无菌检查法（共9篇）
无菌检查法 篇1
呋喃西林溶液对葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有杀菌作用。系呋喃西林、氯化钠为主要原料, 加注射用水配制而成。能干扰细菌氧化酶系统而发挥抑菌或杀菌作用, 用于多种革兰阳性及阴性细菌引起的耳、鼻、皮肤、腔道等疾病, 对厌氧菌引起的感染也有效果。适用于腔道、皮肤等的冲洗, 是医院常用的自制制剂之一。本品能引起过敏性反应, 如过敏性皮炎等。故建立科学、合理的制剂质量控制标准, 确保公众用药安全具有重要的意义。
1 仪器与材料
1.1 仪器
高压蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;双人净化工作台:上海苏净实业有限公司;智能集菌仪:杭州高得医疗器械有限公司;生化培养箱, 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 样品
呋喃西林溶液0.02g:100m L/瓶 (兰州大学第二医院, 批号:130509、130510、130513) 。
1.3 验证用菌种
枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63 501]、生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]、金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10 104]、白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]、黑曲霉[CMCC (F) 98 003]。见表1。
1.4 培养基
营养肉汤培养基, 批号:20130517;营养琼脂培养基, 批号:20131211;改良马丁液体培养基, 批号:20131701;硫乙醇酸盐培养基, 批号:20130818等。
2 方法
按照《中国药典》2010年版二部无菌检查方法验证实验[1]。
2.1 菌液制备:
取经30~35℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌肉汤培养物1m L, 生孢梭菌的液体硫乙醇酸盐培养物1m L。取经28℃培养24~48h的白色念珠菌液体培养物1m L, 分别加9m L 0.9%无菌氯化钠溶液, 10倍逐级地稀释至菌数小于100cfu, 做菌液组计数, 备用[2]。
取经28℃培养7d的黑曲霉斜面培养物, 加3~5ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子, 吸取霉菌孢子液1m L加9m L 0.9%无菌氯化钠溶液, 10倍逐级地稀释至菌数小于100cfu, 备用。
2.2 检查法:薄膜过滤法
取6瓶供试品, 分别取半量/瓶, 按薄膜过滤法处理, 滤过, 然后将相应的培养基100m L加入到滤筒内, 加入相应的实验菌, 作为试验样品[3]。另取1个滤筒不滤样品, 然后将相应的培养基100m L加入滤筒内, 加入等量的实验菌作为阳性对照, 六种验证菌同法操作。各试验管按相应规定温度培养3~5d, 观察实验菌生长情况。
3 无菌检查法验证试验:
3.1 试验组
取供试品12瓶, 分别置于6个滤筒中过滤 (每筒2瓶) , 冲洗液用量为每筒500m L, 每次100m L, 在最后一次冲洗液中分别加入1m L已制备好的上述6株菌菌液 (约为10~100个/筒) , 再加入相应的等量培养基100ml, 按规定条件培养3~5d, 逐日观察, 见表2。
注:接种管1表示:样品加阳性菌;接种管2表示:0.2mo/L Mn SO4加阳性菌;接种管3表示:阳性菌;+表示:有菌生长
3.2 对照组
另取6个滤筒, 分别加入1m L相应试验菌, 再加入相应的等量培养基, 作为对照, 按规定条件培养3~5d, 逐日观察。
3.3 供试品对照组
取供试品4瓶, 分别置于2个滤筒中过滤 (每筒2瓶) , 冲洗液用量为每筒500m L, 每次100m L, 再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和霉菌培养基, 按规定条件培养3~5d, 逐日观察。
3.4 空白对照组
取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和霉菌培养基, 按规定条件培养3~5d, 逐日观察。
3.5 阴性对照组
取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液适量, 分置两个滤筒中过滤, 再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和霉菌培养基, 按规定条件培养3~5d, 逐日观察。
4 结果
试验样品管、硫酸锰对照管同阳性菌管比较, 与阳性对照管内菌生长相似, 各试验菌均生长良好。
5 结论
本品按《中国药典》2010年版二部无菌检查方法验证试验进行验证, 可采用薄膜过滤法 (用0.1%蛋白胨水溶液500m L/膜, 少量多次冲洗) , 试验管中加入3m L0.2mol/L Mn SO4, 进行无菌检查。
摘要：建立呋喃西林溶液无菌检查方法。方法:按照《中国药典》2010年版二部附录提供的无菌检查法的要求进行验证试验。可采用薄膜过滤法 (用0.1%蛋白胨水溶液500ml/膜, 少量多次冲洗) 进行无菌检查。呋喃西林溶液采用微生物学检查法进行检查时, 临床使用可能不够安全, 建议参照2010年版《中国药典》要求, 通过方法学验证试验建立合理的无菌检验方法。
关键词：呋喃西林溶液,无菌检查,方法学验证
参考文献
[1]中国人民共和国药典 (二部) [S].北京:中国医药科技出版社, 2010, 附录, 104-105.
[2]中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社, 2010, 340-344.
[3]中国人民共和国药典 (二部) [S].北京:中国医药科技出版社, 2010, 附录, 109-110.
无菌检查法 篇2
作者:常州乐道于 2011-07-26 11:07:36 发表只看该作者
无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。
（1）沉降菌检测方法及标准：以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开平板盖，在空气中暴露30min后将平板盖好，置32.5℃士
2.5℃培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数平均小于1个。
（2）浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法机制的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定时校检，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其他培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5min，调节流量、转盘、转速。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.5℃士2.5培养48h，取出检查，浮游菌落数平均不得超过5个/m3。每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。
无菌操作台面或超净工作台还应定期检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测，并根据无菌状况必要时置换过滤器。
定期进行洁净度再验证：定期（每季度、半年、1年）或当无菌室设施发生重大改变时，要按国家标准GB/T16292-16294-1996《医药工业无菌室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度再验证，以确保洁净度符合规定，保存验证原始记录，定期归档保存，并将验证结果记录在无菌室使用登记册上，作为实验环境原始依据及趋势分析资料。并定期对无菌室的环境检测数据进行趋势分析和评估，根据评估结果，了解无菌室设施环境质量的稳定状况及变化趋势，决定是否有必要修订相应的警戒和纠偏限度。
定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的初效、中效、高效头：定期（至少每年1次）更换新的紫外灯管，以确保紫外灯管灭菌持续有效。并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。至少2年1次，或按无菌室验证实际情况，定期更换初效、中效、高效头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换记录，定期归档保存。
使用过程中应尽可能减少人员的走动或活动：平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，同向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
洁净度不符合规定时立即停止使用：发现洁净度不符合规定时，应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、必须经洁净度再验证符合规定后，才再使用，并同时将情况记录在无菌室使用登记册上，定期归档保存。
对进入的外来人员或维修人员进行指导和监督：非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。
无菌检查方法验证资料分析 篇3
1 资料及其他情况
1.1 无药品生产企业名称有9个, 占21%。
1.2 无验证环境洁净度记录39个, 占90%。
1.3 无培养基适应性检查有40个, 占93%。
1.4 无菌种记录或其记录不全 (未标明代数、菌种不全或仅用1株菌种) 有34个, 占79%。菌液无接种量 (个数) 记录有19个, 占44%。
1.5 无培养观察天数表格记录有3个, 占7%。
1.6 无验证结论有7个, 占16%。
2 讨论
2.1 药品生产企业提供验证资料应该有药品生产企业名称及电话号码、药品名称, 验证单位及药品质负责联系人。电话号码是索取方法验证资料重要来源, 也是检验者与药品生产企业技术人员商讨验证资料中不明确的技术问题的重要途径。药品生产企业名称是表明药品的来源所属, 也是验证资料的来源所属。同一药品, 不同的生产企业, 验证结论 (相应品种的无菌检查方法) 是不同的, 也是再次检查同一生产企业生产同种药品的重要依据。无验证资料, 无菌检查项目就无法进行, 故不可缺少。
2.2 验证环境洁净度记录。《中国药典》2005年版规定, 无菌检查应在环境洁净度10000级以下的局部100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行, 其全过程必须严格遵守无菌操作, 防止微生物污染[2]。不记录环境洁净度, 表明验证资料不够全面, 难以相信洁净室 (区) 是否符合要求。
2.3 培养基适应性检查包括无菌性检查和灵敏度检查。无菌性检查, 是检查配制好的培养基是否达到消毒灭菌的目的;灵敏度检查是检查培养基是否适合于《中国药典》2005年版规定的各种菌株接种量 (菌量应小于100 cfu/ml) 是否生长良好, 以监控培养基的质量。培养基的质量好坏, 稳定与否, 对检验结果有极为重要的影响。但因培养基的配方中各原料成分理化性能、稳定性不同, 致使检验结果也有较大的差异, 即使是同一个厂家生产的同一型号的原料产品, 各个批号之间质量都有较大的差异, 加之各地实验室配制的培养基方法不一, 同一实验结果常有显著不同[3]。现在绝大多数药品生产企业和药品检验机构用的都是干燥培养基。据了解有的药品生产企业在配制培养基时, 不按操作规程消毒灭菌, 难以保证消毒灭菌的目的, 难以保证培养基的质量。故做无培养基适应性检查是十分必要的。
2.4 菌种及菌液 (个数/ml) 制备记录是验证资料完整之中不可缺少的一项, 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]。传代次数越多, 有些菌株容易产生变异、衰退, 难以保证应有的生物学特性。这将影响硫乙醇酸盐培养基及改良马丁培养基的灵敏度检查 (验证培养基质量是否符合要求) 、直接接种法、薄膜过滤法的验证试验和无菌检查的阳性菌对照试验, 然而有些验证资料未注明代数及菌液制备方法。
2.5 培养观察记录在验证资料中是至关重要的内容。有些验证资料记录, 培养1 d就长出了肉眼观黑曲霉和白色念珠菌, 这显然不符合实际的, 通常这两株菌和细菌相比较, 生长缓慢、微弱。笔者认为培养1 d, 肉眼是难以观察, 最少需要培养2 d才可见生长。有些验证资料缺乏观培养观察记录内容, 这显得验证资料的真实性差, 没有连贯性。验证结论缺乏可靠性。
2.6 无菌检查目的, 既要保证标准 (Ch.P.2005) 规定的所有阳性对照菌正常生长, 又要准确无误检查样品染菌情况[5]。验证结论是检查药品的重要依据, 是进行无菌检查的可靠的方法, 是否详细明确, 直接关系到验证结论是否具有可操作性, 检验结果的准确性和可靠性。没有验证结论 (如规格500 ml 10%葡萄糖注射液) 或验证结论不明确的验证资料, 给检验工作者带来麻烦, 甚至难以理解。如像这样一些结论, 规格2 ml穿心莲注射液:本品按国家药品标准检查, 结果符合规定;规格2 ml复方大青叶注射液:根据上述结果由于采用直接接种法进行复方大青叶注射液的无菌检查, 存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长有抑制作用。因此, 复方大青叶注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查中的薄膜过滤法进行, 冲洗量规定300 ml等, 没有明确样品检验数量 (最少检验数量+作阳性对照菌所需样品的量) 、方法或方法叙述不简洁, 没有采用何种阳性菌、培养观察时间和结果判断。
3 建议
3.1 菌液 (个数/ml) , 洁净室环境、培养基灵敏度检查、直接接种法以及薄膜过滤法的培养观察记录不要用文字叙述, 最好以表格方式记录, 一目了然, 真实可靠, 容易理解。
3.2 菌液制备方法一般药检人员都是清楚的, 不要照抄药典, 照抄药典显得验证资料冗长不简洁, 一般叙述为按《中国药典》2005年附录××页方法制备即可。如果与药典方法有差异, 应详细描述。
3.3 验证结论, 叙述不能含糊不清, 要简明扼要, 准确, 突出有可操作性。验证方法结论应包括样品取样量、样品处理、接种方法, 采用何种阳性对照菌、培养观察记录及结果判断等内容。例1、规格:10 ml/支颈宁A注射液的无菌检查, 直接接种法:取11支供试品各2 ml分别加至含硫乙醇酸盐培养基10支及改良马丁培养基10支的试管中;于第11支硫乙醇酸盐培养基中加2 ml供试品及小于100 cfu的金黄色葡萄球菌作为为阳性对照。按规定培养14 d, 供试品管均澄清, 阳性对照管生长良好, 判为供试品符合规定。例2、规格40 mg/瓶注射用奥美拉唑钠的无菌检查, 取供试品30瓶溶于100 ml升0.9%氯化钠注射液中, 按薄膜过滤法滤至一次性全封闭的三个滤器中, 用0.1%蛋白胨冲洗3次, 每次300 ml, 冲毕。于两个滤器中加入硫乙醇酸盐培养基 (其中一个滤器加入小于100cfu的金黄色葡萄球菌作为阳性对照) , 另一个滤器加入改良马丁培养基。按规定培养14 d, 供试品管均澄清, 阳对照管生长良好, 判为供试品符合规定。以上两个结论比较完整, 具有可操作性。
3.4 要进一步完善网络资源共享, 虽然抗生素工作网站有少部分无检查验证方法, 远远达不到检验工作的需要。为了减少浪费, 避免传真资料字迹模糊不清, 效果差, 甚至缺页或半页, 故建议全国各地药检所, 药品生产企业, 验证单位将药品生产企业名称、电话号码、药品名称及规格, 验证结论 (无菌检查方法) 等, 输入在网上, 便于查询。
参考文献
[1]中国药典.二部, 2005:90.
[2]中国药典.二部, 2005:89.
[3]马绪荣, 苏德莫.药品微生物学检验手册.科学出版社, 2000:380.
[4]中国药典.二部, 2005:94.
无菌检查法 篇4
为进一步加强无菌和植入性医疗器械（含高值医用耗材）日常监管，全面落实企业主体责任，保障无菌和植入等高风险医疗器械安全有效，根据《XX市市场监督管理局关于印发〈XX市开展无菌和植入性医疗器械监督检查实施方案〉的通知》（X市监〔2020〕X号）要求，结合我县新冠肺炎疫情防控情况及医疗器械经营企业分类分级监督管理工作实际，特制定本方案。
一、检查目标
进一步强化经营企业和使用单位的主体责任，全面提升质量管理意识和水平，加强风险防控和质量管理，保障医疗器械质量安全；严格落实“四个最严”要求，监管职责履行到位，监管不留死角，依法严厉查处违法违规行为，保证公众用械安全。
二、检查对象
全县所有的一次性无菌和植入性医疗器械经营使用单位，其中对批发（含批零兼营）企业及二、三级医疗机构的监督检查达到全覆盖，其余一次性无菌和植入性医疗器械经营和使用单位的监督检查不低于企业总数的15%。
三、检查重点
（一）重点品种。
无菌和植入医疗器械，特别是高值医用耗材、新冠疫情防控使用的医疗器械、医用防护服、医用口罩等产品。（二）重点企业。
存在同年多批次、多年同品种、多年多品种抽检不合格情形的企业；既往监督检查、飞行检查存在严重缺陷项或者整改不到位的企业；企业培训不到位、自查不彻底，未按要求提交自查报告或自查报告流于形式的企业；其他可能存在严重安全隐患、需要重点关注的企业。（三）重点环节。
依据《医疗器械监督管理条例》《医疗器械经营监督管理办法》《医疗器械经营质量管理规范》《医疗器械冷链（运输）管理指南》《医疗器械使用质量监督管理办法》对重点环节进行检查。1.流通环节检查重点。一是有无未经许可（备案）从事经营（网络销售）医疗器械行为；二是有无经营（网络销售）未取得注册证或者备案凭证的医疗器械行为；三是有无经营无合格证明文件以及过期、失效、淘汰的医疗器械；四是购销渠道是否合法；五是进货查验记录和销售记录是否真实完整，相关信息是否能够追溯；六是运输、储存条件是否符合标签和说明书的标示要求，经营需冷链管理的医疗器械是否配备相适应的设施设备；七是履行医疗器械不良事件监测的相关义务是否到位。
2.使用环节检查重点。一是有无购进、使用未依法注册或者备案、无合格证明文件以及过期、失效、淘汰的医疗器械行为；二是有无建立覆盖质量管理全过程的使用质量管理制度；三是有无严格查验供货商资质和产品证明文件；四是对无菌和植入类医疗器械是否建立并执行使用前质量检查制度；五是有无建立植入和介入类的医疗器械使用记录，植入性医疗器械使用记录是否永久保存，相关资料是否纳入信息化管理系统达到可追溯；六是储存条件是否符合标签和说明书的标示要求，对需冷链管理的医疗器械是否配备相适应的设施设备；七是医疗器械不良事件监测相关义务是否履行到位。
四、检查时限
（一）单位自查（5月至6月）。
无菌和植入性医疗器械批发经营企业和二、三级医院在全面自查的基础上，分别填写自查表（附件1、2），自查表须法定代表人（负责人）签字，明确表述对自查报告的真实性、准确性和完整性负责并加盖单位印章（6月30日前将自查表报送至各所留存一份，交局药械股一份）。（二）监督检查（7月至11月）。
各所、队在经营使用单位自查的基础上对本辖区内一次性无菌、植入性医疗器械经营使用单位进行监督检查。对未提交自查报告和自查报告弄虚作假的单位，应当严格监管，对于存在违法违规行为的从重处罚。此项工作县局将纳入对各所、队的年终目标绩效考核，并适时对各所、队开展监督检查情况进行抽查。五、工作要求
（一）精心组织，严格监管。
各所、队务必高度重视，精心组织，要结合本地实际，明确检查目标和范围，突出工作重点，有针对性地开展监督检查工作，保证监督检查工作效果。要由局药械股牵头，各所配合，遴选4-6家经营、使用单位进行示范建设，整理完善相应资料，做好迎接上级药品监管部门调研座谈活动准备。（二）夯实责任，提升水平。
局药械股及各所要组织对无菌和植入性医疗器械经营企业负责人、质量管理人员进行法律法规、业务知识等培训，督促经营使用单位认真开展内部自我培训学习，通过多种方式，切实提升企业自身质量体系管理能力，同时督促企业积极参加省局、协会举办的相关培训，不断提升企业内部管理水平，全面落实企业主体责任。（三）完善机制，拓宽渠道。
各所、队要通过各种渠道收集安全风险信息，及时研判风险状况并上报风险信息，要主动沟通，加强配合，切实消除医疗器械质量安全隐患。要加强宣传，接受公众和舆论监督，鼓励有奖举报，形成社会共治合力，并从投诉举报中挖掘有价值的违法违规案件线索。（四）密切配合，建立机制。
各所、队要及时报送工作动态和案件查处信息，加强工作分析和总结，探索建立长效机制，并于2020年11月15日前将监督检查总结报告报送局药械股。总结报告应当包括对本区域内医疗器械经营和使用环节检查情况、检查发现的主要问题、处理措施、相关意见和建议等。无菌检查法 篇5
米卡芬净钠(Micafungin Sodium)是一类新型水溶性棘白菌素类脂肽,由日本藤泽公司开发,是继默克公司的卡泊芬净(科赛斯)之后FDA批准的第二种棘白菌素类抗真菌药物。米卡芬净钠是真菌细胞壁主要构成成分1,3-β-D-葡聚糖合成过程非竞争性抑制剂。它对曲霉菌属和念珠菌属所引起的深部真菌感染有广谱的抗菌作用,对伊曲康唑和氟康唑耐药念珠菌也有很强的体外抑菌作用,对曲霉菌属的芽孢发芽和菌丝的生长均有一定程度的抑制作用,目前应用于曲霉菌属和念珠菌属所导致的深部真菌感染。米卡芬净钠在体内分布非常广泛,血浆和组织中的浓度较高,主要在肝脏内进行代谢,再经胆汁排泄,和其他药物的相互作用少。对口咽及食道念珠菌病的治愈率为92%,对念珠菌血症治疗的临床好转率为92%,并对各类侵袭性曲霉菌感染有很好的疗效。同时表现出很好的耐受性,也没有与剂量或作用持续时间相关的毒性[1]。
从临床用药的安全性考虑,需对注射用米卡芬净钠进行无菌检查。因为米卡芬净钠为具有抗菌活性的注射用粉针剂,故在进行无菌检查时必须要用适宜的方法消除其抗菌作用,从而保证检查结果的准确性和可靠性。如采用薄膜过滤法对米卡芬净钠进行无菌检查时需要要用冲洗液将滤膜进行冲洗,目的是在保证所有阳性对照菌均正常生长的前提下,检查染菌率。由此可见,具有抗菌活性的注射用粉针剂的敏感菌的选择,选用何种冲洗液,以及冲洗液的冲洗量等对其无菌检查至关重要:选择恰当的敏感菌不但可简化实验步骤,还可避免假阴性,提高染菌的检出率。哪种冲洗液能够使吸附在滤膜上的样品,最大程度的解吸附;冲洗量大时,会使虑膜的通透性增加或损伤菌体,会导致漏检;冲洗量少时,不能消除抗生素的抑菌作用,因而会出现阳性对照菌不生长的现象,同样会导致漏检。因此,在能消除敏感菌抑菌作用的情况下,应选用尽量少的冲洗量。目前,2015年版《中华人民共和国药典》该品种项下敏感菌的选择、冲洗液及冲洗量均无具体规定。为此,笔者按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1101无菌检查法项下的原则性要求进行试验[2],确定了注射用米卡芬净钠无菌检查的具体条件,弥补了检验标准的不足。
1 仪器与材料
1.1 仪器
millipore集菌仪(泵速设为120 r/min,密理博中国有限公司),配全封闭三联集菌培养器(密理博中国有限公司),恒温培养箱(Binder)。
1.2 药品
注射用米卡芬净钠,规格为按C56H71N9O23S计:50 mg,批号为20150901,20150902和20150903。
1.3 培养基和试剂
胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:160216)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:160215)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号:160215)、硫乙醇酸盐流体培养基(批号:160216)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:1602216)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:160216)、酵母浸粉等均由北京奥博星公司提供。吐温80由南京化学试剂厂提供。
1.4 试验用菌种
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]和黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 试验菌株菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,35℃培养18 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中,25℃培养28 h。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上,25℃培养5 d,加入含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。上述培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数小于100 cfu/m L的菌悬液。
2.2 无菌检查方法
2.2.1 方法一
取供试品15支,每支用10 m L生理盐水溶解后,转移至p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,稀释至300 m L,作为供试品溶液,采用薄膜过滤法,全量通过三联集菌培养器。用p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,每个虑筒每次注入100 m L冲洗液,振摇荡洗筒壁,排空后再循环操作,在最后一次冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养,培养时间不超过5 d。各试验菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌)同法操作。逐日观察,记录冲洗量为每筒300,700和1 000 m L时培养基中各菌的生长情况,并与对照桶比较。
2.2.2 方法二
另取本品10支,每支用10 m L生理盐水溶解后,转移至含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,稀释至200 m L,摇匀,全量通过二联集菌培养器。随后用含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,每个虑筒每次注入100 m L冲洗液,振摇荡洗筒壁,排空后再循环操作,在最后一次冲洗液中分别加入小于100 cfu的白色念珠菌和黑曲霉菌菌悬液(每筒加一种菌),过滤,再向两个筒内各注入含1.2%酵母浸粉[3]的胰酪大豆胨液体培养基100 m L。置25℃下培养5 d,逐日观察,记录冲洗量为每筒300和700 m L时各菌生长情况,并与对照比较。
2.2.3 方法三
另取本品10支,每支用10 m L生理盐水溶解后,转移至含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,稀释至200 m L,摇匀,全量通过二联集菌培养器。随后用含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,每个虑筒每次注入100 m L冲洗液,振摇荡洗筒壁,排空后再循环操作,在最后一次冲洗液中分别加入小于100 cfu的白色念珠菌和黑曲霉菌菌悬液(每筒加一种菌),过滤,再向两个筒内各注入胰酪大豆胨液体培养基100 m L。置25℃下培养5 d,逐日观察,记录冲洗量为每筒300和700 m L时真菌生长情况,并与对照比较。
3 结果
方法一试验结果如表1所示,供试品组中白色念珠菌和黑曲霉在培养第5日仍未见生长,其余各细菌均在48 h内生长;对照组中各试验菌均在48 h及72 h内生长良好,表明本品对真菌的抑制作用仍未去除。
方法二试验结果如表2所示,冲洗量700 m L的供试品组中白色念珠菌在培养第2日可见有白色培养物出现,黑曲霉在培养第3日可见薄膜上有霉菌菌落出现,表明用含1.2%酵母浸粉的胰酪大豆胨液体培养基,在冲洗量700 m L时,可以中和残留的米卡芬净钠对真菌的抑制作用。
方法三试验结果如表3所示,冲洗量300 m L的供试品组中白色念珠菌在培养第2日可见有白色培养物出现,黑曲霉在培养第3日可见薄膜上有霉菌菌落出现,表明以含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗的方法,在冲洗量300 m L时可以祛除滤筒内残留的米卡芬净钠对白色念珠菌和黑曲菌的抑制作用。
4 结论
方法二和方法三均可检出全部阳性菌,为减少冲洗量,简化实验操作,故采用方法三进行无菌检查,即以含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液,冲洗量为每筒300 m L,以硫乙醇酸盐流体培养基作为厌氧菌和需氧菌检查培养基,以胰酪大豆胨液体培养基作为真菌和需氧菌培养基,本品的抑菌活性可以消除或忽略,所有菌均生长良好,该方法可行。以白色念珠菌或黑曲霉菌作为敏感菌。
5 讨论
由于米卡芬净钠是一种半合成脂肽类化合物,能非竞争性的抑制真菌细胞壁的必需成分β(1,3)-D-葡聚糖合成酶的生物活性,从而使真菌不能正常的产生β(1,3)-D-葡聚糖,对念珠菌属和曲霉菌属具有强大的抑菌作用,故药物在滤膜上稍有残留就会抑制白色念珠菌和黑曲霉的生长和繁殖。加入酵母浸出粉是采用中和的方式,酵母浸粉中富含β葡聚糖、甘露聚糖等,通过外源补充β(1,3)-D-葡聚糖的方式,使白色念珠菌和黑曲霉孢子利用外源葡聚糖合成细胞壁,保证其生长繁殖,但该方法冲洗量为每膜700 m L。用含1%吐温80的冲洗液是采用加入表面活性剂的方法,该方法冲洗量仅为每膜300 m L。考虑到在冲洗量大的情况下,会使膜的通透性增加,或是损伤菌体,从而导致漏检,出现假阴性结果,因此采用方法三,即以含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液的方法进行该品种的无菌检查。
摘要：根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1101无菌检查法,采用薄膜过滤法,以含1%吐温80和不含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液,当冲洗量分别为每膜300,700和1 000 m L时,以硫乙醇酸盐流体培养基作为厌氧菌和需氧菌检查培养基,以含1.2%酵母浸粉或不含1.2%酵母浸粉的胰酪大豆胨液体培养基作为真菌和需氧菌检查培养基,考察金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉的生长情况。文章研究结果以含1%吐温80的p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液,冲洗量为每筒300 m L,以硫乙醇酸盐流体培养基作为厌氧菌和需氧菌检查培养基,以胰酪大豆胨液体培养基作为真菌和需氧菌培养基,所有菌均生长良好。该方法可消除注射用米卡芬净钠的抗菌作用,白色念珠菌或黑曲霉菌可作为注射用米卡芬净钠的敏感菌株。
关键词：米卡芬净钠,无菌检查,薄膜过滤法,方法验证
参考文献
[1]陈頔,曹国颖.棘白霉素类抗真菌药的研究进展[J].中国新药杂志,2007(14):1082-1087.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[M].北京:化学工业出版社,2015.
无菌检查法 篇6
灭菌是用适当的物理或化学手段杀灭产品中一切活的微生物的方法;而消毒是杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。
无菌是指产品中不含任何活的微生物(包括细菌、真菌、病毒及芽孢)。然而,对于任何一批灭菌产品来说,绝对无菌是无法保证。已灭菌产品的无菌标准一般以物品灭菌后微生物存活的概率-无菌保证水平SAL(Sterility Assurance Level)表示。最终灭菌产品微生物存活的概率不得高于10-6(即100万件产品灭菌之后,只能允许有1件或以下可能有活的微生物存在),已灭菌产品的无菌保证状况可以通过验证实验证明[2]。
与粘膜、血液接触或植入到体内的医疗器械(例如一次性注射器、心脏导管、吸引管、人工关节、伤口护理敷料、血管支架、组织工程皮肤等)都要按照标准要求进行彻底灭菌。倘若这类医疗器械没有按照要求灭菌,非常容易引起感染,甚至导致生命危险。因此,灭菌工艺的控制和灭菌检测是保证医疗器械安全的一个关键环节。
1 灭菌方法
1.1 湿热灭菌
湿热灭菌是将产品放在压力锅内,利用饱和蒸汽在最小温度为121℃的压力下,热力和湿气被迅速传递给灭菌产品,灭菌时间至少15min。蒸汽潜热大,可迅速提高物体的温度,水分子穿透力强,容易使蛋白质凝固变性,所以湿热灭菌是热力灭菌中最常用、效果较可靠的一种灭菌方法。适用于湿热灭菌的医疗器械有:衣服、被单、聚四氟乙烯、外科手术器械、硅橡胶、聚丙烯、环氧树脂等。但对一些不耐高温的聚合物如聚氨酯等,承受不了这样的高温,只能采用其他的灭菌方法。
1.2 干热灭菌
干热灭菌是将产品放于热空气箱中、利用干热空气的氧化作用,杀灭一切活的微生物或消除热原的方法。干热灭菌通常使用的温度较高,范围在160~250℃,依据其使用的温度,暴露的时间可达2h。干热灭菌条件一般为160×120min以上、180℃×60min以上或250℃×45min以上,也可采用其它温度和时间参数。实际应用中,干热灭菌的适用范围十分有限,一般应用于耐高温的玻璃器具和金属外科器械,另有些产品不仅要求达到必要的无菌水平,还要消除细菌内毒素(热原物质),应用其他的灭菌方法很难消除细菌内毒素,而干热灭菌的温度时间参数设置在250℃×45min,可以除去玻璃器具的热原物质。
1.3 环氧乙烷灭菌
环氧乙烷灭菌是医疗器械领域比较常用的灭菌方法,环氧乙烷灭菌原理是通过其与蛋白质分子上的巯基(-SH)、氨基(-NH2)、羟基(-OH)和羧基(-COOH)以及核酸分子上的亚氨基(-NH-)发生烷基化反应,造成蛋白质失去反应基团,阻碍了蛋白质的正常生化反应和新陈代谢,导致微生物死亡,从而达到灭菌效果。
环氧乙烷灭菌时,灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间都是影响灭菌效果的重要参数。一般采用的灭菌条件:温度(55±10)℃、相对湿度(60±10)%、灭菌压力8×105Pa灭菌时间120min。环氧乙烷是一种烷化剂,穿透力强,能够使用各种包装材料,在常温下能杀灭各种微生物(包括细菌、芽孢、病毒、真菌孢子等)[4]。适用于生物医用高分子材料,比如天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯及聚氯乙烯等。环氧乙烷灭菌器包括一个防泄漏、防爆炸的钢制腔室,首先将灭菌腔内抽成真空,通过蒸汽调节腔内的物料温度和湿度,然后进一步抽真空,再通入经过预热的环氧乙烷气体。包装材料必须是对空气、蒸汽及环氧乙烷渗透性良好的,这样容易达到适宜的灭菌条件。由于环氧乙烷具有潜在的致癌性、致突变性、急性毒性反应,为了工作人员的安全,应在灭菌过程中,严密监控大气浓度和腔室的温湿度、压力、环氧乙烷气体浓度及灭菌时间。灭菌效果通常使用生物指示剂来监控[8,9]。灭菌器的控制具有一定难度,整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌处理后,应通入过滤后的无菌空气,经历真空空气循环过程,使残留环氧乙烷安全去除。
1.4 辐射灭菌
辐射灭菌是将灭菌产品放于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射产生自由基通过控制辐射条件而达到杀灭微生物的方法。灭菌用的γ射线通常以钴Co-60或铯Cs-137作为放射源,发生衰变时发射出1.33MeV和1.17MeV两个能级的射线,使微生物DNA受到不可恢复的损失,达到人们所需要的目标[3]。辐射灭菌通常用于外科器具、人工假体、注射器和缝合线等。
用辐射灭菌法灭菌的无菌产品其SAL应≤10-6,γ射线辐射灭菌监控的参数主要是辐射剂量。辐射剂量是依据标准细菌芽孢(短小芽孢杆菌芽孢)所允许的灭菌剂量计算值算出来的,同时应考虑灭菌产品的适应性,验证辐射剂量的有效性及安全性。辐射灭菌使用的剂量通常为25kGy。对某些医疗器械应在保证无菌的前提下尽可能采用低辐射剂量灭菌。钴Co-60辐射灭菌法验证时,除用生物指示剂验证试验外,还需要确认空载和装载时灭菌腔室内辐射剂量的分布图、灭菌产品的均一性、灭菌物品的吸收剂量及最大和最小吸收辐射剂量的分布、灭菌腔内产品的装载方式等[5,6]。
1.5 低温等离子体灭菌
低温等离子体灭菌是最近几年才发展起来的新的低温灭菌技术。等离子体是气体或蒸汽受电场或磁场影响,使大部分分子发生离子化而形成的。等离子体灭菌器是由电源、激发原、气原、传输系统和灭菌腔室组成,抽真空后通过水蒸汽,蒸汽在电场作用下转变为等离子体。等离子体灭菌优点是杀菌效果可靠、作用温度低、灭菌后的器械不需要放置空气中去除残留气体,无腐蚀性[7]。目前,许多国家已开始应用这种技术,主要用于不耐热的医疗器械。
2 灭菌工艺验证
灭菌工艺的验证是无菌保证的必要条件,灭菌产品的无菌保证取决于生产过程中适宜的的灭菌工艺、规范的GMP管理和严格的质量管理体系。灭菌工艺的确定应综合考虑生物负荷检测、环境监测、灭菌程序验证和无菌检查等。
2.1 生物负荷检测
生物负荷是指产品中微生物数量或浓度,无菌产品所能达到的无菌保证水平取决于灭菌工艺及灭菌前的生物负荷。怎样在制造过程中减少微生物污染的概率就显得格外重要,因此,有必要使用高质量的原材料,制造环节尽量使用不利于微生物生长的条件,比如提高温度、降低PH值等。
2.2 环境监测
为了保证微生物数量不超过规定限度,必须监控生产操作范围的微生物的水平。微生物可以从工作台面、固定设备和仪器的任何环节传播到产品中。因此,任何微生物可能聚集的死角都必须清除,所有的工作操作区域都必须保持干净、干燥和整洁。空气中掉落的微生物的尘埃和颗粒是常见的污染途径之一,空气中细菌、霉菌的数量的监测是将营养琼脂平皿置于空气中暴露一定的时间,孵育后计数菌落算出来的。
操作人员是另一个潜在的污染源,操作人员的衣服、手套和面罩都应取样,进行微生物种类与数量的评估,有必要对工作人员进行微生物学知识的培训。
2.3 灭菌程序验证
灭菌程序验证是无菌产品灭菌操作过程中最复杂、最重要的环节。通常的灭菌程序验证需要撰写灭菌程序验证方案及制定评估相关标准,确认灭菌设备及监控设备在规定的参数范围内正常运行,提供依据以证实灭菌能达到预期效果,结合生物负荷使用生物指示剂,在“极差”的情况下灭菌工艺仍能达到无菌保证水平,上述检验需要至少三次及以上来证明结果的重复性和稳定性,综合上述结果,撰写验证报告。用于灭菌工艺中的生物指示剂是标准化的细菌芽孢制备品,它所应用的细菌种类须经严格挑选,非致病性,对特定灭菌工艺的耐受能力高于平均水平(表1)。
注:D值即生物指示剂芽孢十倍致死时间
日常生产中,应对灭菌程序的运行情况进行监控,确认关键参数(如温度、压力、时间、相对湿度、灭菌气体浓度及辐射剂量等)均在验证确定的范围内。灭菌程序应定期再验证。当灭菌程序发生变更(包括灭菌物品装载方式和数量的改变)时,应进行再验证。
3 无菌检查
无菌检查试验是通过将医疗器械或其浸提液接种于培养基内的方法来评价灭菌后的医疗器械是否有未杀死的微生物。依据《中国药典》,无菌检查试验主要有直接接种法和薄膜过滤法两种。
3.1 浸提液制备方法
(1)管类器具:按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质,流量约为10mL/min。(2)容器类器具:容器内已装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液;空容器按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1mL,振摇数次。(3)实体类器具:实体类器具按表面积每10cm2加入浸提介质1mL,振摇数次。
3.2 直接接种法
将产品或其有代表性的部分直接投放入营养培养基内。药典推荐两种培养基:(1)硫乙醇酸盐流体培养基内含有葡萄糖和巯乙醇酸钠,在30~35℃温度下培养,适宜于需氧细菌和厌氧性微生物的生长;(2)改良马丁培养基在23~28℃培养,适宜于真菌的生长。
3.3 薄膜过滤法
当产品不适宜直接投放或产品有抑菌成分就要采用薄膜过滤法。具体做法是先进行无菌验证,然后用无菌氯化钠溶液或其他有机溶剂浸提产品,使浸提液通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器,然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜。之后将硫乙醇酸盐流体培养基与改良马丁培养基分别加至薄膜过滤器内(封闭式过滤器),或取出滤膜,分别加入上述二种培养基中,按药典规定的温度和时间培养。
3.4 结果判断
当阳性对照管显浑浊并确证有细菌生长,阴性对照管呈阴性时,可根据观察所得的结果判定:如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格;如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长,应重新加倍取样复试,除阳性对照管外,其他各管均不得有菌生长,否则应判供试品不合格[1]。
无菌检查不能保证每批产品的无菌,但它是产品出厂前的最后一道检查程序,坚持进行无菌检查有助于提高灭菌工艺及无菌操作效果的可信度。
参考文献
[1]中华人民共和国药典(2010年版)北京:中国医药科技出版社,2010.
[2]袁洽劻，凌波.实用消毒灭菌技术[M].北京:化学工业出版社,2002.
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[5]朱南康,王春雷,滕维芳.医疗器械辐射灭菌的现状及进展[J].核技术.2003(.03):189-196.
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[7]李莹,李柯,陈杰瑢,等.低温等离子体杀菌消毒技术的应用进展[J].化工进展.2004(.07):718-722.
[8]ISO 11135-1:2007 Sterilization of health care products--Ethyleneoxide--Part 1:Requirements for development,validation and routine controlof a sterilization process for medical devices.
无菌检查法 篇7
关键词：复方硫酸锌滴眼液,无菌检查,方法学验证
复方硫酸锌滴眼液对革兰阳性菌及革兰阴性菌均具有抑制作用, 用于治疗结膜炎、沙眼等眼部感染, 是临床常用药物。为有效控制药品的质量, 保证无菌检查方法的科学性和检验结果的准确性。根据《中国药典》2010年版[1]附录无菌检查的要求, 建立复方硫酸锌滴眼液的无菌检查方法, 并对其进行方法学验证。
1 材料
1.1 培养基与试剂
硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、蛋白胨、肉汤培养基。以上均为北京三药生产。
1.2 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26 003]、大肠埃希氏菌[CMCC (B) 44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63 501]、生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]、白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]、黑曲霉[CMCC (F) 98 003]。
1.3 样品
复方硫酸锌滴眼液 (哈尔滨医科大学附属第一医院, 批号:20101123, 20101124, 20101125规格:5m L/支) 。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
取经30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物各1m L、取经23～28℃培养24～48h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1m L、30～35℃培养18～24h的生孢梭菌的硫乙醇酸盐液体培养物1m L, 分别加入0.9%无菌氯化钠溶液9m L中10倍依次稀释至浓度约为10～100cfu/m L;取经培养5～7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物, 加入含0.05% (m L/m L) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5m L, 将孢子洗下, 摇匀, 吸取
1m L至无菌试管中, 用含0.05% (m L/m L) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至浓度约为10～100cfu/m L, 备用。
2.2 方法验证
2.2.1 试验组
取供试品60支, 分别置6个滤筒过滤 (每筒10支) , 冲洗液用量为每筒300m L, 分次冲洗并在最后一次冲洗液中分别加入1m L已制备好的上述6株菌液, 再加入相应的培养基100m L, 按规定条件培养3～5d, 逐日观察。
2.2.2 菌液组
另取6个滤筒, 加入相应的等量培养基, 分别加入1m L各试验菌液, 按规定条件培养3～5d, 逐日观察。
2.2.3 供试品对照组
取供试品20支, 置2个滤筒中过滤 (每筒10支) , 冲洗液用量为每筒300m L, 再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100m L, 按规定条件培养3～5d, 逐日观察。
2.2.4 阴性对照组
取试验用0.1%无菌蛋白胨水溶液300m L, 分置两个滤筒中过滤, 再分别加入硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基, 按规定条件培养3～5d, 逐日观察。
注:“+”表示微生物生长良好, “-”表示无微生物生长
3 讨论
眼用药剂是指用于治疗和诊断眼疾直接用于眼的各类剂型。包括滴眼剂、洗眼剂、眼膏剂、眼用注射剂以及眼用膜剂和接触眼镜等。虽然眼用药剂 (除眼用注射剂外) 均非直接进入组织或血液, 但由于眼组织较为娇嫩, 一旦受损后果严重, 因此眼用药剂不同于一般的外用制剂, 均要求无菌以保证用药安全。因此《中国药典》2010年版中要求眼用制剂以无菌检查法取代微生物限度检查。
复方硫酸锌滴眼液主要成分为盐酸小檗碱、硫酸锌和硼酸, 具有一定的抗菌作用, 可与细菌DNA形成复合物, 从而影响DNA的复制, 干扰细菌生长繁殖;对革兰阳性菌及革兰阴性菌如痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌、结核杆菌等都有抑制作用;并能增强人体白细胞的吞噬功能。用于治疗结膜炎、沙眼等眼部感染。
本试验采用薄膜过滤法对样品的无菌检查进行方法学验证, 以每株菌接种10支的样品量进行验证试验, 冲洗量选取以每筒300m L即可消除其抑菌作用。同时考察冲洗液、培养基对试验的影响, 以证明试验结果的可靠性。本试验建立的无菌检查方法准确、可行, 为临床用药安全提供有力保障。
参考文献
无菌检查法 篇8
1 仪器与试药
1.1 仪器
Htysteritest601集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)、HTY反复使用全封闭薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司),孔径为0.45μm、直径为5 cm的微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂),DG-2B多功能恒温箱(上海医疗器械厂);HWS-400型恒温恒湿箱(上海精宏实验设备有限公司);LDZX-40SCI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);101-2A型数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。
1.2 试验菌株
大肠埃希菌(escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、生孢梭菌(clostrididium sporogenes)[CMCC(B)64941]、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(aspergillus niger)[CMCC(F)98003](以上菌种均购于厦门市药品检验所,其中大肠埃希菌为第4代,其余菌均为第3代)。
1.3 培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基,以上均购于广东环凯微生物科技有限公司。
1.4 试药
磺胺醋酰钠滴眼液(解放军第一七五医院药剂科制剂室,规格:0.5%×8 ml,批号:100316、100401、100513),无菌氯化钠注射液(解放军第一七五医院药剂科制剂室,规格:0.9%×100 ml,批号:1000614)。
2 方法与结果
验证操作环境为10 000级洁净条件下的局部100级单向流空气区域内进行。
2.1 菌液的制备
取经35℃培养21 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1 ml,用0.9%的无菌氯化钠注射液稀释至含菌数约为50～100 cfu/ml的菌悬液,做活菌计数备用;取经35℃培养21 h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1 ml,用0.9%的无菌氯化钠注射液稀释至含菌数约为50～100 cfu/ml的菌悬液,做活菌计数备用;取经25℃培养48 h的白色念珠菌改良马丁培养物1 ml,用0.9%的无菌氯化钠注射液稀释至含菌数为50～100 cfu/ml的菌悬液,做活菌计数备用;取经25℃培养5～7 d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,用5 ml 0.9%的无菌氯化钠注射液洗脱下霉菌孢子,并将孢子悬液过滤至无菌试管内,吸取1 ml孢子悬液,用0.9%的无菌氯化钠注射液稀释至含孢子数为50～100 cfu/ml的孢子悬液,做活菌计数备用。每批试剂平行做2次。菌液制备结果,见表1。
2.2 方法的验证(薄膜过滤法)[4]
菌液组:将上述制备好的菌液各1 ml分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基(50 ml/支)和改良马丁培养基(50 ml/支)中。试验组:取相同批号供试品3瓶,按照《中国药典》2010年版无菌检查薄膜过滤法进行过滤,即吸取药液20 ml注入100 ml无菌氯化钠注射液中,过滤,并用5袋无菌氯化钠注射液(100 ml/袋)冲洗,在最后1袋冲洗液中加入相应的试验菌液1 ml,冲洗完后,取出滤膜,接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中。供试品对照组:方法同试验组,但不加试验菌。空白对照组:取同批配制的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各1支作空白对照。
按规定条件将上述培养基培养3～5 d,逐日观察。各试验菌的验证结果,见表2。
由以上试验结果可知,采用薄膜过滤法,用无菌氯化钠注射液作为溶剂和冲洗剂,即吸取20 ml供试品注入100 ml无菌氯化钠注射液中,过滤,用5袋无菌氯化钠注射液(100 ml/袋)冲洗,各试验菌均在规定时间3～5 d内生长良好,并与菌液组中相应的菌落生长情况相似,且供试品对照组和空白对照组均无菌落生长,故可采用薄膜过滤法用无菌氯化钠注射液作为溶剂和冲洗剂对磺胺醋酰钠滴眼液进行无菌检查。
3 讨论
磺胺醋酰钠滴眼液为短效磺胺类药物,含有磺胺醋酰钠成分,为广谱抑菌剂,抗菌作用虽弱,但能抑制大多数革兰阳性菌、沙眼衣原体以及部分革兰阴性菌。为消除该药的抑菌作用对试验结果产生的影响,笔者在选择无菌检查方法时选用薄膜过滤法,用500 ml无菌氯化钠注射液(100 ml/次)分5次冲洗,可消除其抑菌活性,并不损伤滤膜,结果可靠且操作简便,故可以用此法对其进行检验。
注:“+”表示反应呈阳性,“-”表示反应呈阴性。
参考文献
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[2]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录ⅪH.
[3]肖莉.酚磺乙胺注射液无菌检查的方法验证[J].中国药业,2008,17(4):38.
无菌检查法 篇9
无菌检查是注射用头孢地嗪出厂检验时的一个重要的安全性检查项目, 中国药典也明确规定了建立药品的无菌检查法时, 应进行方法学的验证, 以证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。依据中国药典2005年版增补本, 对头孢地嗪钠进行了三个批次的独立平行试验, 通过对药典规定的每一株试验菌的验证, 证明了所采用的方法能有效的去除头孢地嗪钠抑菌活性, 适合该药品的无菌检查。
1 试验材料与仪器
1.1 供试品:头孢地嗪钠 (批号为:A200905001、A200905002、A200905003)
哈药集团制药总厂生产。
1.2 培养基:由北京陆桥技术有限责任公司提供
硫乙醇酸盐流体培养基 (批号080707) ;改良马丁培养基 (批号080618) ;营养肉汤培养基批号 (0070126) ;玫瑰红钠琼脂培养基批号 (070315) ;营养琼脂培养基批号 (080424) 。
1.3 验证试验用菌种名称及其编号:由中国药品生物制品检验所提供
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC (B) 26003];枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501];大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC (B) 44102];生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941];白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98001];黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC (F) 98003]。
1.4 β-内酰胺酶 (酶活力不低于240万单位/ml) :由张家口市格瑞生物化学科技有限公司提供。
1.5 仪器和滤器:
杭州高得泰林责任技术有限公司提供HTY-2000A全封闭集菌仪、全封闭集菌培养器 (KSF330) 。
2 试验准备
2.1 菌液的制备及菌液计数:
2.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中, 于30~35℃培养18~24小时;分别取上述培养物1ml, 加至9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中, 10倍稀释至10-5~10-7, 制成每1ml含菌数小于100cfu/ml的菌悬液, 混匀备用。
2.1.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中, 于30~35℃培养18~24小时;取上述培养物1ml, 加至9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中, 10倍稀释至10-6, 制成每1ml含菌数小于100cfu/ml的菌悬液, 混匀备用。
2.1.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中, 于23~28℃培养24~48小时;取上述培养物1ml, 加至9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中, 10倍稀释至10-5, 制成每1ml含菌数小于100cfu/ml的菌悬液, 混匀备用。
2.1.4取经培养5~7天的黑曲霉改良马丁斜面琼脂培养物, 加入0.9%无菌氯化钠溶液3~5ml洗下孢子, 转移至无菌空试管中作为原液, 再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4~10-6, 制成每1ml含孢子数小于100cfu/ml的孢子悬液, 混匀备用。
2.1.5菌液计数:分别取上述四种细菌菌液1ml加入培养皿, 注入相应琼脂培养基18~20ml, 30~35℃培养48小时;取上述两种真菌菌液1ml加入培养皿, 注入玫瑰红钠琼脂培养基约18~20ml, 23~28℃培养72小时。每种菌液做平行2皿。
2.2 判断标准:每1ml菌液中含菌量小于100CFU。
2.3 试验记录:见表1。
3 试验操作
3.1 供试液制备:
取头孢地嗪钠10克, 分别将其溶解并转移至500ml 0.9%氯化钠溶液中, 制成约20mg/ml的供试溶液1份, 摇匀, 同法制备头孢地嗪钠供试液每批各6份, 混匀备用。
3.2 薄膜过滤。
3.2.1 取一个全封闭集菌培养器 (三筒) , 先用少量0.1%蛋白胨水溶液润湿滤膜, 排空后, 将上述其中1份供试液按薄膜过滤法平行加入3个滤筒中过滤 (每筒过滤供试液约330ml, 含供试品约3.3 g) 。
供试液过滤后, 夹住1筒弃掉不用, 剩余2筒, 每筒分别用0.1%的蛋白胨水溶液300ml冲洗滤膜, 每次各100ml, 每次冲洗液过滤前应充分振摇, 以消除筒壁及滤膜上吸附的药液;其中1筒冲洗液过滤后不加菌液, 先注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml, 作为本次试验的供试品对照, 供试品对照应无菌生长, 否则试验失败;另一筒在过滤最后一次冲洗液时, 向冲洗液中加入上述2.1.1中制备好的金黄色葡萄球菌试验菌液1ml, 完毕后也注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml;两筒培养基中均加入β-内酰胺酶2ml (酶活力不低于240万单位/ml) 。同法共做6组, 各试验菌及相应的培养基逐一进行验证, 放置于规定条件下培养观察。
3.2.2 阳性对照组:
另取一全封闭集菌培养器 (三筒) , 夹住其中2筒弃掉不用, 剩余一筒不过滤冲洗液, 直接注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml, 完毕后也加入上述2.1.1中制备好的金黄色葡萄球菌试验菌液1ml, 作为阳性对照。同法共做6组, 各试验菌及相应培养基逐一进行验证, 完毕后放置于规定条件下培养观察。
3.2.3 阴性对照组:
另取一全封闭集菌培养器 (三筒) , 夹住其中1筒, 另两筒各过滤冲洗用0.1%蛋白胨水溶液300ml后, 再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100 ml (每种培养基加β-内酰胺酶2ml) , 作为阴性对照。
3.3 培养:
硫乙醇酸盐流体培养基筒30~35℃培养3~5天;改良马丁培养基筒23~28℃培养3~5天, 每天观察并记录结果。
3.4 判断标准。
3.4.1 阳性对照管培养48~72小时应生长良好。
3.4.2 与阳性对照管比较, 冲洗液对照组及含供试品各容器中的试验菌均生长良好。
3.4.3 阴性对照管培养5天, 均应无菌生长。
3.5 试验记录:见表2。
4 讨论
药品无菌检查准确与否的关键是试验中的检验条件对其抑菌性的有效消除, 通过上述试验可以得出头孢地嗪钠采用检验量10克, 稀释液用量500ml, 单筒冲洗量不少于300ml, 并且单筒培养基中加入β-内酰胺酶2ml (酶活力不低于240万单位/ml) 的检验条件消除抑菌性时, 与阳性对照管比较, 各对照组及含供试品容器中的试验菌均生长良好, 说明该品种采用上述检验条件进行无菌检查, 其抑菌作用可以忽略不计, 方法可行;同时根据各试验菌的生长情况及中国药典2005年版增补本的相关规定, 阳性对照菌选用大肠埃希菌。
摘要：目的:依据中国药典2005年版增补本无菌检查法的相关规定, 通过一系列试验, 建立头孢地嗪钠无菌检查法。方法:用规定各种试验菌, 同时使用β-内酰胺酶进行试验。结果:头孢地嗪钠采用薄膜过滤法进行无菌检查, 对大肠埃希菌有较强的抑菌活性。结论:头孢地嗪钠无菌检查需加入β-内酰胺酶来消除抑菌活性, 以保证其无菌检查时方法的准确性。
关键词：头孢地嗪钠,无菌检查,抑菌性,β-内酰胺酶
参考文献
[1]中国药典2005年版增补本[M].第二部.