串联质谱（精选11篇）
串联质谱 篇1
大蓟是一种多年生草本植物, 广泛分布于中国、日本和朝鲜。在传统中药中, 大蓟因具有抗出血和利尿的作用而被广泛应用于外伤性出血、高血压和炎症的治疗[1]。刘素君等[2,3,4]研究发现大蓟具有抗肿瘤、抗氧化等作用, 同时对糖尿病有一定治疗作用。
超高效液相串联Q-TOF技术 (UPLC/Q-TOF-MS) 是一种快速、灵敏、精确的非靶向分析方法, 通过精确分子量和二级质谱裂解确定分子式和分子结构。相比于传统分析方法, 如高效液相串联低分辨率质谱, UPLC/Q-TOF-MS具有更好的分离效果和更高的分辨率。因此, 其更适用于中药中未知成分的快速分析和结构鉴定。近十年内, 大蓟中已被鉴定的成分有33种, 大蓟甲醇提取物成分的快速分析研究尚未见报道。因此, 有必要建立一种从大蓟提取液中直接进行成分分析的快速方法。
本研究建立了UPLC/Q-TOF法快速简便分析大蓟中的成分, 共鉴定出29种成分。其中一些二级裂解规律为第一次在ESI源中被报道, 首次在大蓟甲醇提取液中发现的是斑鸠菊酸、叔丁基羟基茴香醚、二氢辣椒素、大黄蒽醌和紫杉叶素。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
乙腈 (色谱纯) 和甲醇 (色谱纯) 均购自Merck公司 (德国, 达姆施塔特) 。甲酸 (色谱纯) 购自DIMA (美国, 弗吉尼亚州) 。亮氨酸-脑啡肽购自Sigma公司 (美国, 密苏里州) , 大蓟购自广州至信药材公司, 全草经过广东药学院刘基柱教授鉴定保存于本实验室, 编号:2001304081017。
1.2 样品制备
取大蓟全草1.0g切碎, 加入甲醇-水 (1∶1) 10mL60℃下水浴1h, 超声提取2次, 每次1h。提取液经10 000rpm高速离心2min, 微孔滤膜 (0.22μm) 过滤, 进样量为5μL。
1.3 色谱条件
超高效液相为Waters公司Acquity系统, 配置2元泵, 真空脱气并自动进样。色谱柱为Waters公司BRH分析柱 (50mm×2.1mm, 1.7μm) , 流速为0.3mL/min, 柱温为25℃, 流动相为为乙腈 (B) -0.1%甲酸水 (A) [5]。梯度洗脱:0~4min, 5%~20%B;4~10min, 20%~30%B;10~11min, 30%~45%B;11~16min, 45%~65%B;16~17min, 65%~100%B。
1.4 质谱条件
毛细管电压为3 000V, 锥孔电压为30V, 源温为100℃, 脱溶剂温度为350℃, 锥孔气流为50L/h, 脱溶剂气体为600L/h, 碰撞气体为氩气, 碰撞能量为25~45V, 质谱数据采集范围为m/z 50~1 000, 采用亮氨酸-脑啡肽作为参考标准溶液 (正离子模式下[M+H]+=556.2771, [M+H]-=554.2615) 。
2 结果
2.1 UPLC/Q-TOF分析条件优化
通过预实验, 将UPLC最佳流速设定为0.3mL/min[6]。通过对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-异丙醇流动相体系进行考察, 同时考虑保留时间、加和离子和分离效果等因素, 最终选择乙腈-水 (含0.1%乙酸) 体系进行梯度洗脱。由于不同离子模式对离子对有竞争性抑制作用, 实验结果显示负离子模式灵敏度和信噪比均较高。
2.2 UPLC/O-TOF分析
本次实验中共有29个成分被鉴定出来 (见表1、表2) , 包括黄酮、黄酮糖苷、异黄酮、有机酸、酚酸和蒽醌类化合物。本研究中鉴定的成分已经通过Sci-finder数据库确认。
2.2.1黄酮和黄酮糖苷裂解
黄酮类在一级质谱中只有母离子存在, 无法鉴定其分子结构, 但黄酮类的二级质谱行为可确定B环和C环上的羟基数量和位置。因此, 将黄酮类的一级质谱与二级质谱相结合可准确鉴定出其分子结构。
本实验中, 毛地黄酮在负离子模式下产生了m/z 199的特征峰, 可能是由于A环和B环的作用, 导致C2H2O和CO2基团连续脱去[7]。负离子模式下C环脱去一个O原子, 但是该现象并未在芹黄素和槲皮素中发现, 可能是由于3-位没有羟基取代, 也可能是B环上羟基的供电子作用破坏了环上的共轭结构, 从而降低了C环的稳定性, 导致m/z269特征碎片离子的产生。在正离子模式下产生了m/z 241的特征峰, 是由于C环脱去CO2, B环脱去一分子H2O[8]。此外, 由于1, 3B+裂解容易脱去1分子H2O, 所以1, 3B+会产生m/z 117的碎片离子。
芹黄素的特征碎片是m/z 153和119。C环由于失去一个CO基团而紧缩, 产生了m/z 243的碎片。m/z 243的碎片可进一步裂解失去CO和H2O, 产生新的碎片m/z 197。特征碎片m/z 153可通过脱去一分子H2O而产生新的特征碎片m/z 171。
槲皮素由于在3-位上有羟基取代, 1, 3A+和1, 2A+都会产生特征例子m/z 179。1, 2A+容易脱去CO基团, 故m/z 151是槲皮素的主要碎片诊断离子。同时, 异黄酮类相对于黄酮类需要更高的碰撞能量才能得到特征碎片离子[9]。
B环上的羟基取代程度可影响黄酮糖苷的质谱裂解行为。B环上羟基越多, 在低能量撞击下脱去糖苷键碎片的强度越高。毛地黄酮-7-O葡萄糖苷在B环上有一个羟基取代, 比蒙花苷-7-O芸香糖苷和芹黄素-7-O吡喃糖苷产生的脱糖苷碎片丰度更高。此外, 糖苷键的取代位置对碎片也有影响, 槲皮素-3-O芸香糖苷在B环上有两个羟基取代, 但是相比于毛地黄酮-7-O葡萄糖苷则需要更高的碰撞能量才能得到黄酮碎片离子。羟基和O-糖苷键是供电子基团, 由于定位效应和共轭效应, B环上未被取代和3-位上有供电子基团的结构需要更高的碰撞能量。因此, 当毛细管电压和锥孔电压分别设定在3 000V和30V时, 槲皮素-3-O芸香糖苷的槲皮素残基可在一级质谱中被找到[10]
2.2.2新分离成分结构特征
首次在大蓟甲醇提取液中发现的是斑鸠菊酸、叔丁基羟基茴香醚、二氢辣椒素、大黄蒽醌和紫杉叶素。由于存在离子对竞争性抑制, 大黄素-甲醚、二氢辣椒素、叔丁基茴香基醚仅存在于正离子模式下, 斑鸠菊酸、半夏酸、紫杉叶素仅存在于负离子模式下。
大黄素-甲醚的主要碎片离子为脱落了一个甲基基团的m/z 270, 其结构是通过共轭作用保持稳定性的。此外, 由于3-位CO基团的脱落, 产生了m/z 242的碎片离子[11]。
二氢辣椒素的主要碎片离子m/z 290与文献报道的主要碎片离子m/z 137并不一致[12], 碎片离子m/z 136进一步失去一个CH2基团, 碎裂成为m/z 122的碎片离子, 这个裂解是ESI源中没有发现过的。二氢辣椒素的主要裂解途径是通过N-C键的断裂, 其主要碎片离子 (m/z 137) 也是由于N-C键断裂而产生的[12,13], 可能的机制见图1。
叔丁基茴香基醚的质谱信息可通过Wiley数据库进行鉴定, m/z 137是其主要的碎片离子, 但仍可以进一步失去一个CH4O基团, 碎裂为m/z 105形成另一个主要碎片离子。
斑鸠菊酸是第一次在ESI-MS中被报道, 其主要碎片为m/z 277 (M-H2O-H-) 和m/z 195 (M-C6H12O-H-) 。半夏酸的裂解方式和斑鸠菊酸类似。
紫杉叶素的母离子相继脱去一个二苯基基团和一个C3O3H5基团, 产生了m/z 241和m/z 151碎片离子。
3 结论
应用UPLC/Q-TOF-MS技术对大蓟甲醇-水提取物进行快速分析, 在17min内成功鉴定出29种成分, 其中5种化学成分为首次在大蓟中发现。本文阐明了电喷雾质谱中大蓟各成分的裂解规律, 并总结了大蓟中各类成分的主要碎片离子和异黄酮类中[1, 2A+-CO+H]+可作为3-位上是否有羟基取代的诊断离子。综上所述, UPLC/Q-TOF-MS技术可应用于大蓟成分的快速分析和结构鉴定。
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串联质谱 篇2
样品经均质,1%三氯乙酸溶液提取,用OASIS MCX固相萃取小柱净化,减压浓缩后以甲醇溶解定容,用Waters BEH-C8柱分离,乙腈和水为流动相,经液相色谱-串联质谱法检测.三聚氰胺线性范围为0.1～10.0mg/kg,相关系数r为0.9999,平均回收率为71%～95%,相对标准偏差为4.56%～9.82%(n=6),方法的栓出限为0.5 mg/kg.
作 者：刘梅 李金强 田德金 李佩暖 曹鹏 付建 娄喜山 Liu Mei Li Jinqiang Tian Dejin Li Peinuan Cao Peng Fu Jian Lou Xishan 作者单位：刘梅,田德金,付建,娄喜山,Liu Mei,Tian Dejin,Fu Jian,Lou Xishan(龙大食品集团检测中心,莱阳,265231)李金强,李佩暖,曹鹏,Li Jinqiang,Li Peinuan,Cao Peng(烟台出入境检验检疫局技术中心,烟台,264000)
刊 名：化学分析计量 ISTIC英文刊名：CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE 年，卷(期)：2008 17(2) 分类号：O6 关键词：固相萃取 高效液相色谱串联质谱法 三聚氰胺★ 气相色谱-负离子化学源质谱法分析牛奶饮品和奶粉中19种有机磷农药残留
★ 高效液相色谱测定卷烟及其主流烟气中的维生素E
★ 高效液相色谱-质谱联用技术在食品安全中的应用及进展
★ 化妆品中甲基异噻唑啉酮及其氯代物的高效液相色谱测定法
★ 气相色谱法测定纤维素基包衣材料的取代基含量
★ Python中实现结构相似的函数调用方法
★ 涡流检测在航空维修中的使用
★ 液滴喷射技术在全聚合物薄膜晶体管制备中的应用
★ 水体有机污染物浓度检测中的紫外光谱分析方法
串联质谱 篇3
关键词 槟榔 ；有机磷农药 ；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号 TS255.7 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.017
Abstract To establish a new method for analysis of residues of nine organophosphorus pesticides in Areca catechu Linn by using HPLC-MS-MS， one percent of acetic acid in acetonitrile was used as an extraction solvent for determination of organophosphorus pesticides by using HPLC-MS-MS. The results showed that the linear range of components of nine organophosphorus pesticides was 2～20 ng/mL with the correlation coefficient r being above 0.999. The average recovery was 73.4%～120%， and the RSD was 0.59%～9.93%. The limit of detection （LOD） was 50.0 μg/kg. This method had good stability and high recovery rate， and can be used to detect organophosphorus pesticide residues in Areca catechu Linn.
Keywords Areca catechu Linn ； organophosphorus pesticide ； HPLC-MS-MS
槟榔（Areca catechu Linn）是棕榈科植物槟榔的种子，位列中国四大南药之首[1]。味苦、性辛、温，归胃、大肠经，有杀虫、破积、下气、行水的功效[2]。具有驱虫[3-4]、镇痛、消炎、抗氧化[5]、抗病原微生物、拟胆碱[6]等药理作用。海南是中国槟榔的主要产区，主要是以鲜果或干果供应槟榔加工企业生产槟榔嚼块。然而2013年“槟榔致癌”风波爆发以来，海南省槟榔产业受到严重影响。“槟榔致癌”风波使人们更加关注槟榔的质量安全、控制和检测。
有机磷农药残留是影响食用槟榔产品质量的重要因素之一，是槟榔产业链在种植、加工、保存环节中主要外源性有害物质之一[7-8]。目前有机磷农药常用的检测方式主要有气相色谱法（GC）、气质联用法（GC-MS）和液质联用法（LC-MS/MS）。有机磷农药易气化，且气相色谱稳定性较好，被广泛地用于有机磷农残的定量检测中[9]。为减少干扰物质的影响，通常将气相色谱和质谱仪联用，可以更加准确的定量和定性[10-11]。目前有机磷农药的定性定量检测大部分采用的是气相色谱或气质联用方法。但气相色谱的缺点是分离时间长，检测效率不高。而高效液相色谱可以对非挥发性和热不稳定性物质进行检测，与质谱联用后可以提高灵敏度，与二级质谱的联用还可对准分子离子进行裂解，获得丰富的结构信息，具有高效率和良好的定性、定量能力[12]。随着多残留检测技术的发展，液质联用技术越来越多地被应用于农药残留检测领域[13-14]。本文针对槟榔中常见的9种有机磷农药，采用高效液相色谱-串联质谱联用技术，优化色谱质谱条件，建立了槟榔中9种有机磷农药的定性、定量检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
美国安捷伦公司Agilent 1200 超高效液相色谱仪、美国ABI 公司API 4000Q 四极杆质谱仪、美国Varian公司Harvard Ⅱ针泵、广州IKA公司MS3涡旋混匀器、5810R离心机、G-285 电子天平。
乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、乙酸铵（色谱纯级）、甲胺磷、敌百虫、伏杀硫磷、甲基嘧啶磷、速灭磷、杀扑磷、亚胺硫磷、治螟磷、三唑磷。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配置
有机磷农药类标准品均购自国家标物中心，浓度为100 μg/mL。分别准确吸取各标液0.1 mL加入100 mL容量瓶，乙酸乙酯定容，得到浓度为0.1 μg/mL的9种有机磷农药混合标准溶液。
1.2.2 样品前处理
槟榔干果，经粉碎机粉碎，剪碎其纤维，准确称取1.00 g（精确至0.01 g）至50 mL具塞离心管中，加入20 mL 1%乙酸-乙腈，涡旋震荡5 min，加入2 g无水硫酸钠，涡旋混合1 min，9 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液待测。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：Thermo Accucore aQ 2.1×100 mm，2.6 μm，填料为C18；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱，洗脱条件见表1。
1.2.4 质谱条件优化
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离子源：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；多反应检测模式（MRM）模式；离子源温度600℃；离子源电压5 500 V；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气，质谱优化条件见表2。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
有机磷农药残留检测中常用的提取溶剂有丙酮、乙酸乙酯和乙腈，因乙酸乙酯不溶于水，不可以直接作为溶剂供液质联用仪检测，所以提取溶剂优先选择丙酮和乙腈。丙酮作为提取溶剂时得到的提取液会含有更多的共萃物[15]，不易净化，所以《食品中有机磷农药残留量的测定》（GB/T 2009.20-2003）和《植物源性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》（GB/T 5009.145-2003）采用丙酮作为提取溶剂的国家标准均加入了繁杂的固相萃取净化步骤。 而乙腈作为一种极性有机溶剂，其优点是糖类、蛋白质和大多数亲脂性物质不会被提取，渗透性强，对大多数有机磷农药具有良好的溶解性。本试验主要采用稀释法降低基质减弱效应对检测灵敏度的影响，达到快速、简便和准确性高的目的，选择乙腈作为提取溶剂，并在乙腈中添加1%乙酸作为类分析保护剂。
2.2 净化条件的选择
本试验方法同时检测了极性较大的有机磷农药品种，如甲胺磷、敌百虫和极性相对较小的品种，如甲基嘧啶磷等，其中甲胺磷和敌百虫等易降解，所以给净化方式造成了一定难度。因考虑到实验操作时间过长对易降解农药回收率的影响，本试验分别考察了QuEChERS的前处理方法和直接稀释法的净化效果，结果表明QuEChERS中使用PSA对样品净化时在吸附了极性杂质的同时对甲胺磷和敌百虫也有不同程度的吸附，而直接稀释法虽然存在一定程度的杂质干扰和基质效应，但是在色谱图上显示杂质可与9种有机磷农药的保留时间完全分离。
2.3 色谱条件的优化
分别考察了水、0.1%甲酸水溶液、0.005 mol/L乙酸铵水溶液对峰形、响应值等影响。结果表明：以甲醇-水或乙腈-水作为流动相时回收率和响应值均不高；在对0.005 mol/L乙酸铵水溶液和0.1%甲酸水溶液进行比较时发现，0.1%甲酸水溶液能让峰形更尖锐，响应值更高。因待测液溶剂为纯乙腈，在色谱分离时有溶剂效应的影响，峰形分叉，响应值低，见图1。在变换流动相比例不能对峰形和响应值达到优化效果的情况下，本试验尝试降低进样量，结果证明峰形均变得尖锐，响应值增加，见图2。
2.4 质谱条件的确定
将9种有机磷农药的混合标准品采用针泵直接流动注射进样，采用正离子模式进行一级质谱分析，确定待测物的分子离子峰， 确定了待测物的分子离子质荷比后，通过碰撞气将分子离子击碎，碎片进入二级质谱分析，得到子离子的质谱图。通过多反应离子检测（MRM），选择相对丰度较高的一组离子作为定量离子对，另一组作为定性离子对。同时对电喷雾电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碰撞气流速、离子源温度、碰撞室出入口电压和去簇电压等参数进行了优化。详见表2。
2.5 方法线性范围、精密度和回收率试验
准确吸取0.1 μg/mL的9种有机磷混合标准溶液20、50、80、100、200 μL，分别用基质提取液定容至1 mL，得到浓度为2、5、8、10、20 ng/mL的9中有机磷混合标准工作液。依次进样，分别以峰面积Y为纵坐标，相应的浓度值X为横坐标，作标准曲线。以槟榔样品作为基质，分别对其添加低、中、高3个水平的9种有机磷农药标样，每个添加浓度做6个平行试验，用于考察本方法的回收率和精密度。结果见表3。
由表3可知，9种有机磷农药在2～20 ng/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r均大于0.999。符合《实验室质量控制规范》（GB/T 27404-2008）中对校准曲线的相关系数不低于0.99的要求。《实验室质量控制规范》（GB/T 27404-2008）规定，添加水平100 μg/kg时，回收率范围应在60%～120%，添加水平在100～1 000 μg/kg时，回收率范围应在80%～110%。添加水平在0.1 μg/kg～1 mg/kg时，变异系数范围应在43%～11%。由表3可知，结果符合检测方法确认的技术要求。
2.6 样品检测
对海南9个市售品牌的食用槟榔样品进行有机磷农药残留检测，9个样品均未检出有机磷农药残留。试验结果证明，试验所用食用槟榔样品并未非法添加甲胺磷，因有机磷农药易降解，种植过程引入的有机磷农药残留可能经过食用槟榔复杂的生产加工工序完全降解。
3 结论
本试验采用直接稀释法对槟榔样品进行前处理，样品基质提取液配置标准曲线，建立了食用槟榔中9种有机磷农药含量的液质联用检测方法。方法采用1%乙酸-乙腈作为提取液，提取液直接稀释后供仪器检测。以实际检测时的信噪比（S/N）为3，计算本方法的检出限为50.0 μg/kg。
结果表明，直接稀释法是一种有效的样品前处理方法。方法通过对提取液的稀释，降低了干扰成分的浓度，提高待测组分离子化的竞争力，减弱基质效应。同时，方法克服了不同品种有机磷农药因极性不同而无法同时采用吸附净化剂的问题，适用范围更加广泛。相较其它的农残分析方法，直接稀释法具有节省溶剂、低检测成本、操作简便、分析速度快等优点。本研究方法提取液经过稀释，减小基质减弱效应，谱图中杂质峰均与待测组分峰分离。该分析方法操作简便，效率高，准确且重现性好，适用于食用槟榔中有机磷农药的含量测定。
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串联质谱 篇4
1 原理
饲料中的吉他霉素经甲醇水提取, Oasis HLB纯化, 初始流动相复溶, 过0.45μm滤膜, 上液质测定, 外标法确证及筛查。
2 样品制备
按照GB/T20195制备试样, 磨碎, 全部通过0.28mm孔筛, 混匀, 装入密闭容器中。
3 仪器设备
AB104-N电子天平、Agilent6410BQQQ液质联用仪、HITACHI CRG离心机。
4 操作步骤
4.1 试样提取
精确称取试样2g于250m L锥形瓶中, 准确加入20 m L提取液 (甲醇+水=20+80) , 振荡30 min, 转入离心管中, 10 000r/min离心5min, 上清液备用。
4.2 样品纯化
固相萃取柱 (6cc/200mg Oasis HLB) 分别用3m L甲醇和3 m L水活化, 准确移取5 m L上清液过柱, 清洗1:3m L5%甲醇及2%乙酸;清洗2:3 m L5%甲醇及2%氨水;清洗3:3m L65%甲醇及2%氨水, 近干后用甲醇洗脱, 收集洗脱液。在氮吹装置上50℃下用氮气吹干, 准确加入1m L初始流动相 (乙腈+0.1%甲酸水=90+10) 复溶, 过0.45μm微孔滤膜, 上LC-MS/MS测定。上机液中的药物浓度应稀释在线性范围内。
4.3 测定
4.3.1 液相色谱条件。
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 2.1×100 mm, 1.8μm;柱温:30℃;流动相:A:0.1%甲酸水溶液;B:0.1%甲酸乙腈, 梯度洗脱条件见表1。
4.3.2 质谱条件。
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测MRM。使用前, 应调节各气体流量, 以使质谱灵敏度达到检测要求。质谱参数应优化至最佳。定性离子对、定量离子对及碰撞能量的参考值见表2。
min, %
流速:0.3 m L/min;进样量:5 u L。
m/z, V
4.3.3 定性测定。
在相同试验条件下, 样品中待测物的保留时间与标准工作液的保留时间偏差在±2.5%之内, 并且样品图谱中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近标准工作液中对应的定性离子对的相对丰度进行比较, 若偏差不超过表3规定的范围, 则可判定为样品中存在对应的待测物。
4.3.4 定量测定。
按照上述液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液, 以色谱峰面积进行单点或多点校正定量, 样品溶液中待测物的响应值应在仪器规定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下, 对照品的工作曲线图、对照品的色谱质谱图和样品的色谱质谱图见图1~3。
5 结果计算
试样中某种待测物的含量X以质量分数 (mg kg) 表示, 按式 (1) 计算。
式中:
m1—计算机外标法自动计算所得到的某待测物的质量, 单位为微克 (μg) ;
m—试样质量, 单位为克 (g) ;
n—稀释倍数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。
6 重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于20%。
7 结果分析
串联质谱 篇5
iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用
研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容.要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来,在体内和体外同位素标记基础上,用多维液相色谱分离多肽,进而用串联质谱进行相对定量的.分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一.该文就目前唯一一种可以进行四重蛋白质样品同步比较的iTRAQ标记-串联质谱分析技术进行综述.
作 者：李伟 LI Wei 作者单位：上海交通大学生命学院系统生物研究所,上海,40刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：26(5)分类号：Q5关键词：比较蛋白质组学 iTRAQ 多维液相色谱 串联质谱 多重同步分析
串联质谱 篇6
关键词：咪唑并吡啶衍生物 电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱 裂解机理
中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
质谱是非常重要的分析工具，对于阐明已知化合物的裂解机理和鉴别未知化合物具有重要意义。电喷雾（ESI）技术是一种新的“软电离”技术，其离子化条件温和，谱图简单，能够快速、准确地测定极性和遇热不稳定有机化合物的分子量。样品在检测过程中处于高真空环境，可提供在无外界环境影响下物质的裂解情况。四级杆飞行时间串联质谱不仅能够同时检测到样品的分子离子峰和碎片离子峰，还能够提供其准确的元素组成，对于未知化合物及碎片离子结构推测，化合物裂解机理研究提供了有力的帮助[1]。
咪唑并吡啶类化合物在结构上与吲哚、氮杂吲哚具有一定的类似性，因此是一类非常重要的含氮稠杂环化合物。由于咪唑并吡啶类化合物具有抗非典型分枝杆菌、抗真菌、抗病毒等生物活性，特别是在抗肿瘤方面有显著的疗效[2]，因此具有咪唑并吡啶结构骨架的化合物成为化学家的研究热点。目前对于咪唑并吡啶类化合物的研究主要集中在化学合成和药理活性方面，对于这类化合物的裂解机理研究尚没有文献报道，为此本实验利用电喷雾-串联四级杆飞行时间质谱对10种结构类似的咪唑并吡啶类化合物进行了质谱研究，通过其裂解规律的阐释，丰富此类化合物的质谱研究数据，以期为同类其它化合物的结构鉴定提供可靠的数据参考。
1 实验部分
1.1 主要试剂与仪器
实验所用的咪唑并吡啶衍生物1-10均为实验室合成[3]，其化合物结构式如图1所示，所有化合物结构经NMR、IR、UV和MS确证。甲醇（色谱级，Merck公司，德国）。德国bruker 公司生产的micrOTOF-QⅡ质谱仪，配有micrOTOFcontrol数据采集软件和Compass DataAnalysis数据处理软件。
图1 咪唑并吡啶类衍生物的结构
1.2 质谱分析条件
复合电喷雾电离源（Dual ESI），氮气作为干燥气，流速为4.0 L/min，干燥气的温度为180℃，雾化气压力为0.4 bar，毛细管电压为4.5 kV，甲醇为溶剂，蠕动泵进样，流速为180 μL/h，氩气作为碰撞气，CID能量：0-35 eV。
1.3 实验方法
配制待测化合物的甲醇溶液，置于进样针中，利用蠕动泵直接导入Dual ESI电离源，正离子模式检测，将[M+H]+准分子离子作为母离子进行MS/MS分析，以用于化合物的裂解规律的研究。
2 结果和讨论
2.1 十种化合物的一级全扫描质谱
运用电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱，在正离子检测模式下，对10种化合物进行一级质谱全扫描分析，所有样品均观察到[M+H]+准分子离子峰，为了进一步研究此类化合物的质谱特征，对10种化合物[M+H]+母离子进行二级质谱分析。
2.2 MS/MS结果分析及裂解路径研究
通过对10个化合物的一级质谱进行全扫描，发现均具有丰度较强的[M+H]+准分子离子峰，将其作为母离子进行二级质谱分析，推测可能的裂解途径如图2所示。
在10个化合物中，首先均发生磺酰胺键的均裂[4]，均失去质荷比为m/z 155的对甲苯磺酰自由基，得到丰度最高的碎片离子，该碎片离子进一步失去·H自由基和HCN，重排生成类似卓鎓结构的离子，卓鎓结构形成了大π键体系，是较稳定的结构。
化合物4的间位含有甲氧基，从质荷比为m/z 239的碎片离子进一步失去CH2O，形成质荷比为m/z 209的特征碎片峰。化合物3和5的对位分别含有甲氧基和硝基，分别从质荷比为m/z 239和254的碎片离子失去·CH3和·NO，形成稳定的共轭体系，得到质荷比为m/z 224稳定的特征碎片离子；同时，化合物5还可以从质荷比为m/z 254的碎片离子失去·NO2自由基，得到质荷比为m/z 208的碎片离子峰。化合物2、6、7和8结构中芳环上的取代基以自由基形式离去，即分别从质荷比为m/z 223、243、287和243的碎片离子失去·CH3、·Cl、·Br和·Cl等自由基，得到质荷比为m/z 208的碎片离子峰。此外，化合物1、2、3、9和10分别从质荷比为m/z 209、223、239、227和225的碎片离子均失去·C5H4N自由基，得到质荷比为m/z 131、145、161、149和147的碎片离子，化合物3从质荷比为m/z 161的碎片离子进一步失去·CH3得到m/z 146的碎片离子峰。
图2 化合物1-10的裂解途径
3 结语
本文采用电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱，在正离子模式下，研究了咪唑并吡啶衍生物的质谱裂解途径。在化合物1-10中，既存在共同的裂解规律，如都会发生磺酰胺键的均裂，得到丰度最高的碎片峰（基峰），都会进一步失去·H自由基和HCN，同时由于芳环上取代基的不同，又会产生各自的特征裂解途径。如化合物3和4，都是甲氧基取代，化合物3是对位取代，化合物4是间位取代，化合物3容易丢失·CH3，形成比较稳定的共轭体系，而化合物4则容易失去CH2O小分子，形成质荷比为m/z 209的特征碎片离子。具有Cl取代的化合物6和8虽然取代基位置不一样，但是却得到了相同的碎片离子峰。说明取代基对该化合物的裂解途径具有一定的影响。
参考文献
[1]梁现蕊，郭子立，俞传明. ESI-Q-TOF-MS/MS研究N-取代邻苯二甲酰亚胺衍生物的裂解途径[J].质谱学报，2013，34（3），135-140.
[2]SONG Y N，LIN X Q，LIN X Q，KANG D W，et al.Discovery and characterization of novel imidazopyridine derivative CHEQ-2 as a potent CDC25 inhibitor and promising anticancer drug candidate[J].Eur J Med Chem，2014，82：293～307.
收稿日期：2015-03-18
*基金项目：国家自然科学基金（21206148）资助。
作者简介：梁现蕊（1975—），女，山东临沂人，副教授，研究方向：从事药品质量及药物结构分析研究。
串联质谱 篇7
1 实验方法
1.1 仪器和试剂
超高效液相色谱-质谱联用仪为ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统, ACQUITY TQD串联四级杆质谱, Mass Lynx TM工作站, 12通道固相萃取装置, 高速离心机, 氮吹仪, 电子天平。氯丙嗪标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer标准品公司, 甲醇为色谱纯, 高氯酸, 实验用水取自Milli-Q纯水机 (Millipore, Bedford, MA, USA, 电阻率为18.2MΩ·cm) 。
1.2 标准溶液配制
标准储备液 (100μg·m L-1) :准确称取适量氯丙嗪标准品, 用乙腈定容于50m L棕色容量瓶中, 配制成100μg·m L-1的标准储备液, -5℃冰箱中保存, 有效期6个月。
1.3 色谱条件
色谱柱:Waters Acquity TMBEH C18柱, 规格为100mm×2.1mm (i.d) , 粒径1.7μm;流动相:乙腈-0.2%甲酸水, 流速0.25m L·min-1, 柱温:25℃, 进样量5.0μL。
1.4 质谱条件
离子源:电喷雾电离 (ESI+) , 检测器为TQD串联四级杆, MRM检测模式, 毛细管电压3.2Kv, 源温度120e V, 脱溶剂气温度300e V, 锥孔电压26e V, 碰撞能量22e V, 12e V, 碰撞气流量0.2m L·min-1。
2 猪肉样品前处理
准确称取猪肉样品2.00g, 加入20m L乙酸乙酯混合, 加入2m L 1mol·L-1氢氧化钠溶液, 充分振荡离心后将上清液转入蒸馏瓶, 再用10m L乙酸乙酯洗涤重复提取, 合并两次上清液, 50℃水浴旋转蒸干, 用2m L乙腈超声溶解残渣, 用4m L正己烷漩涡, 弃去上层备用。
用3m L甲醇, 3m L水活化C18小柱, 将待用提取液1m L上样, 分别用3m L 0.02mol·L-1盐酸, 3m L 0.1mol·L-1盐酸, 3m L甲醇清洗, 最后用3m L2%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液在50℃下用氮气吹至近干, 用乙腈定容至1m L, 漩涡1min, 0.22μm的针头过滤器过滤后UPLC-MS分析。
3 结果
3.1 氯丙嗪色谱质谱检测结果
氯丙嗪的总离子流图及各级碎片离子图, 见图1, 氯丙嗪的保留时间为1.85min, 定量离子为319>86.3。
3.2 回收率实验
取兰州市区肉禽市场猪肉为基底, 在猪肉中加入盐酸克伦特罗标准对照品, 分别配制成浓度为0.5、2.0、10.0μg·L-1的加标溶液, 按照样品预处理方法处理样品, 每个浓度分别做3个平行, 考察不同加标浓度下的回收率, 平行测定3次, 结果见表1。
3.3 2011~2012年兰州市猪肉中氯丙嗪含量检测结果
应用上述检测方法, 连续两年对兰州市猪肉中氯丙嗪进行检测, 结果见表2。
4 讨论
在考察多种溶剂的提取效率后, 确定乙酸乙酯的提取效率较高, 氯丙嗪的离子化效应较低, 流动相加入甲酸后, 明显提高了氯丙嗪的离子化效应。加标回收率实验中, 目标物的平均回收率在75.9%~92.3%之间, RSD均小于10.0%, 同时, 随着加标浓度的降低, 回收率有所下降, 从RSD的结果来看, 本方法重现性良好。UPLC/MS法测定猪肉中氯丙嗪含量简单可行, 专属性强, 为市场肉质品中氯丙嗪监督检测提供了技术支持。
参考文献
[1]王贞媛, 李丹, 夏顺宁.LC/MS/MS法鉴别神速宁胶囊中添加的盐酸氯丙嗪成分[J].中国天然药物, 2007, 5 (3) :219-220.
[2]黄士新, 孙亚云, 曹莹.高效液相色谱法测定饲料中的违禁药物氯丙嗪[J].饲料研究, 2003 (8) :249-251.
[3]路平, 曲志娜, 谭维泉, 等.气相色谱-质谱法测定猪肝中氯丙嗪残留的研究[J].中国动物检疫, 2006, 23 (7) :309-311.
串联质谱 篇8
关键词：牛肉,磺胺类药物,残留,液相色谱—串联质谱法
磺胺类药物(sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物,广泛用于预防和治疗食源性动物的疾病,然而过量使用会导致该类抗生素在食用动物产品中残留[1]。人长期摄入含磺胺类药物的动物性食品后,药物会不断在人体内蓄积,当积累到一定程度后,就会对人体产生毒性作用,可导致肾受损害,破坏人的造血系统,引起溶血性贫血症、粒细胞缺乏、血小板减少症等;对于过敏体质的人,轻者引起皮肤瘙痒症,重者引起血管性水肿,甚至导致死亡[2]。因此,欧盟将磺胺类药物列为必须严格监控的药物,并规定动物源食品中磺胺的最大残留限量为100μg/kg,日本规定食品中不得检出SAs,我国也将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物[3]。因此,对动物源性食品中SAs的检测分析非常重要。
目前,国内外对SAs的分析检测方法主要有分光光度法[4]、酶联免疫吸附法[5,6]、气质联用法[7]、高效液相色谱法[2,3]及高效液相色谱—串联质谱法[8]等。分光光度法和酶联免疫吸附法定量不准确,高效液相色谱法虽然定量功能较强,但该法只能依据化合物的保留时间对样品进行定性,灵敏度不够高,对于一些含量低的样品无法检测;对于基质复杂的样品,其定性和定量结果容易受到基质的干扰,从而导致假阳性或者定量结果不准确;而目前液相色谱法及液质联用法对SAs残留分析主要集中在鸡肉[9]、鸡蛋[10]、水产品[11,12,13]、化妆品[14]和牛奶[2,4,15]等方面,对牛肉中残留测定的报道较少。液质联用法(HPLC-MS/MS)采用多重反应监测(MRM)模式,结合液相保留时间及MRM特征离子对进行定性和定量,可以大大减少由于保留时间相同而待测离子不同所带来的干扰,同时大大提高了检测灵敏度,尤其适于对牛肉这样基质复杂样品的分析。
该文选择国内外关注较多的磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDT)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹噁啉(SQX)共7种SAs为研究对象,建立高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉中7种SAs的方法,该方法具有操作简便、灵敏度高等优点。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器。
Agilent 1260-6430QQQ液相色谱串联质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司),Buchi R-210型真空旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司);KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);L-550型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。
1.1.2 试剂。
甲醇、正己烷、乙腈均为色谱纯,德国Merck公司生产;无水硫酸钠,分析纯,广州化学试剂厂生产。7种标准品:磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDT)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺喹噁啉(SQX),均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均大于97%,分别用甲醇配制成浓度为1 000μg/mL的标准储备液。
1.2 检测条件
1.2.1 色谱柱。
ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×150 mm,3.5μm);流速:0.5 mL/min;柱温:45℃;进样量:10μL;流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～3.5 min,20%B;3.5～6.0 min,20%～40%B;6.0～10.0 min,40%B;10.0～10.5 min,40%～20%B;10.5～12.0 min,20%B(post run:5 min)。
1.2.2 电离方式。
ESI+;毛细管电压:4.0 kV;干燥气温度:350℃;干燥气流速:11 L/min;雾化器压力:50 psi;监测模式:多反应监测(MRM);多反应监测各药物离子对及对应的驻留时间、碎裂电压和碰撞能见表1。
注:*表示定量离子。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的绘制。
用流动相稀释7种磺胺类药物标准品,配制成5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L 5个等级的标准曲线,过0.22μm微孔滤膜后上机测定。以各定量离子色谱峰面积为纵坐标,对照溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程及相关系数见表2。
1.3.2 样品提取。
用组织捣碎机捣碎牛肉混匀,准确称取4g(精确到0.01 g)于50 mL具塞离心管中,加入8 g无水硫酸钠,再加乙腈20 mL,35℃超声提取20 min,6 000 r/min离心10 min,取全部上清液至150 mL鸡心瓶中,再用20 mL乙腈均质残渣1 min,6 000 r/min离心10 min,合并上清液于150mL鸡心瓶中,50℃水浴旋蒸浓缩至近干,用2 mL甲醇涡旋溶解残渣待净化。
1.3.3 样品净化。
向上述溶解液中加入5 mL正己烷脱脂,涡旋2 min,转移至15 mL离心管中,4 000 r/min离心5 min,去除上层正己烷,重复脱脂1次。取下层溶液过0.22μm有机滤膜,供HPLC-MS/MS测定。
1.3.4 回收率测定。
在牛肉空白中分别添加10.0、20.0、40.0μg/L 3组浓度混合标准溶液,按照上述方法操作进行回收率测定。
2 结果与分析
2.1 准确度和精密度
7种磺胺类药物在5.0～100.0μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,r2均大于0.997。在相同的分析条件下,在牛肉空白中分别添加10.0、20.0、40.0μg/L 3组浓度混合标准溶液进行回收率和精密度试验,做5个平行样,试验结果见表3。高、中、低3档加标回收率为92.5%～100.6%,相对标准偏差为2.0%～4.5%,表明该方法具有较好的精密度、准确度和回收率。
2.2 灵敏度
以最低浓度点5.0μg/L的响应值与空白样品中的噪声响应的3倍计算最低检出限,具体检出限结果见表3。7种SAs的检出限为1.0～4.5μg/L,检测灵敏度明显优于同类标准方法。
3 结论
串联质谱 篇9
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters超高效液相色谱/ 串联质谱仪(ACQUITY UPLC/Quattro Premier);MassLynxTM4.0;Zymark全自动固相萃取仪;Accu BONDⅡODS C18固相萃取柱(1 000 mg,6 ml); TurboVapⅡ型氮吹仪(Caliper)。乙腈、甲酸均为液相色谱纯;水为Millipore纯水机出水;MCYST-LR标样为瑞士ALX公司生产(100 μg)。
1.2 液相色谱条件
传统的液相色谱测定MCYST-LR所需时间较长。本方法能在5 min之内完成,极大提高分析速度。图1为标样MRM的总离子流色谱图。流动相中加入适量甲酸可增强ESI+的灵敏度。本文对比了流动相中不同甲酸含量(V/V分别为0%、0.05%、0.10%)对灵敏度的影响,随着甲酸浓度的升高,能显著改善分析灵敏度。综合考虑,选择甲酸浓度为0.10%。本实验液相色谱条件为:Waters超高效液相色谱柱,C182.1 mm×50 mm×1.7 μm,柱温30℃,流动相为乙腈和0.10%(V/V)甲酸的水溶液,流速为0.25 ml/min,进样体积为5 μl,流动相梯度见表1。
1.3 质谱条件
995.7是MCYST-LR的[M+H]+离子质荷比,MCYST-LR裂解产生碎片较多,本实验中离子135.2为特征离子碎片,并且丰度最大,因此选择其为MRM定量分析时的子离子。见图2。本实验质谱条件为:采用ESI+离子源,毛细管电压为3.0 kV,锥孔电压60 V;离子源源温为100℃,脱溶剂气温度为350℃,流量为600 L/h,锥孔反吹气流量为50 L/h;碰撞池压力4.44×10-3mbar。
质量分析器低端分辨率LM1:13.0 V,高端分辨率HM1:13.0 V,离子能量1∶1.0;低端分辨率LM2:13.0 V,高端分辨率HM2:13.0 V;离子能量2∶4.0。
注:1为即时变化,6为线性变化。
1.4 样品的前处理
分别用10 ml甲醇、水活化固相萃取柱,流量为5 ml/min。取水样1.0 L,加入5 ml甲醇,上样速度为4 ml/min。用10 ml 5%甲醇的水溶液淋洗小柱,氮气吹干10 min,5 ml甲醇洗脱两次,氮吹仪浓缩至1 ml,待上机分析。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
将MCYST-LR标准样品逐级稀释成1 000、100、50、10 μg/L,在上述检测条件下测定。以样品峰面积为纵坐标,样品浓度为横坐标,得到标准曲线,见图3。线性范围及相关系数见表2。在信噪比S/N=3的条件下,MCYST-LR检出限达到0.04 μg/L。
2.2 精密度和回收实验
取同一水样,分别加入高、中、低不同浓度的MCYST-LR标准溶液,样品按本文1.4方法进行处理,分析并测定其精密度及回收率。结果表明:相对标准偏差≤5.4%,平均相对标准偏差为4.71%;平均回收率为97.2%。
2.3 实际样品分析
在地表水全分析中,采集4个地表水水质样品,按上述方法进行分析MCYST-LR,分析结果为未检出。
笔者采用超高效液相色谱/ 串联质谱法,乙腈-水-甲酸作为流动相,对水中的MCYST-LR进行测定。结果表明,该法具有快速、准确、灵敏度高、分析周期短、适用范围广等优点,可满足WHO规定饮用水中MCYST-LR浓度低于1 μg/L限量直接测定的要求。
参考文献
[1]张维昊,徐小清.固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒〔J〕.分析化学,2001,29(5):522-525.
[2]刘碧波,肖邦定,刘剑彤,等.天然水体中痕量微囊藻毒素的高效液相色谱测定方法优化〔J〕.分析化学,2005,33(11):1577-1579.
串联质谱 篇10
现阶段世界范围内食品农药残留现状分析
随着社会经济的发展, 人们的生活水平和生活质量得到一定程度的提升, 食品安全问题逐渐的成为人们关注的问题之一, 其中食品中含有的农药残留对食品安全造成的影响较严重, 已逐渐的成为世界范围内各国家衡量食品的卫生情况和安全性中遵循的主要标准之一。欧盟、美国、加拿大等经济发达的国家和地区相继对食品中农药残留的最高限度提出越发严格的要求。
现阶段各国家针对食品中的农药残留展开的检测工作的力度得到一定程度的提升, 对食品农药残留检测中使用的技术也提出更高的要求。当今的检测技术已不仅仅需检测出食品是否含有农药残留成分, 还应向着微量的方向发展, 同时需检测出更多种类的食品中的农药残留。目前, 无论是发达国家还是发展中国家都需将提高食品农药残留检测的准确性和效率作为研究的重点。气相色谱-质谱联用法具有分离效能较强的特点, 并且还能准确地鉴定食品中包含的化合物的具体构成结构, 满足快速准确检测出食品中多种类型的农药残留和代谢物的要求, 在现阶段世界范围内各国家食品农药残留检测中都得到较为广泛的应用。
气相色谱-质谱联用法在我国食品农药残留检测中的应用的
近年来, 我国经济发展进程向前推进的速度较稳定, 人们的生活水平也得到一定程度的提升, 因此各阶层的相关人士也越发关注食品安全问题, 气相色谱-质谱联用法在我国食品农药残留检测中的应用也得到一定程度的提升。
我国已推出用气相色谱-质谱联用法检测食品中的多项农药残留过程中应遵循的国家标准。该标准中规定了检测水果、蔬菜中446种农药残留过程中应使用气相色谱-质谱联用法或液相色谱-串联质谱两种检测方法 (其中383种农药残留需使用气相色谱-质谱联用法进行检测) 。此项标准的适用范围包括苹果、梨、西红柿等多种果蔬的检测。标准规定使用此方法进行检测的过程中检出限应在0.000 2~0.600 0 mg/kg。检测样品应用乙腈匀浆提取, 经盐析离心后, 将上层清液取出, 再使用固相萃取柱对取出的清液进一步净化。用乙腈和甲苯的按3∶1配制的混合溶液将将农药洗脱出来, 洗脱液在经一系列的旋转和浓缩后固定在1 m L, 然后在放到仪器中进行离子检测。在这里应采用将环氧七氯作为内标的内标法单离子定量测定的方法, 该方法最早在2005年在我国开始施行。
使用惰性离子源能使针对食品中所含的农药残留展开的检测工作的准确程度和灵敏程度得到一定程度的提升。通过运用保留时间锁定功能 (RTL) 和保留时间锁定农药质谱库两种技术, 能使对复杂程度较高的样品检测的准确程度得到提升。
结语
串联质谱 篇11
文献显示黄曲霉毒素B1在蛋禽配合饲料中检出率最高,雏禽配合饲料和蛋禽配合饲料中超标最严重,超标率分别为11.0%和14.0%[6]。黄曲霉毒素感染能使雏鸡机体免疫机能下降,生长受阻,抗体水平降低,严重时导致死亡[7]。
黄曲霉毒素检测主要以薄层色谱和酶联免疫法快速检测为主,高效液相法及高效液相色谱-串联质谱法为辅[8,9]。薄层色谱和酶联免疫法方法简单、快速,对人员的要求不高,但准确性不高,容易出现假阳性等,不能作为最终确证的方法。液相色谱法往往需要柱前衍生或配备专用衍生器,成本高,耗时长不适用于大批量的检测。高效液相色谱-串联质谱快速、高效、集定性定量于一体,是近年来黄曲霉毒素研究的主要方向[10],并且已经应用到检测当中。目前国内尚未见有采用高效液相色谱-串联质谱(三重四级杆)针对鸡饲料中黄曲霉毒素B1检测的研究。
本研究运用超高效液相-三重四级杆串联质谱测定鸡饲料中黄曲霉毒素B1。样品经70%甲醇水溶液提取、免疫亲和柱净化,正离子模式下使用乙腈-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱,采用Waters Acquity UPLC®BEH C18色谱柱分离,外标法定量。该方法准确高效,重现性好,可实现鸡饲料中黄曲霉毒素B1的测定。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
收集广州市售11种鸡饲料(分别为肉小鸡料、肉大鸡料、肉中鸡料、快大型黄鸡小鸡料、快大型黄鸡中鸡料、快大型黄鸡大鸡料、快大型鸡小鸡料、快大型鸡大鸡料、育肥鸡料和种鸡料)共24批次。
1.1.2主要仪器与试剂
Waters H-class Xevo TQD液相色谱串联质谱(ESI源);色谱柱:Waters Acquity UPLC®BEH C18柱(2.1mm×50 mm×1.7μm)。万分之一天平AG204,KQ-500DE型超声波清洗,日立CF15RXⅡ离心机。
AFTB1标准溶液,25.00μg/m L,广州泛宏贸易有限公司;乙腈、甲醇,色谱纯,飞世尔(Fisher)公司;甲酸,色谱纯,上海安谱科学仪器公司;黄曲霉毒素免疫亲和柱,3 m L,BIOSTEST公司;50 m MPBS溶液。
1.2方法
1.2.1样品制备
称取样品20 g于50 m L比色管中,加入100 m L 70%甲醇水,涡旋混合、超声20 min,10 000 r/min,离心5min,收集上清液。
1.2.2样品纯化
取5 m L样品提取液,加入20m L PBS(p H=7.4)溶液,涡旋混匀1min,将试液以1 m L/min的流速全部通过免疫亲和柱,加入50 m M PBS/甲醇,90/10 V/V以3 m L/min的流速淋洗免疫亲和柱去掉杂质。准确加入1 m L甲醇,等待30 s,收集样品洗脱液,用微孔过滤膜(0.22μm)过滤后供进样。
1.2.3空白基质溶液的配置
分别称取与待测样品基质相同且不含待测成分的样品,按1.2.1及1.2.2制备方法操作,制备空白基质溶液。
1.2.4仪器条件
液相条件:色谱柱:Waters Acquity UPLC®RBEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7μm);进样量5μL;柱温40℃;流速0.40 m L/min;流动相:0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序见表1。
质谱条件:电喷雾源ESI+,脱溶剂气温度550℃,脱溶剂气流速1000L/min,锥孔气50 L/min,毛细管电压2.50 k V。黄曲霉毒素B1M R M检测的相关质谱参数见表2。
2结果与分析
2.1色谱条件的优化
本实验考察了液相色谱-质谱联用分析中常用的两大流动相体系(甲醇-水和乙腈-水)对黄曲霉毒素色谱的影响。同时由于黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮,在结构上更容易得到质子,因此,实验选择正离子模式。实验表明:在正离子模式下(流动相中含0.1%甲酸),甲醇在色谱分离系统效果较乙腈要好,但其离子化程度受到较大的抑制,乙腈作为流动相时的离子化程度高,响应值、灵敏度等均比甲醇要好。因此本实验采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相,梯度洗脱。
2.2样品前处理的优化
本实验分别研究了甲醇-水系列(体积分数分别为35%、60%、70%、84%和90%)和乙腈系列(体积分数分别为35%、、60%、70%、84%和90%)作为提取剂进行了比较,结果发现甲醇体积分数增加至70%时黄曲霉毒素B1提取率不再增加,乙腈体积分数84%提取效率最好,但考虑到有机相比例太高会影响免疫亲和柱的活性,且甲醇的毒性相对乙腈较低,价格亦相对便宜,因此选择70%的甲醇水溶液为提取剂。
2.3标准曲线及相关系数
移取适量AFTB1标准品,用流动相稀释定容,得到浓度为100.0 ng/m L标准溶液使用液。并移取上述标准品溶液适量,用空白基质溶液配制成浓度分别为0.500 0、1.000、5.000、10.00、20.00 ng/m L和50.00 ng/m L的标准曲线供LC-MS/MS检测。以标准工作液峰面积y为纵坐标,浓度x(ng/m L)为横坐,标绘制标准曲线。方法检出限(LOD)依3倍基线噪音S/N=3所得。检测结果见表3。
在空白样品中加入0.5 ng/m L黄曲霉毒素标准品,依据黄曲霉毒素B1定量子离子图响应值的信噪比为4147,方法检出限满足检测要求。
2.4方法的回收率及精密度
在空白样品中,分别向其中分别添加1.000 ng/m L、10.00 ng/m L、20.00ng/m L 3个水平的黄曲霉毒素B1标准品,每个条件平行处理6次,分别测定样品添加标准品后的浓度,根据每次测的实际值计算其回收率,结果见表4。
2.5实际样品的检测
本方法收集了24批次广州市售不同类别的鸡配合饲料样品,对其中的黄曲霉毒素B1含量进行了测定。结果表明,24份鸡配合饲料有23份黄曲霉毒素B1的含量低于本法检出限(0.5ng/m L),1份鸡饲料(肉中鸡料3)有检出微量黄曲霉毒素B1、含量为0.70ng/m L。阳性样品见图2(B)。
3小结
本研究建立的运用超高效液相分离结合三重四极杆质谱检测鸡饲料中黄曲霉毒素B1,可作为今后进一步研究鸡饲料中黄曲霉毒素B1污染情况的监测以及鸡饲料原料及其配方的比例与真菌毒素产生的关系和规律提供理论依据。
参考文献
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