水通道蛋白8（共8篇）
水通道蛋白8 篇1
羊水量的异常包括羊水过多和羊水过少, 羊水过少的发病率达8%~38%。正常羊水量对维持胎儿正常的生长发育具有重要作用。水通道蛋白 (aquaporins, AQP) 为一类小分子膜蛋白 (28~30 KD) , 可增加质膜脂质双分子层的水通透性, 目前已在哺乳动物体内发现了13种水通道蛋白, 其中AQP8可增加氨水的通透性。有研究发现在羊水过少胎盘和胎膜中, 随着羊水量的明显减少, 羊膜中AQP8的表达亦明显减少[1]。因此, 应用药物调控AQP8的功能, 将成为临床上治疗羊水过少的新策略。目前, 产科临床上多采用地塞米松促进胎肺成熟, 而糖皮质激素对水通道蛋白 (AQP) 调控作用的报道较少。本实验拟通过检测水通道蛋白8 (AQP8) 在正常妊娠和羊水过少孕妇胎膜和胎盘中的表达, 和地塞米松对体外培养羊水过少的胎盘、胎膜细胞AQP8 mR-NA的表达, 探索糖皮质激素对AQP的靶向调控作用, 为治疗羊水过少提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象及分组
选择2009年10月至2010年10月在遵义医学院附属医院产科住院的足月伴羊水过少的孕妇15例为羊水过少组, 另选择同期正常妊娠的足月孕妇15例为正常对照组。所有孕妇均为单胎, 无其他妊娠合并症和并发症, 无缩宫素引产史, 无药物服用史, 无过期妊娠、胎儿畸形、胎儿生长受限、胎儿窘迫及胎膜早破。两组孕妇平均年龄、孕龄、体重比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。羊水过少的诊断依据参照《妇产科学》第7版诊断标准, 即羊水指数 (AFI) ≤5 cm, 或羊水量<300 ml。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及收集
所有孕妇均知情同意, 在分娩后, 无菌取两组孕妇的胎盘和胎膜组织。分离方法:取新鲜胎盘组织小叶, 用含肝素的磷酸盐缓冲液 (PBS) 反复冲洗、剪碎, 1 g胶原酶Ⅳ、1 g透明质酸酶、0.1 g DNaseⅠ (均购自Sigma公司) 37℃消化, 离心, 接种2×105个细胞于含10%胎牛血清 (FBS, Hyclone公司) 的低糖DMEM培养基中。37℃, 5%CO2饱和湿度条件下贴壁, 换液培养, 0.125%的胰蛋白酶消化传代, 第2~3代细胞用于本实验。调整细胞密度至2×105个/ml, 待细胞接近融合时, 加入含0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml地塞米松的无血清培养液, 正常对照组加入等体积无血清培养液, 作用24小时后, 按照Trizol试剂盒说明采用一步法提取细胞的总RNA。
1.2.2 实时定量PCR (RT-PCR)
引物设计 (大连宝生物工程有限公司) :AQP8:5'-TTCATTGGAGAT-GGGAAGACC-3', 5'-TTGAGAAGCAAGGAAGTGG-3', 扩增产物:439 bp;β-actin:5'-ATCGTGATGGACTCCG-GTGAC-3', 5'-GCTGATCCACATCTGCTGGGA-3', 扩增产物:624 bp。实验操作按Trizol产品说明书进行, 取5μl RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳。用Hi FiMMLV c DNA第一链合成试剂盒进行反转录。AB7500型荧光定量PCR仪, 采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。将各样品c DNA 5倍稀释后取2μl作模板, 分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增, 同时在60℃~95℃进行溶解曲线分析, 取5μl反应产物进行电泳。电泳结束后, 把凝胶放入凝胶成像系统, 紫外线投射, 并观察电泳图像, 绘制图像。
1.2.3 免疫组织化学染色
标本用10%的多聚甲醛常规固定, 制备石蜡切片 (5μm) ;切片脱蜡、水化后, 置于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液 (p H 6.0) 中微波修复10~15分钟;3%过氧化氢去离子水消除内源性过氧化物酶活性;正常兔血清37℃封闭15分钟;滴加山羊抗人AQP8多克隆抗体 (1∶50, 中山金桥) 4℃过夜;PBS冲洗5分钟×3次;生物素标记的兔抗山羊Ig G二抗工作液 (中杉金桥) 37℃孵育15分钟;PBS洗5分钟×3次;辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的链霉卵白素工作液37℃孵育15分钟;用二氨基联苯胺 (DAB) 镜下控制显色并观察结果。切片经复染脱水透明后用中性树脂封片, 显微镜下观察。细胞内见到清晰的黄色或棕黄色颗粒者视为阳性细胞。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件包对资料进行统计学分析, 结果以平均值±标准差 (±s) 表示, 采用独立样本t检验分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 AQP8 mRNA在两组胎膜、胎盘细胞中的表达
AQP8 mRNA在两组羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞和胎盘合体滋养细胞中均有表达, 最终扩增产物439bp, 内参扩增产物624 bp, 见图1。羊水过少组羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8 mRNA的表达强度明显低于正常对照组 (P<0.05) 。羊水过少组绒毛膜滋养细胞AQP8 mRNA表达强度与正常对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
(M:Marker;1~4通道:正常对照组;5~8通道:羊水过少组;A:羊膜上皮细胞;B:绒毛膜滋养细胞;C:胎盘合体滋养细胞)
2.2 AQP8蛋白在两组胎膜、胎盘细胞中的表达
免疫组化染色显示, AQP8蛋白在两组羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞和胎盘合体滋养细胞中均有表达, AQP8蛋白表达位于细胞浆和细胞膜中, 呈棕黄色颗粒, 见图2、图3。AQP8蛋白在羊水过少组羊膜上皮细胞及胎盘合体滋养细胞中的表达明显低于正常对照组 (P<0.05) , 在绒毛膜滋养细胞中两组的表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表3。
2.3 地塞米松作用后AQP8 mRNA在两组胎膜、胎盘细胞中的表达
经不同浓度的地塞米松作用24小时0.157±0.0240.120±0.0205后, 两组羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8mRNA的表达随着地塞米松浓度的增加, 表达有增加的趋势, 见表4。地塞米松浓度为50μg/ml时, 两组羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8 mRNA的表达明显高于浓度为0μg/ml时, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;而两组绒毛膜滋养细胞中AQP8 mR-NA的表达在不同浓度地塞米松作用24小时后比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
3 讨论
AQP为一类小分子膜蛋白 (28~30 KD) , 目前已在哺乳动物体内发现了13种水通道蛋白, 分别命名为AQP 0~12。迄今在胎盘与胎膜内发现的主要AQP为AQP1、AQP3~5、AQP8与AQP9等[2~5]。AQP2、AQP3与AQP5对不同妊娠时期的羊水形成器官 (如皮肤、肺与肾脏等) 具有重要作用[6];AQP8可增加氨水的通透性。除改变特定膜对水分、尿素或甘油的通透性外, 有些水通道蛋白 (如AQP1、AQP3、AQP4与AQP9) 还与细胞迁移与粘连有关, 在胚胎器官发生, 胎盘与胎膜发育中发挥重要作用[7~10]。
本课题应用原代及传代细胞培养技术在正常妊娠和羊水过少孕妇的胎盘、胎膜中培养出羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞、胎盘合体滋养细胞。RT-PCR技术和免疫组化染色均显示, AQP8 mRNA和蛋白在正常对照组和羊水过少组羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞、胎盘合体滋养细胞中均有表达。两组绒毛膜滋养细胞AQP8 mRNA和蛋白的表达比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 而羊水过少组中AQP8 mRNA和蛋白在羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞中的表达显著降低, 与正常对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞与羊水量有着重要的关系。
目前, AQP8与羊水量异常的研究报道甚少, 未见地塞米松对AQP8调控的报道。大量的研究表明, 多种AQP的异常表达与多种疾病的病理状态有关。现已证实多种因素均可能影响AQP的表达, 例如血管活性肠肽可上调结肠上皮细胞中AQP3的表达[11~13], 渗透压的改变可影响星形胶质细胞中AQP4表达[14]雌二醇可诱导子宫内膜AQP2的表达[15]。本实验采用较为敏感的RT-PCR实验方法, 检测不同浓度地塞米松对羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞和胎盘合体滋养细胞的AQP8 mRNA表达变化, 结果显示两组中羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8 mRNA的表达强度都随地塞米松的增加呈增加趋势, 其中以经地塞米松50μg/ml作用24小时后羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8 mRNA的增加最为显著 (P<0.01) , 而两组绒毛膜滋养细胞AQP8 mRNA的表达强度差异无统计学意义 (P>0.05) 。由此推测地塞米松可能通过上调羊水过少患者羊膜上皮细胞及胎盘滋养细胞AQP8 mRNA的表达, 使其在细胞膜内重新分布, 提高其通透性及稳定细胞膜性, 但具体机制尚不明确, 有待进一步研究。
本研究羊水过少组的羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞通过不同浓度地塞米松作用24小时后, AQP8表达上调, 不排除经过地塞米松作用的AQP8通过改变其他小分子溶质如尿素、甘油等跨膜运输来改变羊水渗透压从而改变羊水量。地塞米松可提高羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞对水的通透性从而增加AQP8的表达。羊膜上皮细胞及胎盘合体滋养细胞上AQP8 mRNA表达的可调控性可能为选择治疗羊水过少的药物提供新的思路, 为治疗羊水过少提供实验依据, 最终达到减少围生儿并发症和死亡率, 以提高产科质量。
已证实多种AQP在胎盘、胎膜与组织或器官 (如皮肤、肺与肾脏等) 内有表达, 且对体液运转、平衡具有重要作用。然而, 要测定其生理学与病理学意义, 还需要大量的研究。遗传学研究已证实成体啮齿类动物体内不同的AQP具有特定的功能, 但不足以阐明不同的AQP在胎儿体液平衡的作用。探讨正常及病理条件下胎盘、胎膜中AQP的调控及表达, 将会为调控羊水量获得一些有用信息。研究糖皮质激素对多种AQP在胎盘、胎膜内表达及调控, 对指导羊水量异常的治疗是非常有意义的。
摘要：目的:研究水通道蛋白8 (AQP8) 在正常妊娠和羊水过少孕妇胎膜和胎盘中的表达, 和地塞米松对羊水过少胎盘、胎膜中AQP8的干预效应。方法:选择2009年10月至2010年10月在遵义医学院附属医院产科住院的足月孕妇30例, 其中羊水过少组15例, 正常对照组15例。采用RT-PCR技术和免疫组织化学法检测两组在羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞和绒毛膜滋养细胞中AQP8 mRNA和蛋白的表达, 及分别加入不同剂量的地塞米松 (0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml) 孵育24小时后, 检测两组产妇胎膜和胎盘组织中AQP8 mRNA的表达水平。结果:两组绒毛膜滋养细胞中AQP8 mRNA和蛋白的表达比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 而羊水过少组中AQP8 mRNA和蛋白在羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞的表达低于正常对照组 (P<0.05) 。两组羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞AQP8 mRNA的表达随着地塞米松浓度的增加有增加趋势。两组羊膜上皮细胞和胎盘合体滋养细胞在地塞米松 (50μg/ml) 作用24小时后, AQP8 mRNA的表达明显增加, 与地塞米松0μg/ml浓度比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而绒毛膜滋养细胞在不同浓度中的表达比较无差异 (P>0.05) 。结论:羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞与羊水量有一定的关系;地塞米松对AQP8 mRNA表达水平有促进作用, 地塞米松可能通过上调羊膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞中AQP8的表达而对羊水量的稳态产生一定的影响。
关键词：水通道蛋白8,羊水过少,胎盘,胎膜,地塞米松
水通道蛋白8 篇2
目的 丙泊酚具有脑保护作用,其分子机制尚不清楚.水通道蛋白4 (aquaporin 4,AQP-4)与脑损伤后脑水肿有关.文中探讨大鼠脑缺血-再灌注损伤后AQP-4基因的表达规律及丙泊酚的作用.方法 雄性SD大鼠108只,体重(220±20)g,随机等分为3组,即假手术组:仅开颅,不做缺血再灌注处理;缺血再灌注损伤组(I/R组);丙泊酚组:I/R组、丙泊酚组经右股静脉置管后分别用微量泵持续给予等渗盐水2?ml/(kg・h)和丙泊酚20?mg/(kg・h),在大脑中动脉阻断前开始用药,至再灌注3?h后停止给药,各组又分为缺血2?h后再灌注0.5、1、3、6、12及24?h 6个亚组,每亚组6只大鼠.测定各组大鼠脑含水量,分别用RT-PCR和Western blot检测脑内各时相点AQP-4的mRNA和蛋白水平.结果 再灌注后3?h开始,脑组织含水量即有增加.与I/R组相比,再灌注损伤后3、6、12及24?h 丙泊酚组脑组织含水量均明显下降(P<0.05或0.01) .脑缺血-再灌注损伤后,脑组织AQP-4 mRNA表达升高(P<0.05或0.01),于12?h达峰值,而蛋白则于6?h达峰值.再灌注后24?h AQP-4 mRNA表达仍明显高于假手术组.与I/R组相比,丙泊酚组各点AQP-4 mRNA和蛋白的.表达均明显下降(P<0.05或0.01).结论 丙泊酚可部分抑制脑缺血-再灌注损伤后AQP-4的表达,减轻脑水肿,可能是其脑保护作用机制之一.
作 者：水祥兵 朱克军 任传路 缪明永 时多 SHUI Xiang-bing ZHU Ke-jun REN Chuan-lu MIU Ming-yong SHI Duo 作者单位：水祥兵,朱克军,任传路,SHUI Xiang-bing,ZHU Ke-jun,REN Chuan-lu(解放军第一00医院麻醉科,苏州,215007)
缪明永,时多,MIU Ming-yong,SHI Duo(第二军医大学生化教研室,上海,33)
水通道蛋白8 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物
封闭群新生1日龄SD大鼠,雌雄不限,体重8~10 g,由广东省实验动物中心提供。与母鼠同笼,母鼠喂养。母鼠自由饮水,喂以条杆状动物饮料,室温15~25℃,自然采光。
1.2 主要仪器及试剂
Mx-3000P荧光定量仪(美国Stratagene公司);自制有机玻璃常压低氧舱大小为5 L的广口瓶,气孔和出气孔各1个;CY-7指针式测氧仪(成都贝斯达仪器有限公司);总RNA提取试剂盒(美国Promega公司);逆转录PCR试剂盒[Takara宝生物工程(大连)有限公司];PCR反应试剂盒(SYBR GreenⅠ)[Takara宝生物工程(大连)有限公司]。
1.3 实验方法及步骤
1.3.1 实验动物及分组
1日龄SD大鼠共20只,体重8~10 g,分为实验组(n=10)与对照组(n=10)。实验组依照“1.3.2”项下方法暴露在低氧条件下,4 d后断头处死,对照组为空气。
1.3.2 动物模型的制作[3]
先给低氧舱通入99.99%CO2,调节流速,应用CY-7指针式测氧仪,测得舱内的CO2浓度达99%后,放入1日龄新生SD大鼠5 min后取出,迅速向舱内通入99%O2,应用测氧仪使舱内氧浓度达99%,再将低氧后新生鼠放入舱内5 min取出。经处理后所有新生鼠均放回母鼠身边喂养,至第4天断头处死,用眼科剪行剖腹术取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织,-70℃冻存。
1.3.3 染料法(SYBR GreenⅠ法)荧光定量PCR反应
1.3.3. 1 鼠肠组织总RNA提取
总RNA提取试剂盒由Promega公司提供,按照操作说明上的SV Total RNA Isolation System步骤进行总RNA提取,并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,紫外分光光度计测定A260和A280确定RNA质量。28s r RNA条带强烈且A260/280位于1.8~2.0之间的RNA样品用于后续实验。
1.3.3. 2 逆转录反应
逆转录反应使用Takara试剂盒进行,取总RNA 4.0μl,依次加入5×Prime Script TM Buffer 2μl,Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5μl,Oligo d T Primer 0.5μl,Random primers 0.5μl,加无RNase水补足配成总体积10μl的反应液,37℃15 min(逆转录反应),85℃5 s(逆转录酶的失活反应),合成好的c DNA放入-20℃冰箱保存备用。
1.3.3. 3 引物的合成
荧光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成,PAGE纯化级别。引物序列如下:β-actin,F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3',第1 026~1175位核苷酸,片段长150 bp;AQP4,F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3',R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3',第2 615~2 731位核苷酸,片段长117 bp;AQP7,F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3',R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3',第322~468位核苷酸,片段长147 bp;AQP8,F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3',R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3',第292~417位核苷酸,片段长126 bp。
1.3.3. 4 荧光定量PCR反应
以β-actin作为内参基因,采用SYBR GreenⅠ染料法进行PCR反应扩增,在测定目的基因的同时测定内参基因用以标准化标本。反应体系:RT反应液2μl,加SYBR Premix Ex Taq TM 12.5μl,上下游引物各0.5μl,加d H2O补足至25μl总体系。各取样品3μl,使用EASY Dilution按10倍梯度稀释4次(1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000),每个浓度各取2μl,行3个复孔进行PCR反应,制作标准曲线。由于采用相对定量法作比较,标准曲线的横坐标并不要求真实的起始模板拷贝数,故制作标准曲线的时候需要设定模板的相对拷贝数。上述5个梯度的样品对应设定的相对拷贝数分别为5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。反应条件如下:95℃10 s预变性,95℃5 s,60℃30 s,40个循环PCR反应。Mx-3000P荧光PCR仪自动读出待检样品Ct值。另外以样品中起始模板的拷贝数为横坐标,Ct值为纵坐标,并以上述配制的按10倍梯度稀释的样品为5个点,绘制出标准曲线,自动计算出曲线的斜率(slope)及扩增效率(E)。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用REST-2005软件进行统计学处理。
2 结果
对照组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(18.84±0.43)、(19.80±0.43)和(20.68±0.31)。实验组AQP4、7、8基因的平均Ct值分别为(21.85±0.45)、(22.62±0.24)和(23.51±0.20)。对照组β-actin基因的平均Ct值为(15.40±0.31),实验组β-actin基因的平均Ct值为(15.30±0.49)。
图1~4中各条线分别表示β-actin、AQP4、AQP7和AQP8标准曲线,横坐标代表相对模板浓度,纵坐标代表Ct值,5个梯度稀释点基本在一条直线上,证明Ct值与相对拷贝数据呈良好的线性关系。荧光定量仪分析软件求得标准曲线方程Y=a X+b,X代表起始模板拷贝数,Y代表Ct值,这样通过标准曲线中方程可求出待检样品的相对拷贝数。见表1。
用Pfaffl[4]推导的数学公式计算目的基因的相对表达量:
Ratio(R)表示目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数,分子部分为目的基因扩增效率,分母部分为内参基因的扩增效率。△Cttarget(control-sample)表示对照组与实验组中目的基因的Ct值之差,△Ctref(control-sample)表示对照组与实验组中内参基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分别表示目的基因和内参基因的扩增效率。如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近100%且相差<5%,也可以将PCR扩增效率默认为100%,这样公式就简化为2-△△Ct,计算结果为R值。R<1表示基因表达下降,R>1表示基因表达上升。
采用Pfaffl等[5]设计的REST-2005软件运行2-△△Ct公式,计算R值。把所有荧光定量资料包括各实验组Ct值、对照组Ct值、模板Ct值和模板浓度倍数输入计算机,运行软件,软件自动计算R值及P值。
根据REST-2005软件计算结果,内参β-actin基因的R值为(1.000±1.079)。AQP4、7、8基因与内参β-actin基因比较,实验组表达下降,R值分别为(0.117±0.129)(P<0.05)、(0.140±0.156)(P<0.05)和(0.134±0.140)(P<0.05)。实验组R<1,与对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。用REST-2005软件计算各基因组QPCR反应的反应效率(E)、相对表达差异倍数(R)、样本标准误(SE)、95%可信区间(95%CI)及P值。结果见表2。
3 讨论
目前对AQPs的研究逐渐深入,发现AQPs参与多种消化道疾病的发病过程。主要集中在AQP1~8等几种。研究发现,AQPs与口干症[6]、便秘及大肠内液转运有关[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除实验中发现,剔除AQP5基因的大鼠经毛果芸香碱刺激后其唾液分泌量减少60%以上,而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未见明显减少,说明AQP5在涎腺的分泌中扮演着关键的作用。血管活性肠肽(VIP)神经元广泛分布于回结肠壁内,其递质VIP抑制肠道蠕动,参与便秘的发生。AQPs是VIP作用的最终靶分子之一,VIP能过c AMP依赖的途径上调AQP3及其m RNA的表达[9],可以推测VIP参与便秘发生与上调AQPs的表达,从而促进水分的吸收有关。
小肠大部分切除后出现的腹泻病,可能与AQPs上调有关。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小肠被大部分切除后AQPs m RNA在残留小肠、回肠、结肠中表达的变化,他们选取6周龄SD大鼠(n=15),切除80%远端小肠,残留的小肠、回肠、结肠分别在术后第1、3、5、7天切开,提取残留肠黏膜组织,用Northern blo技术分析AQPs m RNA的表达。结果发现,残留小肠AQP1和AQP3 m RNA在术后1 d表达明显增加,AQP7 m RNA在术后3 d增加,AQP4 m RNA术后无变化;结肠AQP3 m RNA在术后第1、7天表达增加,AQP4 m RNA无改变;AQP8 m RNA表达在术后第7天轻微增加,表明小肠大部分切除后除AQP4外,多种AQPs适应性上调。
Hardin等[11]用硫酸钠葡聚糖(DSS)喂养小鼠制成结肠炎模型,在进食DSS后12 h~7 d,以及从停止进食DSS后的恢复阶段第1天至第15天进行AQPs作用评价,并在实验阶段前3 d对鼠肠水分吸收进行测量。结果显示,DSS组12~24 h后结肠AQP4、7、8表达开始减少并持续至第7天,停止进食DDS后逐渐恢复,且病变肠组织对水分的吸收减弱。从结肠炎、溃疡性结肠炎及感染性结肠炎患者中提取的病理标本发现相似的改变。
新生儿时期严重的肠道疾病NEC虽然病因与成人结肠炎有很大不同,但从病理角度来看有非常相似的病理改变。各种原因引起的肠壁缺血、低氧被认为是发病的直接因素,特别在新生儿时期,窒息、低氧、休克等原因引起机体防御性反射,肠壁血流减少、缺血,肠黏膜屏障损伤情况容易发生。为了探讨AQPs在其中所起到的病理作用,本研究制作鼠模型进行前期研究。
NEC鼠模是采用新生SD大鼠,模拟宫内低氧环境下制作而成,用高纯度CO2在短时间内使鼠窒息,再通入高纯度O2复苏,造成肠道微循环缺血-再灌注损伤的病理过程。受损的肠组织通过荧光定量实验证明,与空白组比较,AQP4、7、8 m RNA在NEC组表达下降,实验仅说明AQPs在NEC鼠模中的表达改变,不能直接说明这些基因在发病中的调节机制。Laforenza等[12]认为APQs能起到使水跨细胞吸收或分泌的作用。肠功能出现障碍后,AQPs表达下降,可能与其蛋白质构象改变或发生移位有关。肠道的消化和吸收功能丧失,肠液大量排出,造成脱水肠液排进第三间隙及腹腔,造成体液丢失,引起内环境紊乱,AQPs的表达变化可能起到维持体液平衡及内环境稳定的作用。
AQPs与NEC的发病关系主要涉及肠腔渗透压的改变。NEC发病过程出现的水代谢障碍可能与AQPs的表达发生变化并引起肠腔渗透压改变有关。由以上可知,水吸收的主要器官是消化道。AQPs表达的变化可以影响水的吸收,使机体出现水代谢障碍,本实验NEC鼠模从外观上分析有脱水的表现。NEC鼠模实验证明AQPs表达下降,提示发生NEC病变时可引起细胞信号改变,导致AQPs合成障碍,从而形成NEC发病机制中的一个因素。目前AQPs在细胞内信号调节机制下出现的表达变化,在肾脏、肝脏已有很多学者阐述清楚,但在消化道方面仍然需要进一步研究。
AQPs参与消化道疾病是可能的,但发病机制较复杂。由于NEC是一种多因素引起的疾病,除AQPs外,还涉及其他如细胞因子、血管内皮素、血小板活性因子等参与发病过程。实验的最终目的是揭示真相,为临床打下基础。希望通过本次实验使相关工作者对AQPs给予足够的重视,认识到AQPs受损是一个引起机体水代谢紊乱的危险因素。
水通道蛋白4的研究进展 篇4
1 AQP4基本结构及分布
AQP4基因位于人类染色体18q11.2与q12.1的连接处,包含4个外显子,负责127、55、27、92位氨基酸序列的编码,3个内含子位于其间。从结构上看,其包括6个跨膜结构和A、C、E 3个细胞外环和B、D 2个细胞内环。AQP4的四级结构是由相对分子质量约34 KD的4个具有独立活性的且均含有6条疏水性跨膜结构的单体组成的四聚体,每个单体的6条疏水性跨膜结构形成类似沙漏的水通道,仅允许单线通过1个水分子。
AQP4主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞、脉络丛上皮细胞、室管膜上皮细胞等支持细胞中,并大量表达在星形胶质细胞足突、胶质界膜、软脑膜及室管膜与其下星形胶质细胞的空隙中,目前尚未发现其在兴奋性细胞中表达[1]。此外,AQP4呈极性分布于星形胶质细胞足突上,锚定蛋白和细胞周围环境对其这种分布起到了一定的作用[2]。由此可以简单的通过AQP4的分布及表达特点推断其与中枢系统的水平衡有关。
2 AQP4与Kir4.1
内向整流钾离子通道4.1(Inwardly rectifying K+channel,Kir4.1)是中枢神经系统的一种膜蛋白,其具有内向整流的特点并能通过调节胞外过高的钾离子浓度而维持内环境的稳态。其主要分布在胶质细胞、软脑膜、室管膜、视网膜Müller细胞等等。
研究表明,AQP4与Kir4.1在结构和功能上均存在共耦联的关系,两者的C末端均通过α-syntrophin的PDZ结构域锚定在胶质细胞的细胞膜上,AQP4表达的变化可以影响细胞内外水分子的运动,进而导致Kir4.1对钾离子通透性的改变,出现相应的电位变化。病理状态下,在颞叶癫痫患者的海马组织中发现AQP4的表达明显升高而Kir4.1却表达下调,钾离子平衡破坏,AQP4和Kir4.1的锚定蛋白复合体功能受损[3],提示两者可能通过功能耦联共同参与了癫痫的病理过程。虽然大部分研究肯定了AQP4与Kir4.1在功能上的耦联关系,但仍有些学者对此提出了怀疑,认为胶质细胞中Kir4.1介导的K+的摄取功能与AQP4没有联系[4]。目前来说,两者之间的作用机制及是否存在相互作用还有待于进一步研究。
3 AQP4与脑水肿
人体中60%的成分是水,尤其在脑组织中其所占比例更是高达70%,脑水肿即由于各种致病因素的影响使水分在脑组织中过多存在的病理现象,直接导致脑组织容量扩增,继而提升颅内压,使临近脑组织受压并进一步加重脑水肿,最终因这种恶性循环导致脑疝,危及患者生命,因此脑水肿是各类脑部疾患致残致死的根本所在。自1966年,Klatzo提出血管源性和细胞毒性两种脑水肿的分类方法以来,人类对脑水肿的研究从未停下脚步,随着分子、生化等各相关领域研究的不断深入,对脑水肿的分类又提出了新的见解,并将其分为血管源性、细胞性、脑积水性及渗透性四类普通脑水肿以及缺血性、粒细胞性、离子性三类特殊类型脑水肿。各类脑水肿在脑部疾病的演变过程中,既能共存,又能互变。大量研究表明,AQP4表达升高是颅脑创伤引起脑水肿的主要原因,通过检测颅脑创伤后脑脊液中AQP4的水平,可以有效地评估脑水肿的严重程度[5]。而脑出血后的血肿周围水肿程度更是与AQP4基因的变异有独立的关联[6]。Manley等[7]通过敲除AQP4基因的大鼠制作大鼠水中毒模型,与普通大鼠制作的水中毒模型相比,其脑组织含水量更低,其围绕于血管周的星形胶质细胞足突的肿胀程度也更低。推测AQP4在脑水肿的发生、发展的过程中起到了促进的作用。
虽然支持上述结论的学者很多,但也有些学者提出了相反的结论,Bloch等[8]利用被敲除AQP4基因的小鼠和普通小鼠制备梗阻性脑积水模型,与普通小鼠比较,被敲除AQP4基因的小鼠颅内压升高更明显,脑水肿更严重,其生存率也明显降低。推测AQP4的表达对脑积水后的脑组织含水量增加起到了抑制作用。Tang等[9]利用被敲除AQP4基因的小鼠和普通小鼠制备脑出血模型,研究发现被敲除AQP4基因的小鼠在制模成功后,其脑水肿程度更高,意识障碍更明显。推测AQP4的表达在一定程度上抑制了脑水肿发展的病理过程。
诸多研究表明,AQP4的表达在细胞毒性脑水肿时起正向作用,而在血管源性脑水肿时却起反向作用。细胞毒性脑水肿时,血脑屏障未受到破坏,水分子通过AQP4进入脑组织,所以当AQP4的表达升高时,进入脑组织的水分就越多,造成的脑水肿就越严重。Papadopoulos等[10]提出,血管源性脑水肿时,AQP4的表达上调减轻了脑水肿的程度。这可能是因为破坏了血脑屏障,血清蛋白与等渗液为了适应流体静力压的变化而渗透到细胞间隙,造成细胞间隙的肿胀。因此血管源性脑水肿的形成没有AQP4的参与,但其发展过程中水分子的排出需要AQP4作为介导。所以AQP4在此过程中对脑水肿起到了抑制作用。
Karmacharya等[11]研究发现,在大鼠脑水肿模型中施加低强度超声波刺激,可以减少AQP4的局部聚集,与对照组比较可以明显减少脑组织含水量以及AQP4的表达。其他方面如:亚低温治疗、去骨瓣减压、地塞米松等治疗方法均能通过抑制AQP4的表达减轻脑水肿,改善预后,提高其生存率。由此推测,以AQP4作为治疗靶点来减轻各种原因导致的脑水肿是切实可行的。
4 AQP4与脑肿瘤
脑肿瘤是指发生于颅腔内的肿瘤,WHO于2000年经过整理分类将神经系统肿瘤归纳为七大类,即神经上皮组织起源肿瘤、外周神经起源肿瘤、脑膜起源肿瘤、淋巴和造血组织肿瘤、生殖细胞起源肿瘤、鞍区肿瘤和转移性肿瘤。与其他部位的肿瘤相比,颅内肿瘤不论良恶性,均能挤占颅腔内脑组织的空间,造成占位效应对脑组织造成损害并危及生命。
胶质瘤是临床中神经系统发病率最高的原发性脑肿瘤,并多呈恶性侵袭性生长,手术全切率低且术后复发率高,需要术后配合放化疗及其他综合治疗,但目前在其治疗中仍然很艰难。Warth等[12]研究发现,在脑星形胶质细胞瘤中,AQP4的高表达和瘤周水肿的发生以及胶质瘤的恶性程度密切相关。另有研究表明,AQP4在脑肿瘤细胞中明显增多,以胶质瘤更为显著。其极有可能对肿瘤的生长有正性作用,促进病情的恶化。AQP4在胶质瘤细胞中具有抗凋亡的作用[13],除此之外,AQP4还可以促进胶质瘤细胞的迁移,这无疑将会促进肿瘤的生长并增加其侵袭性[14]。据此推测,人为地促使AQP4的表达下调可能对脑胶质瘤的发展有抑制作用[15]。
脑膜瘤为发病率仅次于胶质瘤的颅内肿瘤,多呈良性,隐匿发病且缓慢生长,早期多无明显症状。后期多以颅内压增高的症状表现,影像学检查多提示颅内肿块伴瘤周水肿,可见瘤周水肿对脑膜瘤引起的颅内压增高起到了重要的作用。目前脑膜瘤瘤周水肿的形成机制并不明了,可能与软脑膜供血、瘤脑界面的存在、脑膜瘤血管渗透性增加、脑膜瘤自身引流静脉的发育等等因素有关,而脑膜瘤中AQP4的表达与其周围的水肿有没有联系呢?有学者研究表明,AQP4主要表达于脑膜瘤的瘤体细胞膜上,其表达水平的高低与瘤周水肿的严重程度成正性相关,推测如果能够抑制肿瘤细胞的AQP4表达,就能控制瘤周水肿,即可减轻患者围手术期的颅内压增高症状,又可减少手术中脑膨出的风险,而且更容易在手术中分离肿瘤,减轻对脑组织的损害[16]。
颅内多发转移瘤系身体其他部位肿瘤转移至颅内所致,男性以肺癌转移多见,女性则多以乳腺癌转移多见,可以转移至颅内的任何部位。颅内转移瘤常常伴有瘤周水肿,且水肿大多十分严重,对患者的生活质量及治疗效果有重要的影响[17]。Zhao等[18]研究发现,在多发的脑内转移瘤的瘤周脑组织中含有大量的AQP4表达,而在瘤组织中却鲜有AQP4表达。在瘤周较远的脑组织中AQP4轻度染色,随着对肿瘤的不断靠近,其周围脑组织中的AQP4染色亦不断加深,推测AQP4表达与多发转移瘤周围脑组织的水肿密切相关且成正相关。因此,可以通过研究瘤周水肿的分子生物学机制为临床的治疗提供理论依据。
5 AQP4与抑郁症
抑郁症是心境障碍的最主要类型,多以持续情感低落为主要临床表现,自卑抑郁,甚至有自杀的想法及行为,患者常伴有思维迟缓、意志活动减退、认知功能损害以及睡眠障碍、食欲减退等一些躯体症状。目前抑郁症的病因并不完全清楚,其治疗多以药物治疗配合心理治疗,并积极创造良好环境预防复发。
正常成年动物海马区的海马齿状回颗粒细胞下区有成人神经干细胞存在,其不但具有自我更新及分化成多种神经细胞的能力,而且参与学习、记忆等脑的高级功能,其病理状态下再生能力的变化与多种神经系统疾病的发生发展密切相关。研究表明,抑郁症可以抑制海马齿状回颗粒细胞下区的神经再生功能,而AQP4在海马齿状回颗粒细胞下区呈高表达,并促进成人神经干细胞的增值分化以及海马神经再生。Jayatissa等[19]通过尸检抑郁症患者发现,其海马神经元胞体体积及神经纤维网均不同程度萎缩,推测抑郁症的发病机制可能与海马的器质性病变有关。而AQP4对抑郁模型大鼠海马区的内环境及神经元凋亡都具有调节作用,并且能通过对星形胶质细胞功能及海马神经再生的调节而影响抑郁症的病理过程[20]。因此,AQP4可能为今后抑郁症的治疗提供了新的方向。
6 AQP4与癫痫
癫痫是由于脑组织神经元高度同步的异常放电所导致的一组具有发作性、短暂性、重复性和刻板性特点的临床综合症。由于癫痫发作时放电神经元的位置及放电范围的不同,其导致的发作形式也是各不相同,治疗方法目前还是以药物治疗为主,对于药物难治性癫痫则考虑手术治疗。
近年来诸多研究发现,AQP4与癫痫的病理过程存在一定的联系,Binder等[21]研究发现,在敲除AQP4的癫痫大鼠模型癫痫发作时,无论是其抽搐程度还是抽搐的频率均比野生对照组大鼠明显降低。在癫痫的潜伏期中,AQP4位于近血管腔足突膜的密度明显低于位于远血管腔足突膜的密度[22],提示AQP4的分布改变与癫痫有关。研究发现,AQP4在星形胶质细胞大量分布,而这种分布的改变可以导致星形胶质细胞的水肿,并促使其内的谷氨酸盐释放,使胞外谷氨酸盐的浓度升高,激活神经元活动导致颞叶癫痫。Heuser等[23]从基因的水平上证实AQP4参与了癫痫的发作过程,但其详细机制有待于进一步研究。
7 小结与展望
目前来说,对于AQP4的研究已经不仅仅局限于其对水的转运作用,而是面向更多的研究方向。Ishiyama等[24]发现,梅尼埃病可以特异性的改变AQP4在支持细胞和线粒体蛋白的表达,因此通过检测AQP4表达量的变化对梅尼埃病的诊断具有极其重要的意义。Yasui[25]发现,AQP4在类淋巴系统紊乱过程中起到了关键作用,而未来通过研制抗AQP4药物就可以更好的治疗由于类淋巴系统通路功能紊乱导致的各种神经功能退化疾病及精神疾病。除此之外,AQP4还参与诸如脑部炎性疾病、视神经脊髓炎、阿尔茨海默病等等疾病的病理过程,本文在此不再一一详述。目前关于AQP4的基础研究虽然取得了很多的成就,但其临床转化率仍然较低,针对于以AQP4作为靶点在临床疾病的诊断治疗中的研究还少有报道,在今后的研究中,可以将AQP4更加的向临床靠近,研发出针对AQP4的治疗药物及诊断方法。
摘要：水通道蛋白4(AQP4)是一种与水的通透性有关的蛋白,主要存在于中枢神经系统,并广泛表达于中枢神经系统的星形胶质细胞、脉络丛上皮细胞、室管膜上皮细胞等支持细胞中,目前大量研究表明,AQP4不仅与脑水肿的发生发展密切相关,同时还参与多种神经系统疾病的病理过程,对临床神经系统疾病的诊断及治疗具有重要的意义,本文就AQP4与几种常见神经系统疾病的联系作一综述。
水通道蛋白8 篇5
关键词：肺胀,阳虚水泛,水通道蛋白-2,脑钠素,钠钾三磷酸腺苷酶
肺胀阳虚水泛证是肺胀病发展的末期,已到了阳虚至极不能运化、推动、温化、气化、蒸腾水湿的程度,水湿输布、运化、排泄功能障碍,以至于水湿不循常道而泛滥,泛溢肌肤而出现水肿,阳虚于下,水趋下行故脚肿显著,甚则腰以下水肿、全身水肿、胸腔积液、腹腔积液、心包积液( 痰饮、溢饮、支饮、悬饮) ,严重影响患者生活质量,甚至危及生命。肺胀阳虚水泛证的特点是阳虚与水泛同在,其证型的关键决定因素值得深入探讨,现从尿水通道蛋白-2( aquaporin-2,AQP2) 、血浆脑钠素( brain natriureticpeptide,BNP) 、钠钾ATP酶、血浆精氨酸加压素( ar-ginine vasopressin,AVP) 探讨其与肺胀的关联性。
1 对象与方法
1. 1研究对象
选择2012年10月至2013年6月云南省中医医院肺病科收治的119例肺胀病患者为观察对象,其中阳虚水泛证45例; 肺肾气虚证33例; 痰热郁肺证41例。其中男性96例,女性23例,平均年龄( 69±0. 24) 岁,病程5 ~30年。3组之间性别、年龄、病程等一般情况比较无统计学差异( P >0. 05) ,具有可比性。
1. 2 诊断标准
依据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组《COPD诊治指南( 2007年修订版) 》的慢性阻塞性肺疾病急性加重期( AECOPD) 的诊断标准进行西医诊断[1],并符合《中医内科学》肺胀的阳虚水泛证、肺肾气虚证、痰热郁肺证之一的中医诊断[2]。
西医诊断依据症状有慢性咳嗽、咳痰和( 或) 呼吸困难及危险因素接触史; 存在不完全可逆性气流受限( 用支气管舒张剂后FEV1 /FVC < 70% ) 。
中医证候诊断分型:
( 1) 阳虚水泛证: 主症为咳嗽喘促,甚则倚息不得卧,咯痰清稀,心悸,面浮,下肢浮肿,甚则一身悉肿,腹部胀满有水,耳鸣,脘痞,纳差,濡泄,尿少,腰酸冷,形寒肢冷,面唇青紫,苔白滑,舌淡胖质暗,脉沉迟细弱。
( 2) 肺肾气虚证: 主症为呼吸浅短难续,咳声低怯,胸满短气,甚则张口抬肩,倚息不能平卧,咳嗽痰白如沫,咯吐不利,胸闷,心慌,形寒汗出,面色晦暗,舌淡或暗紫,脉沉细数无力,或有结代。
( 3) 痰热蕰肺: 主症为咳逆,喘息气粗,胸满,烦躁,目胀睛突,痰黄或白,黏稠难咯,或伴身热,微恶寒,有汗不多,口渴欲饮,溲赤,便干,舌质暗红或舌边尖红,苔黄或黄腻,脉数或滑数。
1. 3 纳入标准
( 1) 主要症状为慢性咳嗽、咳痰和( 或) 呼吸困难及危险因素接触史; 存在不完全可逆性气流受限,符合西医诊断为AECOPD者; ( 2) 符合肺胀的定义; ( 3) 符合中医诊断为肺胀阳虚水泛、肺肾气虚、痰热蕴肺证之一者。
1. 4 排除标准
( 1) 合并心、肺以外严重疾病及不合作者; ( 2)其他原因引起的水肿者; ( 3) 年龄在75岁以上者;( 4) 1周内服用利尿及严重影响内分泌、免疫、心功能的药物者。
1. 5 主要仪器与试剂
Sc-3614低速离心机 ( 科大创新股份有限公司中佳分公司) ; PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱( 上海市跃进医疗器械一厂) ; Thermo Multiskan As-cent酶标仪( 美国Thermo公司) ; ROCHE E601全自动电化学发光分析仪( 德国ROCHE公司) ; MedisoftMicro 5000 provo2肺功能仪 ( 比利时Medisoft公司) ; AQP2试剂盒( 生产批次: 14881,上海江莱生物科技有限公司) 、AVP试剂盒( 生产批次: 10210,上海江莱生物科技有限公司) 、BNP试剂盒( 生产批次: 13768,上海江莱生物科技有限公司) 、Na+-K+-ATPase试剂盒( 生产批次: 12199,上海江莱生物科技有限公司) 。
1. 6 检测指标
用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测尿AQP2; 用放射免疫法检测血浆AVP水平; 用酶联免疫吸附法检测血浆BNP、钠钾ATP酶水平。
1. 7 统计方法
采用SPSS 16. 0统计软件分析检测结果。计量资料用均数±标准差( ±s) 表示,进行正态分布Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验,呈正态分布的多组均数比较采用多因素方差分析,不呈正态分布的多组均数比较采用两个独立样本秩和检验,用相关分析法比较变量之间的相关性。
2 结果
由于部分患者未留置尿标本或未提供血标本,而未提供血样标本的患者较多,或因检测数据出现负值或显著偏差等而脱落,所以,所收集的患者尿样标本与血样标本例数不一致,组间观察例数与收集数据例数也不相同。
2. 1 各证型尿 AQP2的比较
各组尿AQP2数值经Descriptive Statistics Explore分析进行正态性检验,结果显示呈偏态分布,用非参数检验法两 个独立样 本 ( Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test) 检验,结果显示: 阳虚水泛证型组与肺肾气虚证型组AQP2比较无统计学差异( P > 0. 05) ;肺肾气虚证型组与痰热郁肺证型组AQP2比较无统计学差异( P >0. 05) ; 痰热郁肺证型组与阳虚水泛证型组AQP2比较无统计学差异( P >0. 05) ,见表1。
2. 2 各证型血浆 BNP 的比较
各组血浆BNP数值经Descriptive Statistics Ex-plore分析进行正态性检验,结果显示呈偏态分布,用非参数检验法两个独立样本( Two-Sample Kolmog-orov-Smirnov Test) 检验,结果显示: 阳虚水泛证型组与肺肾气虚证型组血浆BNP比较无统计学差异( P> 0. 05) ; 肺肾气虚证型组与痰热郁肺证型组血浆BNP比较无统计学差异( P > 0. 05 ) ; 痰热郁肺证型组与阳虚水泛证型组血浆BNP比较有统计学差异( P < 0. 05) ,见表2。
2. 3 各证型血浆钠钾 ATP 酶的比较
各组血浆钠钾ATP酶数值经Descriptive Statis-tics Explore分析进行正态性检验,结果显示呈偏态分布,用非参数检验法两个独立样本( Two-SampleKolmogorov-Smirnov Test) 检验,结果显示: 阳虚水泛证型组与肺肾气虚证型组血浆钠钾ATP酶比较无统计学差异( P > 0. 05) ; 肺肾气虚证型组与痰热郁肺证型组血浆钠钾ATP酶比较无统计学差异( P >0. 05) ; 痰热郁肺证型组与阳虚水泛证型组血浆钠钾ATP酶比较无统计学差异( P > 0. 05) ,见表2。
2. 4 各证型血浆 AVP 的比较
各组血浆AVP数值经Descriptive Statistics Ex-plore分析进行正态性检验,结果显示呈偏态分布,用非参数检验法两个独立样本( Two-Sample Kolmog-orov-Smirnov Test) 检验,结果显示: 阳虚水泛证型组与肺肾气虚证型组血浆AVP比较无统计学差异( P > 0. 05) ; 肺肾气虚证型组与痰热郁肺证型组血浆AVP比较无统计学差异( P > 0. 05) ; 痰热郁肺证型组与阳虚水泛证型组血浆AVP比较无统计学差异( P > 0. 05) ,见表2。
2. 5 各证型中因素相关性分析
各证型组内AQP2、钠钾ATP酶、BNP、AVP数值经双变量相关分析,结果显示在阳虚水泛证中,AQP2与BNP无相关性( P > 0. 05) ; AQP2与钠钾ATP酶无相关性 ( P > 0. 05 ) ; AQP2与AVP显著正相关( P < 0. 01) ; BNP与钠钾ATP酶显著正相关( P <0. 01) ; BNP与AVP显著正相关( P < 0. 01) ; 钠钾ATP酶与AVP显著正相关( P < 0. 01) 。
肺肾气虚证中,AQP2与BNP无相关性 ( P >0. 05) ; AQP2与钠钾ATP酶无相关性( P > 0. 05) ;AQP2与AVP无相关性 ( P > 0. 05) ; BNP与钠钾ATP酶显著正相关( P < 0. 01) ; BNP与AVP显著正相关( P < 0. 01) ; 钠钾ATP酶与AVP显著正相关( P < 0. 01) 。
痰热郁肺证中,AQP2与BNP无相关性( P >0. 05) ; AQP2与钠钾ATP酶无相关性( P > 0. 05) ;AQP2与AVP无相关性( P > 0. 05) ; BNP与钠钾ATP酶呈正相关( P < 0. 05) ; BNP与AVP无相关性( P >0. 05) ; 钠钾ATP酶与AVP无相关性( P > 0. 05) 。
3 讨论
3. 1 肺胀阳虚水泛证是阳虚并水泛
肺胀是多种慢性肺系疾患反复发作,迁延不愈,导致肺气胀满,不能敛降的一种病证,在《灵枢·胀论》、《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证并治》等中早有记载[3,4],指明了肺胀的症状是以咳、喘、满、上气、甚则躁为特征。
肺胀常见的证候有风寒袭肺、外寒内饮、痰热郁肺、痰湿阻肺、痰蒙神窍、阳虚水泛、肺脾气虚、肺肾气虚、肺肾气阴两虚证等[5],阳虚水泛是肺胀的常见证候之一。汉代《金匮要略·水气病脉证并治》云“咳而喘,不渴者,此为肺胀,其状如肿”[4],严重时可出现“咳逆倚息,短气不得卧,其形如肿”的症状。本病证是由阳虚和水泛两方面构成的复合证型,阳虚和水泛存在着必然的因果关系,是阳虚引起了水泛,阳虚是内在的,隐而不见,水泛是外在的,显而可见。进入此期预示着阳虚到了极点,水湿不化已泛滥成灾。阳虚可累及肺、脾、肾、心等脏腑,但关键的脏腑是肺和肾。《内经·水热穴论》[6]云: “肾者至阴也,至阴者盛水也,肺者太阴也,少阴者冬脉也,故其本在肾,其末在肺,皆积水也。”“故水病下为胕肿大腹,上为喘呼不得卧者,标本俱病,故肺为喘呼,肾为水肿,肺为逆不得卧,分为相输,俱受者水气之所留也。”本病证以阳虚为本,水泛为标[7]。
慢性阻塞性肺疾病在发展过程中,由于气道壁和肺实质的慢性炎症及结构改变,最终导致气道管腔狭窄和进展性气流阻力增加,肺血管阻力增高,肺动脉压力增大,右心负荷加重,右心功能受损,引发右心功能衰竭。
从疾病症状来看,肺胀与慢性阻塞性肺疾病相类似,肺胀阳虚水泛证与慢性阻塞性肺疾病伴右心室衰竭相类似。
3. 2 肺胀阳虚水泛证的相关因子
在生理状态下的液体转运除了通过脂质双分子层弥散( 钠通道和Na+、K+-ATP酶共同构成细胞内外离子浓度差) 外,还有水通道蛋白( aquaporins,AQP) 介导逆浓度梯度的主动转运过程,水通道蛋白是一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白。AQP2是肾脏调节水重吸收的重要分子,在调节机体水平衡中起着至关重要的作用[8,9]。AQP2受AVP调控。临床研究提示,心力衰竭患者尿液AQP2水平增高[10,11]。实验检测显示,肺气肿模型大鼠肾组织AQP2表达上调[12]。在慢性肺心病的发病中神经内分泌的激活是重要机制之一,这些被激活的神经内分泌物质主要包括AVP、心钠素( ANP) 、BNP、内皮素、血管紧张素等。临床研究表明,慢性阻塞性肺疾病急性发作期合并水肿患者血浆AVP、尿液AQP2明显增高[13],慢性肺源性心脏病患者血浆AVP、ANP明显增高[14]。而BNP与心力衰竭关系最为密切,研究表明,慢性肺源性心脏病心衰患者血清BNP明显增高[15],BNP是判断慢性肺心病患者右心室功能不全严重程度的指标之一[16],是慢性充血性心力衰竭肾阳虚证的参考指标[17]。但也有学者认为,血浆BNP浓度与中医证型无相关性[18]。肺心病心衰引起的水肿,既有心肌收缩力下降的因素,也有收缩力下降引起的系列神经内分泌异常,还有水通道本身的功能障碍。
阳虚的另一个特征与细胞膜钠钾ATP酶有关[19]。当钠钾ATP功能发生障碍时,细胞离子泵活性丧失,膜通透性增加伴随细胞内水分增加或( 和) 细胞内离子紊乱,当ATP酶活性严重下降将出现以胞质肿胀和核溶解为主要细胞损伤表现的“细胞胀亡”,轻度下降则会导致凋亡。研究发现,心肾阳虚型慢性充血性心力衰竭( CHF) 患者细胞钙泵活性低下,说明心肾阳虚型CHF患者体内的细胞膜上ATP酶活性低下[20,21]。慢性阻塞性肺疾病晚期由于长期慢性缺氧可导致肺血管广泛收缩和肺动脉高压,进而产生 慢性肺源 性心脏病 及右心衰竭[22],进入了肺胀阳虚水泛证阶段。
临床研究表明,多数肺胀病患者到69岁左右时需住院治疗,从中医的生理功能来看,此期已进入肺肾气虚、肾阳不足的年龄阶段; 从病理来看,由于长期病损,耗伤肺气、肺阴,肺气虚尤为显著,气虚则阳衰,有阳虚的病理基础。
本研究结果来看,肺胀阳虚水泛证与痰热郁肺证的BNP水平有显著性差异,提示BNP是肺胀阳虚水泛证与痰热郁肺证的鉴别点,是肺胀阳虚水泛证的特征因素之一。虽然阳虚水泛证、肺肾气虚证、痰热郁肺证各组之间的AQP2、钠钾ATP酶、AVP没有显著性差异,但阳虚水泛证的AQP2、钠钾ATP酶、AVP水平均较其他组增高。而且在阳虚水泛证中,除AQP2与BNP、钠钾ATP酶无相关性外,其他因素之间均有显著相关性,提示着BNP、钠钾ATP酶、AVP与阳虚水泛证有明显相关的趋势,符合肺心病右心衰的发展规律,是肺胀病阳虚水泛证的发展规律。研究表明,AQP2与AVP有显著相关性与以往的研究结果相类似[8,9],BNP与AVP的显著相关性与以往的研究结果也相同[14]。本研究表明,钠钾ATP酶与AVP显著相关,而且阳虚水泛证、肺肾气虚证、痰热郁肺证3组中均显示钠钾ATP酶与BNP显著相关性,提示血中钠钾ATP酶随着BNP、AVP的增高而增高,是肺胀病急性加重期的重要表现。BNP是心力衰竭的标志物,在肺胀病末期随着心功能不全的加重而升高,释放于血中的钠钾ATP酶数量增多而活性下降,组织细胞内的钠钾ATP酶相对不足、能量代谢低下,与阳虚有密切的联系,是阳虚的重要因子。AQP2水平受AVP的调控,AVP与BNP的水平是同步的,本研究结果显示钠钾ATP酶与BNP是显著相关的,提示钠钾ATP酶也是阳虚水泛的重要因子之一,依据因子间网络调控机制,间接反映AQP2、AVP也是肺胀阳虚水泛的内在因素。
3. 3 存在的问题
本研究没有得到肺胀阳虚水泛证与AQP2关联性的直接阳性结果,可能与下列因素有关: ( 1) 血标本和尿标本多为次日收集,部分患者拖延提供标本,检验室非工作日未收取标本,造成患者的血尿标本收集推后,与入院时间相距参差不齐,部分主要症状明显消退,特别是阳虚水泛证的水肿消退较快,样本与入院时的症状不同步,未能确切反映与证候的密切关联性。( 2) 试剂为国外进口国内组装,试剂的纯度及灵敏度可能存在差异。( 3) 检测的具体方法、步骤等操作细节可能缺乏严密地规范性。
水通道蛋白8 篇6
眼的许多功能, 包括角膜和晶状体透明性的维持、眼内压 (IOP) 恒定的调节和视网膜信号传导等都要依靠液体的跨膜转运来完成。维持角膜的透明性要求对角膜基质的含水量进行精确的调节, 眼内压恒定要求对房水的产生和排除进行调节。在眼内重要的液体调节包括睫状体和泪腺对液体的分泌;小梁网和视网膜色素上皮对液体的重吸收以及液体流入及流出角膜和晶状体等。快速的液体转运也可能发生于视网膜Muller 细胞和双极细胞的光-电信号转导。眼的液体转运可发生于由电解质转运引起的渗透性水转运, 如睫状体上皮和泪腺;或者是由流体静力压引起的透析和超滤, 如小梁网。现在已明确水通道蛋白可促进包括眼在内的许多跨屏障水转运。
1 AQPs在眼外组织中的功能
眼组织的AQPs在身体其他部位也有表达, 因此研究AQPs缺失鼠的表现型可以为揭示它们在啮齿类动物生理功能中的作用提供相当有用的信息:缺乏AQP1或者是AQP3 (主要在肾小管和微血管表达) 的大鼠会出现因尿的浓缩功能障碍而引起的多尿症 [3];最近发现人缺乏AQP1也会出现类似鼠的尿浓缩功能障碍[4];鼠缺乏AQP1也会出现明显的脂肪吸收障碍 (在肠乳糜管) [5]和痛觉敏感度降低 (定位在脊髓后角) [6];缺乏AQP3的大鼠 (在角质层) 会因皮肤水合作用减弱而致皮肤屏障功能受损[7];缺乏AQP4的鼠 (在脑的胶质细胞和内耳上皮) 会出现听力受损[8]和各种脑损伤后所引起的脑水肿减轻;AQP5缺乏 (在腺上皮) 会导致唾液产生缺陷[9]和支气管腺泡分泌减少。眼外组织AQPs缺失表型分析提供了AQPs参与眼生理功能的直接依据, 提示眼内睫状体上皮对水的分泌可能为AQP依赖性的, 而角膜和晶状体透明性以及视网信号传导可能也是如此。
2水通道蛋白在眼的分布
见表1。
如表所示, 有许多AQPs在眼的假定液体转运部位表达。AQP0 (也叫MIP) 主要表达在晶状体纤维, 其基因突变与人的遗传性白内障有关。AQP1最先经原位杂交显示位于睫状体上皮[10], 后通过免疫染色发现睫状体上皮和Schlemm管/小梁网高度表达AQP1。AQP3 和AQP4被克隆出来后很快即发现AQP3在眼的结膜表达, 而AQP4主要在眼的睫状体上皮和视网膜表达[11]。这些发现后来被许多实验室在包括人在内的多种啮齿类动物身上证实。还相继发现AQP5主要在眼的角膜和泪腺上皮表达[12];AQP9在视网膜Muller细胞表达[13]。AQPs在眼的分布模式为他们参与眼的功能提供了间接的证据:眼内压 (IOP) 的调节 (AQP1和AQP4) , 角膜和晶状体透明性的维持 (AQP0, AQP1和AQP5) , 视网膜信号传导 (AQP4) , 结膜的屏障功能 (AQP3) 和泪腺的分泌功能 (AQP5) 。通过对培养的角膜内皮细胞和睫状体上皮细胞AQP1的表达和功能的研究为他们参与眼的液体转运提供了更直接的证据。
3水通道蛋白与眼的功能
3.1 角膜和晶状体的透明性
角膜包含一个基质层和覆盖在它的外面与泪液相接触的上皮细胞层以及它内面的与房水相接触的内皮细胞层。角膜的透明性要求调节其含水量在78%左右, 如果角膜含水量改变则会影响对角膜透明性至关重要的胶原纤维的半径和均匀的间距大小[14]。角膜上皮和内皮包含有许多离子转运载体, 可以产生驱使水定向转运的渗透梯度。溶质的主动跨角膜内皮转运被认为对于抵消基质吸收水分的倾向, 维持角膜透明性是至关重要的。因为基质层含有高浓度的带负电荷的氨基葡萄多聚糖, 可产生50mm Hg左右的基质膨胀压, 所以基质层相对房水呈轻度高渗状态。角膜主要有AQP1和AQP5表达:AQP1在角膜内皮细胞, 而AQP5在角膜上皮细胞。有力说明了AQPs参与角膜水合作用的是AQP1敲除鼠的角膜厚度明显减小, 而AQP5敲除鼠的角膜厚度却增加[15]。AQP5表达于角膜上皮的鳞状细胞层, 为单层细胞。它提供了一个湿性表面, 是眼的最主要折射面。目前的研究认为角膜上皮的转运能力有限, 据推测上皮层的AQP3、AQP5以及基质层内的AQP1、内皮层的AQP1共同协调, 使水被快速转运, 阻止了由于渗透梯度形成的角膜水肿及透明性下降。也有报道, 角膜上皮和内皮细胞有AQP4表达, 但具体功能不明。
AQP0只表达于晶状体纤维细胞, 可能通过使晶状体纤维细胞增加细胞内水的摄入出境量而保持晶状体的透明性。晶状体纤维细胞和晶状体上皮细胞 (含有AQP1) 之间具有狭窄的间隙, 两者在功能上具有协作能力。在眼中, 当睫状肌舒缩以使光线透过角膜清晰成像于视网膜时, 晶状体的形状随之改变, 从而使晶状体纤维细胞两侧的渗透梯度发生变化。在流体静力压的驱动下, 水穿过了晶状体纤维细胞上的AQP0通道。有研究证明AQP0在小牛眼中以26kDa蛋白的形式存在, 而在成年牛眼中, 却有部分变成了22kDa的片段[16]。看来, AQP0随年龄的增长可能会发生变化, 由此推测其与白内障和老视的发生有关。 用反义AQP1探针发现晶状体表层也有强烈的杂交信号, 与AQP1抗体染色结果一致, 晶状体前层覆盖一功能尚不清楚的单细胞层, 这种水可通透性上皮层可能与表达AQP1的角膜内皮层能保持角膜透明的功能相似, 而有维持晶状体透明性的作用。
3.2 房水的产生及调节
AQPl存在于虹膜、睫状体和晶状体的上皮细胞。睫状体产生和分泌房水。房水是一种低渗的液体, 成分与脑脊液基本相同。眼房水的产生是一个主动过程, 一般认为是由面对后房的睫状突2层上皮细胞 (色素上皮细胞和非色素上皮细胞) 产生的。估计在渗透梯度压力的作用下, 每一睫状体上皮细胞每分钟将分泌出相当于其总容量1/3的液体。睫状突的突起结构与房水的连续产生有关。在睫状体面对后房的上皮层表面, 有强烈的杂交信号和抗体染色, 表明AQP1在非色素上皮中存在的数目要大于色素上皮细胞。 睫状体上皮含有许多酶 (Na+-K+-ATP酶、腺苷酸环化酶、碳酸苷酶) , 它们对房水的产生率有重要作用。按密度梯度分离的小牛色素上皮及非色素上皮, 有活性的Na+-K+-ATP酶大部分位于非色素上皮。免疫组化法显示Na+-K+-ATP酶的α1、α2、α3亚单位位于非色素上皮的基底侧。仅有少量的α1亚单位位于色素上皮层。最为重要的是房水的产生率与箭毒苷阻断Na+-K+-ATP酶活性呈反向相关[17]。由于转运Na+是最大的驱动力, 所以水的转运很可能主要位于非色素上皮。因此, AQP1对房水的产生有直接作用。其表达模式与肾近曲小管的表达模式相同, AQP1位于胞膜的顶端及基底膜, Na+-K+-ATP酶位于基底膜, 两处胞膜均负责等渗性水的重吸收。AQP1存在于Schlemm管内皮细胞、小梁网内皮细胞及巩膜网, 它在这些部位的特殊作用还不清楚, 但在内皮细胞的表达与毛细血管及静脉内皮不同。AQP1可能为其提供了一个高水平的渗透性, 允许水高效率的穿过这些障碍, 排入巩膜及色素膜血管, 例如角巩膜网包含许多相互联系的薄膜向角膜延伸, 这些薄膜含孔洞, 但洞的开放数目有限, 故房水必须运输一定的距离, 从一个孔洞进入另一个孔洞。AQP1可能为房水的流通提供了一个高效通路[18]。
虹膜的基本功能是控制总的进光量, 其后表面由2层内皮 (前色素层和后色素层) 构成。在后层, 抗体染色十分强烈, 这是因为其前后2层分别由睫状体色素上皮细胞层和非色素上皮细胞层延续而来。与之对应, AQP1在虹膜后色素层与在睫状体非色素上皮层的存在状况相似。尽管对于虹膜上皮的离子和液体转运还知之甚少, 但估计虹膜可能与调节房水的流量有关。
AQPs在眼中的分布提示它与一些疾病有关。青光眼可引起视野缺损甚至致盲, 这种疾病的特点是眼压增高, 可能是由于房水的重吸收环节出现异常所致。AQP1和AQP4分布在睫状体和小梁网, 可能介导房水的分泌和重吸收, 因此估计与青光眼的发生有关。
3.3 视网膜的兴奋性
AQP4表达在许多神经组织, 包括中枢神经系统的星型胶质细胞, 内耳的支持细胞, 视网膜Muller细胞和视神经的胶质细胞。 Muller细胞具有视网膜神经胶质细胞的特性, 表达电压依赖性通道及神经递质受体, 通过调整细胞外神经活性物质 (包括K+、谷氨酸、GABA、H+) 调节神经元活性。AQP4在视网膜Muller细胞中非常丰富, 这些细胞围绕并支持着光感受器细胞。因此, AQP4可能通过影响包绕光感受器的光感性水合作用而参与视觉活动。定量分析视网膜Muller细胞发现AQP4在足突膜较非足突膜有高浓度的表达, 提示AQP4参与了神经活动时其足突周围区的快速水转运, 对维持细胞外渗透性有重要意义。亦有假说认为AQP4参与了K+的虹吸, 因为在小脑及大脑部分组织中神经胶质细胞突起内有AQP4的表达。在神经生理活动过程中, 动作电位和渗透梯度是通过Na+泵/离子泵和交换器所产生的离子流引起的。由于钾通道与AQP4在视网膜Muller细胞的特殊膜域共区域化, 因此, 设想AQP4对于Muller细胞和双极细胞间相互作用的视网膜信号传导中有重要作用[19]。相似的作用也可能发生在AQP4表达的胶质细胞和其毗邻的神经元以及AQP4表达的耳蜗支持细胞和它毗邻的感觉毛细胞, 因为最近研究AQP4缺失鼠的脑水肿时提示AQP4在脑内液体平衡中有重要作用[20], 而测量AQP4缺失鼠的听觉诱发电位显示其听力明显受损[21]。
研究AQP4缺失鼠的视网膜电流图认为AQP4对于视网膜信号传导是必要的:研究发现10月大的AQP4缺失鼠的视网膜电流图上b波的振幅有较小但却较明显的降低[22], 而在光镜和电子显微镜下未见视网膜有任何超微结构改变。一般认为视网膜电流图上b波是由内核层的双极细胞去极化引起的, 与其毗邻的Muller细胞的K+ 的空间缓冲作用紧密相关。因此, 推测AQP4缺失鼠视网膜较低的水通透性改变了由光引起的视网膜水合作用和钾离子浓度变化损坏了K+ 虹吸作用。所以, AQP4在Muller细胞信号传导过程中伴随的细胞内快速水转运中有重要作用。同时, 也印证了在神经系统的支持细胞中的AQP4有促进其毗邻的电兴奋细胞的神经信号传导作用的假说。
3.4 泪腺的分泌
已有研究报道AQPs在人和鼠的泪腺表达:AQP1在微血管内皮;AQP3在腺上皮基底部;AQP4在导管上皮;AQP5在腺上皮顶部。但是, 测量AQPs缺失鼠泪腺的分泌提供的证据并不认为AQPs对于泪腺的分泌是必须的[23]。用毛细血管法收集AQPs缺失鼠经毛果芸香碱刺激后所分泌的泪液, 却发现其容积和离子成分都不受影响。因此, 虽然AQP5在唾液腺和呼吸道黏膜下腺的分泌中有作用, 但对基础和刺激条件下的泪液分泌似乎并非必要。这一结果和先前提到的AQPs对于快速的近等渗性的液体分泌和吸收是必须的是一致的, 因为AQPs促进由渗透压引起的快速性液体转运而不是等渗性液体吸收[24,25]。而在鼠, 单位面积泪腺腺上皮的液体分泌量不及唾液腺的1/30, 肺泡上皮等渗性液体吸收率也是如此。在人类, 有学者研究Sjogren’s综合征患者泪腺时发现AQP5在胞浆而不是在胞膜表达[26], 说明细胞错误处理AQP5可能是该病的病理生理所在。但这一结果还未在其他实验室被证实。
4展望
水通道蛋白8 篇7
《黄帝内经》曰: “饮入于胃,游溢精气,上输于脾。脾气散精,上归于肺,通调水道,下输膀胱。水精四布,五经并行,合于四时五藏阴阳,揆度以为常也。”这些指出正常水液是通过肺脏的通调水道作用来输布全身的,故肺脏水液代谢功能的失调可以引起多个脏腑水液代谢紊乱。有学者通过Bradford法检测正常组和哮喘组豚鼠尿中水通道蛋 白2( aquaporin-2,AQP-2) 含量得出: 哮喘组豚鼠小便量显著减少( P < 0. 05) 、尿AQP-2显著升高( P < 0-01) ; 提示肺失宣降状态下,AQP-2表达的增加抑制了豚鼠体内水液代谢速度,导致小便量明显减少;故认为AQP-2的正常表达是保证肺主行水和肺通调水道功能的基础[1]。有研究发现慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者过多二氧化碳潴留能增加肾脏AQP-2的表达,过多AQP-2能增加肾集合管对水的重吸收,从而使患者水负荷过重导致外周水肿的发生,而患者在水肿发生前即有尿液AQP-2的增加[2]说明了慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者的肺脏呼吸功能的失调可很敏感引起肾脏中AQP-2基因的表达,进一步促进了水肿发生。
2 AQP-2 与肾脏水液代谢功能失调之间的关系
《素问·水热穴论》指出: “少阴何以主肾,肾何以主水? 歧伯对曰: 肾者,至阴也,至阴者,盛水也;肺者,太阳也,少阴者,冬脉也,故其本在肾,其末在肺,皆积水也。”因此中医上认为肾脏功能失常是机体水液代谢功能紊乱的根本因素。同时肾脏的气化功能在水液的正常运行中起重要作用。在基础研究中有国内外学者通过对小鼠的AQP-2基因敲除、活组织的检测及酶联免疫法等得出: AQP-2存在于肾内髓部集合管主细胞胞浆内囊胞和顶质膜,还存在于末端结肠上皮顶质膜及内耳内淋巴囊上皮细胞中; 特异性参与尿液浓缩[3]及稀释[4],与尿液的生成及变化有重大关系。现代生物学研究证实:AQP-2为抗利尿激素依赖式水通道蛋白,在抗利尿激素为零值时主细胞管腔膜AQP-2数量极少,水渗透通透性也极低; 当血浆抗利尿激素水平显著升高时主细胞管腔膜AQP-2水通道蛋白数量急剧增加,水渗透通透性也显著升高[5],这与中医因肾阳虚衰引起的水液泛滥极为相似。在相关疾病的临床观察中发现: 随着先天性肾积水患儿肾积水程度的加重,其尿液中的AQP-2的浓度和尿渗透压均进行性下降,提示肾脏AQP-2表达与肾脏积水程度密切相关,指出AQP-2变化是先天性肾积水肾脏浓缩稀释功能受损的重要分子基础之一[6]。另有报道显示:急性和慢性肾功能衰竭时AQP-2表达均降低,并指出AQP-2的变化与肾集合管上皮细胞损伤程度密切相关; 同时自由基、一氧化氮、肿瘤坏死因子等都会导致肾集合管AQP-2蛋白表达下降[7]。国外学者用链脲佐菌素诱导糖尿病发现几天后的糖尿病大鼠肾脏髓质顶端及基底部的AQP-2含量明显高于正常组[8],这也证实下消初期可引起AQP-2的增多。在中医治疗肾脏疾病方面研究发现: 黄芪能上调阿霉素肾病大鼠肾髓质AQP-2mRNA的表达,同时降低肾脏AQP-2蛋白表达,认为这是黄芪能改善阿霉素肾病大鼠水钠潴留状态的重要原因[9]。且临床复方治疗肾气虚型研究结果表明: 上调肾小管和集合管主细胞的AQP-2基因表达能达到治疗作用[10]。而在泽黄煎剂对糖尿病大鼠肾脏水通道蛋白表达的调节研究中发现: AQP-2蛋白在肾集合管表达,而在肾小球和肾间质未见表达; 且观察到在早期泽黄煎剂能减少动物的尿量和尿蛋白排泄率与在晚期可以利水消肿,增加尿量以减少尿蛋白排泄率似乎矛盾[11]; 这是否说明中医在治疗糖尿病肾病或者其他所有疾病的整个过程中都起到正性作用,甚至能降低最后事件的发生都是很值得探索的问题。
3 AQP-2 与脾胃水液代谢功能失调之间的关系
《素问·至真要大论》: “诸湿肿满,皆属于脾。”《脾胃论·脾胃盛衰论》: “百病皆由脾胃衰而生也。”中医学认为水液的生成有赖于脾胃的水谷运化。有专家通过总结国内外脾主运化水液与水通道蛋白的研究文献后得出: 津液代谢是联系脾胃功能与水通道蛋白2的纽带,认为水通道蛋白的正常表达可能是脾主运化水液的分子生物学基础[12]。有研究表明在脾胃湿热证中,湿重于热时测量尿中AQP-2明显减少,而在热重于湿时尿中AQP-2明显增多[13]。观察脾胃湿热证大鼠湿、热偏重模型及在三仁汤、白虎加苍术汤的干预下大鼠尿液中AQP-2的变化的实验发现: 脾胃湿热证大鼠湿、热偏重模型存在AQP-2含量增高,而三仁汤、白虎加苍术汤对大鼠尿液中的AQP-2含量具有调节作用,能降低已增高的AQP-2的含量; 说明AQP-2对脾胃湿热证型有重要鉴别作用,且得出中医祛湿的作用机制可能是通过降低人体AQP-2的含量来达到调整细胞内外的水液平衡[14]。另有实验研究认为,AQP-2在胃体中间粘膜组织的表达减少可能是湿阻中焦证临床证候产生的原因之一,亦可能是口渴口干等津液代谢失调的根本原因[15]。
4 AQP-2 与心脏水液代谢功能失调之间的关系
《素问·五脏生成篇》: “诸血者,皆属于心。”《素问·痿论》: “心主身之血脉。”中医上认为津血同源,心脏亦是参与了水液代谢平衡的调节,故心气、心阳虚等的发生可引起水液平衡失调。卢武生等[16]在监测心力衰竭模型大鼠尿中AQP-2时发现,随着心肌梗死的面积的逐渐增多,尿中的AQP-2的浓度也逐渐升高; 但尿中AQP-1及AQP-3的表达并无明显变化,而同时水潴留亦增加,导致低钠血症的进一步加重,这表明AQP-2是特异性增加的。临床研究也证明慢性心力衰竭患者尿中AQP-2与其血钠浓度呈负相关[17],提示AQP-2是慢性心力衰竭患者调节水潴留的关键性蛋白。以上研究为心阳虚证提供了新的思路和研究基础。在高血压病的病因研究中,Roxas[18]发现对盐敏感的Dahl SS /Jr大鼠给予高盐饮食后,其肾脏中的AQP-2的转录显著增加,这说明APQ-2的表达改变可能是引起高血压病的一个原因之一。
5 AQP-2 与肝脏水液代谢功能失调之间的关系
《金匮·水气病篇》曰: “肝水者,其腹大不能自转侧,胁下腹痛。”故指出肝脏的疏泄功能失调可引起水肿等病症的出现。在肝硬化腹水研究中发现:腹水大鼠模型肾脏皮髓质的AQP-2蛋白及其mR-NA全面上调,而在解释多项采用由BDL制备的肝硬化( 代偿) 动物模型的实验中发现,血浆抗利尿激素( 又称血管升压素,vascular vasopressin,AVP) 水平正常,AQP-2在肾皮质中的表达降低,而在内髓中无明显改变,其直接原因是AQP-2表达的下调,这也可能是肝硬化代偿阶段对于水潴留的一种适当反应; 当进展至失代偿阶段时,伴随着血浆AVP水平的增高才会出现AQP-2的上调,并认为丹参能下调肝硬化腹水时肾组织中AQP-2的高表达[19]。临床中证实肝硬化腹水患者存在AVP和肾脏AQP-2浓度增高,且血浆AVP的变化亦影响AQP-2的表达[20]。
6 AQP-2 与大肠水液代谢功能失调之间的关系
《脾胃论》指出: “大肠主津,小肠主液。”故当大肠功能失常,则大肠中的水液不得吸收,水与糟粕俱下,就可出现肠鸣、腹痛、泄泻等病症。Gallardo等[21]在研究大鼠 的结肠上 皮细胞时 发现AQP-2mRNA的确在远端结肠隐窝表达,表面吸收上皮细胞也有少量表达( 胃肠道的其他部位没有发现表达) ; 而且发现AQP-2蛋白与H+-K+-ATP酶共存表达于表面吸收细胞的顶部,并发现水剥夺可提高原位杂交信号及AQP-2蛋白表达水平; 这些可证实AQP-2存在于结肠并参与水液调节,这说明AQP-2与大肠分清泌浊功能有关系。有研究发现: 用宣白承气汤从 肠论治慢 性阻塞性 肺疾病得 出,使AQPsmRNA表达增强是其产生相关效应的作用环节之一; 进一步证实大肠分清泌浊功能与AQP-2的表达密切相关,亦从侧面证明运用中医治疗相关水液代谢疾病时AQP-2与疾病的好转存在明显的相关性[22]。
7 AQP-2 与子宫水液代谢功能失调之间的关系
《黄帝内经·五脏别论》云: “女子胞,主月事及胎儿,为女子先天之本。”中医学认为女子胞功能失调可以引起月经周期及白带分泌的异常。国外学者发现AQP-2能够在外源性雌激素的诱导下表达于小鼠子宫肌层和内膜的腺上皮和腔上皮细胞[23]。有实验从AQP-2在人不同时期子宫内膜中的表达入手,证实了AQP-2在人子宫内膜中的表达,且在月经周期的不同时期表达量不同,从而为揭示雌激素作用下的水在人子宫内的转运机制提供了理论依据。但由于本实验所取标本有限,增生期的标本也限于增生早中期,目前无晚期标本,因此有关AQP-2在人增生晚期内膜中的表达有待更深的研究; 而AQP-2在人子宫内膜液体分泌中作用亦有待于进一步探索[24]。另有学者通过对子宫肿瘤组织的病理切片研究后发现: AQP-2存在于子宫内膜上皮细胞胞质及胞膜,且参与了宫腔液体的增减[25],指出AQP-2的变化是引起子宫液体分泌变化的重要原因之一。
8 AQP-2 与膀胱水液代谢失调之间的关系
《素问·灵兰秘典论》: “膀胱者,州都之官,津液藏焉,气化则能出矣。”故膀胱功能的失调可引起尿失禁、少尿等病症。现代研究发现AQP-2定位于人膀胱黏膜上皮细胞的细胞膜及胞质中,在研究腺性膀胱炎患者中发现: AQP-2在炎症组织中表达较正常组织弱,即其相关组织中的阳性指数( 阳性指数 = 阳性面积/测量组织面积×阳性强度灰度值)较正常膀胱粘膜组织明显减少且差异有显著性( P < 0. 01)[26],这些都说明了膀胱功能的失调可引起AQP-2表达的异常,进一步可引起膀胱水液功能的失调而导致尿量减少。但临床上相关研究较少,故可以从AQP-2的表达来研究膀胱水液失调为相关疾病的治疗提供新方法。
9 小结
科学研究表明: 人体中的三分之二是水,没有水就没有生命; 并且它能决定大分子的结构、活性和反应,在生命的 过程中处 于中心地 位[27]。而AQP-2为水通道蛋白中一员,是人体各脏腑水液正常代谢所必须的非常重要的通道。综上可知:中医脏腑与水液代谢的关系可以通过AQP-2的变化来反映; 当人体水液代谢正常时,AQP-2在各脏腑中都有正常表达; 而水液代谢紊乱时相关脏腑都可出现AQP-2浓度及相关AQPmRNA表达的明显变化。通过进一步研究各脏腑对AQP-2浓度变化影响来了解人体水液代谢情况,不但可以为中医相关脏腑疾病的诊疗提供更加科学的依据,也为中医理论的现代化研究提供新方法和新思路,对指导中医临床诊疗规范和丰富中医理论均有重要意义。
摘要：经过多年的研究,目前对水通道蛋白2(aquaporin-2,AQP-2)的蛋白质基本结构、功能及作用机理方面都有较清晰的了解。但关于中医脏腑水液代谢功能失调与AQP-2关系的研究较少。从动物实验、临床观察、药物治疗等方面,都证实中医各脏腑的水液失调均可直接或间接引起AQP-2基因表达的变化,主要表现在相关组织或尿中APQ-2浓度的变化,并都存在相关性联系。这些为中医相关脏腑水液功能失调的深入研究提供现代医学基础。
水通道蛋白8 篇8
关键词：视网膜挫伤,水通道蛋白4,视网膜神经
视网膜挫伤是指眼部受到钝性外力击打所引起的视网膜损伤,其主要表现是急性视力损害和视网膜水肿、变性、出血、坏死,其发病机制尚未完全明了[1]。水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)在机体中介导各种类型细胞膜的水转运[2],在眼部也有广泛分布[3]。本文通过对实验性兔视网膜挫伤后不同时间段视网膜神经上皮AQP-4表达特点进行观察,以期进一步了解视网膜挫伤的发病机制。现报道研究结果如下。
1 材料与方法
1.1 仪器设备和试剂
Olympus光学显微镜;普通电冰箱(新飞电器集团);恒温培养箱(苏州医疗仪器厂);恒温电热烤箱(苏州医疗仪器厂);1/100000电子天平(上海光学仪器厂);图象分析系统(美国Media Cybernetics公司);AQP-4试剂盒(北京博奥森公司);其他试剂均为国产分析纯级;生理盐水为医用无菌制剂。
1.2 动物分组及模型制作
1.2.1 动物与分组
健康无眼疾成年大白兔42只(二级,新乡医学院动物中心提供),体质量2~2.5kg,雄雌兼用;饲养条件:开放系统,温度18~29℃,日温差≤3℃,相对湿度为40%~70%,换气量12次/h,氨气浓度≤14mg/m3,噪声≤30d B,工作照度约200Ix,昼夜明暗交替时间12h/12h,普通饮水和全价饲料喂养。外眼及眼底检查正常,选取右眼为致伤眼;随机(随机数字表法)分为挫伤后1h组、3h组、1d组、3d组、7d组、14d组和正常对照组共7组,各组均为6只。
1.2.2 视网膜挫伤模型制作
王志玉等[4]改良重击法,致伤能量约为2.87 J(E=mgh)。所有造模由同一操作者序贯完成。
1.2.3 眼部伤情观察
实验家兔均在同一条件、不同时间点进行眼部伤情观察,检查眼球位置、结膜、角膜、前房、瞳孔、晶状体、玻璃体和视网膜;眼底检查是在用散瞳剂充分散瞳后用直接检眼镜对包括周边部在内的眼底结构进行细致的检查。眼部检查由同一名高年资眼科医师完成。
1.2.4 动物模型制作成功的判断
伤眼直接对光反应迟钝,瞳孔散大;检眼镜观察眼底可见视网膜乳白色混浊、水肿范围较大,同时伴有眼底出血,即认为模型制作成功,纳入实验。制模后结膜囊内涂红霉素眼膏。
1.3 标本制备和视网膜AQP-4表达检测
在规定时间点经由耳缘静脉空气栓塞处死各挫伤组兔子;于14d按上法处死正常对照组受试兔子;处死受试兔子后,迅速摘除受试眼球,置于冰台上,修剪眼球表面的多余组织,0~4℃生理盐水冲洗3次,沿角巩膜缘后3~5mm处环形剪开眼球,剪除眼前节(角膜、虹膜、晶状体等)和玻璃体,翻转眼球壁使视网膜暴露于表面,用吸耳球沿视网膜周边部吹打视网膜表面,这样视网膜神经上皮层将脱离起来,此时可轻松剥取视网膜。然后按照AQP-4试剂盒说明书要求由专人严格操作;AQP-4表达以细胞膜呈不同程度的棕黄色为阳性,阴性结果无棕黄色表达。结果用图象分析处理系统测量灰度值;每个标本任意选择15个视野来检测阳性表达细胞的灰度值:灰度值高表示AQP-4含量高,灰度值低表示AQP-4含量低。AQP-4灰度值以χ—±s表示。
1.4 数据处理
采用SPSS13.0统计软件包进行数据统计学处理;致伤组与对照组间均值的两两比较用t检验,致伤组各组间的差异分析用单因素方差分析(F检验),为双侧检验;检验水准α=0.05。
2 结果
AQP-4在各组家兔视网膜神经上皮均有表达,阳性表达主要见于面对视网膜血管的神经胶质细胞突起,见图1~图7。
与正常对照组相比较,AQP-4的表达在视网膜挫伤后1h组(t=9.407,P<0.01)、3h组(t=6.653,P<0.01)、24h组(t=7.249,P<0.01)、3d组(t=4.556,P<0.01)、7d组(t=3.724,P<0.01)和14d组(t=2.268,P<0.05)均明显升高;视网膜神经上皮AQP-4表达在视网膜挫伤后也呈现动态变化:伤后1h组即高于对照组(t=9.407,P<0.01),3h组明显升高,24h组AQP-4表达最强,3d组AQP-4表达已经明显下降,挫伤后7d组表达下降更为明显,14d组AQP-4表达仍高于正常对照组(t=2.268,P<0.05);各个挫伤组AQP-4表达也存在明显差异(F=12.692,P<0.05),见表1和图8。
3 讨论
视网膜挫伤是导致眼外伤后视力丧失的主要原因之一,目前对视网膜挫伤后的临床表现已经有了较充分的认识,但其发病机制并未完全明了,研究表明视网膜挫伤后会发生水肿,并且视网膜水肿是动态变化的[1]。
AQP-4在眼部有广泛的分布,介导各种类型细胞膜的水转运;AQP-4在视网膜上的表达最强,整个视网膜均可见AQP-4阳性表达,特别是在外丛状层、内核层、神经节细胞层AQP-4表达更明显[3,5,6]。Hamann等[7]用免疫印迹、免疫电镜证实AQP-4主要表达于视网膜Müller细胞和星形胶质细胞,定量分析发现AQP-4在视网膜Müller细胞足突膜较非足突膜有高浓度的表达。眼组织AQP-4的调节机制尚不十分清楚,早先认为大多数AQP以固有的活性状态存在于所分布的组织中,无需门控和调节,但后来很多实验表明,在分子和基因水平还是存在着组织特异性调节,调节AQP的因素包括激素、神经递质及细胞因子等[2,3,8,9,10]。本研究观察到视网膜神经上皮层有AQP-4表达,并且AQP-4的表达在视网膜挫伤后呈现动态变化:在挫伤后1h AQP-4表达升高,挫伤后3h AQP-4表达升高明显,挫伤后24h AQP-4表达最强,挫伤后3d AQP-4表达较前明显下降,挫伤7d后AQP-4表达下降更为明显,但3d组和7d组AQP-4表达仍高于正常对照组;挫伤14d后AQP-4表达也未完全恢复正常;而先前的研究提示视网膜挫伤后视网膜会发生水肿,并且视网膜水肿也是动态变化的[1];因此,推测挫伤后视网膜神经上皮层AQP-4表达的动态变化和视网膜水肿的动态变化存在一定相关性。AQP-4在视网膜水肿中的变化是功能方面的作用,还是一种附带现象,暂不能下定论。因此,AQP-4抑制剂的研发应用非常有意义。AQP-4的作用可能是双方面的,它可能导致视网膜水肿的形成和发展,也可能起到保护作用。因此,这又为我们临床治疗提供了新的线索。AQP-4是水分子向细胞外转移的直接通路或载体[11],是胶质细胞和血管之间的水调节和运输的重要结构基础,以AQP-4作为治疗的靶向,可能在防止视网膜水肿的发生发展具有一定的指导价值。目前对AQP-4与挫伤性视网膜水肿的研究还非常少,而临床资料十分有限,这需要广大学者共同去研究。
**各致伤组间比较F=12.692,P<0.05