有机溶剂提取物（精选9篇）
有机溶剂提取物 篇1
摘要：采用了机溶剂提取法, 研究了溶剂种类、提取时间、料液比单因素进行提取马尾松松针有效物质, 并探究了提取物抗氧化性, 结果表明其对DPPH有较高的清除效果, 对羟基自由基的清除不具稳定性。
关键词：马尾松,提取,抗氧化性
0前言
马尾松属松科植物, 是我国亚热带地区分布最广、资源最大的树种松针营养丰富, 资源富足, 价格低廉, 国内松针的工业应用发展很快。目前国内松针的产品主要运用在饲料添加剂、食品、医药、日常生活用品中, 如松针粉、松针浸膏、松针叶绿素-胡萝卜素-软膏、粉状松针膏饲料添加剂、松针饮料、松针茶等等。有机溶剂浸提松针得到的浸膏, 其可作为功能性肥皂、牙膏等的添加剂, 也是松针食品、药品、化妆品研发的活性源料成分。本文初步探讨松针有机溶剂浸提物的抗氧化性, 其为在医药、食品、环境方面的应用提供一定的导向。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
马尾松;1, 1-二苯基-2-苦基肼、邻二氮菲、硫酸亚铁、EDTA、双氧水、氮蓝四唑、核黄素、甲硫氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾, 氯化钠、氯化钾、电子分析天平、SHZ-D (Ⅲ) 循环水式多用真空泵;RE-5298A旋转蒸发仪、电热恒温水浴锅、UV-1800紫外可见分光光度计。
1.2 实验方法
1.2.1 提取物的制备
取新鲜松针5g粉碎置于圆底烧瓶中, 加入一定量的溶剂, 水浴加热回流提取, 减压浓缩至20m L, 得马尾松提取物。
提取工艺的选取:采用有机溶剂回流提取松针, 进行了溶剂种类、提取时间、料液比单因素实验;
1.2.2 松针提取物抗氧化性能测定
待测液的制备:取待测提取物浓缩液20μL, 50μL, 100μL分别加蒸馏水配制成1m L。
1) DPPH (1, 1-二苯基-2-苦基肼) 的测定
DPPH溶液的制备:用70%乙醇配制成0.2m M的DPPH溶液。
提取物DPPH清除率的测定[1,2]
取制备好的待测液, 分别加入2.0m L 0.2m M的DPPH溶液, 充分混匀, 室温下在黑暗处静置培养30min, 采用分光光度法, 在517nm处检测吸光度As。加入松针提取物以外的所有试剂, 按照测定As的方法测定A0。加入DPPH以外的所有试剂, 测定Ac。
2) 羟基自由基清除率的测定[3]
取5m M邻二氮菲溶液0.6m L, 依次加入0.4m L p H7.4磷酸盐缓冲溶液, 0.6m L硫酸亚铁溶液, 0.6m L EDTA溶液, 1.4m L蒸馏水, 1m L样品溶剂, 混合均匀, 37℃保温1h, 536nm处测定吸光度值A空白。
取邻二氮菲溶液0.6m L, 依次加入0.4m L p H7.4磷酸盐缓冲溶液, 0.6m L硫酸亚铁溶液, 0.6m L EDTA溶液, 0.6m L蒸馏水, 1m L样品溶剂, 0.8m L 0.1%双氧水, 混合均匀, 37℃保温1h, 536nm处测定吸光度值A损伤。
样品制备方法同上, 将损伤液配制中的1m L样品溶剂换成1m L样品。混合均匀后, 37℃保温1h, 536nm处测定吸光度值A样品。
3) 超氧阴离子的测定[4,5]
参考Ghiselli A和沈文飚等人的检测方法, 并对方法加以调整。试管内依次加入0.5m L 0.2Mp H7.8的PBS溶液, 0.3m L5×10-5M核黄素, 0.25m L 13m M甲硫氨酸, 0.25m L 5.1×10-4M氮蓝四唑, 0.7m L 0.1m M的EDTA, 1 m L样品溶剂, 再加入蒸馏水, 定容到4m L, 40W日光灯照射于560nm处测定空白样的吸光度值A空白。将测定A空白时的样品溶剂换成不同浓度的样品溶液, 测定样品的吸光度值A样品。
2 结果与讨论
单因素提取实验抗氧化性研究:
2.1 溶剂种类
1) DPPH自由基清除效果
70%乙醇、60%丙酮的提取物对DPPH自由基具有较的的清除效果, 其在选取的浓度范围内, 增加提取物浓度对DPPH自由基清除率影响不大。
2) 羟基自由基清除效果
70%乙醇的提取物对羟基自由基清除效果差, 60%丙酮、乙酸乙酯两种溶剂的提取物对羟基自由基清除效果相对强些。
3) 超氧阴离子清除效果
为溶剂种类对松针提取物清除羟基自由基的影响。三种溶剂中, 70%乙醇、60%丙酮的提取物清除效果强些。总体上, 提取物浓度对超氧阴离子清除效果影响不明显, 三种溶剂的提取物对超氧阴离子都有一定的清除作用。
2.2 提取时间
料液比1:30, 根据前面的实验, 选取70%乙醇为提取溶剂, 对提取时间因素进行研究, 同时, 在选取提取物浓度的研究范围内, 提取时间因素对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的清除效果有不同的结果。结果表示:提取时间因素对DPPH自由基、超氧阴离子的清除效果影响不明显;松针提取物对DPPH自由基清除效果强些;对羟基自由基的清除效果不稳定。见图1。
2.3 料液比
通过上述实验探索, 选取提取溶剂70%乙醇、提取时间1.5h的条件对料液比因素进行研究。由图2可知, 提取物的抗氧化能力:对DPPH自由基、羟基自由基的清除效果与提取时间影响因素的结果大体一致;对超氧阴离子清除效果在提取物加样容量为20微升时, 清除效果不受料液比因素的影响。当取物加样容量为50微升、100微升时, 在料液比1:40的条件下, 清除效果最弱, 其它料液比的条件下, 清除效果几乎不明显。整体上, 提取物对DPPH自由基清除效果好。
3 结论
(1) 对DPPH自由基清除能力:溶剂回流工艺得到的松针提取物对DPPH自由基有较高的清除效果。提取时间、料液比的影响因素对此自由基清除能力影响不明显。
(2) 对羟基自由基清除能力:提取物对羟基自由基清除能力不稳定, 可能是提取物内的有效成分性质不稳定, 易发生变化。
(3) 对超氧阴离子清除能力:提取物对超氧阴离子具有一定的清除能力。本实验研究的影响因素及提取物的浓度几乎对超氧阴离子清除能力无影响。
参考文献
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[5]沈文飚, 叶茂炳, 徐朗莱, 等.小麦旗叶自然衰老过程中清除活性氧能力的变化[J].化学通报, 1997, 39 (7) :634-640.
有机溶剂提取物 篇2
用加速溶剂萃取(ASE)技术提取土壤中的烃类污染物
摘要：据报道,在世界范围内均有发现烃类燃料的地下储油罐泄漏.而地下储油罐泄露的汽油,柴油或者其它燃料会污染周围的土壤.截至1992年受监控的.地下储油罐仅有200万吨,但是还有约300万吨不在监控范围内,通过检测土壤中烃类污染物的浓度来监测储油罐是否泄漏.因此检测土壤中烃类污染物的浓度是非常重要的分析手段.作 者： 作者单位： 期 刊：环境化学 ISTICPKU Journal：ENVIRONMENTAL CHEMISTRY 年，卷(期)：2009, 28(6) 分类号：X13有机溶剂提取物 篇3
关键词：泡沫分离；有机磷；核磁共振；NaOH-EDTA萃取法
磷是水体富营养化的限制性影响因子，水体中磷浓度高于0.02 mg/L[1]时，很容易引起水体富营养化。减少外源磷污染进入水体能够显著降低水体磷的浓度[2]，改善水体的富营养状况，改善水质。但是底泥所释放的内源磷成为阻碍河流、湖泊等水体生态系统修复的主要因素[3]。来自于欧洲的Carvalho.L[4]、Scharf.W.[5]和北美的Welch et al.[6]、Larsen et al.[7]等分别详细报道了湖泊内源磷污染现象。当外源磷污染减少时，藻类数量并没有降低，内源磷负荷推迟或阻止了水体生态系统的修复进程。另外据Jensen H.S.[8]报道即使底泥在有氧环境中，其释放磷可占到进入水体总磷量的99%，所以由底泥所释放的磷污染，即内源磷负荷不容忽视。
目前，底泥磷的核磁共振分析普遍采用NaOH-EDTA萃取法，限于萃取物中有机磷含量，虽然经过了冷冻干燥来富集有机磷，但是溶液中有机磷含量仍然不能满足测定需要，底泥的31P-NMR测定需要很长时间，一般需要12～72 h[9-10]，且谱图的分辨率和信噪比较低。
底泥中有机磷主要有磷酸单酯（phosphate monoester）、磷酸双酯（phosphatediester，DNA-P、膦酸（phosphonate）等，其中磷酸单脂和磷酸双脂是生物体细胞膜的主要组成部分具有表面活性，膦酸含有疏水的脂肪族链烃以及亲水的磷酸头部，也具有两性。DNA-A虽然是亲水性高分子聚合物，但是在细菌细胞内DNA分子上结合有很多表面结合蛋白，形成的生物大分子也具有不同程度的表面活性，所以理论上可以利用泡沫分离法来进行底泥有机磷的富集，目的是提高用于核磁共振分析底泥萃取液样品中有机磷的浓度。
1实验装置和方法
1.1实验装置
泡沫分离器是由空气压缩机，气体流量计，气体分布器，泡沫分离塔，泡沫收集装置组成。空气压缩机将压缩的空气通过胶管输送到气体流量计，气体流量计用于调节进入泡沫分离塔的气速。从气体流量计出来的空气通过胶管进入泡沫分离塔底部的空气分布器，空气通过空气分布器进入泡沫分离塔，底阀用于调节泡沫分离塔中待分离溶液的液位高度。泡沫分离过程中，可以看到泡沫分离塔中液面以上部分的泡沫，泡沫层高度为0.6～0.8 m，随着空气持续通入泡沫分离塔，塔中泡沫流入泡沫分离塔上部放置的泡沫收集装置，泡沫收集装置中的泡沫自然破裂形成溶液即为泡沫分离收集的有机磷溶液。泡沫分离塔的材质为有机玻璃管，直径为50 mm。装置如图1。
1.2实验方法
取同一采样点底泥样品，分为两份，其中一份采用分级萃取法提取底泥无机磷，另外一种用泡沫分离方法富集有机磷。
泡沫分离的方法，将底泥真空冷冻干燥24 h，取干燥泥样300 g，添加到3 L 0.25 mol/L NaOH溶液中，将溶液置于25 ℃恒温摇床上，震荡萃取16 h[11]。将制得的底泥混合液4 000 r/min离心10 min，去除大部分底泥杂质，然后将离心所得上清溶液以10 000 r/min离心30 min，用0.45 μm滤膜过滤，收集滤液。滤液中含有大量的氢氧化钠，pH呈强碱性，不利于泡沫的形成，需要调节溶液的pH，用3 mol/L HCl调节溶液的pH值到8.0。应用泡沫分离器，对萃取液中的样品进行泡沫分离，空气流速设定为20 mL/min，收集泡沫流出液体积20 mL。将泡沫分离法得到溶液于-50 ℃，小于20 pa真空度下进行真空冷冻干燥，待样品干燥后，刮取干燥后的有机层，取600 mg重新溶解于约2 mL 10 mol/L的NaOH溶液中，而后10 000 r/min离心去除不溶物质，取上清加入核磁共振管中，再加入0.1 mL重水D2O，进行核磁共振分析。
核磁共振试验温度为环境温度约20～25 ℃。采用德国BRUKER400核磁共振仪，外磁场强度为161.976 MHz，采样时间0.4 s，延迟时间12 s[12]。
2实验结果与分析
从图2和图3中可以看到，采用泡沫分离法，在化学位移为1.14 mg/L处出现了两个吸收峰，这是传统NaOH-EDTA萃取法检测不到的。从两个图中可以看到，都可以检测到正磷酸额信号，虽然正磷酸不具有表面活性，理论上不会被泡沫分离法所富集，但是由于其含量较高，容易混入富集分离溶液中，所以两种分离液都检测到了。另外泡沫分离法检测到了更多的磷酸单脂吸收峰。总测定时间，传统方法测定需要12 h，采用泡沫分离方法测定需要8 h。
总之，相比传统方法NaOH-EDTA萃取法，泡沫分离法富集有机磷的能力更强，用于底泥有机磷核磁共振分析的样品中有机磷含量更高，且泡沫分离方法富集的有机磷检测到了一个磷酸二脂信号峰，而传统方法检测不到，且测定所需时间缩短到传统方法的2/3。
参考文献：
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（收稿日期：2014-10-31）
饮用水有机提取物遗传毒性的研究 篇4
1材料与方法
1.1主要仪器与主要试剂荧光显微镜(Nikon E600),生物显微镜(cx-21),电泳仪(北京六一仪器厂)。XAD-2树脂、乙二胺四乙酸二钠、正常熔点和低熔点琼脂糖、Tris、Trition X-100溴化乙锭、肌胺酸钠(Sigma公司),鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98与TA100(哈尔滨医科大学提供)。
1.2水样的采集与处理采集某水源水与管网末梢水各1500L,静置沉淀泥沙后,采用XAD - 2大孔树脂富集其中的有机物。控制流速2~3L/min,每柱过水样250L。将有机提取物用正己烷和丙酮的混合液(1: 1)洗脱,旋转蒸发仪浓集后分别用玉米油、二甲基亚砜定容,冰箱贮存备用。
1.3试验方法
1.3.1 Ames试验采用平板掺入法[3]进行试验。菌株选用TA98与TA100经四步法鉴定,各项生物学指标符合要求后进行试验,阳性对照选用敌克松(62.5μg/ 皿),同时设自发回变组。两组样品浓集物以DMSO为溶剂,每组设4个剂量,分别为1L/ 皿、3L/ 皿、5L/ 皿和7L/ 皿。取不同浓度样品浓集物0.1m L,制备好的新鲜菌液0.1m L,加入融化好且温度适宜的顶层培养基中,混匀后铺平于37℃温箱中孵育48h,观察每平皿的回变菌落数。如回复突变菌落数超过阴性(溶剂)对照两倍及以上,并有剂量- 反应关系,就可确定受试物为致突变阳性。样品每个染毒剂量设3个平行皿,试验进行2次,最后以6皿均数的致突变率(MR值)表示。
1.3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验选用体重在18~22g的清洁级昆明种小鼠80只(购于哈尔滨兽医研究所,合格证为SCXK(黑)2011-007)。观察一周合格后将小鼠随机分为8组,每组10只,雌雄各半。分别为样品组、阴性对照组(玉米油)和阳性对照组(环磷酰胺0.06mg/g)。样品组剂量为0.125,0.250, 0.500L/g.。采用30小时染毒法进行试验,染毒6h后处死,取股骨骨髓涂片,空气中干燥,甲醇固定后用Giemsa染液染色,每张片子检查1000个嗜多染红细胞(PCE)计数微核,并计算微核细胞率(‰)。
1.3.3小鼠原代肝细胞凝胶电泳试验首先将小鼠处死制备细胞悬液。按照悬浮染毒方法进行染毒[4]。先用PBS液调细胞浓度至105~106个/m L,加入不同浓度的样品100μL,使终浓度为每管含0.125,0.250, 0.500L水样,每个剂量组设2个平行样,同时设溶剂对照(DMSO100μL)和阳性对照重铬酸钾(K2Cr2O70. 2 mmol/L 100μL)。样品混匀37℃恒温水浴,振荡染毒一小时,收集染毒后细胞,再用PBS液重悬确保细胞浓度达到104~105个/m L用于彗星试验。在荧光显微镜下观察记录拖尾细胞数、拖尾长度,每个剂量随机观察50个细胞,计算细胞的拖尾率和平均尾长。
1.4数据统计方法采用SPSS13.0软件进行数据分析。用CASP软件计算肝细胞凝胶电泳试验拖尾率。
2结果
2.1 Ames试验自发回变组和阳性对照组的菌落数均在正常值范围,样品结果存在剂量- 反应关系,差异有统计学意义,试验结果成立。TA98菌株在末梢水有机浓集物浓度为7L/ 皿剂量时致突变率(MR值) >2,试验结果为阳性。TA100菌株在两组样品四个剂量范围水源水有机浓集物在四个浓度范围致突变率均<2,致突变结果为阴性。经氯化消毒处理后样品遗传毒性增加。见表1。
注:a MR>2
2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验两组样品随着染毒剂量的增高,小鼠骨髓细胞微核数也增多。末梢水在最高染毒剂量下,雌雄和雄性小鼠骨髓细胞微核数均明显增高,与阴性对照组差异,有统计学意义(P<0.01),而水源水在高、中、低三个染毒剂量所产生的微核数与阴性对照组均无差异。见表2。
注:a 与阴性对照比,P<0.01
2.3小鼠肝细胞凝胶电泳试验溶剂对照组有少量细胞出现DNA损伤,而阳性对照组细胞DNA损伤严重。末梢水在为中、高剂量范围时,细胞拖尾率和细胞尾长与溶剂对照比较差异,有统计学意义(P<0.01),水源水仅在高剂量时,细胞拖尾率和拖尾细胞尾长与溶剂对照组间差异有统计学意义。见表3。
3讨论
在本试验的剂量条件下,三项试验结果均显示末梢水在高剂量下具有遗传毒性,其活性明显高于水源水,主要是移码型突变。水源水只在单细胞凝胶电泳试验最高剂量时出现阳性结果,说明单细胞凝胶电泳试验在检测水质遗传毒性时比Ames试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验敏感。虽然其他两项试验为阴性结果,但存在随着试验剂量的增加遗传毒性也增加现象,说明水源水受到有机物污染,在高剂量接触时也具有潜在的致突变性。研究结果表明,在本实验剂量范围内经过氯化消毒处理后,末梢水致突变性增强,这也与国内其他报道结论一致[5,6]。另外,末梢水致突变性增强也不排除管道存在二次污染的可能。因此,要改进水处理方法,提高有机物去除效果,探讨更加科学合理的水处理工艺、保障饮水安全。这是涉及我国人口健康素质和国家发展的重要问题,有必要从国家安全性的角度去重视饮水安全问题。
注:a 与阴性对照比,P<0.01。
摘要：目的 检测某水源水及经常规处理后的管网末梢水的遗传毒性,了解氯化消毒前后水质遗传毒性变化。方法将水样经XAD-2树脂柱富集其中的有机物,正己烷和丙酮的混合液(1:1)洗脱,旋转蒸发仪浓集后分别用玉米油、二甲基亚砜定容,冰箱贮存备用。利用成组生物试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠肝细胞凝胶电泳试验)从不同的遗传学终点检测其遗传毒性。结果 水源水只在单细胞凝胶电泳试验最高剂量时出现阳性结果,其他两项试验为阴性结果,末梢水以上三项试验结果与阴性对照有显著差异,均为阳性结果。结论 在本实验剂量范围内经过氯化消毒处理后的管网末梢水有遗传毒性。
有机溶剂提取物 篇5
1 仪器与试药
1.1 仪器
恒温金属加热器 (金银杏生物科技 (北京) 有限公司) , 酶标仪 (美国BIO-RAD公司, BIO-RAD型) , FW100 型粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司) , KQ5200 DE型超声仪 (昆山市超声仪器有限公司) , EYEL4旋蒸仪 (日本EYELA公司) , DZF-6050 型真空干燥箱 (北京神泰伟业仪器设备有限公司) , AL204-IC型电子天平[梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司], SHZ-CB型循环水式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂) , 微量移液器 (美国Thermo公司) , NANOpure超纯水系统 (美国Barnstead公司) , 96 孔细胞培养孔板 (美国Corning公司) 。
1.2 样品与试剂
茯砖茶 (一品茯茶, 湖南益阳茶厂) ;2, 2′-连氨- (3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸) 二氨盐 (ABTS, Amresco公司) ;二苯代苦味酰基 (DPPH, Alfa Aesar公司) ;抗坏血酸 (广州化学试剂厂) ;没食子酸 (中国食品药品检定研究院) ;福林酚 (Sigma公司) ;芦丁 (成都曼思特生物科技公司) ;氯化铝 (天津福晨化学试剂厂) 常规溶剂;乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等均为北京化工厂分析产品。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的提取和制备
将3.27 kg茯砖茶粉碎, 80%乙醇浸泡提取3 次, 分别为72, 48, 48 h, 过滤, 合并滤液, 减压浓缩干燥得总提取物230 g;将总提取物加水混悬, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取, 浓缩干燥, 得石油醚提取物1.75 g, 乙酸乙酯提取物64 g, 正丁醇提取物82 g, 水提取物38 g的不同溶剂提取物。 取各不同溶剂提取物10 mg, 用不同溶剂定容至10 m L (总提取物用超纯水, 其余用无水乙醇) , 得1.0 g/L母液10 m L, 分别用相应溶剂稀释, 得到0.01, 0.0125, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 g/L的供试溶液。
2.2 总多酚、黄酮含量测定
2.2.1 总多酚含量测定
2.2.1.1 标准曲线绘制参考文献[11], 采用Folin-Cio-calteu比色法, 稍作修改。 吸取质量浓度分别为0.01~0.10 g/L的没食子酸标准溶液20 μL于96 孔板中, 加入10%福林酚水溶液100 μL, 混匀, 反应5 min, 加入7.5%碳酸钠溶液80 μL, 混匀, 室温反应1 h, 在波长765 nm处测定吸光度, 绘制标准曲线:Y=2.1277X-0.0084, r2=0.999。
2.2.1.2 样品总多酚含量测定将不同溶剂提取物样品母液稀释适当的倍数, 按照上述方法显色, 测定吸光度。 根据标准曲线方程计算样品中总多酚含量, 结果表示为没食子酸当量 (mg/g) 。
2.2.2 黄酮含量测定
2.2.2.1 标准曲线绘制参考文献[12], 采用Al Cl3显色法, 稍作修改。吸取质量浓度分别为0.01~0.10 g/L的芦丁标准溶液50 μL于96 孔板中, 加入100 μL 0.1 mol/L Al Cl3和50 μL醋酸-醋酸钠的缓冲液 (p H 5.2) , 摇匀, 40℃反应15 min, 在400 nm处测定吸光度。 绘制标准曲线:Y=1.8861X-0.0087, r2=0.999。
2.2.2.2 样品黄酮含量测定将不同溶剂提取物样品母液稀释适当的倍数, 按照上述方法测定吸光度。 根据标准曲线方程计算样品中黄酮含量, 结果表示为芦丁当量 (mg/g) 。
2.3 抗氧化活性测定
2.3.1 清除DPPH自由基能力的测定
参照文献[13]的方法, 略有改进。 配制DPPH自由基测定液:称取7.88 mg DPPH自由基, 用无水乙醇溶解并定容于100 m L容量瓶中, 配制成2×10-3mol/L的DPPH自由基溶液, 于0~4℃避光保存, 备用。 测定:分别移取质量浓度为0.01, 0.0125, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液50 μL于96 孔板中, 加入150 μL DPPH自由基测定液, 迅速混匀, 37℃恒温反应30 min后, 在510 nm处测定吸光度。阴性对照以相应溶剂代替样品溶液, 其余步骤与样品相同。 所有的测量值均做3 个复孔取其平均值。 VC作为阳性对照。 样品的抗氧化程度用对DPPH自由基的清除率表示, 清除率越大, 抗氧化活性越强, 反之则弱。 计算公式如下:
(A0为阴性对照组吸光度;A1为样品组吸光度) 。
2.3.2 清除ABTS+自由基能力的测定
参考文献[14]和文献[15]的方法, 并作适当修改。配制ABTS+自由基储备液:配制2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液, 二者等体积混合, 避光条件下静置16 h, 形成ABTS+自由基储备液。 配制ABTS+自由基测定液: 将ABTS+自由基储备液用溶剂稀释, 使其吸光度在734 nm波长处达到0.700±0.020。测定:移取质量浓度为0.01, 0.0125, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液50 μL于96孔板中, 加入150 μL ABTS+自由基测定液, 混匀, 室温反应30 min, 在734 nm处测定吸光度。阴性对照以相应溶剂代替样品溶液, 其余步骤与样品相同。 所有的测量值均做3 个复孔取其平均值。 VC作为阳性对照。样品对ABTS+自由基的清除率照下面公式计算:
(A0为阴性对照组吸光度;A1为样品组吸光度) 。
2.3.3 铁离子的还原/抗氧化能力 (FRAP法)
参照文献[16]的方法, 略做改进。 取质量浓度为0.01, 0.0125, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液1.0 m L, 加入1.0 m L磷酸盐缓冲液 (p H 6.6) , 1.0 m L K3Fe (CN) 6。 上述混合物于50℃恒温20 min后, 加入1.0 m L10%的三氯乙酸水溶液终止反应, 3000 r/min离心10 min。 取上清液2.5 m L, 加入2.5 m L蒸馏水, 0.5 m L Fe Cl3, 混匀, 在700 nm处测定吸光度A。 阴性对照以相应溶剂代替样品溶液, 其余步骤与样品相同。 所有的测量值均做3 个复孔取其平均值。 VC作为阳性对照。
2.3.4 结果测定
半清除率浓度 (IC50) 计算根据回归方程计算清除率为50%时的浓度 (g/L) 。
2.4 结果
2.4.1 总多酚、黄酮含量
茯砖茶不同溶剂提取物总多酚、黄酮含量见表1。不同溶剂提取物中总多酚含量在59.90~291.38 mg/g之间, 其含量从高到低依次为乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>石油醚提取物>水提取物。 提取物黄酮含量在83.24~222.86 mg/g之间, 其含量从高到低依次为正丁醇提取物>总提物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物。
2.4.2 清除DPPH自由基的作用
清除DPPH自由基能力的测定结果及IC50, 分别见图1 和表2。 从图1 中可以看出, 茯砖茶不同溶剂提取物对DPPH自由基均有清除作用, 并且在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。 各溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力顺序为:乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。 乙酸乙酯提取物、总提物的IC50分别为0.043、0.048 g/L, 略弱于阳性对照抗坏血酸 (0.031 g/L) , 表明茯砖茶总提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。
2.4.3 清除ABTS+自由基作用
ABTS法清除自由基能力的测定结果及半清除率浓度, 分别见图2 和表2。 茯砖茶不同溶剂提取物对ABTS+自由基都表现出一定程度的清除能力, 并在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。 不同溶剂提取物对ABTS+自由基的清除能力顺序为:总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。 乙酸乙酯提取物、总提物的清除ABTS+自由基的IC50分别为0.027、0.025 g/L, 略低于阳性对照抗坏血酸 (0.017 g/L) , 表明茯砖茶总提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。
注:DPPH:二苯代苦味酰基;ABTS:2, 2′-连氨- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二氨酸
2.4.4 铁离子的还原/抗氧化能力
从图3 中可以看出, 石油醚提取物铁还原能力较弱。 其他溶剂提取物随着浓度增加, 吸光度逐渐增大, 表明在实验浓度范围内, 样品浓度越高, 还原能力越强。 不同溶剂提取物铁离子还原能力的顺序为:总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物>石油醚提取物。
2.4.5 总多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性
茯砖茶不同溶剂提取物清除DPPH、ABTS+自由基的能力与总多酚含量的相关系数分别为0.9294、0.8845, 相关性良好。 而黄酮含量与DPPH、ABTS+自由基清除能力以及还原力的相关系数分别为0.1818、0.3031 和0.2694, 相关性较差。 分析表明总多酚含量与抗氧化活性呈正相关, 推测酚类物质是茯砖茶提取物清除自由基及抗氧化的主要成分。
3 讨论
自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的分子或原子, 其化学性质相当活跃[17], 对DNA、蛋白质和脂质等生物大分子发生破坏性反应, 损害机体的组织和细胞, 进而引起各种病变[18,19]。 现已明确许多疾病或症状, 如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等都与自由基有关[20]。 植物中多酚[21]、黄酮[22]等活性物质能够清除过剩的自由基, 具有一定的抗氧化活性。
本文采用FRAP法、DPPH法和ABTS法对茯砖茶不同溶剂提取物进行了抗氧化活性研究, 比较了茯砖茶不同溶剂提取物对铁的还原抗氧化能力和对DPPH及ABTS+两种自由基的清除能力, 并测定了茯砖茶不同溶剂提取物中总多酚和黄酮的含量。 结果表明, 茯砖茶不同溶剂提取物均具有清除自由基、抑制铁氧化的能力, 其中总提物清除ABTS+自由基 (IC50为0.025 g/L) 及还原Fe3+的能力最强, 乙酸乙酯提取物清除ABTS+自由基 (IC50为0.027 g/L) 及还原Fe3+的能力次之, 石油醚提取物清除ABTS+自由基 (IC50为0.556 g/L) 及还原Fe3+的能力最弱。 清除DPPH自由基方面, 乙酸乙酯提取物清除能力最强 (IC50为0.043 g/L) , 总提物清除能力次之 (IC50为0.048 g/L) , 石油醚提取物清除能力最弱 (IC50为0.456 g/L) 。 而茯砖茶不同极性提取物总多酚、黄酮含量测定表明:茯砖茶不同极性部位均能提取出一定量的总多酚和黄酮, 其中以乙酸乙酯和正丁醇提取物含量较多。 分析茯砖茶不同溶剂提取物抗氧化能力与总多酚黄酮含量的关系, 结果表明随着总多酚含量提高, 抗氧化活性提高, 说明了抗氧化活性与其所含的多酚有一定关系。
通过茯砖茶不同溶剂提取物的体外抗氧化实验评价, 表明茯砖茶具有良好的抗氧化活性, 为进一步利用茯砖茶活性成分作为天然抗氧化剂用于食品工业及卷烟过滤烟嘴等提供科学依据。
摘要：目的 研究茯砖茶不同溶剂提取物体外抗氧化活性, 并测定其总多酚、黄酮含量。方法 以抗坏血酸为阳性对照, 采用二苯代苦味酰基 (DPPH) 、[2, 2'-连氨- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二氨盐] (ABTS) 及铁离子还原/抗氧化能力 (FRAP) 三种抗氧化模型, 评价茯砖茶80%乙醇 (总提物) 、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水5种不同溶剂提取物体外清除DPPH、ABTS+自由基能力和对铁离子的还原/抗氧化能力。结果 茯砖茶乙酸乙酯提取物总多酚含量最高, 正丁醇提取物黄酮含量最高, 分别为 (291.38±5.24) 、 (222.86±6.12) mg/g。茯砖茶不同溶剂提取物均具有一定的抗氧化活性, 清除ABTS+自由基和铁离子还原/抗氧化能力为:总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物;清除DPPH自由基的能力为:乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。茯砖茶总提物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗氧化活性, 清除DPPH自由基能力的半清除率浓度 (IC50) 分别为0.048、0.043 g/L, 清除ABTS+自由基能力的IC50分别为0.025、0.027 g/L。茯砖茶抗氧化能力与总多酚含量呈正相关。结论 茯砖茶提取物具有良好的抗氧化能力, 为开发功能性抗氧化剂提供科学依据。
有机溶剂提取物 篇6
1 仪器与材料
HY - 3A多功能振荡器,江苏金坛市金南仪器厂; UV -2550PC紫外可见分光光度计,日本。
绞股蓝,产自浙江丽水。将绞股蓝60 ℃ 烘干,粉碎过40 目筛,样品密闭避光保存,备用。芦丁对照品,二苯基苦基苯肼( DPPH) ,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 绞股蓝中黄酮类物质的提取
参考文献[6 - 8]的提取方法。准确称取1. 0 g的绞股蓝样品,于250 m L锥形瓶中,分别加入30 m L 80 ℃ 的蒸馏水和30 m L 25 ℃ 50% 的乙醇溶液( 固液比1 ∶30) ,设置一定温度浸取10 min,置于多功能振荡器上振荡30 min,抽滤得提取液,密闭、避光储存,备用。
2. 2 芦丁标准曲线的制作
准确吸取不同体积的芦丁标准溶液于7 支25. 00 m L比色管中,加入5% 亚硝酸钠溶液1. 0 m L,10% 硝酸铝溶液1. 0 m L混匀,室温静置6 min,最后加入4% 氢氧化钠溶液10 m L,蒸馏水定容至25. 00 m L,室温静置15 min,510 nm波长处测得其吸光度,绘制A - C标准曲线。
如图1 所示,得线性回归方程: y = 12. 162x + 0. 0002,R =0. 9993。
2. 3 提取液中黄酮类物质含量的测定
参考文献[9]测定提取液中总黄酮含量。分别用吸量管准确吸取50% 乙醇绞股蓝提取液和80 ℃ 水绞股蓝提取液各1 m L于25 m L比色管中,加入5% 亚硝酸钠溶液1 m L混匀,室温静置6 min,然后加入10% 硝酸铝溶液1 m L混匀,室温静置6 min,最后加入4% 氢氧化钠溶液10 m L,加蒸馏水定容至25. 00 m L,室温静置15 min,510 nm波长处测得其吸光度分别为0. 1473 和0. 4390。由线性回归方程知,25 ℃ 50% 乙醇绞股蓝提取液和80 ℃ 水绞股蓝提取液中黄酮类物质的浓度分别为0. 012 mg / m L和0. 036 mg / m L。计算得到两种不同绞股蓝提取液中黄酮的含量分别为0. 6% 和1. 8% ,即6. 00 mg/g和18. 0 mg / g。
2. 4提取液清除DPPH自由基的能力与黄酮类物质量效关系
在1 号试管中依次加入2. 5 m L 6. 5 × 10- 5mol / L DPPH溶液和1. 5 m L体积分数为50% 的乙醇溶液,纯水稀释至10. 00m L,混匀,室温静置20 min,于517 nm处测定其吸光度记为A0,在2 号和3 号试管中分别加入2. 5 m L 6. 5 × 10- 5mol / L的DPPH溶液和相同体积的两种绞股蓝提取液,纯水稀释至10. 00m L混匀,室温静置20 min后,于517 nm处测定其吸光度记为As1和As2; 在4 号和5 号试管中分别加入2. 5 m L 50% 的乙醇溶液和等体积的两种绞股蓝提取液,纯水稀释至10. 00 m L混匀,室温静置20 min,于517 nm处测定其吸光度记为Ar1和As2。
按以下公式计算提取液对DPPH自由基的清除率,结果见表1,表2。
从表1 可以看出: 80 ℃ 水绞股蓝提取液对DPPH自由基有清除效果,且效果很明显。测定液中黄酮类物质含量在0. 09 ~0. 27 mg /10 m L范围内对DPPH清除率随浓度上升明显提高。但当测定液中黄酮类物质浓度达到0. 36 mg/10 m L时,清除率逐渐降低。这与有关报道相符[10,11],一些天然抗氧化剂在高浓度时会表现促氧化作用,对自由基清除能力下降。
从表2 可以看出: 25 ℃ 50% 乙醇绞股蓝提取液对DPPH自由基有清除效果,测定液中黄酮类物质浓度0. 15 mg/10 m L时,清除率可达40. 70%。测定液中黄酮浓度在0. 03 ~ 0. 15 mg/10 m L范围内对DPPH清除率随浓度上升而提高。比较表1 和表2 可以看出,80 ℃ 水绞股蓝提取液比50% 乙醇绞股蓝提取液对DPPH自由基的清除效果明显要好。说明提取液温度对提取效果影响明显; 随着提取液温度升高,绞股蓝中水溶性黄酮类物质含量较多。
3 结论
以80 ℃ 纯水和25 ℃ 50% 的乙醇溶液为提取溶剂,以普通震荡法提取绞股蓝中黄酮类( 包括儿茶素、原花青素) 物质,80 ℃ 纯水提取液中黄酮类物质含量较25 ℃ 50% 的乙醇溶液高得多,说明提取液温度对黄酮类物质提取效果影响较大。固液比均为1∶30 的80 ℃ 纯水绞股蓝提取液比25 ℃ 50% 的乙醇溶液绞股蓝提取液,清除DPPH自由基能力明显要好。说明80 ℃水绞股蓝提取液中水溶性黄酮类物质含量较多,符合人们平时喝茶保健习惯。清除自由基能力与提取物中黄酮类物质含量并不完全呈正比。因此,食品工业生产过程提取绞股蓝中黄酮类物质,可以用75 ~ 80 ℃ 普通纯水作为提取溶剂,既节约提取成本也便于规模化生产。
摘要：分别以80℃水和25℃50%的乙醇溶液为提取溶剂,固液比1∶30,以普通震荡法提取绞股蓝中黄酮类(包括儿茶素、原花青素)物质,紫外显色法测定两种提取液中黄酮类物质含量。结果表明:提取液中黄酮类物质含量分别为18.0 mg/g和6.00 mg/g,提取液温度对绞股蓝中黄酮类物质的提取效果影响较大。80℃水提取液比25℃50%的乙醇提取液清除DPPH自由基的能力更强;清除自由基能力与提取物中黄酮类物质含量并不完全呈正比。
有机溶剂提取物 篇7
赶黄草含有没食子(GaLie acid)、槲皮素(Guercatin)、2,6-二羟基苯乙酮-4-0-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,6-dihydroxyacetophenone-4-0-β-D-gLucside)、两个结构有待进一步确证的化合物及丰富的黄酮类物质[3,4]。中医学认为,赶黄草性温味甘,具有祛黄疸、利尿、活血、保肝、清热等功效,以其为原料提取而成的肝素颗粒广泛应用于临床。近几年来,国内外对赶黄草的化学成分及其对肝病的治疗作用研究较多,但对该植物抑菌方面的作用,少有报道。本文分别采用赶黄草的水提取物及乙醇提取物对多种菌进行体外抑菌实验,拟观察赶黄草的体外抑菌活性,为临床提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
赶黄草,采于四川古蔺桂花乡。供试菌种:金黄色葡萄球菌(StaphyLococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coLi)、枯草芽孢杆菌(BaciLLus stubtiLis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、表皮葡萄球菌(StaphyLococcus epidermidis)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(MoniLia aLbican),皆由我校微生物实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 赶黄草水提取法[5]
取赶黄草10g,加适量蒸馏水浸泡30min后加热煮沸,再用文火加热30min,过滤得第1次水提取物,将滤渣用同样方法得到第2次、第3次水提取物,合并3次滤液,再浓缩至10mL,得到赶黄草水提取物(即每毫升药液含1g干药)。
1.2.2 赶黄草乙醇提取法[6]
取赶黄草10g,共4份,分别置于500mL圆底烧瓶中,然后加适量30%、50%、70%和90%乙醇浸泡30min后,100℃加热30min后过滤。药渣再加适量同浓度乙醇溶液,100℃加热30min后过滤。将两次滤液合并,用文火浓缩至10mL,得到赶黄草相应浓度乙醇提取物(即每毫升药液含1g干药)。
1.2.3 比浊管的配制[7]
取0.5mL浓度为0.048moL/L的BacL2加到99.5mL浓度为0.18moL/L的H2SO4中配制成0.5个麦氏浊度的比浊管(相当于细菌数为1.5×108个/mL),密封备用。
1.2.4 菌悬液的制备[7]
将供试菌接种至固体培养基上,细菌37℃培养24h,真菌28℃培养48h后,用适量生理盐水将菌落洗下。用比浊调管对比稀释至0.5麦氏浊度(1.5×108个/mL),4℃保存备用。
1.2.5 药敏纸片制备
取优质滤纸,用打孔器制备成直径6mm的滤纸片,置于洁净干燥的培养皿中,121℃高压蒸汽灭菌20min。无菌操作下将其分别浸在赶黄草的各种提取液及相应提取剂中,备用。
1.2.6 药敏试验[9]
无菌操作下吸取0.2mL菌悬液于琼脂平板上(细菌用MH琼脂平板,真菌用沙氏琼脂平板),均匀涂布,取含药滤纸片紧贴于平板上,每个平板贴4片,每个菌种做三组平行,另外每个菌种用含提取剂滤纸片做一份阴性对照,10min后倒置于恒温培养箱中37℃培养,细菌培养24h,真菌培养48h。使用十字交叉法测量抑菌圈直径,并记录数据。
2 结果
赶黄草水提取物及不同浓度乙醇提取物的体外抑菌效果见表1。
(抑菌圈直径mm)
注:表中各抑菌圈直径为三组平行试验测得表皮葡萄球菌的抑菌圈直径的平均值;“—”表示无抑菌圈产生;所用阴性对照组均无抑菌圈产生。
3 讨论
现代药理研究表明赶黄草有治疗黄疸、水肿、经闭、血甭、带下、跌打损伤以及各型肝炎、胆囊炎、脂肪肝等作用[10],对细菌与真菌的抑菌作用研究甚少。本实验用赶黄草的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇提取物与水提取物,分别对白色念珠菌、新生隐球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌在体外进行抑菌效果观察。结果如表1所示,赶黄草水提物及醇提物对绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,对供试真菌无抑菌效果。
表1提示水与乙醇不同溶剂赶黄草提取物的抑菌活性无明显差别;乙醇浓度与抑菌效果之间呈不均一的线性关系,随着乙醇浓度的增高,赶黄草乙醇提取物对绿脓杆菌的抑菌活性降低,对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌活性增强:30%乙醇提取物对绿脓杆菌抑菌效果最好,90%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌体外抑菌效果较好。
随着抗生素的广泛应用,致使多重耐药菌株的出现,细菌耐药性的问题已日益突出。中草药以其价格低廉,毒副作用小,且很少产生耐药性等独特优势越来越受到外界重视,中草药的抑菌作用已受到重视。目前,对赶黄草的抑菌作用研究较少,进一步对其抑菌机制、抑菌成分及其对更多其他菌种的抑菌活性进行研究将具有更大的价值。
摘要：目的:研究赶黄草水提物及不同浓度醇提物的体外抑菌作用。方法:以抑菌圈直径为参考指标,采用滤纸片法,测定赶黄草水提物及30%、50%、70%、90%醇提物对几种常见病菌的体外抑菌活性。结果:各提取物对绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,而对白色念珠菌、新生隐球菌、大肠杆菌的抑制作用不明显。结论:赶黄草不同溶剂提取物对4种供试菌均具有不同程度的抑制作用,是一种具有开发价值的天然抑菌资源。
关键词：赶黄草,水提物,醇提物,体外抑菌
参考文献
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天然有机物的提取与分离 篇8
1 超临界流体萃取技术
超临界流体萃取是一种新型的提取分离技术,它利用流体在临界点附近某区域内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能,这种流体可以是单一的,也可以是复合的。超临界流体是一种介于液体与气体之间的流体,其密度接近普通液体,其粘度接近普通气体,具有低粘度、高扩散性、无污染和高选择性等良好溶剂的特性,且可以利用温度与压力的变化来调整流体的性质。在超临界萃取技术中,通常用的萃取剂为CO2,因为它是一种无毒、不燃和化学惰性的物质,价格便宜,纯度高,容易获得,且对环境无污染,其密度对温度和压力变化十分敏感,且与溶解能力在一定压力范围成正比例,可以通过控制温度和压力改变物质溶解度。因此,CO2特别适合天然产物有效成分的提取。
超临界流体萃取特点:(1)萃取和分离合二为一;(2)萃取效率高,过程易控制;(3)萃取温度低,可较完好保存中药有效成分不被破坏,不发生衍生化,特别适宜于对热敏感、易氧化分解成分的提取;(4)萃取流体可循环使用。其缺点是:样品量受限,回收率受样品中基体的影响。要萃取极性物质需加入极性溶剂以继续在高压下操作,设备投资较高等。
超临界流体萃取技术在中药提取分离中的应用前景广阔,特别对于一些资源少、疗效好、剂量小、附加值高的产品极为适用。近年来我国利用SEF技术对中草药的研究和开发也取得了很大的进步[2],研究开发出了成熟的CO2-SEF工艺技术的中草药有银杏叶、金银花、紫草、生姜、大蒜等近30种。此技术在其他方面也有广泛的应用,例如在食品方面的应用。目前已经可以用FC-CO2从葵花籽、红花籽、花生、小麦胚芽、可可豆中提取油脂,这种方法比传统的压榨法回收率高,而且不存在溶剂分离问题。
2 超声波提取技术
天然植物有效成分大多数为细胞内物质,在提取时往往需要将植物细胞破碎,现有的机械破碎法难以将细胞有效破碎。化学破碎法又容易造成被提取物的结构性质等变化而失去活性,因而难以取得理想的效果。超声波提取是集物理学、化学和工程学于一体的一门综合技术[3]。将超声波应用于提取植物的有效成分,操作简便快捷,无需加热,提取率高,速度快,效果好,且结构未被破坏,显出明显的优势。
药用植物的化学成分较为复杂,常规法提取效果常不理想,近年来用超声波提取收到了良好的效果,尤其是生物碱、苷类、挥发油等成分的提取。用超声波从曼陀罗、萝芙木、吐根、天麻、马钱、益母草等植物中提取生物碱均可得到同样的效果,用超声波提取苷类,取样量小,所用溶剂少,检验周期短。在绞股蓝、党参、人参根中应用超声波提取皂苷,与传统方法相比,也具有省时、节能、杂质少、提出率高等优点。于淑娟等[4]对超声波协同纤维素酶和菠萝蛋白酶法提取灵芝多糖进行了研究,超声波高频振荡及其产生的“空化效应”可破坏细胞壁的维持力,提高酶解纤维素的效率,尽快地释放出细胞多糖物质。
3 微波提取技术
微波辅助萃取是利用微波能来提高萃取率的一种新技术,在提取过程中,微波辐射导致植物细胞内极性物质吸收微波能,产生热量,由于细胞内温度迅速上升,水汽化产生的压力会将细胞膜冲破,形成微小孔洞;若进一步加热,则导致细胞内部和细胞壁水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。空洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内产物。在微波的作用下,某些待测组分选择性地加热,使之与基体分离,进入微波吸收能力较差的萃取剂中,这是由于物质结构不同,吸收微波能的能力各异。
近年来,国内外将微波技术应用于天然药物活性成分的浸提过程,有效提高了回收率,取得了可喜的进展,且迅速朝着工业化方向发展。目前,微波技术用于提取生物活性成分的报道不断出现,已涉及到几大类天然有机化合物如挥发油、苷类、多糖、生物碱及有机酸等。韩伟伟等[5]用微波辅助提取法提取青蒿素,与传统提取法相比,提取率明显提高。郝守祝等用此法提取大黄游离蒽醌并与传统法相比较,此法的提取效率明显高于蒸煮法,且操作简单。MAE的特点为投资少、设备简单、适用范围广,选择性高,操作时间短,溶剂好量少,与传统煎煮法相比,克服了药材细粉易凝聚、易焦化的弊端。缺点是:(1)使用极性溶剂;(2)提取后要过滤,这就不利于与气相色谱等仪器联机而实现自动化。
4 酶法提取技术
酶提取技术是近几年来用于中药工业的一项生物工程技术。中草药成分复杂,既有有效成分,也有非需成分。传统的提取方法提取温度高,提取率低,成本高且不安全。而用适当的酶,可通过酶反应较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放和提取。酶技术在食品工业、饲料工业、精细化工等行业应用越来越多,在天然产物提取中的应用近年来也有所发展。如单一材料补骨脂、香菇、银杏叶、决明子等的有效成分提取和除去杂质。
酶技术用于药材提取,反应温和,提取效果较好,收率好,节约能耗,所以应用前景广阔。高大维等人[6]研究了冷冻预处理协同酶浸渍提取灵芝、木耳、螺旋藻多糖,取得了满意的结果。上海中药一厂首先应用酶法成功地制备了生脉饮口服液。在动物药材的提取中,酶法应用得更广泛。
5 仿生提取技术
仿生提取法综合运用医学仿生与化学仿生的原理,同时又将整体药物研究与分子药物研究法相结合,是将生物技术手段应用到中药研究中的一种尝试。仿生提取法主要是针对口服给药的提取。将原料药经模拟人体胃肠道环境,根据人体消化道的生理特点,消化管和血管之间的生物膜是类脂质膜,允许脂溶性物质通过,分子性药物更容易吸收。仿生提取法是中药口服药制备中的一项重大革新,具有较高的学术价值和推广应用前景。
6 固相微萃取技术
固相微萃取[7~10]是近年来出现的一种集萃取、浓缩、解吸于一体的样品前处理新方法。它主要与气相色谱和高效液相色谱联用,能快速有效地分析样品中的痕量有机物。SPME主要针对有机物进行分析,根据有机物与溶剂之间相似相溶的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来。1990年Pawliszyn等首次发表了关于SPME的论文并开始了深入研究.随着技术的发展,SPME已成功地运用于气体、液体甚至固体样品中有机化合物的前处理及痕量分析,在环境监测、食品检验、医药卫生、生物化学、天然产物等领域应用广泛。此技术在对中草药挥发性成分的分析中开始应用,如中药石菖蒲、新鲜紫苏、肉桂、冷杉叶以及蛇麻草中各种挥发性成分的鉴定等。
7 大孔树脂吸附色谱技术
大孔树脂吸附法是利用大孔吸附树脂对欲分离物质的吸附作用和筛选作用达到分离的目的。大孔树脂柱色谱是以大孔吸附树脂为固定相,使天然物提取液通过装有大孔树脂的柱子,其中的有效成分有选择性地吸附在树脂上,而杂质成分不被吸附,在经适当的溶剂洗脱,收集含有效成分的流出液,合并浓缩,回收溶剂,便可除掉天然提取液中的杂质成分,达到有效成分与提取液中糖类、色素等杂质分离的目的。这是一种纯化精制天然有机化合物的新工艺,具有快速、高效、方便、灵敏、重现性好等优点。
由于大孔吸附树脂在水溶液中吸附力较强,具有良好的选择性,而在有机溶剂中吸附力极小,因此大孔树脂主要用于分离提纯中药皂苷类、生物碱、黄酮类、多肽类等水溶性成分或极性化合物。皂苷是广泛存在于自然界的一类化合物,也是许多中草药发挥疗效的主要活性成分,已应用于临床。皂苷本身的特性和大孔吸附树脂分离纯化的优势决定了大孔吸附树脂技术能够在皂苷的分离纯化中得以推广和发展。蔡雄等[11]用D101大孔树脂富集纯化人参总皂苷,洗脱率达90%以上。制川乌、制草乌是中药处方中常用的对药,其主要成分是亲水性乌头原碱类的氨基醇类生物碱。杨桦等[12]用正交设计法优选大孔吸附树脂提取分离制川乌、制草乌饮片中乌头类总碱的工艺条件,可分离出样品液中85%以上的乌头类生物碱。在黄酮类化合物的分离中,麻秀平等[13]比较了10种大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附性能及动力学过程,筛选实验结果表明,弱极性树脂AB-8是一种对银杏叶黄酮吸附性能优良的吸附剂,吸附容量大,吸附、解吸容易。在用此法分离其他中药成分方面,萧伟祥等[14]报道了用大孔吸附树脂柱色谱法从茶中分离纯化茶多酚,结果PA树脂对茶多酚,XDA大孔树脂对咖啡碱,具有较高的吸附量和选择性,用85%乙醇洗脱,可分别用于茶多酚和咖啡碱的吸附分离。
8 高速逆流色谱技术
高速逆流色谱技术是一种不用任何固态载体的液相色谱技术,其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离,其分离效率和速度可以与HPLL相媲美。HPLL分离效率高,产品纯度高;不存在载体对样品的吸附和污染;制备量大,溶剂消耗少;操作简单,能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。在中试规模和产业化中应用时,还需对逆流色谱的分离机理进行更深入的探讨,并需要解决现有仪器设备在放大过程中的一些关键技术问题。高速逆流色谱技术应用于天然产物的分离可实现:(1)制备高纯度的药用成分对照品和必须控制的杂质成分;(2)配合活性跟踪与入药部位的设计,主机分离制备活性部位或活性成分;(3)中药材和中药方剂指纹的建立,提供更丰富的信息和数据;(4)进行中试批量生产和工业生产。如中科院工程研究所探索了利用此技术制订中药指纹图谱的方法,以丹参原药材为模式植物,初步建立了丹参的高速逆流色谱指纹图谱。该技术有望成为中药有效成分质量标准研究的一种新方法及中药生产的一种新型分离技术。此外,高速逆流色谱技术还可与其它新型分离技术相结合分离中药有效成分。巢志茂等[15]将高速逆流色谱与双水相萃取技术相结合,以双水相系统作为高速逆流色谱技术的固定相和流动相,对牛漆多糖成分进行分离纯化,成功地分离出多糖部分和蛋白多糖部分。
溶剂法提取火棘籽油工艺研究 篇9
火棘在我国是一种储量十分丰富而尚未开发的野生植物资源,广泛分布于我国东南和西南各省的广大地区。据调查,湘西自治州年产火棘鲜果1.1万t以上,单株平均产果达7.5 kg,其不仅极具观赏价值,其果实药用保健及食用价值也很高,亦可作为重要的天然色素、果胶及饲料资源之一[3]。
火棘总提取物具有降血脂、清除氧自由基、增强体力、增强免疫力和促进消化功能等作用[4]。湘西北火棘籽油中天然VE浓度很高,而且富含亚油酸、油酸等[5]。由于火棘籽油的亚油酸与亚麻酸的含量较高,具有很高的营养和保健价值。该文以火棘籽为原料,通过单因素和正交试验,探讨有机溶剂浸出法提取火棘籽中油的最佳工艺条件,以为火棘籽的综合开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验仪器:TMP-2上皿式电子天平(湘仪天平仪器设备有限公司)、RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、HH·Q-1电热恒温干燥箱(长沙医疗器械厂)、4孔电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂)、XA-1固体样品粉碎机(江苏金坛市亿通电子有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
材料与试剂:火棘籽(湘西吉首)。石油醚Ⅰ(30~60℃沸程)、石油醚Ⅱ(60~90℃沸程)、乙醚、正己烷、丙酮等均为国产分析纯试剂。其中石油醚Ⅰ:成都金山化学试剂有限公司。
1.2 试验方法
有机溶剂法提取油脂即利用有机溶剂能溶解油脂的特性,通过润湿、渗透、分子扩散等作用,将油料中的油脂提取出来,然后进行混合油中溶剂分离得到毛油的过程[6]。提取过程的具体操作步骤如下:将干燥后的样品放入滤纸筒内,滤纸筒上方塞少量脱脂棉;再将滤纸筒放入索氏提取器内连接已干燥至恒重的脂肪瓶,注入有机溶剂至虹吸管高度以上。待提取液流尽后再加入适量溶剂,连接回流冷凝管;将底瓶放在水浴锅上加热,用少量脱脂棉塞入冷凝管上口,提取开始。
1.2.1 工艺流程。火棘籽→除杂→洗净→烘干→粉碎→提取→干燥→粗油→计算。
1.2.2 操作过程。
(1)原料预处理。将腐烂果和杂物从火棘果中去除,将挑选好的果实清洗干净,沥干。(2)破碎取籽。手工破碎,得到果籽与果肉,采取沉降分离法选取下沉籽,经60℃干燥后备用。(3)粉碎过筛。用粉碎机对火棘籽进行粉碎,过40目筛。(4)有机溶剂提取。将溶剂和火棘籽粉末放入脂肪瓶中,将冷凝装置接好,将脂肪瓶浸入恒温水浴锅中进行浸提。(5)溶剂回收。浸提后对料液进行抽滤分离,所得滤液用旋转蒸发仪蒸发回收石油醚,得火棘籽毛油。(6)干燥。采用真空干燥箱对毛油进行干燥处理,控制温度95~105℃,真空度0.08~0.10MPa。
1.2.3 影响提取率的单因素试验。
通过前期的文献研究与预备试验结果,选取提取时间、提取试剂、提取温度、提取料液比对火棘籽油的提取工艺进行单因素试验研究[7,8,9,10]。其试验方法如下:(1)有机溶剂。准确称取5份粉碎好的的火棘籽10g,分别加入60 m L乙醚、石油醚Ⅰ(30~60℃沸程)、丙酮、正己烷、石油醚Ⅱ(60~90℃沸程)在一定沸程内恒温浸提2 h,经旋转蒸发干燥得火棘籽粗油,考察不同溶剂对火棘籽油提取率的影响。(2)提取温度。准确称取6份粉碎好的火棘籽10g,分别加入石油醚Ⅰ60 m L,浸提2 h,分别在55、60、65、70、75、80℃下进行提取,经蒸发干燥后得火棘籽粗油。以提取率为评价指标,考察提取温度对火棘籽油提取率的影响。(3)提取时间。准确称取6份粉碎好之后的火棘籽10 g,分别加入石油醚Ⅰ60 m L,60℃恒温分别浸提1、2、3、4、5、6 h,经蒸馏、干燥后得火棘籽粗油。以提取率为评价指标,考察提取时间对火棘籽油提取率的影响。(4)提取料液比。准确称取6份粉碎好的火棘籽10 g,分别加入40、50、60、70、80、90 m L的石油醚(30~60℃),60℃恒温分别浸提2 h,经旋转蒸发、干燥得火棘籽粗油。以提取率为评价指标,考察料液比对火棘籽油提取率的影响。
1.2.4 火棘籽油提取工艺的优化。
根据上述结果,影响火棘籽油提取率的主要因素为提取温度、提取时间、料液比,故以此3因素设计L9(33)正交试验,以提取率为评价指标,优化提取工艺。为确定在多因素条件下的最佳提取温度、时间、料液比,进行正交试验[11,12,13]。
1.2.5 火棘籽含油量的测定。
由于各地火棘籽含油量不一样,并且差异较大。本次试验所用火棘籽含油量的测定参照GB/T 14488.1-2008,试验测得火棘籽含油量7.05%。
1.2.6 得率计算。具体计算公式如下:
式中:m1—火棘籽粉质量(g);m2—提取后火棘籽油与脂肪瓶总质量(g);m0—脂肪瓶质量(g)。
2 结果与分析
2.1 索氏浸提火棘籽油工艺条件的确定
2.1.1 提取剂对火棘籽粗油得率的影响。由图1、表1可知,丙酮的提取率最高,是由于丙酮极性较大,在提取油脂的同时也溶解了其他物质。并且提取物其中既含油脂又含原花青素,颜色为棕褐色,油的品质较差,所得产物仍需分离,所以淘汰。石油醚Ⅰ、石油醚Ⅱ、乙醚、正己烷对火棘籽浸提效果相差不多,但由于乙醚挥发性较强,试剂回收率较低,且提取的油质地较混浊,亦淘汰,石油醚Ⅱ和正己烷对火棘籽的浸提效果较好,但沸程较高,浸提温度高,不易控制。石油醚Ⅰ溶解油脂仅要求较低的温度条件,且化学性质稳定,毒性小、沸程低、易回收。因此,综合考虑浸提剂的安全性、浸提效果及油脂色泽等方面的因素,确定石油醚Ⅰ(30~60℃沸程)作为提取火棘籽油的浸提剂。
2.1.2 提取温度对粗油得率的影响。
由图2可知,以65℃为界限,低于65℃粗油得率呈明显上升趋势,高于65℃趋势变缓,当温度达到70℃时,提取率达到最大值6.72%。到70℃以后提取率略有下降,可能是因为温度高,石油醚挥发过快,导致料液比降低,从而影响提取率。因此,提取温度选择70℃左右较好。
2.1.3 提取时间对粗油得率的影响。
由图3可知,产率随着浸提时间的增加而提高,因此,适当延长浸提时间可提高火棘籽油的产率。当提取时间在1~3 h时,粗油得率的增加较快,但当时间超过3 h后产率的增加有所减缓,基本保持平衡。因此,提取时间应选择3 h左右比较适宜。
2.1.4 料液比对粗油得率的影响。
由图4可知,油脂浸提效果随着溶剂比例增大而越好,在料液比(g∶m L)1∶4~5范围内产率呈直线上升,粗油得率显著增加;这是由于料液比在1∶4时浸提很难形成回流,只能靠浸泡提取,所以效果不佳。在1∶6~9之间产率的增加幅度不大,提高料液比对产率影响不大。因此,提取料液比应选择1∶6~7比较适宜。
2.2 正交试验
以3因素设计L9(33)正交试验,以提取率为评价指标,优化提取工艺[11,12,13]。正交试验的因素水平选择如表2所示,正交试验结果如表3所示。由表3极差分析可知:影响提取的主要因素为时间和温度,料液比稍小一些,影响火棘籽油脂提取工艺的主要因素主次顺序为B>A>C,最佳方案为A3B3C3,即以石油醚Ⅰ为提取剂,提取温度75℃,提取时间4 h,料液比(g∶m L)1∶8时产率最高。
为进一步验证所选工艺的重复性,按上述优选的条件重作了重复性试验进行验证,准确称取粉碎好的的火棘籽粉10 g,以石油醚Ⅰ为浸提剂,在温度75℃,浸提时间4 h,料液比1∶8的条件下进行试验,所得产率达到6.87%。说明A3B3C3为最佳组合。
3 结论
(1)试验所用火棘籽含油量为7.05%;索氏浸提溶剂选择石油醚Ⅰ(30~60℃)为佳,所得油脂颜色浅亮,油脂质好,安全性高,无异味且提取率较高。
(2)由正交试验可知,火棘籽油索氏提取的毛油得率受时间和温度影响较大。最优工艺条件为料液比(g∶m L)1∶8,温度75℃,时间4 h;毛油得率为6.87%,接近火棘籽含油率。提取过程所用时间较短,温度不高,节约了能源消耗且所得火棘籽粗油得率较高,油质较好。
摘要：采用单因素和正交试验的方法对有机溶剂浸提法提取火棘种子油的工艺进行优化研究。选取提取试剂、提取时间、提取温度、提取料液比等条件对火棘籽油的提取工艺进行单因素试验研究,再选取3因素3水平进行L9(33)正交试验确定最佳工艺条件。结果表明:用石油醚Ⅰ(30~60℃)为浸提剂,在温度75℃,料液比1∶8(W∶V)的条件下浸提4 h,所得火棘籽粗油得率最高,可达6.87%,油质较好。