别的特性。而且将2个相同或不同的小分子抗菌肽序列一起设计到一个表达盒中进行融合表达, 可以提高抗菌性及抗菌肽产量, 也便于分离识别。将不同源且不同种的两个抗菌肽的抗菌功能较强的基因整合成一条抗菌肽, 这样的设计称为融合设计, 也被称为杂交设计, 属于抗菌肽序列的优化。该方法应用较多, 能很大程度上改善抗菌肽活性, 如王秀青等[14]选择天蚕素A (CA) N端的第1~7个氨基酸残基及马盖宁 (M) N端的第2~12个氨基酸残基构成一种新型的杂合抗菌肽, 其在毕赤酵母SMD1168菌株中的表达产物具有广谱抗菌活性、耐酸性及耐高温的特性。Q.Z.Yang等[15]用Lys逐步取代α螺旋结构表面的中性和酸性氨基酸残基, 并用Leu来替代疏水性较小的氨基酸, 进而增加或减少疏水性, 得到了具有更高生物学活性的新型temporin-1CEa抗菌肽基因。Y.G.Xie等[16]对原抗菌肽OG1进行氨基酸序列的删除和替换, 设计出的新型抗菌肽OG2具有更高的净正电荷、两亲性和更低的疏水性, 其表达结果显示了更低的细胞毒性和更高的抗菌活性, 为其进一步发展提供了方向。
1.2.3 串联表达
串联表达是将某些特定基因盒按照特定的顺序串联起来形成多个基因盒, 并进行共同表达的一种方法。与表达过程中获得多拷贝基因的方式不同, 串联表达是在外源基因设计初期就开始进行的。这一表达方式有利于解决某些基因表达量过低的问题。在最近几年里, 已经有抗菌肽基因通过串联表达方式在不同表达系统中成功表达的报道。在毕赤酵母中的串联表达, 达到3个表达盒。如王秀青等[17]将3个抗菌肽天蚕素B基因串联在一起表达, 每个单体前添加Kex2酶切位点, 在α因子信号肽的引导下, 表达产物具有明显的活性。刘延杰等[18]通过大肠杆菌表达Exendin-4的串联表达体, 成功获得了可溶性表达产物。李霞等[19]通过毕赤酵母表达兔防疫素基因的单基因、2个基因串联、3个基因串联, 其表达量依次为3.39, 6.39, 13.05 mg/L, 说明随着串联表达盒的增加, 表达量也会成倍增加。
1.2.4 基因剂量
基因剂量即拷贝数。在一般情况下, 一个拷贝的外源蛋白盒就能够获得最佳表达量。多拷贝表达是否为增加抗菌肽表达量最有效的策略, 是值得探究的。如果一旦实现多拷贝表达, 那就有可能大量表达目的蛋白, 而实现质粒具有固定的多拷贝数一直具有主观性。据报道, 毕赤酵母PIC系载体在表达一些生物酶时, 已验证了具有这样的多拷贝能力, 并分离出多拷贝子, 且可通过检测增加重组基因的拷贝子数来判断是否增加蛋白表达量能力。较为成熟的提高整合拷贝数的方法是采用不同的转化技术, 主要有电转化法、原生质体转化法、聚乙二醇 (PEG) 法和氯化理 (Li Cl) 法。以原生质体转化法实现多拷贝转化子的概率较大, 但这种方法在毕赤酵母系统中应用较少。而毕赤酵母系统选用电转化法技术则较多, 因为后续试验中, 用G418来检测拷贝数更方便。在转化过程中还可以通过提高PCR合成载体浓度、重复转化、利用G418或Zeocin筛选和确认, 其操作简单易行。李哲峰[20]在表达牛气管抗菌肽b TAP时, 采用二次电转化实现增加质粒的多拷贝数。还有研究采用多拷贝设计表达了黑腹果蝇抗菌肽Metchnikowin, 但没有拷贝子检测的数据。
是否拷贝子增多就一定高效表达, 这种观点目前没有定论。在研究胰岛素 (PIP) 分泌多拷贝子表达时发现, 多拷贝子在10~20个时会增加表达量, 在1~6个时表达量差异不大。拷贝子超过20个以上时, 增加拷贝数有可能导致外源蛋白表达的负效应, 这是由于高拷贝基因提高了PIP蛋白的合成量, 使得内质网中对PIP蛋白的氧化折叠通量加大, 细胞受到氧化胁迫;另一方面, 毕赤酵母可以通过对甲醇途径的关键酶进行调节, 使甲醇同化途径的碳源流量大大降低, 从而导致菌体碳源和能源供给不足, 以至于高拷贝菌株细胞生长速率反而下降。王艳萍等[21]在表达牛肉风味肽时, 获得4, 8, 12, 16个拷贝子, 经过水解分离发现随着拷贝子的增加, 肽的表达量也会相应增加 (6.0, 16.3, 22.9, 35.4 mg/L) , 而且高拷贝表达时易发生蛋白质修饰现象, 这种现象是否与蛋白分子质量有关呢?侯瑞[22]在表达抗菌肽h PAB-β时就直接采用多拷贝子设计, 得到的目标抗菌肽浓度为73.7, 76.61, 74.3 mg/L。林云雄等[23]在表达Cyclopsychotride时, 筛选出的高拷贝转化子可使表达量达到245 mg/L。说明通过改变发酵条件可以控制表达速度, 因此选择合适的拷贝数重组子对外源蛋白的产量具有重大意义。
2 菌株
目前, 人们使用的毕赤酵母菌株均是由NRRL-Y11430株衍生的, 最近几年的研究中应用较多的有GS115系、KM71系、MC100-3系、X-3系和SMD1168系等。GS115系、KM71系和MC100-3系都是组氨酸脱氢酶基因缺陷型菌株 (his4) , 不同的是GS115系含有AOX1基因和AOX2基因, 而KM71系上的AOX1基因被ARG4基因取代, 甲醇利用也就弱于GS115系。根据这一特性, 这3种菌株可通过不含组氨酸的MD平板来筛选阳性转化子。应用GS115系可表达牛乳铁蛋白肽 (Lfcin B) [24]、牛β-防御素BNBD5[25]。扈进冬等[26]用KM71成功表达了天蚕抗菌肽B。SMD1163 (his4 pep4 prb1) 、SMD1165 (his4 prb1) 和SMD1168 (his4 pep4) 是一系列蛋白酶缺陷的菌株, 它们可以避免抗菌肽基因在表达过程中被降解, 从而提高表达量。刘德辉等[27]通过SMD1168表达抗菌肽LL-37, 结果显示, 表达量达到237 mg/L, 且具有很好的抗菌活性。SMD1168是一类基因组中缺失编码蛋白酶A和蛋白酶B的基因的蛋白酶缺陷型菌株, 这种特点有益于减少表达时蛋白酶对外源蛋白的降解作用, 可用于分泌型表达载体转化[4], 获得高产量蛋白产物, 满足工业化生产的需要。姜丽华等[28]用SMD1168来表达线性化的p PIC9K-PBD-1抗菌肽基因, 得到了对金黄色葡萄球菌有很好抑菌效果的分泌蛋白。
表达载体和表达宿主的选择是抗菌肽基因在毕赤酵母表达系统中获得方便、快速、高效表达的重要因素。在最近的各种表达载体和表达宿主的不同组合中, 常见的是用甲醇作为诱导剂进行表达的组合, 如p PIC9K和GS115, p PICZαA和X-33等。但是, 组成型表达载体p GAPZαA和SMD1168系的组成体系也开始被用于抗菌肽基因的表达, 并且这一表达体系不需要甲醇诱导也能进行多拷贝表达。此外, 在α因子信号肽和GAP启动子的调控下, 该体系也能获得较好的表达量[19]。可以预见的是, 这一组合的发现将会被研究者优先选择。
3 展望
随着各种新型抗菌肽的发现, 人们更加深刻地认识到抗菌肽在食品、饲料和医疗等方面所发挥的作用。通过对毕赤酵母表达系统的研究, 为了解毕赤酵母表达系统的局限性和潜在的利用价值提供了理论依据。毕赤酵母作为生物技术的一种重要的宿主生物体已经被广泛接受, 毕赤酵母表达系统的不断改善将为抗菌肽的安全生产和安全应用提供条件, 同时也为高效表达的酵母系统提供了较为广泛的应用空间。然而, 随着抗菌肽产品的不断研发, 人们也遇到了一些值得深思的问题, 一方面是抗菌肽来源较少、合成成本高、工艺要求高等因素导致了抗菌肽产品的价格高;另一方面, 基因工程表达产品还面临着对宿主细胞毒害作用、溶血活性、抗菌活性等方面的不确定性。这些问题都影响了抗菌肽产品在生产实际中的应用。除此之外, 长期使用抗菌肽是否对人和动物产生不良反应, 耐药性是否真的不会产生, 以及抗菌肽产品在运输过程中如何保持其活性等问题都需要进一步研究证明。
表达系统 篇2
中公教育专家孙晶认为，言语理解与表达能力是贯穿于面试始终的面试测评要素之一。言语理解与表达能力就是指能针对不同的听众采取不同的语言方式、风格，将自己的思想、明白无误、清楚条理的表达出来，让听众接受并能引起反响的能力。
即便是在面试中没有设置言语表达题型，考生也应明确在面试考场所思、所想、所讲的每一句话都是言语理解与表达能力的表现。所以，在综合近五年医疗卫生系统面试真题总量来看，虽然涉及到言语表达题型的地区、年份比重相对来说很小，但是不代表不考。考生也应重视提升言语表达能力。而且，结合各地区事业单位考试、各省公务员考试趋势来看，言语表达题型在未来医疗卫生系统面试中也是一种新颖题目，只有把握住言语表达题型的主旨，明晰命题意图，掌握基本作答思路，才能以不变应万变。
言语表达题型主要有三种考试形式：演讲、情景模拟和串词类。
在医疗卫生系统面试中，目前只考察到情景模拟题，我们也将该类题目做重点论述。
一、演讲
演讲是演讲者在特定时间和空间以口语和体语为载体向听众传播信息的活动过程。在医疗卫生系统面试中演讲类题目主要围绕医德建设、个人道德修养以及医务工作者的日常工作等方面内容展开。
演讲解题思路：
写文章讲究“凤头猪肚豹尾”，这对演讲同样适用。清晰的层次结构、鞭辟入里的分析、华丽的旁征博引，都能为考生加分。由于在面试规定的时间内很难写出字斟句酌的演讲稿，因此这就需要考生在平时多加训练，具备快速列出提纲的能力，至少做到对演讲稿的框架了然于胸，在此基础上扩充、深化，争取更精彩的表现。
二、串词
串词类题目重点考查考生对词语以及成语的应用，考查形式分为主题式串词和无主题式串词。主题式串词主要围绕医务工作者的职业道德等方面内容展开，指定演讲主题，要求考生使用所提供词语围绕主题讲一段话或者一个故事;无主题式串词不特设主题，只要求考生使用题目中所提供的词语讲一段话或者一个故事即可，主题考生可以自己确定。
考生在回答串词类题目时，需牢记三大原则：第一，要涵盖题目中所给出的所有词汇或句子;第二，主题明确、立意深刻;第三，结构清晰、情节完整丰富。考生在回答时首先要设定一个较为深刻、积极的主题，随后围绕主题有条不紊地展开，合理运用“三要素”：人物、情节、环境，将语句一一带入到逐渐丰满的故事中。
三、情景模拟
情景模拟题是依托情景模拟测评的方法，以结构化的题目形式呈现出来的新题型。主要涉及为医务工作者日常工作中的人际关系处理、职场情景应变、计划组织协调等内容，比如与患者、患者家属、其他医务人员、人民群众等的现场模拟谈话，让考生在特定的情景中扮演特定的角色，完成指定的任务，通过此过程考查考生实际工作的能力。
情景模拟题在内容上主要是涉及人际关系处理、活动组织协调等，但与人际关系题、计划组织协调题的区别是考生角色的变化，有原来的第三方转变成现在的第一方主体。要求考生直接带入题目的角色，根据题目情景说话。在医疗卫生系统面试中，情景模拟题多与患者、患者家属以及科室同事就某一事件进行谈话，化解矛盾，解决问题。
情景模拟题从考查形式上可以划分为两大类：一对一谈话类、一对多发表讲话类。无论哪一类，解题思路都可以概括为：
(1)获得认同：即要求考生在特定的情境内用简明易懂的语言，拉近与谈话对象的距离，从而为后面谈话的顺利进行做好铺垫。
(2)步入正题：即要求考生在谈话就切入正题，避免拖沓和冗长，能够主动向谈话对象阐明自己的身份及来意。
(3)解决分歧：考生可以根据题目中特定的情境和具体的要求，引用相关事例或理论，从而深入向谈话对象阐述自己的观点和看法。
(4)达成一致：在谈话或讲话的结尾，需要考生进行适当的议论或者升华，从而在听众心目中留下深刻的印象。
(一)一对一谈话：
一对一谈话类题目，往往将考官身份设置为题目中某身份，直接面对面交谈、说服、劝解。类似于“小品式”的对话，更侧重于生活中的口语交际，语言要自然，表达要得体，内容要实在。谈话对象的称谓、语言措辞、语气、语调等都应与谈话对象、谈话目的相吻合。
(二)一对多谈话：
一对多讲话就是在特定情景和身份下为解决特定问题而发表的演讲，也就是情境演讲。在这一类题目中要重点分析情境和听众。认真分析情境，由题目设置的情境来准确的把握演讲主题和演讲内容。重点考虑听众的特点和演讲的场合，学会真情流露，真情演绎，才能使演讲的效果更好。
乐于表达 易于表达 篇3
【关键词】表达；习作指导；《猪八戒吃西瓜》
【中图分类号】G622 【文献标识码】A
案例描述
【教学目标】
学习动作描写结合心理描写的写作方法。
【教学流程】
一、激趣导入，讲述故事
（一）师：看，谁来到了我们的课堂？（猪八戒）
（二）在你的印象中，猪八戒是个怎样的形象？请你用一个词语说说看
（三）出示题目《猪八戒吃西瓜》
看了课题，你想知道什么？让我们一起去唐僧师徒四人西天取经的路上看看吧。
教师讲述故事起因——话说唐僧师徒四人去西天取经，当时正值六月里最热的天气，他们走到了一个前不着村后不着店的地方准备休息。唐僧派孙悟空和猪八戒去找吃的了。猪八戒大家都了解的，刚走了一会儿就不想走了，于是它就装肚子疼躲在大树底下睡大觉。一觉醒来，他看到草丛中有个大西瓜。发现大西瓜后猪八戒会怎么做呢？
设计意图：布鲁纳提出：“学习最好的刺激乃是对所学材料的兴趣。”学生只有对写作产生浓厚的兴趣，才能产生兴奋点，调动写作的积极性与主动性，从而让学生产生想写的欲望。猪八戒这一形象，是学生都熟悉的，也是他们都喜欢的。用这样一个形象导入，能够激发学生的兴趣，调动他们积极性，也给学生提供了一个乐于表达的形象。
二、观看动画，观察动作，揣摩心理
（一）一起来看一看，仔细看哦，看清楚它的每一個动作
【板书：动作】
（二）播放视频
（三）交流：你看到猪八戒有哪些动作？分别用一个字或一个词说一说
【板书：有哪些 （写动词）】
（四）这些动作是怎么做的呢
【板书：怎样做？】再来看看视频。
（五）交流：怎样做的
设计意图：小学生对形象直观的事物更为感兴趣。多媒体集图、文、声、像于一体，优美的图片、直观的画面、动听的音乐与精彩的视频这些都是小学生所感兴趣的事物，可以同时刺激学生的多种感官，吸引学生注意力，带给学生全新的感受，从而激起学生对写作的兴趣，使学生对接下来的写作教学充满期待，并积极而主动地投入到写作活动中来。】
三、仿照例文，自由写作
（一）故事还没说完呢！猪八戒找到西瓜了是怎么吃的呢
（二）他每吃一块都有哪些动作呢？是怎样做的？他心里又是怎样想的
设计意图：作文的主要阵地是我们的课堂教学，我们必须在教学中唤醒学生的生活积累和知识积累，使之转化成生动形象真实的语言文字。在教学中，教师的范文可以帮助学生降低写作的难度，开阔学生写作思路，为部分怕写作的学生提供模板，让他们也能够“易于表达”。
四、乐于表达 易于表达
《语文课程标准》中指出：“写作是运用语言文字进行表达和交流的重要方式，是认识世界、认识自我、进行创造性表述的过程。”这就要求身为教者，我们应该为学生提供一个自由的写作空间，解放对其写作思维的束缚，开阔其写作思路，激发学生“想写”的欲望，让学生“有内容可写”，教会学生“会写”，最终达到“乐写”的理想效果。
（一）激发兴趣，让学生乐于表达
布鲁纳提出：“学习最好的刺激乃是对所学材料的兴趣。”兴趣是非智力因素中最为积极、最为活跃的，是学生学习强大的动力。学生只有对写作产生浓厚的兴趣，才能产生兴奋点，调动写作的积极性与主动性，从而让学生产生想写的欲望。
1.选择学生的生活实际为主题。学生在写作中遇到的最大问题是“无米下锅”，不知道写什么。其实，作文，就是生活的一种反映方式；我们的生活就是作文的源泉。
因此，想要学生有自主的表达，关键是教师选择的主题要站在学生的视角，要积极创设与儿童心灵对话的语境，让学生写自己的故事，写自己的生活。
2.利用多媒体，唤醒学生的生活经验，刺激学生的多种感官，吸引学生注意力，带给学生全新的感受。
五、教给方法，让学生易于表达
我们的身边总存在着这样一群学生，他们对写作有很高的积极性，生活经验也比较多姿多彩，可是写出来的文章却马马虎虎，不尽如人意。追根究底，学生没有很好的语言表达能力，没有较好的表达方式，不能将自己心中的所见所闻所感所想很好地呈现在文章中，他们缺乏一种方法，一种提升文章水平的写作方法。作为教师的我们就要帮助学生培养感受语言艺术美的能力，帮助学生掌握一系列的写作方法，教会他们谋篇布局，学以致用。
（一）阅读课教学
我们的教材是训练习作的最佳范文。教材中出现的“并列式结构”、“总分结构”以及首尾呼应的表达方式、动词的运动等，都是教给学生习作方法的例文。通过对教材中文的分析、学习，学生自然能习得谋篇布局的方法，也会运用到自己的习作之中。
利用文本，教会学生谋篇布局的方法，教会他们写作的方法，教会他们将文章变得精彩的方法。这些方法一定会在他们的写作中有所体现，久而久之，他们的文章也就渐渐成熟，写作水平也会逐渐提高。
（二）习作范文
书本上的例文或是教师的下水文，在一定程度上可以帮助学生降低写作的难度，开阔学生的写作思路，为部分怕写作的学生提供模板，让他们也能够“易于表达”。
乐于表达，易于表达——这是一个良性的循环。在教学中，在日常学习生活中，我们要想法设法激发学生“想写”的欲望，让学生“有内容可写”，教会学生“会写”，最终一定会达到“乐写”的理想效果。
浅谈地理参考系统的文本表达 篇4
在测量工作中，施工的成果一般以地图或坐标点集的形式进行表达，由于测绘成果数据的地理特性，无论图纸(纸质或电子)还是坐标点集，都须要以某个特定的地理参考系统作为依托，无法孤立存在。没有指明地理参考系统的测量成果通常没有实际应用价值。因而在测量成果提交的同时必须附带测量数据的地理参考系统信息。
地理参考系统是一种相对复杂的数据，在实际应用中需要制定一种相对固定的格式来适应数据交换的需要。一般而言，地理数据参考的表述有二进制形式和文本形式，二进制形式的数据冗余较少，但读取困难，只适用于程序员操作数据;而文本格式可以直接编辑，方便测绘工作者进行直接查看，创建，修改。本文以地理信息系统领域，也即测绘数据的应用领域中常用的地理参考系统文本表述模型为例，谈谈地理参考系统的表达。
1 坐标参考系统
坐标参考系统或称坐标参照系有3种最常见的子类：地心坐标系，地理坐标系，和投影坐标系。一般而言，坐标系由2个、3个甚至更多个坐标轴，单位标度等组成，使得可利用数学法则计算距离、角度或其他几何元素。
坐标参考系统是通过基准面与真实世界或者说地球相关联的坐标系即坐标参照系。这里的基准面是指用椭球体逼近某地区物理表面基准，因此各个国家和地区大都使用不同的基准面。我们常用的基准面有北京54坐标系的克拉索夫斯基椭球和西安80坐标的WGS84椭球等。坐标参照系有许多主要子类和辅助系统，例如地理坐标系、投影坐标系、地心坐标系、时间坐标系等。
地心坐标系，是最富数学特征的地理参考系统，其以地球中心为原点，直接用X、Y、Z的右手直角坐标系来进行位置的描述，无需任何基准模拟地球球面，常用在GPS的原始数据以及全球化的区域网平差中。
地理坐标系通常指带有基准面的椭球面的坐标系，以大地经纬度(角度为单位)，以及高程作为坐标表达点位位置。但为了确定椭球面的基准通常需要椭球长轴，偏心率，以及在参心坐标时椭球位置与地球质心位置之间的三维矢量。
投影坐标系，是使用特定函数将三维曲面上的点映射到平面上的一种表达方式，通常是一种平面直角坐标系。单位一般使用米、英尺等长度单位。它通过定义坐标原点用数学上常用的X、Y来描述地球上某个点的位置。在使用投影坐标系时的附加参数较多，需要定义完整的地理坐标系，投影方式，以及对应不同投影方式的投影参数。在测绘领域中，大多数数据是以投影坐标的形式进行记录，因而描述详细的投影参数是解决数据交换中坐标变换的关键问题。
2 文本表达模型
WKT (OGC well-known text)是OGC制定的空间数据的组织规范中的文本表达模型。正如其英文名称所述，它是目前地理信息领域最常用的文本表述模型，可以被许多地理信息程序库接口直接导入。作为一种通用的地理参考表述模型，WKT可以数学变换和坐标系统两大类地理参考系统。
数学变换在实际的测绘工作中并不十分常用，其WKT格式为：|
坐标系统的WKT格式为：
其中"]，即授权名称与代码，在各种地理参考系统中都有该项，它是一个可选项，允许外部授权着管理该参考的定义。
其余的项目包括：
例如，WGS1984的地理坐标系WKT形式可以表达为：
可以看到，其基准采用WGS84椭球，椭球参数列在SPHEROID子项内，PRIMEM指明了中央子午线位置，对于每个子项，都使用了EPSG的外部授权，且系统使用大地经纬度的形式表示点位坐标。
3 结论
地理参考的文本表达模型为测绘工作者提供了这样一种途径，可以手工编辑测量成果的元数据，使其可以直接被应用层面的施工者直接读取，并作为一种通用格式用于数据的交换与处理。其兼容性好、可读性强，并可以扩展等特点使之可以在地理信息领域广泛的应用。
电气操作事故对人身、设备危害极大，违章操作是根源，安全的保障来自于对危险因素分析与预控措施的落实，规范运行操作，任何不规范的行为均可能重大事故，严格考核制度，切实实行电气操作标准化管理，保障人身、设备安全。
摘要：本文介绍了一种通用的地理参考系统的文本表示格式, 并对其具体框架做了比较详细的阐释, 其在测量数据交换以及元数据表达中具有非常重要的作用。
关键词：地理参考系统,坐标表述模型,文本表达
参考文献
[1]邱菲菲, 唐曦, 黄余明, 张超.对地理空间信息图形符号显示标准化的探讨[J].测绘科学, 2009, 34 (4) .
[2]蔡国瑞.地理信息检索的可视化[J].现代图书情报技术, 2004 (10) .
[3]樊明辉, 陈崇成, 吴小竹.OGSA-DAI的异源空间数据访问技术及应用[J].华侨大学学报:自然科学版, 2008, 29 (2) .
不露痕迹的表达是最高表达 篇5
金像奖不同于其他摄影比赛之处就在于，它是将“评人”与“评作品”相结合。一个有影响力的摄影家，曾经引领过潮流，当下再来参评，我们要承认他的影响，但不能单纯地把他过去的成绩作为全部。
这就要提到创新——思想的创新，手法的创新。这次参评的作品中出现了很多摄影工艺，如蓝晒、湿版、火胶棉等，这些摄影传统技法一直为摄影人所传承是好事儿，也令数字时代的摄影人有了更多元的体验。我们在运用这些工艺的时候，要记住的一点是——摄影的关键还是在内容，影像本身必须能够承载你的思想和表达，这样使用特殊工艺才有价值。
我们现在常提到原生态，希望摄影也能回归到原生态，回归到生活本质中去，离生活越近离艺术越近，脱离生活的艺术是空中楼阁，没有生命力的。
用新的手法、新的观念，不露痕迹的表达才是最高表达。
评选过程中，评委们多次提到了作品的呈现方式，请您谈谈后期输出对于一个摄影人意味着什么？
本届金像奖艺术类参评作品中，有很多制作精良的作品，在色调的调整方面非常专业，而且采用了非常专业的纸张，如德国哈内姆勒纯棉无酸纸输出，呈现出银盐照片的效果。此外，还有用传统手工放大的照片，可以说是达到了目前世界一流水平的工艺。摄影的成本太大了，人力、物力、时间各方面的储备才能造就一张作品。思考很久才会去拍的一个画面，如果随随便便找一个纸张来呈现，那是对自己的不尊重。我们的摄影人喜欢追求相机的高像素，却因为不会后期或者吝啬纸张而忽视了作品的打印输出。殊不知，艺术品最终是要呈现在介质上的。本次参评作品中有些影像是不错的，但最终因为呈现方式不恰当等技术性问题打败了自己。
一个合格的摄影师要学会自己调整照片，调整照片也是要付诸思想的，与拍摄一样是摄影创作环节中不可分割的一部分，不应该交给别人去调整，因为只有摄影师自己到过拍摄现场，也只有自己能还原出现场的感觉。摄影人最忌讳重前期拍摄而轻视后期自己调片。对于摄影师来讲，如果拍摄花费一个小时的话，那至少需要三四倍甚至十倍的时间去研究、调整、编辑，选择最佳呈现方式，并根据参赛要求去投稿。同时也要知道不同输出材质的特性，按艺术品标准去制作，好的介质可以提升你作品的艺术感。
对今后的参评者有哪些建议？
金像奖的评选肯定会产生一定的导向作用，但作为评委我不希望摄影人受这个导向影响。每一届参评人员都应该仔细研究往届获奖作品，以避免趋同。同样，作为评委，也一定要了解上一届的获奖作品，一定要了解中国摄影界的发展、动态、思想、潮流，了解有哪些活跃的人物。金像奖其实也是在对评委的价值观、艺术观做出评价，体现着评委的眼力与艺术水准。
杨国美
1945年出生，江苏省盐城市摄影家协会名誉主席。多年专注于拍摄麋鹿主题的作品，作品多次获奖。先后出版多部摄影画册。曾获得中国摄影家协会德艺双馨优秀会员。
三十年专注麋鹿，用影像为拯救这种濒危物种，为建造麋鹿自然保护区，竭尽全力。参评作品在变幻的光影中倾注了他对濒危物种的关爱之情，呼吁人们保护自然环境，守护美好家园。如果说影像的社会价值、文化价值，如春风化雨、润物无声，对麋鹿的关爱，可谓浓墨重彩、掷地有声！
——林路
陈大志
1966 年出生。供职于吉麦岭（北京）投资管理有限公司。专注于“反向区域曝光法”，有多件作品发表获奖。曾出版个人作品集、举办个人摄影展。
利用胶片的颗粒性和线性涂布的特性，通过在前期拍摄与后期制作中的层次压缩，强调线性，形成笔的点、皴和勾勒感，并通过加大反差，形成墨的晕染感，在现代摄影中探寻中国传统画意的境界与韵味。这种被专家称之为“反向区域曝光法”的技法具有创新与独创的价值，得到国内外业界广泛赞誉和认可。
——林路
周梅生
1951年出生，中国摄影家协会理事。从事摄影30余年，擅长人文、地理、建筑、风光类专题，出版摄影画册多部。近年来尤注重“世界遗产影像学”体系的创立与整理，从文化人类学的角度以摄影的方式对于世界遗产进行大量的拍摄与研究工作。 nlc202309081055 近年来, 无细胞蛋白质表达系统再次受到关注。相比较体内表达, 无细胞蛋白表达系统具有其明显的优点[], 例如, 不受细胞生理限制可进行较大量的毒性蛋白表达;产物的活性和溶解性增加;产物不受胞内蛋白酶的降解;反应可以在短时间内进行;无需繁杂的下游处理;适合于高通量表达。而且通过优化反应系统, 可以得到高产率表达产物。总之, 在无细胞系统合成蛋白质可提高目标蛋白的表达效果。 随着核酸测序技术、芯片技术和RNA干扰技术的建立和突破, 人们对核酸信息的了解越来越多。而生命过程最终多是以蛋白质形式执行其功能的, 因此对蛋白质结构和功能的研究成为后基因组时代重要的工作。因此, 发展能够合成任何目标蛋白系统以及实现高通量表达是当今生物技术中重要的课题。 2 无细胞蛋白表达系统 无细胞蛋白质合成系统是一种以外源DNA或m RNA为模板, 利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系, 通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统 (如图一) , 1958年, Zamecnik首次证明, 从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成;1961年, Nirenberg和Matthaei[4]利用蛋白质的无细胞合成体系, 以破译遗传密码子。该方法对蛋白翻译机制的研究, 同样也作出了重要贡献。然而, 当时由于此方法的表达量有限, 无法进行规模化生产, 因此, 在过去几十年一直没能被重视起来。 随着人们对蛋白质生物合成机制的深入了解, 建立稳定的无细胞蛋白表达体系已成为可能。现已确定, 蛋白质生物合成的机器是核糖体, 如果存在有t RNA, 以及蛋白折叠加工必需的酶和各种相关因子, 只要提供外源的RNA模板、氨基酸和能量, 无需其他的细胞结构 (如线粒体) , 蛋白质合成也能顺利进行。而在各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因子。因此, 可以在无细胞体系中实现蛋白质表达, 通过对无细胞反应体系的优化, 系统的稳定性和蛋白产率得到了大幅度的提高。 目前, 已开发出来的无细胞表达系统有原核和真核系统两大类型。原核系统通常是通过E.coli BL21 (DE3) 或其他敲除了内源蛋白酶和核酸水解酶的菌种, 如A19来进行无细胞表达体系的建立;真核系统, 目前较为成熟的是利用兔网织红细胞和麦芽提取物来实现无细胞蛋白表达系统的建立。理论上来说, 任何遗传信息都可以在这两大类体外表达体系中进行翻译而得到目的蛋白, 但不同的系统有着不同的特点, 应该根据自己的需求来进行选择。 2.1 原核系统 原核系统表达系统主要利用大肠杆菌的提取物来实现的。目前对大肠杆菌蛋白合成机制已有十分详细的认识, 这使得大肠杆菌的体外表达系统也随之不断得到改进。大肠杆菌提取物基础上建立的无细胞蛋白表达系统有一个很大的优势就是它的耐受性, 它可以在含有其它不同成份杂质时仍可以进行目标蛋白的表达。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂, 分子伴侣, 代谢物, 非天然氨基酸甚至是少量的变性剂, 也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。为此, 该体系的弹性非常大, 可以加入许多其它必要成份以提高产率和提高溶解性。例如:微修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键, 然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定的修饰, 比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是, 蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍然是一个问题, 特别是利用这一系统合成那些多结构域构成和含有二硫键的真核蛋白。不过, 由于真核体外合成体系也未能解决蛋白质翻译后加工的问题, 而大肠杆菌的材料来源成本最低, 实用性高, 表达效率也高, 因而依旧是体外表达的热门选择。 2.2 真核系统 2.2.1 兔网织红细胞 兔网织红细胞是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来, 在体内主要是负责合成大量血红蛋白 (90%以上) , 以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核, 但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力, 而没有复杂的背景, 即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定, 体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少, 有助于长链RNA的稳定 (包括有帽子或者没帽子结构的RNA) , 因而可以合成较大的蛋白。 2.2.1 麦芽提取物 麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的m RNA很少, 这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高, 直到最近[5]才通过延长合成时间的方式提高了产率。如果要保持麦芽提取物系统持续数日的合成效率, 就必需保证反应体系不含有任何会破坏核糖体功能以及其它合成中使用到的相关的酶。这样此系统的合成效率可以被不断加强, 由试验结果显示, 24小时内最高的合成量可达1mg/ml。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。 3 应用 利用无细胞体系表达蛋白质已经应用于很多方面, 但是大致可以归属于以下两个方面。 3.1 结构蛋白质组研究中的应用 首先, 利用无细胞体系可以进行蛋白质的高通量表达, 能同时得到许多用于结晶的蛋白质, 进而开展结构蛋白质组的研究。第二, 特别是膜蛋白和有细胞毒性的蛋白质都可以利用无细胞体系进行表达。第三, 可以在蛋白质中人为地引入硒代半胱氨酸, 有利于蛋白质的X射线结晶学研究。第四, 因为可以在很小体积内进行无细胞体系的蛋白质表达, 这样有利于蛋白质的同位素标记, 例如进行了双重同位素标记蛋白质后, 无需烦杂的纯化, 即可进行灵敏的NMR测定。 3.2 功能蛋白质组研究中的应用 同样是由于无细胞体系可以进行蛋白质高通量、微量化的表达, 表达后又可省去烦杂的分离纯化, 因此对表达产物的活性测定非常容易, 尤其是对酶的活性研究。如果进一步降低无细胞表达体系的体积, 使得反应浓集在很小区域内 (例如在96孔板中) , 几乎可以达到蛋白质 (微) 阵列的目的。 在无细胞体系表达蛋白质时可以引入非天然氨基酸 (其中包括荧光和生物素光标记的氨基酸、可以进行光化反应的修饰氨基酸) , 对蛋白质进行修饰和标记。这样可以更为有效地研究蛋白质组中得到的各个组分的功能。 4 讨论及展望 体外表达由于是在无细胞的条件下进行的, 缺少蛋白质翻译后加工所需要的细胞器和空间结构, 所以其致命的弱点就是:即使是真核体外表达系统, 目前依然无法对蛋白进行糖基化和其它天然蛋白必需的高级修饰。所以有必要对体系进行改进, 如渗入单糖基化的氨基酸或加入微粒体 (microsome) 等, 理论上可以实现一些必要的修饰。 关键词：商务建模,价值链,价值系统,供应链,REA模型 一、问题提出 过去, 商务建模人员将公司的价值链看作是公司信息系统所要支持的商务的核心结构。这些价值链包含若干价值活动, 例如物流、经营、营销和销售、采购、人力资源管理等。这些价值活动预期给客户创造价值, 为客户所创造价值的一部分应当返回给创造价值的公司, 作为价值创造活动的回报。价值系统包含公司的价值链。价值系统还包括供应商以及客户的价值链。商务建模的重点放在价值链上产生了将公司理念或信息结构, 流程、活动和角色文档化的公司模型的构建方法。 这种做法可以为公司级的管理信息系统、交易处理系统和会计信息系统提供一个概念基础。然而, 持续不断、越来越快的世界经济全球化和供应链上商务伙伴间越来越频繁的合作增加了为整个价值系统, 而不仅仅是为价值系统中某个单一商家而建模的需求。 这种从单个商家向供应链上各个伙伴商家间通力合作的转变作为商务建模的中心揭露出很多学术界和实务界现有概念模型的不足, 这些设计的概念模型服务于某一家公司某一时点的特定需求目的, 主要提供特定部分应用视角的商务领域。因此, 这些模型的抽象级别有限, 特定应用语义阻碍了公司在更高抽象级别上的经济单元的建模。 这种商务建模方法确实能够很好地支持特定信息系统工程化从所涉及商务伙伴的内部业务角度的抽象的价值系统建模, 但却越来越不支持整个价值系统的整体概念设计。因此正如前面定义的那样, 我们不能认为这些简单概念化是优化的商务建模方法。例如, SCOR方法中从经营角度构成价值系统, 并且提供在设计这些流程过程中提出经营问题的词汇表的价值创造流程的设计。这很明显就是从支持信息技术角度抽象而来的。 二、模型演进 另一方面, 不从战略角度看待同一个价值创造流程, 并为在流程设计时提出战略问题提供一个本体论。这很明显就是从经营问题的E3-Value本体论抽象而来的, 它提供了基于经济交换原则, 表达这类商略商务模型和预测他们的获利能力的工具, 作为早期的电子商务信息系统工程的需求启发。同样, 战略问题的商务目标模型在信息系统开发的更早期, 例如商务规划时期, 就如此看待商务。 在信息系统开发的早期, 提供支持的信息技术架构是不相关的。作为Dietz的公司本体论补充的DEMO方法论, 关注构成价值创造流程的交易的控制流。与REA一样, DEMO方法包含价值创造流程所产生信息的处理。然而, DEMO本体论不符合“理性经济人”这一核心概念假设, 而REA本体论符合理性经济人的假设。与Dietz的公司本体论相反, Ushold的公司本体论的目标只包含通过提供一个共享的商务词汇表来加强交易双方的通信。因此, 后来的公司本体论更倾向于被用作信息系统的人为组成部分, 而不是用来支持开发信息系统。 需要什么是一种商务建模方法, 该方法允许每家公司参与一个价值系统来提高自身的价值链信息系统, 同时也支持系统交互操作能力和供应链上各商务伙伴间的信息共享。产生系统的交互操作能力需要具备4个先决条件: (1) 与标准的参照模型一致; (2) 标准化的服务接口模型; (3) 关于领域特定概念模型的标准化集合 (例如原型和模板) ; (4) 标准化的鱼控制变量协同的决策机制。 在当前状态下, 除了标准化的服务接口模型, 例如网络服务标准W3C、电子数据交换标准Eur等模型外, 商务信息系统工程领域缺少这些先决条件中的绝大多数。 尽管存在广义定义的应用领域的参考模型, 例如公司架构、工作流建模以及更狭小的领域, 例如产品跟踪追溯、电子合同等。该领域还没有一个可跨越多种商务信息系统应用领域的普遍接受的参照模型。以上单独的应用领域参照模型可以实现领域内的系统集成, 但是不能实现跨领域的系统集成。这些参照模型与概念模型的建模模式或领域术语互相不一致。 各个不同的本体论都已经提出了商务领域的标准化的决策机制, 像专业词典、分类系统、语义模型等。但以上模型中没有一个能够超越统一各个不同的基于特定目的商务子领域, 诸如会计、业务流程管理、公司治理等, 或者实现跨领域范围内的共享。 三、REA模型表达 本文迈出了价值链和价值系统建模都能使用的, 为信息系统开发和集成提供了基础的开发商务模型方法的第一步, 即一个克服了商务信息系统各个应用领域障碍的参考信息模型。该模型可以用作价值系统内出现的公司内部现象和公司间现象建模的一个参照。本文同时也提出一个商务专用概念模型的标准集来实例化这一参照模型。这些作为对象模型表达的概念模型显示了递归概念或者商务信息结构的原型发生法。在今后的研究中, 这些原型对象模型可以被集中到用作创建商务模型积木的建模模板中。 本文提出的参考信息模型是从作为受控业务词汇表的REA本体论派生而来。REA是一个开发自会计信息模型的商务本体论。会计是一种拥有500多年历史的记录商务交易的专门技术, 会计因此能够表达商务领域内大量的实际业务。由于REA本体论已经被用作供应链和电子协同建模, 以及生产过程、公司会计信息系统和管理信息系统建模的概念基础, 因此, REA本体论的会计本源并不意味着REA只是一个面向会计的本体论。 国外的研究已经表明, REA本体论的模型可以支持跨越公司边界的业务流程集成, 也有助于数据库主体框架的演进。正因为以上业务流程集成, 以及现有商务建模应用的变形, 研究人员选择REA理念作为提出的公司内部以及公司间的参考信息模型的本体论基础。 选择REA作为参考信息模型的基础并不意味着REA理念本身就是参考模型。REA在商务资产和交易中交易各方视角和独立视角之间提供了一个明确的区别。交易各方视角特别强调从交易的唯一特定参与方进行商务概念化。这个唯一的、特定的参与方称为“交易方”, 例如公司以客户、生产者或供应商的身份进行交易。REA的ISO标准版本中提到的, 作为开放-可编辑的商务交易本体论 (the Open-edi Business Transaction Ontology, Oe BTO) 的独立视角, 从独立观察者的角度或者说从空中 (即将经营活动看成交易各方发起的商务事项所导致的货物流、服务流和货币流) 看待经营活动。两种视角都关注公司内部建模以及公司之间建模, 如果该参考模型既要满足价值链建模, 又要满足价值系统建模, 那么REA参考模型必须集成, 这一点显而易见。 参考文献 [1]周梅.REA公司本体论视角下的AIS建模[J].财会月刊, 2012 (11) . [2]周梅.公司本体论中的会计信息系统[M].吉林大学出版社, 2014 (8) . 关键词：展柜设计,古钱币,传统与现代 展柜是展品表演的舞台, 是展品和观众进行无声交流的平台, 它的“美”是建立在突出展品主题的前提上, 因此, 赋予了它艺术的组成部分。展柜的作用是展品的包装和展示, 在保护展品的同时又极佳的表现展品。 在展览展示行业突飞猛进的时代, 特别是在各国世博会的推动下, 展示设计的理念、技术、材料都是日新月异, 极大的影响了全国各类博物馆、展览馆的设计感观效果, 各国不断推陈出新的展览展示手法和技术, 也让观众惊叹不已。在熏陶陶冶中, 人们不知不觉中对于展馆的品味已经上去了一个档次。在国内也催生了一批展览设计公司, 培养和锻炼了一大批展示设计人才, 但是不难发现人们注意力都是集中在设计理念的更新升级, 展示手法的标新立异, 建筑材料的独特创新, 却对展馆中最基本的元素忽略了, 那就是对展览设施———展柜设计的忽略, 不论是国家级的展览馆, 还是一个社区展馆, 我们对展柜都没有给予足够的重视, 这里包括甲方、设计方、参观群众等等, 在对展馆装饰理念技术空前期待的同时, 似乎大家对于司空见惯的展柜是理所当然的。作者人参与了多个展馆的设计, 其中包括广州十三行历史展览馆、广东省中国银行行使馆、海南省中国银行行使馆设计、广州大学校史馆设计, 虽然我们在设计的过程中精心雕琢了无数的细节, 甚至是一个石块的去留问题, 可是对于展柜的讨论却涉及甚少, 对于这样一个不太合理的现象, 整个设计界似乎集体走神, , 对于风格与形式的“一脉相承”大家似乎觉得也是理所当然。可是作者觉得这样的远远不够的, 展柜的设计应该没有“标准”模式, 应该切合展馆的主题内容, 设计理念、进行精心策划, 突显个性。 1 展柜设计的现状与要求 展柜是储存、展示和保护展品等综合功能的设施, 目前却是展示设计中一个比较薄弱的环节, 当前许多展馆的展柜不论是功能还是形式, 都是比较落后和陈旧的, 使展品既得不到充分的展示, 也不能起到很好的保护作用, 还有一些展馆的展柜一味的模仿外国的形式, 而忽略了与自身展馆相协调的问题。对于展柜设计的研究也是更多的局限于展柜的功能探讨, 包括展柜的稳定性, 安全性、展示性, 操作性等等。 显而易见, 我们在讨论展柜设计时, 仅仅研究他的功能性或片面强调形式是远远不足, 必须结合审美学、人文学、心理学、人体工程学、材料学等综合考虑展柜设计的目标, 概括而言就是展柜设计应是艺术感和技术感的完美结合, 时代感和历史感的和谐统一, 标准化和个性化的相辅相成, 同时考虑展柜与展览主题相吻合, 与展览环境相协调的问题。 2 古钱币应用在金融系统展柜中的意义 我国具有悠久而深厚的文化底蕴, 历史长河中的文化精华的取之不, 尽用之不完, 如能从中吸取有用的养分融入展柜设计中, 并加以创新, 必定能从传统与现代之中孕育一种审美特质, 这种特质渗透者传统的文化气质和现代的潮流趋势, 这也正是文章探讨的意义所在。 中国古钱币经历了四千年历史风风雨雨的考验, 源远流长, 琳琅满目, 其形状各异, 品种众多, 在它漫长的发展过程中已逐步形成了独具特色的东方钱币文化体系。中国古钱币的灿烂历史文化, 以及古钱币各个不同时期美妙的造型和独特材料, 为展柜设计提供了养分支持和灵感源泉。 在展柜设计中, 以“古钱币”的概念突出银行系统的身份特征, 以区别于其他商业展柜和一般的文化性展柜, 突出银行系统的展柜自身的特色和品牌价值, 在形式和内涵上都具有重要延伸意义。 3 古钱币应用于金融系统展柜中的创意表达 古钱币在中国流通较广的古代实物货币为“贝”, 在考古发掘中, 夏代、商代遗址出土过大量天然贝, “贝”作为实物货币一直沿用到春秋时期。因此中国汉字中和财富, 价值有关的字大多与“贝”字有关 (图1) 。如:贵、资、贪、贫、财、购等。中国是世界上最早使用铸币的国家。从春秋时期进入金属铸币阶段到战国时期已确立布币, 刀货, 蚁鼻钱, 环钱四大货币体系, 后朝历代的古钱币各有不同, 但它们的形式、材料和工艺各有各的特色, 具有很高的艺术价值和审美价值。 金融系统展柜设计可以对古钱币进行抽象概括, 拆解重构, 结合现代的设计语言, 融入了钱币文化元素, 突出金融系统展柜“贝”的特性, 强化自身标签的同时, 延伸了展柜文化内涵。 文章以布币为例, 探讨金融系统展柜设计的创意表达。布币产生较早, 形状似铲, 后来制作益精, 首为实首进而为平首;足由尖足渐变为平足, 继而为圆足 (图2) 。在海南省中国银行行使馆的展柜设计中, 借鉴了布币的元素, 取其形意加以概括, 重点在于形体感观的意向传达, 有此意念却不是简单的模仿, 而且要与展柜结构力学完美结合, 案例中的展柜形有“布币”缩影, 同时这个形似“贝”字 (图1) , 造型简洁流畅, 在用材上柜身用实木与金属相结合, 整体为机理优美儒雅大气的实木, 古朴中透出厚重的历史文化感, 在收口与转折的位置金属修饰, 金属质地增强了展柜现代感, 折射其高贵的气质与身份特质, 同时金属收口, 有益于增强展柜的保护作用和耐用程度 (图3) 。 4 结束语 现代的展览展示早已不再仅仅是商品千篇一律的简单摆放和陈列, 对于使用功能、个性要求、品牌价值日益重视。在激烈的市场竞争和科技迅猛发展的今天, 新技术、新工艺、新材料的研发不断推动博物馆的展示艺术效果, 展柜展示更加的注重文化性和艺术性。 几千年的文化积淀, 深厚而久远的钱币文化, 多样的形式, 丰富的内涵为展柜设计提供了无穷无尽的灵感源泉。而对于古钱币的借鉴运用不能一味模仿, 而应有兼容的思想, 重在达意, 有所选择有所创新的运用, 兼有古钱币的人文内涵又融合时代精神与新代技术, 兼有东方含蓄的内涵美又融合西方简约明了的形式美, 最终形成具有传统内涵、又不失时代特征的展柜设计, 这是必然趋势。 参考文献 [1]陈成军.国家博物馆展柜设计和使用中的几点思考[J].中国博物馆, 2013 (1) . [2]王珊珊.展具设计的传统性与现代性的思考[J].大众文艺, 2012 (3) . 我们正处在信息飞速增长的时代,互联网已经成为现代生活必不可少的一部分,大量信息时刻通过互联网发布。如何在海量、快速更新的信息中快速、及时、准确、低遗漏地自动寻找与某一特种需求(例如汽车)相关的所有信息,成为目前研究的重点。参考文献[1]分析了正则表达式的特性,并把这种特性用在了网页分析中,但由于网页的来源均为手动搜集,并不能保证网页随着时间而更新,且没有利用网站内部的超链接功能实现对网站的内部所有信息的抓取。本文将正则表达式对网页的解析和网络信息监控分析系统的实时性结合起来,使得信息从发布到被抓取得的时间控制在5分钟之内,同时利用HTMLparser和正则表达式对网站内部的所有网页进行递归匹配,保证了对网站分析的及时性和全面性。 1 正则表达式的原理 编写处理字符串的程序或网页时,会有查找符合某些复杂规则的字符串的要求,需要借助正则表达式来完成。正则表达式是一个字符构成的串,它定义了一个用来搜索匹配字符串的模式。利用正则表达式可以实现以下三种功能:(1)测试字符串的某个模式;(2)替换文本;(3)从字符串中提取一个子字符串。本文中网络信息监控系统基于Java实现,利用sun jdk1.4中的java.util.regex包对正则表达式的匹配功能提供支持。 2 正则表达式在网页信息抓取中的应用和实现 在网页信息抓取之前,首先需要了解网页的构造,一个大型网站是由无数个相互连接在一起的网页组成的,这些页面称为HTML文档,文档中的内容由超文本标识语言编写,如:包括显示内容和标记符号两个部分。只要了解了网页的这种结构,就可以利用正则表达式将信息单元直接匹配出来,本文设计的网络信息监控分析系统主要是为了收集较大的网站的新闻和论坛信息,而这类网页的特点是结构相当稳定,且网页的功能相似,因此可以大批量统一处理。利用正则表达式可以过滤掉标记符等无用字符串,直接将符合条件的字符串找出并判断,然后将得到的信息入库。信息抓取的核心为直接匹配。 网页信息的抓取流程如图1所示。 (1)输入URL,例如http://auto.sina.com.cn。 (2)利用HTMLparser将网站内部所有与1中URL链接的子网页抽取出来。这些抽取出来的文档将以超文本的形式存在。例如汽车。 (3)利用正则表达式对各URL页面中的有用信息进行直接匹配。HTMLparser提取的超文本文件中包含了网址,标题,页面内容等,正则表达式要做的就是对提取出来的超文本进行清洗操作,假设需要网址信息,只需要用正则表达式将直接匹配出来即可。 (4)入库,图中的存储模块利用MY SQL保存抓取的数据,并不断更新数据库避免保存重复信息。 参考文献 [1]吕晓波.正则表达式使用详解[EB/OL].http://dev.csdn.net/arti-cle/8/8254.shtm. [2]RORBERT.Delphi使用与此同时表达式[EB/OL].[2006-01-19].http://robert2005.boke.com/4237344. [3]周源远,等.Web页面清洗技术的研究与实现[J].计算机工程,2002(9):48-50. [4]任函.大规模中文网页的自动分类研究[D].武汉:华中师范大学,2006. [5]闫宏飞,等.关于中国Web的大小、形状和结构[J].计算机研究和发展,2002(8). [6]苏新宁,等.信息检索理论与技术[M].北京:科学技术文献出版社,2004. [7]李保利.信息抽取研究综述[J].计算机工程与应用,2003,39(10):1-5. 摘要： 运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上，替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1；再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4；双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上，得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒，然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒，并进行病毒滴度测定；体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确；而RT-PCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体，转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。 关键词： 5型腺病毒；间充质干细胞（MSCs）；胰腺十二指肠同源框蛋白1（PDX1）；成对盒基因4（PAX4）；转录因子 中图分类号：Q78文献标志码：A 文章编号：1672-1098（2016）02-0080-07 Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells. Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells 糖尿病是由于胰岛β细胞功能绝对或相对缺陷，以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病[1-2]。长期血糖增高，可导致大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10%是肾病变所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，预防糖尿病的并发症并最终控制血糖是重要的社会问题。 至目前为止，控制患者血糖仍主要是依赖每天胰岛素的补充，给患者生活带来极大的不便与沉重的经济负担。寻找具有合成与分泌胰岛素的细胞进行细胞替代治疗一直是研究的热点。近年来研究证实间充质干细胞具有多向分化的潜能且无免疫原性，是一类极具应用潜能的干细胞[4-5]。胰十二指肠同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎发育过程中具有促进胚胎干细胞向胰腺的早期发育和晚期胰岛素分泌细胞分化的功能[6]；此外，还具有维持胰岛β细胞合成与分泌胰岛素的功能[7-8]；然而，单独的PDX1转录因子并不能有效诱导干细胞定向向胰岛β细胞分化，在胰腺前体分化与发育过程中，成对盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表达将有利于胰腺前体细胞定向向β细胞分化，并参与调控β细胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1与PAX4联合作用对诱导MSCs定向向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞可能具有促进作用，基于这一假设，在本研究中，选用对MSCs具有较高感染效率的Ⅴ型腺病毒载体，构建携带目的基因PDX1与PAX4的重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs细胞，以观测所携带的目的基因表达情况，为进一步研究PDX1与PAX4在诱导MSCs向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞分化的可能及其分子机制奠定实验基础。 1材料和方法 1.1材料与试剂 Bgl II等多种限制性内切酶、Klenow及T4 DNAligase均购自美国Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、质粒提取纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天恩泽公司；腺病毒pADxsi载体系统由上海汉恒生物有限公司提供；293细胞及DH5a菌株由深圳清华研究院郑义博士惠赠，pEGFP-N1-PAX4与pEGFP-N1-PDX1质粒为前期本实验室所构建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG购自美国Abcam公司，HRP标羊抗鼠IgG、HRP标羊抗兔IgG、FITC标羊抗兔IgG、CY5标羊抗鼠IgG购自eBioscience公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；RT-PCR试剂盒为北京天恩泽公司； DMEM/F12培养基购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。原代人脐带间充质干细胞购自北京医科利昊生物科技有限公司。 1.2方法 1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒载体的构建。 首先构建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭质粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位点，下游有Sal I和EcoR I酶切位点，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端处理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I双酶切pShuttle-GFP-CMV载体，替换GFP， CIP去磷酸化处理，回收载体片段5.2 kb；最后，酶连切好的载体片段和插入片段，获得pShuttle-CMV-PDX1。再构建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒载体：从pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I双酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位点，下游存在Xba I和Sal I酶切位点）；同时对pShuttle-CMV- PDX1载体用BamH I和 Sal I双酶切，CIP去磷酸化处理，胶分别回收与纯化载体与酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 连接酶酶连得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒。最后用T4 DNA 连接酶酶连目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架质粒；转化产物并转染DHSa，扩增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4质粒，对质粒产物进行提取并进行电泳签定，产物由上海丰恒生物科技有限公司进行测序鉴定。 2） 重组腺病毒的包装、扩增和滴度测定。 Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒，用Lipofectamine 2000脂质体转染细胞密度约80%的293细胞。3～5 d后，开始出现明显噬斑，待大部分细胞病变（cyto-pathic effect，CPE）时，收集细胞混悬液，于-80℃/25℃反复冻融3次，再离心收集上清，继续感染293细胞扩增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法测定病毒滴度。 3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs与目的基因表达。 于六孔板接种MSCs细胞5.0×105/孔，细胞密度达80%时，按感染指数为10PFU/细胞、50PFU/细胞、100PFU/细胞加入相应量的腺病毒液；同时设ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒对照组。当实验进行到相应阶段时，即培养到24h、48h和72h等阶段分别收集细胞行WB、免疫细胞化学与间接荧光检测；同时RT-PCR检测目的基因表达，引物分别如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm为61.5℃，扩增目的片段为882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm为60 ℃，扩增目的片段为515 bp；内参照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。 （4）Western blotting检测 胰酶消化，收集目的细胞，裂解细胞并离心取上清液，应用15%的SDS-PAGE胶电泳2h后，湿转移法至PVDF膜，脱脂牛奶TBST液封闭1h，再分别加抗人PAX4、PDX1抗体IgG液振荡过夜，HRP标记相应二抗亲合反应后ECL显色。 2结果 2.1鉴定重组腺病毒质粒 Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒质粒，阳性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6条带组成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而阴性克隆（pADxsi骨架质粒）只有以下6条带组成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切结果阳性质粒均与理论预期一致，具体酶切结果（见图1）。 2.2重组腺病毒的包装和滴度测定 Pac I酶切线性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重组腺病毒质粒经脂质体Lipofectamine2000转染293细胞后3 d，开始出现病变效应（见图3）。120 h后，此时约70%细胞悬浮，收集细胞与上清液体，冻融后，再应用293细胞重复扩增、收集病毒液。空斑计数法（PFU）测定病毒滴度为1.0×108 PFU/mL；使用同样方法测定对照组。空载腺病毒ADxsi的滴度为2.0×108 PFU/mL。 2.3 目的基因表达 MSCs在光学显微镜下呈典型的长梭形，呈漩涡状或放射状平行排列（见图4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在荧光镜下观察到GFP表达。免疫细胞化学染色与间接荧光分别证实ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染复数（MOI）=100感染目的细胞 （MSCs）24 h后，实验组MSCs的细胞核中即可检测到PDX1与PAX4 mRNA；细胞化学检测显示，PDX1与PAX4 主要定位于细胞核内，阳性率高于75%。间接荧光同样证实细胞核中PAX4（FITC）与PDX1 （CY5）均稳定表达（见图4）。 转染后光镜下的细胞形态相同于正常的MSCs细胞形态，呈梭形排列，应用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染细胞后，可见到细胞内绿色荧光表达，分别应用抗体检测PDX1与PAX4表达与定位，荧光结果显示PDX1与PAX4均定位于细胞核内，且免疫细胞化学检测也证实两转录因子定位于细胞核内，且稳定表达。 2.4 目的基因转录与表达 RT-PCR法与WB分别检测重组腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4转染后不同时段细胞内目的基因mRNA和蛋白表达结果显示：MSCs胞质内PDX1与PAX4 mRNA水平稳定；进一步Western blotting（WB）法检测感染后12 d的细胞核内PDX1与PAX4蛋白一直稳定表达（见图5），提示重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能稳定表达，这为后续研究目的基因在MSCs转分化过程中的功能奠定实验基础。 3讨论 MSCs具有多向分化潜能，为探讨MSCs分化为合成与分泌胰岛素功能的胰腺β细胞，选用了在胰腺前体细胞向β细胞分化过程中起关键作用的两个转录因子PDX1与PAX4[8-11]，并构建对MSCs具有稳定转染能力的Ⅴ型腺病毒载体[12-13]，用PDX1换去示踪基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位点，构建并包装成带PDX1与PAX4双目的基因的活性重组腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切结果与测序结果证实重组腺病毒构建成功，目的基因连接正确。 应用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs结果显示，重组病毒可以稳定高效感染MSCs，间接荧光检测结果显示，转染的MSCs在细胞核稳定表达PDX1与PAX4分子，细胞化学染色结果同样证实PDX1与PAX4分子定位于在MSCs细胞核内，这提示带PDX1与PAX4转录因子基因的重组腺病毒不仅可以高效感染目的细胞，并且稳定表达目的转录因子，而且所带的转录因子均具有核定位功能。 另一方面应用RT-PCR技术检测转录重组腺病毒的MSCs细胞内目的基因的转录水平表明目的基因在重组腺病毒感染细胞后仍可以检测到转录目的基因的mRNA水平稳定，提示在腺病毒的CMV启动子的作用下，目的基因在细胞内稳定转录。进一步抽提感染腺病毒的MSCs的细胞核蛋白，并行WB检测PDX1和PAX4转录因子蛋白水平，发现两种转录因子在细胞核水平稳定，这一方面提示腺病毒的CMV启动子具有强的启动目的基因转录功能，另一方面，目的转录因子稳定定位于细胞核，说明表达的转录因子具有核定位能力。的并且能稳定转录与表达PDX1与PAX4分子。 综上检测结果证实， PDX1与PAX4双带目的基因的Ⅴ型重组腺病毒被成功构建，重组腺病毒所带的目的基因均能稳定转录与翻译成功能转录因子PDX1与PAX4，且两功能转录因子均具有核定位功能，这为下一步研究2功能转录因子在诱导MSCs定向向胰腺β细胞分化过程中的功能与分子机制奠定了实验基础。 参考文献： [1]GAO T， MCKENNA B，Li C， REICHERT M， et al. 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J Biol Chem ， 2014， 289（47）：32 798-32 810. 计算机专家系统所包含的知识是和其他软件系统的知识是不同的, 这是一个极其重要的特征。所以说, 专家系统的中心就是知识库, 专家系统功能的卓越性取决于知识库里知识的数量和质量。那么为了使专家系统具有智能, 让它可以模仿出好似人类的智能活动, 那么就必须使它具备知识。 知识的表达只是研究机械的一般方法, 也就是说一种数据的结构是否具备有效性和可行性就决定于知识, 知识是数据结构和控制结构的根基。我们不仅要考虑知识的运用, 还要琢磨知识的保存, 知识可以拿来表示描绘事物的一个群体, 于是, 人类的知识可用来表示成机械处理的数据结构。会直接影响专家系统的办事功效及专家系统的通用性在于知识表达的好坏。 当前最常用表达知识的方法主要包含以下几种:一阶谓词逻辑表示法、框架表示法、产生式表示法、语义网络表示法等。 1.1一阶谓词逻辑表示法 逻辑表示是基于离散数学的理论基础命题逻辑和谓词逻辑, 它作为一个原子命题存在于自然语言的语句中, 每个原子命题可以分成两部分, 个人和谓词, 逻辑表示法可以用来描述大多数自然语言逻辑公式, 这是一种应用程序更早、更广泛的表示方法, 是一个成功的知识表示方式, 适合使用定理系统的方法来解这个问题。 1.2框架表示法 世界上别样的事物有着各色各样的属性, 就像不同的东西之间平常有自己的规律一样。这种规律性的知识一旦经过细化, 就可以形成一种人们用来认识某一类事物的一种固定的框架 (Frame) 。框架表示法是一种用于表示经验性知识的知识表示法。在使用框架来表示知识的时候, 一个类型的实体, 框架是一种属性, 它可以用来描绘一个数据结构的对象些都是视具体情况而定的。根据实际情况的需要每个槽又可以分为若干个“侧面”。槽是用来描述对象属性, 或者一个状况和某一方面, 一个方面可以用一个侧面来描述相应的属性。侧面和槽所具有的属性值分别称为侧面值和槽值。 框架是继承性和实用层次结构。通过使用一个框架的继承和槽值, 可以用来构建一个知识表示体系。数据结构是一种多层框架下可以建立的框架, 框槽架之间的关系可以通过该框架到网络。 可以使用框架的内外嵌套的结构来表达不同档次的知识是它的优点, 可以随意的填写、修改、添加其说明和内容, 人在观察事物时的思维活动可以用框架表示法来反映, 当人观察失误适合固定概念、行为和事件, 但框架本身还是没有形成一个比较完整的理论体系, 框架槽和侧面之间缺乏一个清晰的语义知识表示单位, 这会使户构建立知识库的负担变重, 所以对于一个给定的问题领域, 仅仅用于正式化领域知识的框架系统是不容易的 1.3产生式表示法 用来表示因果关系的知识通常用产生式, 它的基本形式是:“如果…然后…”。一组产生式可以放在一起, 使它们协同作用, 互相配合;得出的结论产生式可以使用另一个产生式可以作为已知事实使用, 从而求得解决问题的方案, 产生式系统就是这样一个系统。产生式系统的基本结构包括事实库、规则器和控制器这三个主要部分。它们之间的关系如图2-2所示。 1.3.1事实库。事实库也被称为综合的数据库, 是一个用于存储当前信息和解决各种问题的数据结构。例如, 问题的初始状态、推理结论得到的中间结论及输入的事实和最终的结论等。在推理的过程中, 在某些规则的前提下我们可以在规则库中匹配和事实库中的已知事实, 那么该规则将被激活和作为新的事实被放入事实库中, 可以作为已知事实后面的推理。 1.3.2规则库。规则库是一个用来解决存储的所有规则和有关问题的集合。其中包含了从初始状态到目标状态转换问题所需要的所有转换规则。这些规则可以用来描述问题领域的一般知识。可见, 产生式系统解决问题的基础是规则库, 规则库的效率取决于其知识的准确性、灵活性、一致性、完整性和知识组织的合理性等。 1.3.3控制器。推理机构或推理机也称为控制器, 它由一组程序组成, 操作运行是用来控制整个产生式系统的, 求解过程决策问题的推理, 实现解决方案的问题。 所以, 固定的表达格式是产生式规则, 形式很单一, 推理路径很容易做出解释, 接近人的自然推理系统的, 便于理解和学习。推理方式是很简单的, 复杂化的计算是无用功, 并且分离的是推理机和知识库, 从而知识库的修改便捷了很多。通过很多操作票专家系统所操作并采用这种方法。 1.4语义网络表示法 语义网络表示的守则是通过对语义关系及其和概念来进行知识表达的一种网络构图。语义网络是简洁而且直观明了的, 并在解决问题时可以通过网络的连接关系来推导有关对象和概念, 并不需要遍布整个巨大的知识库, 从而获得领域的专家系统自然语言理解在领域内被宽泛应用, 但尝试用节点来代表世界上的各色各样的事物, 各种形式之间的弧代表事物形式上过于简略, 如果节点间的关系来保持几种较典型的关系, 那么关系到其他的各种联系将难以表达, 使表达内容受到了限制, 而加大联系会极大地提升网络的复杂性。 参考文献 [1]Zhang Z.Z, Hope G.S, Malik 0.P.A Knowledge-BasedApproach to Optimize Switching in Substations.IEEE Transactionon Power Delivery, 1990, 5 (1) :103-109. 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