扩增效率不高（共3篇）
扩增效率不高 篇1
摘要：本研究开展了SELEX技术中ssDNA文库不对称PCR扩增及回收条件的优化试验, 结果得出:20μL不对称PCR反应体系中上下游引物的最佳比例为60∶1, 最优循环数为30个循环, 回收效率最高的方法为乙醇沉淀法。此条件下, 随机ssDNA文库不对称PCR扩增出来的条带清晰、稳定、特异性高, 并具有较好的纯化效率。
关键词：配基系统进化技术,ssDNA文库,不对称PCR,DNA纯化
20世纪90年代诞生了一种新兴的科学技术, 它利用人工合成的大容量随机寡核苷酸文库与靶分子在体外的相互作用, 筛选出一种与传统抗体相比特异性更强、亲和力更大、性质更稳定以及制备更容易, 无免疫原抗性, 无批间差异的适配子[1], 该技术称之为指数富集的配基系统进化技术 (SELEX) 。SELEX技术打破了传统的核苷酸配对的思想, 称得上是核酸研究与应用领域的里程碑式进步。其原理是利用大容量的随机单链寡核苷酸文库进行体外多轮筛选、扩增, 并最终获得与非核酸靶分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列[2]。SELEX技术筛选出的适配子不仅分子量小、配体广泛、体外筛选不依赖于实验动物, 甚至可以进行多种修饰, 比如最为普遍的糖环修饰、碱基修饰和磷酸修饰等[3], 这些优势使得SELEX技术有望成为实验室和临床诊断、治疗的主要技术之一。
随机寡核苷酸是SELEX筛选技术的基础, 而随机寡核苷酸链中间存在一段随机序列, 由于该随机区的存在使文库中的核酸序列极为丰富, 给筛选过程中文库的PCR扩增带来了一系列问题, 导致非特异性扩增[4]得不到理想的随机ss DNA, 而常规的试剂盒回收方法对小片段分子回收效率极低, 影响整个筛选过程。针对上述问题, 本试验在对称PCR最佳优化条件的基础上对随机ss DNA文库的不对称PCR反应体系进行了优化, 并且比较了PCR产物不同纯化方法的回收效率, 以期为SELEX技术中构建亚文库以及筛选特异性更强的适配子奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
随机ss DNA文库:构建长度为80 nt的随机ss DNA文库, ss DNA文库序列:5′-CTGGAGCG TCCTGGGGCGTCN (40) GTGCCCTCGCTCCGACCAGC-3′, 两端为固定序列, 中间N (40) 为随机序列。
PCR扩增引物:上游引物5′-CTGGAGCGTCCTG GGGCGTC-3′, 下游引物5′-GCTGGTCGGAGCGAGG GCAC-3′。随机文库及引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.1.2 试验试剂
Mg Cl2、Taq DNA Polymerase、d NTP、10×PCR Buffer, 均购自大连宝生物工程有限公司。其他试剂:异丙醇、4 mol/L醋酸铵、70%乙醇、酚/氯仿 (1∶1) 、3 mol/L醋酸钠、无水乙醇。
1.2 方法
1.2.1 随机ss DNA文库与合成引物的质量鉴定
将设计好的引物和ss DNA文库交给上海英骏生物技术有限公司合成。合成的引物序列和随机ss DNA文库采用4%琼脂糖凝胶电泳进行质量鉴定。
1.2.2 不对称PCR条件优化
在前期随机ss DNA文库对称PCR反应体系[5]优化结果的基础上, 参照文献[6]报道的方法对随机ss DNA文库的不对称PCR扩增体系进行优化, 拟定的反应体系及循环条件如下:
(1) 反应体系:10×PCR Buffer 2.0μL, 25 m M Mg Cl22.5 mmol/L, d NTP Mixture 0.25 mmol/L, 上游引物12μmol/L, 下游引物0.6μmol/L, Taq DNA Polymerase 1.5 U, ss DNA模板2.5 ng, 无菌水补至20μL。
(2) 循环条件:94℃预变性30 s, 94℃变性30 s, 68℃退火30 s, 共20个循环, 最后72℃延伸15 s, 72℃温育7 min。
其他反应组分与反应条件相同, 固定下游引物投入量 (0.6μmol/L) , 以不同上、下游引物比例 (1∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1) 分别扩增20、30个热循环次数, 进行3次平行试验以验证其稳定性。
(3) 产物鉴定:PCR产物采用4%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 PCR产物回收
以1.2.2中确立的最佳循环次数和上下游引物比例进行不对称PCR扩增, PCR扩增产物分别采用下列3种方法进行回收纯化试验, 比较其回收效率。
(1) 商品化试剂盒提取法:4%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段, 待片段完全分离后, 在紫外光下切取所需条带, DNA在紫外灯下曝光时间不超过30 s, 准确称取凝胶块的重量, 按照1 g/m L Binding Buffer对应量, 加入适量体积的Binding Buffer, 55~60℃水浴溶解 (约7~10 min) , 每隔2~3 min振荡一次。溶解完成后, 将DNA/凝胶混合液转移到套有收集管的Hi Bind DNA柱子上, 10 000×g离心1 min, 倒去滤液, 把柱子装回收集管;加入300μL Bind Buffer, 按上述条件离心, 弃去滤液, 再把柱子重新装回收集管;加入700μL SPW Wash Buffer, 也按上述条件离心, 弃去滤液, 13 000×g离心空柱2 min, 以甩干柱子基质。将柱子装在干净的EP管中, 加入30~50μL经65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上, 室温静置2 min后, ≥13 000×g离心2 min洗脱出DNA。回收产物加20μL DEPC水重悬, 置4℃冰箱中备用。
(2) 乙醇沉淀法[6]:吸取100μL PCR产物, 12 000×g离心4 min, 吸取上清液于1.5 m L EP管中, 向其中加入等体积的酚/氯仿 (1∶1) , 混匀, 置离心机中12 000×g离心5 min, 吸取上清液于另一干净的1.5 m L EP管中, 加入0.1倍体积的3 mol/L醋酸钠, 混匀后加入2倍体积的无水乙醇, 再次混匀, -26℃下放置过夜。取出后12 000×g离心30 min, 弃去上清液, 加入1 m L70%乙醇于室温洗涤沉淀样品, 5 000×g离心5~10 min后弃去上清液, 敞开管盖, 置于室温, 直至乙醇完全挥发。沉淀的DNA样品加入DEPC水20μL重悬, 置4℃冰箱备用。
(3) 不完全沉淀法[7]:吸取100μL PCR产物于干净的EP管中, 加入等体积4 mol/L醋酸铵溶液, 振荡混匀, 再加入等体积的异丙醇, 振荡混匀, 室温静置10min, 然后以12000×g离心10min, 去上清, 加1 m L70%乙醇漂洗, 振荡, 5 000×g离心5~10 min, 弃去上清液, 再加1m L 70%乙醇振荡混匀, 4℃下12 000×g离心5 min, 弃上清, 室温下干燥, 加20μL DEPC水重悬, 置4℃冰箱备用。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测回收效率及DNA浓度测定
分别吸取以上3种不同纯化方法的纯化产物各5μL进行4%琼脂糖凝胶电泳, 检测回收效率, 并测定回收前后DNA的浓度和OD260/OD280比值。
2 试验结果
2.1 随机ss DNA文库及引物合成产物的质量鉴定
通过4%琼脂糖凝胶电泳得到如图1所示的条带, PCR扩增结果与预期相符, 条带单一, 纯度好, 符合要求。
2.2 不对称PCR扩增条件优化
通过4%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析, 以既有较高的扩增效率又有较单一目的条带的扩增条件为最优上下游引物比例和循环次数。结果显示:随机ss DNA不对称PCR扩增的最佳循环次数为30, 最佳上下游引物比例为60∶1。
2.3 待回收产物鉴定
取3组PCR样品各8μL、Marker 3μL进行4%琼脂糖凝胶电泳, 结果显示:3组样品的条带亮度一致, 符合要求 (图2) 。
2.4 回收产物检测
通过4%琼脂糖凝胶电泳检测商品化试剂盒、乙醇沉淀法、不完全沉淀法回收所得产物, 以随机ss DNA文库PCR产物出现清晰的单一条带、回收效率最高的纯化方法为最佳回收方法。结果显示:对短片段ss DNA回收效率最佳的是乙醇沉淀法, 其次是不完全沉淀法, 最后为商品化试剂盒提取法。
用核酸蛋白测定仪测定回收前后ss DNA的浓度, 结果见表1。比较3种方法的回收效率, 可见乙醇沉淀法与不完全沉淀法差异显著, 乙醇沉淀法与商品化试剂盒法差异极显著, 不完全沉淀法和商品化试剂盒法差异极显著。
用紫外分光光度计测定3种方法回收产物的OD260/0D280值, 结果见表1。当0D260/OD280=1.6~1.8时, 可以认为该ss DNA纯度较好。从表1可知, 这3种纯化方法所得纯化产物的质量均在标准范围以内, 其中乙醇沉淀法的纯化效率最高。
4 分析与讨论
理论上, SELEX技术结合PCR扩增技术以指数富集与靶分子特异性结合的寡核苷酸, 经过几轮甚至十几轮的筛选, 可以获得亲和力高、特异性好的靶分子, 但是在实际操作中还是存在筛选效率低的问题。PCR技术始终贯穿着适配子筛选的全过程, PCR扩增效率的高低也会直接影响适配子的特异性和高效性, 制备下一轮筛选文库的方法一般有不对称PCR法和生物素-链亲和素磁珠分离法[8], 虽然应用磁珠法获得的ss DNA纯度好, 但是磁珠法耗材较为昂贵, 不为实验室所广泛采用, 因而成本较低、方法简单的不对称PCR法应用得更为广泛。同时, 随机ss DNA文库随机区的存在也使得文库具有多样性, 当以ss DNA为模板进行PCR扩增时, 随着循环次数的增加, 非特异性扩增产物也会增加[9]。为保证亚文库的纯度和数量, 对不对称PCR扩增条件的优化就显得尤为重要, 尤其是对循环次数和上下游引物比例的优化。本试验中, 以30个循环为最佳热循环次数, 既可以获得高质量的ss DNA文库, 又能较好地避免非特异性产物的扩增, 且结果稳定。在一般的不对称PCR扩增中, 合适的上下游引物比例一般在50∶1~100∶1之间, 过低的引物比例容易引起非特异性扩增, 而过高的引物比例则会使扩增效率下降[10]。本试验得出的最佳上下游引物比例为60∶1。
PCR扩增产物中一般都含有过量的酶和引物等, 会影响后续的连接、筛选等操作过程[11], 因而扩增产物的纯化是非常有必要的。常规的回收纯化方法一般为商品化试剂盒提取法, 但是试剂盒对<500 bp的目的片段的回收效率非常低, 而且商品化试剂盒价格昂贵。本研究结果表明, 乙醇沉淀法对小片段DNA分子的回收效率及纯化效果均比较好, 但是不能完全分离产物中的单双链, 导致回收产物中仍含有ds DNA;试剂盒提取法所得产物中, 含有ds DNA较少, 却存在回收效率低的问题。
5 结论
本研究得出20μL体系ss DNA文库不对称PCR的最佳扩增条件为30个热循环, 上下游引物比例为60∶1, 在此条件下可以得到单纯、无特异性扩增的ss DNA目的条带。乙醇沉淀法对小片段 (80 nt) 目的DNA的纯化效果较好, 对后续构建亚文库有重要的作用。
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扩增效率不高 篇2
1.我工作太多了
你一定经常听见这句，没有成效的人可能没有认识到，我们都有太多工作。因为我们就处于这样一个过度工作的年代。即刻查收email，以及手机浏览器意味着工作总是一点就有。什么把麦子从糠秕中分离出来?真正有生产力的人不会思想问题，他们只是工作。
2.那不是我的工作
要有生产力，就要专注于你的工作，而且别去做那些无生产力同事的工作。但是这是一种糟糕的模式设置。有趣吧，真正没有成效的人总好像注意到，他们做额外的工作来帮助一个项目。
他们过多地专注于他们的角色，专注于别人不在做什么。真正有生产力的人甚至不关心。他们不惜一切地完成任务，费力前进，之后分析具体的角色定义。
3.我会晚些时候完成的
还记得马克吐温对拖延症的人描述吧。没有成效的人浪费时间，因为他们生活在一种不一致的常态中。他们任务的不牢靠的结果从未偶然遇见，也就是不牢靠。他们开始一个word的文件，工作了一会，放下，接着开始做一个PPT。在这种“拿起又放下”的过程中，他们浪费了时间。因为每项任务需要一个启动，而这回用更多精力。
4.我还没有所有答案
过于细节取向的人喜欢用这个。他们在开始一个任务前，会等待直到每件事都完美地弄好以后。但是他们通常在这样的等待中已经无精打采了，因为事情很少会弄好。
讽刺性地，一些你公司的员工，就是全天浪费时间漫无目的浏览的人，也是那些认为他们必须等到项目的所有部分都就位的人。解决方案?富有生产力的人会做无论什么需要现在完成的活，他们不会等待完美的时间表。
5.我会等老板告诉我做什么
对于小公司的任何人来说，缺乏独立性是真正的生产力杀手，
当某人等着被告知要做什么时，这个项目将会失控。我们都知道“干活”的人只是找出问题，而且开始一项任务。此外，如果老板必须解释每个细节，那就浪费了宝贵的时间。
6.我不明白所有的变量
真的吗?有员工不愿行动，知道他有了所有答案吗?这是要等待长时间的人的信号，因为没人曾有所有答案。Airbnb和Uber的创业者没有等待所有的管制问题被解决，Google不会等到每个州允许他们的时候，才测试他们的无人驾驶汽车。
7.我没有看见对我有什么好处
我们生活在一个自恋狂的世界里，这些自恋狂，每30分钟就会想想自己，并把他们的内在感受发布在微博上。潜在问题呢?他们让项目慢了下来，因为他们只关心他们自己的奖赏。富有成效的人看到的是一个成功公司的更大的奖赏，而且想在建设一些酷的事情中扮演一份子。自我的人能等到周末。
8.我可能得不到美名
和这个问题相关的是另一个生产力的摧毁者：针对任务拿美名的.需要。恶意炒作你的工作，要求美名，纠缠人注意到你的行动等所有过程，都会带来一个没有成效的一天。那些正在事情最大慢下来的人正在浪费过多时间，努力引起老板的注意。
9.我担心我的工作质量
富有成效的人知道如何在源源不断的创造力和技能中带来好的工作。他们关心质量，但是他们也明白富有成效需要完成的推动力。当目标是为了总是制造完美，没有成效的人就会带来严重的减速。表扬质量，期待熟练，但是鼓励富有成效。
10.我可能会失败
每个在工作上没有成效的人的标记是担心失败。这是一个经过时间检验的真理。如果员工从不开始一个项目，他们不必担心失败，对吗?允许几个任务的失败是可以的。这意味着你在尝试新事物，而且保持忙碌。因为你想每个任务都成功而退缩不前吗?这只意味着完成更少的任务。
扩增效率不高 篇3
一、目前小学教学中师生互动所存在的纰漏
在多年的教学中,发现一些情况:(1)为了互动而互动,因为老师在教学过程中其目的是突出互动,只是以问答式的方式和学生形成互动,并没有考虑这个知识点是否可以通过别的方式进行展现更容易让学生理解,着实体现不出来课堂的成效。(2)在互动的过程中没有定位,因为课堂师生互动是一项有秩序的活动,老师一定要起到引导和点化的作用,在保证课堂成效的前提上,让学生对新的知识点更牢固地消化。(3)在课堂互动的过程中,只看中老师和学生之间的,而忽略学生与学生之间的互动,老师可以抛个知识点,让学生进行交流,出现分歧时,可以彼此了解、相互学习。只有这样,才能形成完美的互动成效。这些都是在教学的过程中所发现的问题,需要教师不断更改教学方法,为数学课堂找到更好的互动方法。
二、针对目前师生互动问题制定出解决方针
1. 依据课堂内容找到合适的、相对应的组合教学方法
在教学过程中,学生的学习方法分为自觉主动学习、小组讨论合作学习以及对知识点探究学习。这三种学习方法,不管是哪一种都要结合课堂上的具体情况,看哪个适用就用哪个。老师在数学教学的过程中,不能只是单纯地使用一种,这样会让课堂变得无趣,而且质量也搞不上去。所以针对这个问题,我们也找到了解决的办法。
老师在选择学习组合方式时,一定要考虑学生的特性,比如年龄,根据他们的年龄找到适合他们的学习形式。所以,老师一定要结合学生的年龄特点,设计一个适合他们的课堂互动活动,让他们能够投身到活动中,且开动大脑,展现他们的才华与智慧。
在小学数学教学中,老师一定要把握好自己在学生活动中的指引作用,要充分了解学生的具体情况,结合学习目标,了解学生在课堂活动中的定位角色,对学生进行有针对性的引导。比如,在活动中,如何将活动顺利地开展,怎样让老师和学生参与其中,怎样让学生对自己所收获的进行总结汇报,怎样引导学生讨论知识点,这些问题都是老师所要考虑的,也是非常重要的。
2. 实现师生互动,发现学生超人思维
“在教学中,我们是没有办法预料其中的全部的内容。但是教学的效果我们是可以预料到的,所以教学它不是一种艺术。”学生的想象力是非常丰富多彩的,也有一些学生的想法是我们永远都意想不到的,其中的一些问题就是师生两者互动所产生的美妙效果,老师应该很好地去挖掘它,在以前设立的目标上更进一步,使这种新潮在课堂中起到完美的润化作用。
一方面,老师在课堂中善于运用学生的话。在数学课堂中,老师就是这堂课程的主持者和建立者,老师在课堂中一定要将学生所说的话认真分析,有意义、有突破口地组织学生之间互动,让学生能够互助合作。学生在课堂中,表达的方式有所限制,不能说到重点,这时老师就要把学生所说的话中有意义的部分进行分析,帮助学生更好地考虑怎样完整表达,从而引起互动,达到好的教学成效。
另一方面,以学生犯的错进行教学。“一个人如果没有犯过错误,那么他永远止步不前,不会进步。”所以,作为老师,当学生犯下错误时,一定要以正常的心态去对待。当发现学生要出错误时,老师一定要巧妙地提醒学生,并且将这个错误当做课堂上的一个有效生成来正确对待。比如,在小学数学课程中,老师可以将日常最容易发生的错题,让全班学生去学习纠正。当学生在回答错误时,让他们听取别的同学的意见,让他们自己去改正错误,下次学生肯定对此类错误有抗体。
总之,在小学数学教学的过程中一定要将师生互动充分地利用到课堂中,这种教学方法很符合现代的教学特点,而且对提高学生的素质也有帮助。所以,老师在课堂中一定要合理地运用师生互动环节,确保小学数学的高质量教学。
摘要：在一堂精密的数学课中,老师想要让学生都能参与到课堂中,其中课堂师生互动是特别好的方法。它可以调动学生参加到课堂中的欲望。而且对学生的数学成绩,学习渴求和师资力量,甚至是学生以后的发展前景都有着至关重要的作用。探索了在小学数学中师生之间的互动能给课堂带来怎样的效果以及老师在经过课堂中师生互动实践中进行反思,对师生互动有新的看法以及如何正确实施这种教学方法。
关键词：数学课堂,师生互动,方针
参考文献
[1]黄秀美.师生互动,创造有活力的小学数学教学[J].吉林教育,2014(1):119.