生长机制（共8篇）
生长机制 篇1
羊毛生产是养羊经济的一项重要内容, 羊毛的生长与羊自身的遗传因素及其生长环境因素有关。因此, 研究影响绵羊羊毛生长的因素和各种生理调节因子在羊毛生长中所发挥的作用, 对提高羊毛生产量具有重要的意义。
1 影响羊毛生长的因素
影响羊毛生长的因素有很多, 主要包括遗传、生理、年龄、营养、环境、管理等诸多方面。
1.1 遗传因素
羊毛的生产受品种、性别的影响, 在皮肤单位面积毛囊数上, 伯列考斯羊在一岁时1mm2内毛囊数为130个, 而一岁的莱斯克羊有42个, 盖茨羊有47.7个, 高加索羊有65.5个。在羊毛细度上, 一般细毛羊在60支以上, 半细毛羊在46~58支左右。羊毛长度上, 英国肉羊羊毛长度可达25cm, 而细毛羊一般为7cm左右。一般公羊的毛比母羊的毛密、粗且长;去势的公羊介于中间。
1.2 生理因素
母羊妊娠期, 由于胎儿和母体对养分的竞争, 有可能导致母羊羊毛产量的下降。健康羊较年老体弱者羊毛产量高。
1.3 年龄因素
王庆基等 (1998) 指出不同年龄母羊羊毛生长, 在各季节段有一定差异, 净毛量以成年羊最高, 初产羊其次, 育成羊最低。
1.4 营养因素
营养是影响羊毛生产的重要因素。影响羊毛生产的营养物质主要有蛋白质、能量、矿物质和维生素。Reis[1]发现向美利奴羊的真胃中补充氨基酸或蛋白质, 可提高羊毛的生长速度。在低营养水平下, 真蛋白能为羊毛生长提供必需含硫氨基酸, 也可能有助于绵羊生理的正常调控。有人用双生公羔试验, 对一只公羔饲喂高能量饲料, 对另一只公羔饲喂低能量饲料, 在6周龄时, 于体侧刺一个方块 (5×10cm2) , 观察500天, 结果饲喂高能量饲料的羊从50cm2扩大到158cm2;而另一只低能量的羊扩大到93cm2。田玮 (2001) [2]、哈尔·阿力等[3] (1996) 的研究表明羊毛生长速度主要受营养水平的影响, 矿物元素添加剂对放牧绵羊羊毛生长速度有明显的促进作用, 对羊毛细度和强度也有一定程度的改变。维生素是羊毛生长所必需的, 其中维生素B2及维生素A直接影响羊毛生长, 并能防止皮炎维持皮肤正常生理机能。
1.5 环境因素
不同季节内的温度、湿度、气压、风速、光照等, 对羊毛的产量、长度和细度以及净毛率都有一定的影响。一般情况下, 寒冷可使毛的密度和混型毛中的绒毛含量增加, 气候干燥、温暖有利于生产细毛;气候湿润有利于生产半细毛;夏季羊毛生长速度快, 且较冬季粗。羊背部羊毛受风蚀作用大, 严重时, 使背部羊毛强度降低, 羊毛变黄, 缺乏光泽。自然光对羊毛品质影响较小, 波长小于340nm的紫外线长期作用可使羊毛强度下降。
1.6 饲养管理
我国的细毛羊饲养方式有三种, 一是牧场, 二是专业户, 三是分散的农牧户, 每年约有95%的羊毛是由农牧户生产的, 其生产规模小, 产量低, 且专业知识薄弱, 绝大部分是细毛羊与土种羊混群饲养, 造成绵羊毛交叉混杂, 细羊毛中混入粗毛、粗腔毛甚至有色毛。也有进行分群饲养的, 但为了区别群体, 作有色标记, 有用油漆的, 有用墨汁加废机油的, 甚至有用沥青的, 还有的用有色纱线或彩色塑料线等, 后果是不可洗涤标记毛或异性纤维混入而造成工厂产出次品, 有的甚至会造成加工设备的损坏。
不论放牧绵羊或舍饲绵羊, 从当年剪毛后到次年剪毛前的一个完整生长周期内, 羊毛细度随季节不同有一定变化[4]。营养的季节不平衡可使羊毛纤维的细度不均匀, 改善营养可使羊毛产量提高, 但其中70~80%用于纤维直径的增加[5]。
2 羊毛生长的调节
2.1 调节羊毛生长的相关因子
绵羊毛被生长的调控因子有胰岛素样生长因子-I (IGF-I) 、表皮生长因子 (EGF) 、肝细胞生长因子 (HGF) 、血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 及神经生长因子 (NGF) 和成纤维细胞生长因子-5S (FGF-5S) 等多个因子。
2.1.1 胰岛素样生长因子-I (IGF-I)
研究证明IGF-I可以显著地促进体外培养的毛囊生长[6], 并且IGF-I能够影响毛囊形态发育, 在毛囊细胞生长期IGF-IR开始表达, 出现毛囊外根鞘颗粒细胞分化, IGF-I对毛囊生长的细胞分裂和毛囊形态发育有双重作用[7]。在毛周期的初期毛囊中IGF-IR m RNA水平较高, 到了毛周期的中期 (退化期) IGF-IR m RNA开始显著下降[8,9]。许多资料证明, 在毛周期的初期 (活跃生长期) IGF-I对维持毛的生长是非常必要的, 对防止过早进入中期至关重要[10,11]。
Bhora等[12] (1995) 报道, 体外培养的人皮肤表皮, 在培养体系中加入外源性IGF-I之后, 皮肤中DNA合成显著地增加, 角质细胞明显增殖。
2.1.2 表皮生长因子 (EGF)
EGF对上皮组织的发育和生长有重要的作用。研究结果表明[13,14], EGF对羊毛生长的主要效应表现为:毛囊和羊毛纤维产生EGF剂量的依赖性退化变化。低剂量时毛球稍微变小, 纤维表皮层形成暂时性障碍;大剂量时毛囊退化, 羊毛纤维根端扭曲变形, 最后呈锥形脱落。
2.1.3 肝细胞生长因子 (HGF)
肝细胞生长因子 (HGF) 是一种多功能细胞因子, 可刺激各种上皮细胞、黑素细胞和内皮细胞的生长及其功能。也有研究表明HGF对毛囊的上皮成分毛乳头细胞和真皮部分毛球内的角朊细胞均有重要的刺激作用。范卫新等 (1999) [15]用VEGF和HGF联合对小鼠触须毛囊体外培养的试验结果显示, VEGF与HGF促毛囊生长有协同作用, 但VEGF促毛发生长的作用在培养的前3天较明显, 而HGF促毛发生长作用在培养6天以后明显优于
2.2 激素对羊毛生长的影响
2.2.1 生长激素对羊毛的生长调节
有些专家利用转基因动物研究了GH对皮肤生长的影响。Wallke等 (1999) [16]利用牛GH转基因小鼠就GH对皮肤生长的影响进行了研究, 结果转基因小鼠皮肤相对面积和绝对面积均显著高于非转基因正常对照小鼠。Wynn等 (1988) [17]给饲喂高能量饲料的美利奴母羊每天饲喂10mg重组GH, 持续28天后, 测定羊毛的直径和羊毛的长度, 同时测定了血液中GH、胰岛素 (Insulin) 、IGF-I、葡萄糖、游离脂肪酸、T3、T4、可的松、催乳素、蛋氨酸的浓度, 测定了粪尿中的氮。与试验对照组相比, 试验组血液中GH、胰岛素 (Insulin) 、IGF-I、葡萄糖、游离脂肪酸浓度显著升高, 羊毛直径减少, 羊毛生长下降20%。Spenoer等 (1994) [18]给羔羊全身注射重组GH, 对羊毛生长没有显著的影响。
2.2.2 褪黑激素对羊毛的生长调节
褪黑激素对光照的变化最为敏感。研究表明, 动物的毛发生长周期可能与光照周期引起的褪黑激素分泌量变化有关。贾志海等[19]研究发现, 每天对山羊光照16小时而不埋植褪黑激素, 则山羊绒不能生长;如果对山羊埋植褪黑激素, 则不论光照长短山羊绒都生长;如果每天给山羊光照8个小时, 则不论是否埋植褪黑激素, 山羊绒也都能生长。研究还发现, 短光照和褪黑激素处理, 均可显著提高山羊绒产量, 而对粗毛生长没有影响。但与对山羊绒生长的作用相比, 褪黑激素对绵羊毛生长的影响要小得多。
2.2.3 催乳素对羊毛生长的调节
动物血浆催乳激素 (PRL) 水平随光照时间变化而呈现出夏高冬低的周期性变化, 与羊毛生长速度的变化节奏相吻合。Foldes等研究表明[20], 切除松果体对绵羊毛生长没有明显影响。
生长机制 篇2
关键词：胰岛素样生长因子-1；心肌
中图分类号：R541 文献标识码：A 文章编号：1671-864X（2016）03-0157-01
胰岛素样生长因子（IGF）是属于胰岛素家族的一类多肽，包括IGF-1和IGF-2。IGF-1对心脏具有重要的生物学效应。机体中的IGF-1主要由肝细胞分泌，部分来自组织的自分泌或旁分泌。在血液中可检测到具有活性的IGF-1。循环中IGF-1的运载和储存方式主要通过与IGF结合蛋白（IGFBP）结合。目前已发现来源于不同组织各6种IGFBP。IGF-1主要与IGFBP-3结合后对一些生理机能起调节作用。
一、心肌上IGF-1的来源及其受体
心肌组织的IGF-1除来自血液循环外，其本身也具有分泌IGF-1的能力。IGF-1主要与IGF-1受体结合，两者有较高的亲和力，亦能与IGF-IIR结合，但亲和力低。
二、IGF-1对心肌的作用
（一）IGF-1参与胚胎和出生后早期心脏的生长发育。
IGF-1为胚胎和产后新生个体生长发育所必需 。IGF-1基因缺失的转基因大鼠，表现为个体小，肌肉严重萎缩，出生时的死亡率增高，心脏重量和体重明显下降。外源性的IGF-1剂量依赖性地促进新生大鼠心肌细胞蛋白的合成，增强心肌细胞DNA合成及有丝分裂，促进细胞增生。
（二）IGF-1对心脏功能的影响。
IGF-1使离体灌流心脏的左心室收缩压、左心室dp/dt max和左心室收缩压与舒张压之差均明显增高，但在31p核磁共振成像上未见收缩期中细胞内钙增加。
（三） IGF-1和心肌肥厚。
IGF-1在心肌肥厚形成中有重要作用：1.IGF-1促进胚胎和出生后早期心脏生长发育。2.在肥厚心肌组织中，IGF-1/IGF-IR系统的活性上调。3.在成年大鼠，长期应用外源性IGF-1可使心肌细胞体积增大，左心室重量增加，左心室壁增厚，舒张末直径和舒张容积增大。4.IGF-1促进成年心肌细胞合成蛋白。
（四）IGF-1和心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是不同于心肌细胞坏死的另一种死亡形式，已证实IGF-1对心肌细胞凋亡有抑制作用。在小鼠心肌缺血-再灌注模型上，IGF-1能减少缺血-再灌注引发的心肌细胞凋亡。
三、IGF-1对心脏的作用机制
（一）促细胞增殖和肥大。
IGF-1主要通过MEK-MAPK和/或P13K信号途径激活或调节心肌细胞的增殖和肥大效应。在体内、体外实验均发现IGF-1促心衰心脏细胞增殖和肥大现象，但研究其机制的实验大都在体外培养心肌细胞中进行，这些细胞均是正常细胞，因而IGF-1在心衰心脏中的促增殖和肥大作用，是直接作用于心衰细胞还是作用于功能障碍细胞周围的正常细胞，抑或是作用于心肌干细胞分化产生的细胞周期的亚群需要进一步的实验研究。
（二）抑制细胞凋亡。
IGF-1与细胞表面的特异性受体结合后，磷酸化的IRS与P13K结合，P13K启动去磷脂反应和激活AKT，AKT通过激活抗凋亡靶因子或抑制凋亡因子抑制细胞凋亡。目前已知的AKT靶因子有：bcl-2家族成员BAD、Procaspase-9、CREB、GSK-3β等。但近来有实验证明IGF-1可同时通过两条和两条以上信号途径来调节抑制细胞凋亡。
（三）增加心肌收缩性。
IGF-1通过促进三磷酸肌醇和二酰甘油的生成，从而分别使细胞内钙离子浓度增高和蛋白激酶C激活途径来增加心肌收缩性。Von Lewinski等研究人的心衰心肌细胞，IGF-1的正性肌力作用机制。Ca2+转运和SR Ca 2+浓度的增加与正性肌力作用相关。IGF-1提高L-型Ca2+流，证实IGF-1在心衰心肌细胞中执行Ca2+依赖的正性肌力作用。Ren等在IGF-1缺乏的小鼠心衰模型中，发现IGF-1缺乏直接与心肌细胞的兴奋-收缩耦联的功能障碍有关。
（四）增加冠状动脉供血。
Kiowski等1994年发现NO参与IGF-1的舒血管效应。Wickman等在切除垂体的雌性大鼠中发现IGF-1使血管内皮的eNOS上调，提高NO的生物利用度，从而改善冠状动脉供血。
四、结语
生长机制 篇3
关键词：肝细胞生长因子,肺动脉高压,内皮细胞
PAH是一种进行性发展的、预后不良的疾病, 直到现在仍无特效治疗药物。无论原发性抑或继发性, PAH的特征都是肺动脉内皮细胞和内膜平滑肌细胞无序增生和凋亡, 导致进行性肺血管重构和肺血管床的毁损, 导致有效循环血管床面积减少, 最终肺动脉高压形成[1]。抗凝剂、利尿剂、钙通道阻滞剂、正性肌力药物已被用于治疗肺动脉高压患者, 试图减轻他们的症状, 但效果有限或无效。近年来具有特异性靶向治疗药物已被开发利用, 包括前列环素[2], 内皮素受体拮抗剂[3], 磷酸二酯酶 (PDE-5) 抑制剂[4], 虽然这些些药物在一定程度上可减缓病情。但由于个体差异等原因, 其作用很多时候并不理想, 尤其是远期效果。因此, 探索新的治疗方法十分迫切。
近年研究发现, HGF是一种血管内皮特异性生长因子, 具有促内皮细胞增殖、迁移, 促进新生血管生成和抑制细胞凋亡与组织重构的作用[5]。因此, 其治疗肺动脉高压的研究成为一项热门课题。本文对HGF治疗肺动脉高压的可能机制作一综述。
1 HGF与PAH
1.1 HGF的分子结构与受体
肝细胞生长因子 (Hepatocyte Growth Factor, HGF) 又称离散因子 (Scatter Factor, SF) , 是一种主要来源于肝脏间充质的多功能细胞因子。HGF是由728个氨基酸构成的单键分子衍生而成, 由链 (69kD) 和链 (34kD) 组成异源二聚体。α链中含有4个Kringle结构 (扣环结构) , 该结构有一个特殊的氨基酸序列 (Asn-Tyr-Cys-ArgAsn-Pro-Asp) , 其结构与纤溶酶原相似。β链是一种类似于丝氨酸蛋白酶的结构, 虽然结构相似, 但不具有蛋白酶的催化功能, 链和链间通过二硫键结合[6]。
HGF受体是原癌基因c Met编码的一种跨膜蛋白, 称为Met。由50k D的α链和145k D的β链经二硫键相连构成的二聚体。Met具有Ⅱ型酪氨酸激酶受体的结构, 含胞外结合区、跨膜蛋白区、胞内蛋白激酶区等3个结构区[7]。HGF与HGF受体结合后, HGF自身磷酸化, 但之后的细胞内信号转导机制仍不十分清楚。一般认为, HGF的促细胞增殖作用是通过激活Grb2/Sos Ras Raf-MAPK的途径;HGF的促细胞迁移作用是通过激活PLC-PI3-K-Rho的途径;HGF的诱导形态形成作用是通过激活Gab-1、Stat-3;HGF的抗凋亡作用是通过激活Bag 1、Bcl-x L、Bcl-2来实现的。
1.2 HGF与PAH
最早的研究发现, HGF与肝脏再生有关, 后来有研究表明肺部肿瘤[8]、肺纤维化[9]、肺损伤等, HGF的水平会有所增高。在肺的形成和肺结构损伤修复过程中HGF发挥着重要的作用, 在野百合碱构建肺动脉高压大鼠模型中, 发现HGF能靶向作用于肺小动脉并延缓肺动脉高压的进展, 当肺动脉高压时, 肺内HGF mRNA的水平和蛋白浓度下降, 而血浆中HGF的水平则代偿性的升高[10]。
2 肝细胞生长因子治疗肺动脉高压的机制
2.1 HGF对内皮细胞的影响
越来越多的研究表明, PAH的主要发病机理是血管内皮功能紊乱。HGF不仅可以预防内皮细胞和内皮祖细胞功能紊乱, 延缓其衰老[11];还可以的促进内皮祖细胞的增殖, 动员内皮祖细胞分化为成熟的内皮细胞, 有利于内皮细胞的修复和血管的新生[12];从而增加有效循环血管床数量, 治疗肺动脉高压。还有研究发现[13], HGF可以激活内皮细胞MAPK、PI3K-Akt等多种信号转导通路, 发挥内皮细胞生物学功能分子水平的调控;并参与了血管内皮细胞增殖过程中局部微环境的形成。在HGF与细胞膜表面的特异性受体c-Met结合后, 激活的Met发生自动磷酸化, 其酪氨酸激酶活性增强, 导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化, 从而发挥调节细胞增殖分化功能。
2.2 HGF抗血管内皮细胞凋亡的作用
HGF作为一种内源性组织修复因子, 具有抗细胞凋亡的作用。在血管紧张素 (Ang) II诱导的内皮细胞损伤中, HGF通过激活 (ERK) 1/2信号转导通路, 稳定细胞质Bcl-xL和核仁素 (nucleolin) mRNA, 进而抑制细胞色素C释放、caspase-3激活、DNA破碎来发挥抗凋亡作用[14]。HGF也能通过激活PI3K-Akt、p38MAPK、JNK等信号转导通路阻止由晚期糖基化终产物 (Advanced Glycation End Products, AGEs) 诱导的内皮细胞凋亡[15]。HGF也能通过激活PI3K-Akt信号转导通路保护由低密度脂蛋白 (LDL) 诱导的内皮祖细胞 (EPCs) 的损伤[16]。上述研究表明, HGF能通过抑制血管内皮细胞的凋亡, 保护肺血管结构的完整性, 延缓肺动脉高压的进程。
2.3 HGF抑制肺间质重构
PAH的病理生理学显示, 肺动脉高压的发生发展过程伴有肺小动脉的狭窄和重构, 主要是肺动脉平滑肌细胞增生和细胞外基质的大量沉积[17], PAH的间质重构也包括间质的纤维化。Ono等[17]通过注射野百合碱制成的鼠肺动脉高压模型, 2周后通过HGF基因转染, 观察到肺动脉中层增生肥厚较前减弱, 肺动脉血管平滑肌细胞的增生也受到限制, 肺中膜的总胶原沉积亦减少, 所以HGF基因的转染几乎完全阻断了肺动脉高压的中膜增厚, 从而降低肺动脉高压的发生。Hiramine等[18]研究发现, HGF抑制肺动脉血管平滑肌细胞增生, 进而改善肺动脉狭窄, 是通过间接地降低血小板源性生长因子 (PDGF) 的表达, 以及直接地通过平滑肌细胞c-Met的表达。此外, 在肺纤维化大鼠中发现, HGF可通过诱导MMP-2-MMP-9的表达或激活细胞外基质 (ECM) 降解酶, 触发成肌纤维细胞的凋亡[19];体外研究也发现, 尽管静止的纤维母细胞不表达Met, TGF-β1可诱导c-Met在成肌纤维细胞中表达, HGF可抑制TGF-β1的水平, 阻断纤维母细胞向成肌纤维细胞的分化, 抑制肺纤维化[19], 改善肺间质的重构。
2.4 HGF激活一氧化氮合酶 (NOS)
研究表明, NO是一种由NOS产生强有力的血管舒张剂, 在PAH中, NO具有保护血管的作用。Purdie等[20]研究发现, HGF可强烈刺激HGSVEC细胞 (人大隐静脉内皮细胞系) iNOS的表达, 从而增加NO的合成。Zhu等[12]研究表明, 肝细胞生长因子可通过诱导血管内皮细胞中NO的合成, 调控内皮祖细胞的迁移和增殖, 从而发挥修复内皮细胞和促进血管新生的作用。另外, 有研究证实HGF能引起快速的微血管的舒张, 可为NO阻断剂所抑制, 这种短期的效应是HGF诱导的eNOS表达上调的结果。Makondo等[21]实验表明, HGF可通过激活PI3K/Akt信号通路磷酸化, 而有效地激活eNOS的活性;或是通过一系列磷酸化反应使细胞膜发生超级化, 激活e NOS使NO合成增加。
2.5 HGF与炎症
越来越多证据支持, 炎症在PAH的发生发展中扮演着重要的角色。首先, 在PAH患者的病理标本发现大量的炎症细胞堆积, 包括巨噬细胞, 树突细胞, T和B淋巴细胞, 肥大细胞;其次, PAH时, 血液中某些炎症因子会过量表达, 包括TNF-α、IL-1、IL-6等, 这些炎症因子与PAH的严重程度密切相关;最后, 治疗潜在的炎症反应可减轻PAH的症状[22]。研究发现[23], HGF可通过与c-Met结合磷酸化细胞质中的GSK3β、NF-κB p65, 进而降低促炎因子IL-6的表达, 增加抗炎因子IL-10的表达, 抑制炎症反应。
3 应用前景
生长机制 篇4
1 PUFA的分类、体内代谢途径
PUFA是含有2个或2个以上的双键,碳原子数在16~22个的直链脂肪酸,包括n-3、n-6、n-9系列。n-3PUFA是指第一个双键位于甲基端第3个碳原子上的PUFA,n-6PUFA是指第一个双键位于甲基端第6个碳原子上的PUFA。n-3PUFA和n-6PUFA在体内不能合成。亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)分别是n-6和n-3系列脂肪酸的前体,在体内经过一系列的碳链延长和脱饱和作用衍化生成其他的PUFA。具有特殊生物学意义的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。ARA可以产生前列腺素-2(PGE2)、凝血烷(TX-2)、白细胞介素4(LT-4);二十碳三烯酸(DGLA)可以产生PGE-1、TX-1、LT-3;EPA可以产生PGE-3、TX-3、LT-5[1]。
2 PUFA的生物学作用
PUFA是一类独特的生物活性物质,在生物系统中具有广泛的功能。PUFA对细胞膜的流动性和变形性起着决定性作用,对脂类代谢、机体免疫、机体生长发育和基因表达调控等许多方面起着重要的作用。例如:n-3PUFA对脂质代谢进行调节,能够集中抑制脂肪生成的相关基因表达,促进脂肪酸氧化分解及抑制前脂肪细胞的分化,最终使体内的脂肪合成与储存减少,可以调节细胞核固醇调节元件-1c(SRE BP-1c);n-3PUFA还可以有效激活过氧化物酶体增殖激活受体(PPARs),使其直接结合到肝脏X受体(LXRs)上,进而抑制LXRs对脂肪生成的积极作用[2]。n-3PUFA能够显著削弱细胞内脂多糖(LPS)诱导IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)及IL-6基因mRNA水平上调,说明n-3PUFA在肠上皮细胞中具有抗炎作用[3]。n-3PUFA能够抑制有LPS诱导的每个阶段核因子ΚB(NF-ΚB)途径,可以抑制活化蛋白AP-1活性[2];n-3PUFA还有提高机体免疫力的作用。经过20年的时间,研究者现在已经达成共识,人类PUFA平衡摄入n-6/n-3最佳比值是4~10∶1[4]。而仔猪摄入n-6/n-3最佳比值为10∶1[5,6,7]。关于n-6 PUFA的功能至今还没有达成一致的观点,有人认为n-6具有免疫抑制作用,当血液中n-6PUFA增加时PGE2相应增加,易造成炎症的发生;相反,有人认为n-6PUFA的衍生物共轭亚油酸是一种n-6系列PUFA,是安全性较高的新型饲料添加剂,具有抗癌、抗动脉硬化、增强机体免疫、降低体脂肪沉积及促进骨生成等生物学功能。CLA能缓解免疫应激引起的仔猪生长抑制,其防止免疫应激诱导的生长抑制作用可能与CLA抑制炎性细胞因子的分泌有关[8]。这个方面的进一步研究是非常必要的,由于现在NRC(2013年)[9]列表中很多饲料中含n-6PUFA,而含n-3PUFA的饲料种类很少。在生产应用中仅知道增加PUFA对养猪有利,还没有考虑到最佳含量和比值的问题,从而可能产生反作用。
3 n-3PUFA对仔猪免疫和生长的作用机制
n-3PUFA可竞争性地抑制ARA的代谢。ARA和EPA都能合成前列腺素、凝血烷和白细胞介素等类二十烷酸家族的前体,并且催化从花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)合成类二十烷酸的代谢酶相同,但是EPA为前体合成的类二十烷酸的生物活性低于以ARA为前体合成的同类物[1]。n-3PUFA可下调内毒素和细胞因子诱导的环氧化酶2(COX-2)及5-脂过氧化酶(5-LOX)的表达,产生一些效能不高的前列腺素(PGE-3、PIG3)及白三烯(LBT-5),减少ARA产物的生成,这个过程与细胞膜表面的TLR2有关;n-3PUFA能显著抑制磷脂酶PLA2活性,减少膜磷脂ARA的释放,减少来源于ARA的类二十烷酸。
日粮中长链n-3PUFA可以通过调节仔猪体内促炎细胞因子的产生,进而以影响胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)的功能来调控仔猪生长;能够影响肌肉中肌纤维组成,并可能影响仔猪肌肉生长,通过提高背最长肌中生肌决定因(Myo D)基因的表达,促进卫星细胞增殖与分化,增加肌纤维中肌核数量,提高肌肉生长潜力,从而促进仔猪生长。
4 n-3PUFA在仔猪生产中的应用效果
4.1 在妊娠母猪日粮中添加n-3PUFA对仔猪生产性能的影响
4.1.1 对仔猪免疫的影响
在妊娠和哺乳母猪日粮中添加n-3PUFA可显著提高乳中的n-3PUFA含量,降低ARA含量,提高仔猪免疫力。在妊娠末期日粮中添加鱼油,发现母猪乳中DHA和EPA含量增加,并且新生仔猪通过哺乳获得的ARA含量有所下降,新生仔猪血浆中n-3PUFA量显著提高[12]。在妊娠后期母猪日粮中添加5%、7%鱼油提高了猪乳中DHA、EPA和n-3PUFA含量,降低了n-6PUFA含量,并且仔猪增重与乳中n-3PUFA含量呈正相关,与n-6PUFA含量呈负相关[13]。在妊娠末期、泌乳期母猪日粮中添加7%鱼油能显著提高仔猪脾脏中白细胞介素-2(IL-2)以及辅助体细胞(Thl)特征基因mRNA的表达,促进T淋巴细胞增殖和Th1极化,加速仔猪免疫成熟[14]。
4.1.2 对仔猪生长的影响
在妊娠107天~哺乳28天母猪日粮中添加不同来源的脂肪酸(动物油、菜籽油、鱼油、椰子油、棕榈油、葵花油),结果表明,添加不同来源的脂肪酸后母猪能量摄入增加,同时增加了仔猪出生到断奶增重,其中鱼油组效果最好[15]。另外的研究表明,与添加等量的猪油相比,妊娠末期、泌乳期母猪日粮中添加7%鱼油有利于仔猪生长[14]。说明不同种类脂肪酸对仔猪生长是有影响的。在妊娠母猪日粮中添加n-3PUFA,可以提高仔猪初生重,同时没有增加妊娠母猪肥胖程度,原因是n-3PUFA与脂类代谢有关[16]。在妊娠母猪日粮中添加1.75%鱼油并且在哺乳母猪日粮中添加3.5%鱼油,可以促进所产仔猪的生长[17]。添加10%鱼油到哺乳母猪日粮中降低了母猪泌乳量,并且降低了哺乳仔猪断奶存活率[18]。说明适量的鱼油添加到妊娠、泌乳期母猪日粮中有利于仔猪生长,但过量添加反而不利于仔猪的生长。妊娠末期母猪日粮中添加适量鱼油对仔猪的影响具有远期效应,促进了仔猪在保育期生长。妊娠末期、泌乳期母猪日粮中添加7%鱼油,经母乳所提供的n-3PUFA降低了仔猪背最长肌中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达,提高了仔猪背最长肌中IGF-ⅠmRNA的表达,有利于仔猪的生长。而在保育期日粮中直接添加7%鱼油所提供的n-3PUFA则促进了仔猪脾脏中促炎细胞因子(IL-2、IL-6和TNF-α)mRNA的过量表达,降低了背最长肌中Ⅰ型胰岛素生长因子-Ⅰ受体(IGFIR)mRNA的表达,不利于仔猪生长[14]。说明对仔猪生长性能而言,通过母乳提供的n-3PUFA比从断奶仔猪日粮补充的鱼油效果更好。大量试验证明,适量添加n-3PUFA对妊娠母猪、同窝产仔数没有影响,也没有促进氧化反应的发生[19]。
4.2 在断奶日粮中添加n-3PUFA对仔猪生产性能的影响
4.2.1 对仔猪生长的影响
n-3PUFA在仔猪生长中起着重要作用。在日粮中添加2%和3%饲用鱼油能有效提高饲料转化率,显著提高仔猪日增重[20]。日粮中添加2%饲用鱼油提高仔猪日采食量和日增量的效果最佳[21]。A.M.Gaines等[22]在24~36日龄断奶仔猪日粮中添加5%鲱鱼油+1%玉米油,结果仔猪日增重和采食量降低。保育期仔猪日粮添加7%鱼油,促进了仔猪脾脏中促炎细胞因子的产生,造成IGF-Ⅰ受体抵抗,从而抑制了仔猪生长[14]。说明在断奶仔猪日粮添加不同比例鱼油对仔猪生长的影响不同。
4.2.2 适当n-6/n-3比例的PUFA对仔猪生长和免疫的影响
在21日龄断奶仔猪日粮中添加不同比值的n-6/n-3 PUFA,结果表明,在21 d的试验期,采食n-6/n-3 PUFA比值为10∶1日粮的断奶仔猪生长性能及免疫反应最佳[6]。与上述结果相似,n-6/n-3PUFA比值为10∶1的日粮能提高断奶仔猪饲料转化率,提高断奶仔猪免疫能力,缓解免疫应激或断奶应激,改善生产性能[7];还可以显著降低仔猪腹泻[5]。说明n-6/n-3PUFA比值平衡对于断奶仔猪免疫和生长非常重要。
5 n-3PUFA在仔猪日粮中应用的注意事项
PUFA日粮容易氧化酸败,一定要保管好,防止受潮和高温。还要注意摄入PUFA时一定要补充足量抗氧化物(维生素A、维生素E和微量硒、锌)。原因是PUFA具有氧化性。近年来随着研究的不断深入,研究者发现早期断奶过程中伴随氧化应激的产生,并推测氧化应激有可能是早期断奶综合征产生的主要原因之一。因此,PUFA用于仔猪时一定保证足量的抗氧化物是非常必要的。
6 展望
综上所述,n-3PUFA在仔猪生产中有着很重要的意义。在妊娠末期母猪日粮中添n-3PUFA极大地提高仔猪免疫力,促进仔猪生长。n-3PUFA在仔猪生产上有着广阔的应用前景。因此,今后n-3PUFA产品开发和利用也有非常好的前景,比如开发含n-3PUFA的饲料取代鱼油。近日,英国洛桑研究所的研究人员通过转基因手段,让油料作物亚麻荠成功生成品质与鱼油相媲美的n-3PUFA,为弥补鱼油资源的不足提供了有效的替代方法。已有试验证明,蓝鲸鱼油(主要成分为C18∶4n-3,SDA)不需要经过Δ6去饱和酶;此鱼油在仔猪组织内生成EPA、DHA更多。仔猪体内Δ6去饱和酶有限,寻找含有亚麻油酸(C18∶4n-3,SDA)的油可能是未来好的发展方向。仔猪日粮中减少ARA含量有助于提高仔猪的免疫力和生长速度。所以,在养猪生产中建立一套完整的n-3PUFA需要量,确定含量比值,是现在养猪生产中迫切需要的。
摘要：第一个双键位于甲基端第3个碳原子的直链脂肪酸(n-3PUFA,polyunsaturated fatty acids)是一种重要营养物质,具有多种生理功能,随着国内外研究的不断深入,使得n-3PUFA被广泛应用于实际生产中,在养猪生产中能够有效提高生产效益,尤其是对于仔猪可以提高仔猪免疫力、促进生长。本文综述了PUFA分类、体内代谢途径、生物学作用、调节机制和在仔猪生产中的应用效果及展望。
生长机制 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞系Lo Vo细胞由武汉大学消化与肝病研究所冻存, 阿司匹林购于Sigma公司, Annexin V/PI试剂盒购于BENDER公司, 胎牛血清、DEPC购于杭州四季青生物材料研究所, Caspase-3活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司, RUNX-3单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司, 辣根酶标记兔抗山羊Ig G购自武汉博士德生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Lo Vo细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养, 根据生长情况3~5 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT实验检测细胞增殖抑制率
取对数生长期的Lo Vo细胞, 以1×104个/m L的浓度接种于96孔板, 每孔200μL, 待细胞贴壁后分组:阿司匹林组加入阿司匹林终浓度为1、2、4、6和8 mmol/L的培养液, 对照组加入等量的培养液, 并设立调零孔。每组设5个复孔, 分别培养24、48和72 h, 实验终止前4 h每孔加入MTT试剂20μL, 孵育4 h, 小心弃掉上清液, 每孔加150μL DMSO, 振荡10 min, 使结晶完全溶解, 酶标仪测定570 nm处的吸光值 (A值) , 抑制率=﹝1- (实验组平均A值-调零孔A值) / (对照组平均A值-调零孔A值) ﹞×100%。
1.2.3 显微镜下观察细胞形态
取对数生长期Lo Vo细胞消化传代并培养24 h后, 换阿司匹林终浓度为1、2、4、6和8 mmol/L的培养液连续培养24、48和72 h后置于倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数生长期的Lo Vo细胞, 以1×106个/m L浓度接种于6孔培养板中, 贴壁后分为实验组和对照组, 实验组分别加入阿司匹林终浓度为1、4和8 mmol/L的培养液, 对照组加入等量培养液, 培养48 h后, 收集细胞, 离洗固定后加入Annexin V-FITC和PI染色。筛网过滤送流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.5 分光光度法检测Caspase-3酶活性变化
细胞接种及分组同上, 培养48 h后, 收集细胞, 分别加入50μL冷裂解缓冲液, 冰浴裂解15 min后, 4℃、1 200 r/min离心15 min, 将上清移至预冷的离心管中, 置于冰上, 按试剂盒使用说明书操作, 酶标仪上405 nm测定Caspase-3的酶活性, OD405为样品中Caspase-3酶活化后催化产生p NA (p-nitroaniline) 产生的吸光度, 可反映细胞裂解液中总的Caspase-3活性强弱。
1.2.6 RT-PCR法检测RUNX-3 m RNA表达变化
细胞接种及分组同上, 培养48 h后, 收集细胞, 按Trizol试剂说明书一步法提取总RNA, 计算出RNA浓度, 按RT试剂盒说明书合成c DNA, 并进行聚合酶链反应 (PCR) 。PCR反应条件:94℃4 min, 94℃30 s, 51℃30 s, 72℃25 s, 30个循环, 72℃4 min。取5μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察并拍照。RT-PCR采用的β-actin及RUNX3引物由南京金瑞斯合成, RUNX3上游引物为5'-CAGA AGCTGGAGGACCAGAC-3', 下游引物为5'-TCGGA GAATGGGTTCAGTTC-3';β-actin上游引物为5'-C ACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3', 下游引物为5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。扩增片段长度分别为179 bp和240 bp, β-actin为内参。
1.2.7 Western blot检测RUNX-3蛋白表达变化
细胞接种及分组同上, 收集细胞, 用PBS漂洗, 参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作, 提取细胞总蛋白, 并测定蛋白浓度, 蛋白样品加入1/5体积的5×上样缓冲液, 沸水煮沸5 min后离心, 以每孔20μg/孔上样, 行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 然后电转至PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入1︰1 000稀释的兔抗人人类相关转录因子3 (human runt-related transcription factor 3, RUNX-3) 蛋白, 4℃过夜, β-actin作为内参, TBST洗膜3次, 加入1︰1 000稀释的辣根酶标记的兔抗山羊Ig G, 室温孵育2 h, 同样洗膜3次, ECL显色, 观察各条带深浅变化。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 两样本间参数比较用独立样本t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 阿司匹林对Lo Vo细胞增殖的影响
MTT法检测发现, 阿司匹林能显著抑制Lo Vo细胞增殖, 且随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长, 其抑制作用逐渐增强, 呈明显的浓度和时间依赖效应 (见附表) 。与对照组比较, 各浓度和时间点阿司匹林对Lo Vo细胞增殖抑制作用差异有统计学意义 (P<0.01) 。
2.2 细胞形态观察
倒置显微镜下可见对照组Lo Vo细胞生长旺盛, 折光率较高, 胞体大, 形态成梭形或多边形, 胞质均匀透明, 随培养时间的延长形态无明显变化。阿司匹林处理的细胞增殖减慢, 且随着阿司匹林浓度的升高和作用时间的延长, 细胞逐渐变小、变圆, 折光率减弱, 核浓缩等, 部分脱落漂浮于培养瓶中, 但细胞膜完整, 最后裂解。阿司匹林浓度越高, 作用时间越长, 上述表现越明显, 漂浮细胞越多。
2.3 阿司匹林对细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示, 阿司匹林 (浓度分别为1、4和8 mmol/L) 处理Lo Vo细胞48 h后, 细胞凋亡率分别为12.4%、23.4%和35.4%, 而对照组凋亡率仅为3.3%, 表明阿司匹林能诱导Lo Vo细胞凋亡 (见图1) 。
2.4 阿司匹林对Caspase-3活性的影响
对照组Lo Vo细胞Caspase-3相对活性为 (0.91±0.06) , 阿司匹林 (浓度分别为1、4和8 mmol/L) 处理Lo Vo细胞48 h后, Lo Vo细胞Caspase-3相对活性分别为 (1.31±0.07) 、 (1.84±0.08) 和 (2.46±0.07) 。与对照组比较, 阿司匹林组Caspase-3相对活性升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) (见图2) 。
2.5 阿司匹林对RNUX-3 m RNA表达的影响
琼脂糖凝胶电泳结果显示, RUNX-3基因的扩增产物条带为179 bp, 内参β-actin条带为240 bp, 与所设计的片段大小一致, 阿司匹林处理人结肠癌Lo Vo细胞48 h后, RUNX-3基因表达上调, 且随药物浓度升高, Lo Vo细胞RUNX-3基因的表达量亦升高, 呈明显剂量依赖效应。见图3。
A:对照组;B:1 mmol/L组;C:4 mmol/L组;D:8 mmol/L组
注:覮与对照组比较, P<0.05
1:对照组;2:1 mmol/L;3:4 mmol/L;4:8 mmol/L;5:DL 2 000;A:β-actin;B:homo RUNX3
2.6 阿司匹林对RUNX-3蛋白表达的影响
阿司匹林处理Lo Vo细胞48 h后, 结果显示随着阿司匹林浓度的升高, RUNX-3蛋白表达量也逐渐升高, 见图4。
3 讨论
细胞凋亡是维持多细胞机体平衡的一个重要生理机制[6], 细胞凋亡不足是结肠癌发生、发展的一个重要机制[7], 通过诱导细胞凋亡已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究发现, 1~8 mmol/L浓度范围内的阿司匹林对人结肠癌Lo Vo细胞的增殖均有抑制作用, 且随着药物浓度的增加和作用时间的延长, 抑制作用亦增强, 呈明显的浓度及时间效应关系。阿司匹林处理人结肠癌Lo Vo细胞后, 在倒置显微镜下可见到凋亡细胞的形态;流式细胞仪检测其细胞凋亡率随着浓度的增加而升高, 阿司匹林处理后细胞凋亡率明显增加, 且呈浓度依赖效应。在细胞凋亡过程中, Caspase家族的激活起着关键作用, 被认为是引起凋亡的直接效应物。已发现的Caspase家族有10余种, 其中Caspase-3是该家族的重要成员, 是细胞凋亡过程中的关键酶。本研究发现, 阿司匹林呈浓度依赖性增加Lo Vo细胞Caspase-3相对活性, 表明阿司匹林能抑制细胞增殖, 并可能通过增强细胞Caspase-3活性从而促进细胞凋亡。
此外, 本研究还发现, 阿司匹林能上调Lo Vo细胞中RUNX3基因表达, 呈明显浓度效应。大量研究[8,9]证明, 转录生长因子β (transforming growth factor, TGF-β) 和Wnt信号通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。RUNX3参与TGF-β信号通路诱导生长抑制的过程[10]。研究证实, RUNX3基因在多种肿瘤如乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌及肺癌等肿瘤中表达下调甚至缺失, 在肿瘤的发生、发展中起重要作用[11]。有证据表明, 恢复RUNX3基因的表达能通过诱导细胞凋亡、调节细胞周期及下调Cyclin D1的表达而显著抑制肿瘤细胞增殖及转移[12]。本研究发现, 阿司匹林能抑制肿瘤细胞向G1期行进和G1/S转换[13]。并且RUNX3基因表达上调趋势与细胞Caspase-3相对活性增加趋势及细胞凋亡率升高趋势是一致的。因此, 笔者推测阿司匹林能通过上调RUNX3基因表达影响细胞周期、激活Caspase-3活性抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡, 进而发挥抗肿瘤作用。
生长机制 篇6
1 资料与方法
1.1 研究对象
2011年8月—2015年2月选择在我院诊治的动脉粥样硬化脑梗死病人72例作为病例组,纳入标准:经颅脑CT或磁共振成像(MRI)等影像学检查证实,以及根据全国脑血管病会议脑梗死标准确诊为动脉粥样硬化性脑梗死;超声检查结果显示有颈动脉粥样硬化。另设对照组72名,为健康人群。对照组和病例组在年龄、吸烟史等基线资料方面差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。两组病人都排除肺纤维化、周围血管血栓性疾病以及其他性质疾病、严重感染、近期手术、自身免疫疾病、外伤史、严重的肝肾功能不全;且研究对象知情同意,并获得医院伦理委员会的批准。
1.2 超声检测
本研究通过彩色多普勒超声检查仪来检测病人动脉粥样硬化易损斑块状况,分别对病人颈内动脉、双侧颈总动脉、颈外动脉及其分叉部分的内-中膜厚度(IMT)进行测定。正常情况下,颈动脉IMT<1.0 mm,IMT在1.0 mm~1.5mm之间为内膜增厚但未形成易损斑块,IMT≥1.5 mm表明已经形成了动脉粥样硬化易损斑块。
1.3 CTGF检测
入院24 h内抽取病例组病人4 m L静脉血,体检时对照组空腹抽取4 m L静脉血,室温放置1 h后,4 000 r/min低速离心10 min,分离得到上层血清,血清样品冻存于-70℃冰箱,后续通过酶联免疫吸附法(ELISA)进行CTGF检测。
1.4 炎症因子检测
取同样时间点的血清样本,采用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)浓度。所有检测试剂盒均为美国R&D systems公司生产,从北京中山生物技术有限公司购买,实验过程严格参照说明书进行。
1.5 统计学处理
采用SPSS14.0软件分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料采用χ2检验;相关分析采用Pearson法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 颈动脉IMT与易损斑块情况比较
经过超声检测,对照组中只有2例(2.8%)病人检测出易损斑块,而病例组有60例(83.3%)病人检测出斑块,两组间斑块检出率差异有统计学意义(P<0.01);病例组的IMT值明显高于对照组(P<0.05)。详见表2。
2.2 两组血清CTGF含量比较
病例组血清CTGF含量明显高于对照组(P<0.01)。详见表3。
ng/L
2.3 两组血清炎症因子水平比较
病例组血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平都明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。详见表3。
2.4 血清CTGF含量与颈动脉粥样硬化易损斑块形成的相关性
将所有研究对象分为无斑块组(82例)和有斑块组(62例),结果显示:有斑块组血清CTGF含量(203.55±47.11)ng/L,明显高于无斑块组的(9.14±3.11)ng/L,差异有统计学意义(t=65.584,P<0.01)。直线相关分析表明:血清CTGF含量与IMT呈正相关(r=0.692,P<0.05),也与血清TNF-α(r=0.322,P<0.05)、IL-6(r=0.422,P<0.05)和IL-1β(r=0.309,P<0.05)浓度呈正相关。
3 讨论
随着社会的不断发展,脑血管疾病已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一。颈动脉粥样硬化是当前多数脑血管疾病的基础病理表现,大部分病人的动脉系统都存在不同程度的损伤,常常表现为易损斑块,血管壁变厚、顺应性低和僵硬化,有比较高的致残率和死亡率[9,10]。本研究显示:病例组中易损斑块检出率83.3%,对照组中易损斑块检出率为2.8%,两组间易损斑块检出率差异有统计学意义(P<0.01);同时病例组的IMT值明显高于对照组(P<0.05),说明颈动脉粥样硬化病人多伴随有易损斑块,且颈动脉内-中膜厚度明显增加。颈动脉粥样硬化是一个长期的演变过程,最早表现为血管通透性增大,越来越多脂蛋白可透过血管内皮细胞,接着表现为血管壁堆积大量淋巴细胞和氧化低密度脂蛋白,最后出现平滑肌细胞迁移[11]。
人类结缔组织生长因子(h CTGF)本身为一种分泌性多肽因子,富含半胱氨酸,其c DNA最早从人脐静脉内皮细胞中克隆得到,由5个外显子和4个内含子组成;人源性CTGF是通过成纤维细胞和活化的肝星状细胞的高尔基体分泌的,在细胞增殖、分化、伤口愈合以及胚胎发育方面可能发挥调节作用[12]。目前研究发现CTGF与其他生长因子和细胞因子能诱导纤维斑块的新生血管形成,促进内皮细胞的迁移和增殖,参与阻塞性血栓形成[13];随着CTGF表达水平的进一步提高,游离的CTGF可进入细胞间隙以及体循环中,从而进一步诱发血管纤维化或血管增生[14]。本研究结果显示:病例组与对照组的血清CTGF含量分别为(189.24±45.33)ng/L和(15.45±2.89)ng/L,病例组明显高于对照组(P<0.01)。表明CTGF在颈动脉粥样硬化中呈现高表达状态。
有研究表明:炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β能促使血管平滑肌细胞增殖,迁移并可能参与导致血管的再狭窄[15]。已知TNF-α是一种多向性的炎性介质,可以加速培养的血管平滑肌细胞的移动,并且导致一些生长因子、黏附分子、细胞因子、细胞外基质降解金属蛋白酶的表达,促进血栓形成[16]。相关研究也表明:载脂蛋白E敲除的鼠中IL-6 mRNA在心肌损伤区域及损伤血管再狭窄区域表达明显增多,IL-1β通过上调黏附分子,可与TNF-α共同促进炎症细胞聚集和浸润;IL-1β也与TNF-α协同作用,诱导多种细胞分泌IL-6,并能增强TNF-α对靶细胞的损伤,抑制新生内膜形成[17]。本研究结果显示:病例组的血清TNF-α、IL-6和IL-1β浓度都明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。由此可见TNF-α、IL-6、IL-1β在颈动脉粥样硬化的形成中起了重要的作用。
作为一种细胞生理调节因子,CTGF的分泌和表达受到细胞内信号系统的精准调控。相关研究结果显示:CTGF是导致动脉粥样硬化的重要因素,可提高斑块不稳定性以及促进粥样斑块形成。文献报道通过免疫组化方法检测斑块中CTGF水平,结果显示纤维斑块中CTGF水平显著高于复杂性斑块,表明CTGF能够促使单核细胞移行到粥样硬化病变处从而促成动脉粥样硬化的形成[18]。本研究结果显示:有斑块组的血清CTGF含量为(203.55±47.11)ng/L,明显高于无斑块组的(9.14±3.11)ng/L(t=65.584,P<0.01);直线相关分析表明:血清CTGF含量与IMT呈直线正相关(r=0.692,P<0.05),也与血清TNF-α(r=0.322,P<0.05)、IL-6(r=0.422,P<0.05)和IL-1β(r=0.309,P<0.05)浓度呈正相关,说明CTGF是动脉粥样硬化易损斑块发生发展的关键诱发因素,可用于预测颈动脉病变程度和粥样硬化斑块的稳定性;抑制CTGF表达或拮抗CTGF活性可能是临床预防和治疗颈动脉粥样硬化的有效途径之一。
生长机制 篇7
1 材料与方法
1.1 实验材料
人源性黑色素瘤细胞系A375 和原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)。BALB/c裸鼠(雄性,6~8 周龄,18~20 g),无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2012-0001。芹菜素纯度为98%,购自美国Sigma-Aldrich公司。10%胎牛血清、无血清细胞冻存(dulbecco modified eagle medium,DMEM) 培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA) 蛋白定量试剂盒(美国PIERCE公司Cat.No.23227),Ⅰ型鼠尾胶原蛋白(天津卫凯生物有限公司Cat.No.MAT1015 Lot.No.LQF20120221,包装规格:10 mg),MatrigelTM基底膜基质(美国BD公司Cat.No.356234 Lot.No.2342761包装规格:5 ml)。Western blot检测所涉及抗体:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(美国CST公司,Cat No:3852S),基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)(CALBIO-CHEM,Cat No:IM51),总蛋白P38(total-P38,t-P38)/ 磷酸化P38 (phosphorylation P38,p-P38)(1∶200,美国Abcam公司),总蛋白Erk(total-Erk,t-Erk)/ 磷酸化Erk (phosphorylation Erk,p-Erk)(1∶1 000,美国Cell Signaling Technology公司),甘油醛-3- 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(美国Bioworld公司,Cat No:AP0063)。
1.2 方法
1.2.1四唑氮化合物[3-(4,5-dimenthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS]法检测芹菜素对A375黑色素瘤细胞增殖的影响
A375细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞,用胰酶消化后离心计数,用DMEM完全培养基调整细胞浓度为4.5×105个/ml,接种于96孔板,每孔200μl细胞悬液,常规培养至细胞增长至80%左右时,分别加1、2、4、8、16、32、64和128μmol芹菜素,与溶剂对照组[二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)]孵育24 h。每孔加入MTS试剂20μl,继续培养3 h。培养结束后,在490 nm波长下测定吸光度值(optical density,OD)。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%。每个浓度设置6个复孔,实验重复3次。
1.2.2 A375裸鼠皮下移植瘤模型检测芹菜素对肿瘤体内生长的影响
(1)将购买的BALB/c裸鼠适应性饲养1周。根据体重随机分成两组,随机选择其中一组作为模型组(只接种肿瘤细胞,不接受任何药物处理);(2)常规培养A375黑色素瘤细胞,实验前4~5 d,按1∶8比例将细胞传代于75 cm2细胞培养瓶中,以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含0.8×107~1.0×107个细胞,取对数生长期细胞,弃培养液,用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗2遍。加入1 ml 0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),37℃消化1 min后,轻敲培养瓶使细胞脱落,加血清终止消化。转移至10 ml离心管中,常温1 000 r/min离心3 min,弃上清液。加PBS,吹打获得单细胞悬液。通过细胞计数将悬液浓度调节至1×107个/ml,放置冰上备用;(3)用浓度为75%的酒精消毒皮肤,1 ml注射器吸取0.2 ml(2×106个细胞)A375细胞悬液接种至裸鼠右后肢的背部皮下,每注射2只裸鼠,充分混匀细胞悬液后继续接种,接种完继续饲养,每天观察小鼠肿瘤的形成,测量肿瘤体积:用游标卡尺测量记录瘤径,长短径各测3次,求得长径均值a和短径均值b,肿瘤体积=1/2×a×b2。接种7 d后,选择造模成功的24只裸鼠,测定平均瘤体积和体重进行随机分组,分为模型组、芹菜素低剂量组(10 mg/kg)、芹菜素高剂量组(40 mg/kg),每组8只,给药21 d(药物用食用油溶解,灌胃给药;空白组与模型组给予不含药的食用油)。每隔3 d称取每只裸鼠的体重和瘤体积;(4)给药21 d后各组裸鼠颈椎脱臼处死,剪开皮肤,小心剥离整个瘤块,称重、拍照后用4%多聚甲醛液固定,备用。
1.2.3划痕实验检测芹菜素对A375黑色素瘤细胞迁移的影响
A375细胞种至6孔板中,每孔加入浓度2×105个/ml细胞悬液2 ml,培养24 h后,细胞约长至80%~90%,吸弃上清,PBS洗1遍。用10μl枪头沿孔的中线垂直划痕,PBS洗2遍,加入含不同浓度对应药物的无血清培养基,设5个组:溶剂对照组、0μmol芹菜素组、1μmol芹菜素组、2μmol芹菜素组和4μmol芹菜素组,0和24 h分别在100倍镜下拍照。
1.2.4小管形成实验
(1)将96孔板和无菌移液枪头置于-20℃冰箱中预冷过夜;将保存于-20℃冰箱中的MatrigelTM基底膜基质置于4℃冰箱中,缓慢解冻过夜待用;(2)将预冷的96孔板置于冰板上,每孔加入100μl MatrigelTM基底膜基质。将其置于4℃条件下10 min,再置于37℃、5%CO2及95%空气的细胞培养箱中30 min;(3)取指数生长期的HUVEC细胞(100 mm培养皿),弃培养液。加10 ml PBS洗涤1次,弃去PBS后,加入4 ml 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA,37℃消化2 min后,向其加入5 ml完全培养基中和反应,吹打后将细胞转入15 ml离心管中,1 000 r/min离心3 min。配细胞悬液,用适量的基础培养基调整细胞浓度为1.5×105个/ml。96孔板,每孔缓慢加入100μl细胞混悬液;(4)除溶剂对照组,每孔加入等体积的A375细胞培养上清液0.2 ml进行培养。同时不同浓度的芹菜素(0~4μmol)作用24 h后,分别于显微镜下观察管腔形成并拍照记录。运用Image J软件分析管腔生成的长度。
1.2.5 Western blot检测
将约1×107个细胞加至蛋白裂解液,冰上静置30 min,低温12 000 r/min离心20 min,提取上清液。应用BCA定量法计算蛋白的浓度。取60μg总蛋白跑胶(恒压100μV),电转膜30 min。含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐和吐温20(tris-buffered saline and tween 20,TBST)封闭1 h。一抗4℃冰箱过夜,二抗孵育1μh后显影。VEGF、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、MMP-9以及GAPDH抗体购自美国Cell Signaling公司。
1.3 统计学方法
采用Graphpad 5.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用单因素方差分析和LSD-t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 芹菜素抑制A375 细胞的体外增殖
体外不同浓度的芹菜素处理A375 细胞24 h,结果表明,8μmol芹菜素初步抑制A375 细胞的增殖,16 和32μmol浓度时可以明显抑制肿瘤细胞的增殖,并且呈现一定的量- 效关系(见图1)。本实验得出结论,在一定浓度范围内,芹菜素能浓度依赖性地抑制A375 黑色素瘤细胞的增殖。
1:空白组;2:1μmol芹菜素组;3:2μmol芹菜素组;4:4μmol芹菜素组;5:8μmol芹菜素组;6:16μmol芹菜素组;7:32μmol芹菜素组;8:64μmol芹菜素组;9:128μmol芹菜素组1)与空白组比较,P=0.008;2)与空白组比较,P=0.000
2.2 芹菜素能抑制A375 黑色素瘤的体内生长
裸鼠体内移植瘤实验结果发现,与模型组比较,芹菜素能明显减小A375 黑色素瘤的体积和重量,且具有一定的剂量依赖性,表明芹菜素能抑制A375黑色素瘤的体内生长。见图2。
2.3 芹菜素能抑制A375 黑色素瘤细胞的迁移
划痕实验中,选取对肿瘤细胞增殖无明显抑制作用的浓度:1、2 和4μmol芹菜素处理A375 细胞24 h,结果表明,1μmol芹菜素初步抑制A375 细胞的迁移,2 和4μmol可以明显抑制肿瘤细胞的迁移,并且具有一定的浓度依赖性(见图3)。本实验得出结论,芹菜素能抑制A375 黑色素瘤细胞的迁移,且在一定浓度范围内,具有浓度依赖性。
2.4 芹菜素能抑制黑色素瘤细胞条件培养下HUVEC形成小管的能力
小管形成实验中,选取4 个不同浓度:0、1、2 和4μmol芹菜素处理A375 细胞24 h,结果表明,培养肿瘤细胞的上清液可以明显刺激小管形成。1μmol
芹菜素对A375 黑色素瘤细胞诱导的小管形成具有抑制作用,2 和4μmol浓度可以显著抑制肿瘤细胞诱导的小管形成,并且具有一定的浓度依赖性(见图4)。本实验得出结论,芹菜素能抑制A375 黑色素瘤
1:溶剂对照组;2:0μmol芹菜素组;3:1μmol芹菜素组;4:2μmol芹菜素组;5:4μmol芹菜素组1)与溶剂对照组比较,P=1.000;2)与溶剂对照组比较,P=0.012;3)与溶剂对照组比较,P=0.008;4)与溶剂对照组比较,P=0.000
1:溶剂对照组;2:0μmol芹菜素组;3:1μmol芹菜素组;4:2μmol芹菜素组;5:4μmol芹菜素组1)与溶剂对照组比较,P=0.000;2)与0μmol芹菜素组比较,P=0.006;3)与0μmol芹菜素组比较P=0.000
细胞诱导的小管形成。
2.5 芹菜素能抑制VEGF、MMP-9、p-P38 及pErk蛋白的表达
Western blot检测考察A375 细胞中调控肿瘤细胞增殖及血管生成相关蛋白的表达,结果发现,芹菜素能显著降低VEGF、MMP-9、p-P38 及p-Erk蛋白的表达,且具有浓度依赖性,但对t-P38 及t-Erk蛋白表达无明显影响(见图5)。本实验得出结论,芹菜素能通过下调增殖及血管生成相关蛋白的表达,发挥抑制肿瘤增殖及血管生成的作用。
1:溶剂对照组;2:0μmol芹菜素组;3:2μmol芹菜素组;4:4μmol芹菜素组
3 讨论
大量研究表明,肿瘤的生长及转移与肿瘤血管生成密切相关[22,23],肿瘤血管的新生不仅能够为肿瘤细胞提供丰富的氧气和营养,同时还能将肿瘤细胞代谢产生的废物及时排出。芹菜是日常生活中经常食用的蔬菜之一。研究发现,芹菜的主要有效成分为芹菜素,而芹菜素具有多种药理作用。笔者研究的兴趣在于,对于经常食用芹菜的肿瘤患者来说,芹菜对其病情的进展究竟有何种作用。据此,本实验考察芹菜素对黑色素瘤相关生物学行为的影响,如增殖、迁移及血管生成等。同时本实验也从分子层面对芹菜素影响黑色素瘤相关生物学行为进行研究。诸多研究证实Ras/Raf信号通路,尤其是其下游蛋白P38 及Erk在调控肿瘤细胞增殖的过程中发挥的关键作用[24],所以本实验考察这两种蛋白的表达以揭示芹菜素抑制黑色素瘤细胞增殖的可能机制。研究证实,VEGF是调控肿瘤血管生成最关键的调节因子[25],其水平的高低也反映血管生成的状况,因此本实验考察芹菜素对黑色素瘤细胞中VEGF蛋白的水平。MMP-9 是调控肿瘤迁移及血管生成的重要因子之一,主要通过降解细胞外基质进而促进肿瘤细胞的迁移[26],因此本实验也考察芹菜素对黑色素瘤细胞中MMP-9 蛋白表达的影响,结果发现,芹菜素能显著抑制A375 黑色素瘤的体外增殖、迁移及体内肿瘤生长,同时芹菜素对A375 黑色素瘤细胞诱导的血管生成具有明显抑制作用。芹菜素可能通过抑制肿瘤的血管生成,发挥抑制肿瘤增殖及生长的作用。机制研究部分发现,芹菜素能显著抑制Erk及P38 蛋白表达,同时芹菜素对调控血管生成的VEGF及调控肿瘤细胞迁移的MMP-9 蛋白具有显著抑制作用。本文不足之处在于,只在细胞水平对相关蛋白进行考察,缺乏对体内组织水平的蛋白考察,同时缺乏人黑色素瘤临床样本的相关研究,因此后期的研究重点会放在对黑色素瘤临床样本的考察上。
综上所述,芹菜素能够抑制A375 黑色素瘤的生长、迁移及血管生成,芹菜素具有潜在临床应用价值。
摘要：目的 探讨芹菜素对A375黑色素瘤增殖、迁移和血管生成的影响及其作用机制。方法 采用四唑氮化合物(MTS)法检测芹菜素对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响;裸鼠皮下移植瘤模型考察芹菜素对体内黑色素瘤生长的影响;划痕实验检测芹菜素对细胞体外迁移的影响;小管形成实验检测芹菜素对人黑色素瘤血管生成的影响;Western blot检测芹菜素对A375细胞中调控增殖及血管生成相关蛋白表达的影响,如血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、磷酸化P38(p-P38)、总蛋白P38(t-P38)、磷酸化Erk(p-Erk)、总蛋白Erk(t-Erk)。结果 体外芹菜素处理A375细胞后,肿瘤细胞的体外增殖及体内生长较空白对照组明显受抑制;肿瘤细胞的迁移能力较溶剂对照组明显减弱;小管形成实验中,芹菜素能够抑制肿瘤细胞诱导的血管生成;分子机制研究发现,芹菜素能抑制血管生成相关蛋白VEGF及MMP-9的表达,同时芹菜素也能抑制调控肿瘤细胞增殖相关蛋白,如p-P38及p-Erk的表达。结论 芹菜素能抑制A375黑色素瘤生长、迁移及血管生成,其机制可能与抑制调控肿瘤细胞增殖及血管生成相关蛋白的表达有关。
生长机制 篇8
关键词：肝细胞生长因子 (HGF) ,醋酸铅,人肾小球系膜细胞 (HMC) ,凋亡
铅中毒是目前最常见的职业中毒, 其作用机制以及防治日益成为研究者关注的焦点。肾脏是铅代谢的重要器官, 同时是铅中毒除脑外的第2个重要的靶器官。铅性肾病早期和急性期以近曲小管上皮细胞变性、毛细血管充血和间质中炎性细胞浸润为主要病变;慢性期则可观察到肾小球和间质纤维化增生等不可逆性结构性改变。本研究通过用肝细胞生长因子 (HGF) 蛋白防护醋酸铅处理人肾小球系膜细胞 (HMC) 的毒性作用, 进而为探索铅中毒的防护提供一种理论依据, 为铅性肾中毒的机制研究提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人肾小球系膜细胞 (HMC) (本实验室保存) 、醋酸铅 (天津凯通) , HGF蛋白 (北京军事科学院) , DF-12细胞培养基 (美国Sigma公司) 、胎牛血清 (杭州四季青) , 噻唑蓝 (MTT) 、碘化丙啶 (PI) (美国Sigma公司) , Takara逆转录试剂盒、Takara荧光定量试剂盒 (大连宝生物) , 荧光定量PCR仪 (美国ABI) 、细胞凋亡检测试剂盒 (凯基生物) 、台式离心机 (德国GAMR公司) , PCR仪 (美国ABI) , 酶标仪 (南京华东电子) , 分光光度仪 (UV1100) (德国Beckman公司) , 流式细胞仪 (美国BD公司) 。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HMC进行常规培养传代。培养液为含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DF-12培养液。
将液氮冻存的HMC 39℃水浴溶解, 迅速转移至离心管中以1 300 r/min离心5 min (离心半径=8.0cm) , 弃上清后, 加入4 ml完全DF-12培养液 (10%FBS) , 接种于25 cm2培养瓶中, 置37℃、5%CO2细胞培养箱中生长, 细胞贴壁后换液, 待培养细胞处于对数生长期时将其用胰酶消化, 完全培养液终止并吹打成单细胞悬液, 用于以下实验。
1.2.2 实验分组
实验分正常对照组、10μmol/L醋酸铅处理组 (Pb 10μmol/L组) 和HGF+Pb 10μmol/L醋酸铅组, HGF (20μl/ml) 加入HMC细胞共同孵育30min, 再加入10μmol/L醋酸铅后48 h处理细胞。
1.2.3 细胞存活率的检测
将上述单细胞悬液接种于96孔细胞培养板上, 每孔5×103个/孔。将培养板置于细胞培养箱中, 待细胞贴壁后换无血清培养液培养12 h使细胞同步化;吸去培养液, 加入200μl/孔DF-12完全培养基, 并在Pb 10μmol/L组和HGF+Pb10μmol/L组按2μl/100μl加入HGF蛋白, 37℃培养30 min;之后在HGF+Pb 10μmol/L组中加入终浓度为10μmol/L的醋酸铅溶液;之后37℃继续培养, 于染铅后6、12、24、48 h, 每孔分别加入20μl MTT溶液 (5 mg/ml) , 37℃继续培养4 h后, 终止培养;小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入200μl二甲亚矾 (DM-SO) , 振荡10 min, 使蓝紫色结晶物充分溶解, 在酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm处吸光度 (A) 值, 记录结果。根据实验测得的A值计算细胞生长存活率。细胞生长存活率 (%) =实验组A值/对照组A值×100%。
1.2.4 细胞凋亡率的检测
将HMC单细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶 (1×105个/瓶) 中, 待细胞贴壁并同步化后, 各组分别加入4 ml DF-12细胞培养液, HGF+Pb 10μmol/L组加入20μl/ml的HGF蛋白, 37℃继续培养30 min后, Pb 10μmol/L组和HGF+Pb 10μmol/L组各瓶分别加入浓度为10μmol/L醋酸铅, 留对照组, 继续培养6、12、24、48 h后, 用不含乙二胺乙酸 (EDTA) 的胰酶消化细胞, 离心 (2 000 r/min, 离心5 min, 离心半径8.0 cm) 收集细胞, 用PBS洗涤2次, 同样离心收集5×105细胞, 加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞, 再加入5μl Annexin V-FITC混匀后, 然后加入5μl Propidium Iodide, 混匀;室温、避光、反应5~15 min, 在流式细胞仪上检测, 流式细胞仪分析条件:激发波长Ex=488 nm, 发射波长Ex=530 nm。
1.2.5 醋酸铅染毒对HMC Caspase-3 mRNA的转录的影响
HMC单细胞悬液接种于25 cm2培养瓶 (1×105个/瓶) 中, 待细胞贴壁同步化后, 吸去培养液, 加入200μl/孔DF-12完全培养基, 并在Pb 10μmol/L组和HGF+Pb 10μmol/L组按20μl/ml加入HGF蛋白, 37℃培养30 min, 之后在HGF+Pb 10μmol/L组中加入终浓度为10μmol/L的醋酸铅溶液, 之后37℃继续培养48 h。提取细胞总RNA。实验步骤:PBS清洗贴壁细胞2次后, 按每瓶细胞量加入1 ml Trizol, 放置融解2~5 min后转移至1.5 ml dorf管中, 加入200μl氯仿充分混匀, 静止5 min后4℃12 000 r/min离心10 min, 转移上清至另一干净dorf管中, 加入等体积异丙醇充分混匀, 室温静置30 min后4℃12 000 r/min离心10 min, 弃去异丙醇, 加入500μl 75%乙醇洗涤RNA沉淀, 4℃12 000 r/min离心5min, 弃上清, 待沉淀晾干后加入30μl DEPC水溶解RNA沉淀。反转录实验步骤:在20μl反应体系中加入10μl RNA, 2.5 mmol/L的d NTP2μl, Olig (d T) 151μl, 反转录酶 (200 U/μl) 0.5μl, 5×RT-Buffer 4μl, 无Rnase水2.5μl, 42℃温浴90 min, 65℃加热5 min结束反应。将提取的总RNA吸取2μl稀释50倍, 在紫外分光光度计上测量260和280 nm下的A值。总RNA的浓度= (A260/A280) ×稀释倍数×0.04μg/μl。选取A260/A280在1.8~2.0之间者进行下一步实验。提取的总RNA逆转录为c DNA:用Ta KaRa Prime Script TM RTreagent Kit进行逆转录操作。反应体系:5×Prime Script TM buffer 4μl、Oligo d T Primer (50μmol/L) 1μl、Random 6 mers (100μmol) 1μl、Prime Seript TM RT Enzyme MixⅠ1μl、TotalRNA 1μg、Rnase-free水补齐至20μl;反转录反应:37℃, 15 min, 85℃, 5s, 反应结束后将此逆转录产物置-20℃保存。Caspase-3的c DNA序列设计特异性引物 (引物均由大连宝生物公司合成) :上游为5-CCATGAAGTGT-GACGTTGCATC-3, 下游为5-CCTAGAAGCATTTGCG-GTGC-3, 产物大小为284 bp。
将逆转录的各时间点c DNA进行Real time PCR反应。用Ta KaRa SYBR Preix EX Taq TMⅡ (Perfect Real Time) 在ABI7300 Real Time PCR仪上进行PCR反应。反应体系:SYBRPreix EXTaq TMⅡ10μl, PCRForward引物 (10μmol/L) 0.8μl、PCRReverse引物 (10μmol/L) 0.8μl、ROXReferenee Dye11 (50×) 0.4μl、c DNA溶液2μl、灭菌蒸馏水6μl;反应条件:预变性95℃, 30 sec;Stage2 (40 cyele) :95℃, 5 s, 60℃, 31 s;融解阶段:95℃, 15 s, 60℃60 s, 95℃, 15 s。结果采用2-△△ct法进行分析。
1.3 统计方法
实验数据用±s表示, 用SPSS 17.0统计软件进行方差分析, 以P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞生长存活率
经不同浓度10μmol/L醋酸铅染毒HMC 6、12、24、48 h, Pb 10μmol/L组HMC细胞生长存活率较对照组均显著降低 (P<0.01) , HGF+Pb 10μmol/L组HMC细胞生长存活率较Pb 10μmol/L组均明显增加 (P<0.05) , 且存在时间依赖关系。见图1。
注:各时间点Pb 10μmol/L与对照组比较, P<0.01;Pb 10μmol/L组与HGF+Pb 10μmol/L组比较, P<0.05。HGF—肝细胞生长因子;HMC—肾小球系膜细胞。
2.2 细胞凋亡率
在10μmol/L醋酸铅染毒HMC的6、12、24和48 h后, 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示, HGF+Pb 10μmol/L组在各个时间点细胞凋亡率显著低于Pb 10μmol/L组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图2。
注:HGF+Pb 10μmol/L组与对照组比较, P<0.01;HGF+Pb 10μmol/L组与Pb 10μmol/L组比较, P<0.01。HGF—肝细胞生长因子;HMC—肾小球系膜细胞。
4.3荧光定量检测结果
实时荧光定量 (PCR) 检测HMC铅染毒48 h后Caspase-3的表达量的变化结果显示, 对照组表达量为1.8056±0.5142, HGF+Pb 10μmol组Caspase-3的表达量 (0.0014±0.0001) 显著低于Pb 10μmol/L组 (26.7996±4.6895) , 差异有统计学意义 (P<0.01) 。
3讨论
铅是一种社会生活中广泛使用的重金属, 铅中毒严重危害人类尤其是儿童健康, 且铅中毒在众多职业病中占有重大的比例。铅对神经系统、造血系统、消化系统、泌尿系统等都具有不同程度的毒害作用, 而肾脏是进入机体的铅的主要代谢器官, 是仅次于肝脏组织之后的第二大铅储存室, 当进入机体的铅的量超过了肾脏对铅的代谢能力时, 就会使肾脏代谢功能发生紊乱, 进而发生病理性损伤, 严重威胁机体健康。
HMC是肾小球内非常活跃的细胞, 能够分泌细胞基质, 产生细胞因子, 吞噬和清除大分子物质及类似于平滑肌的收缩功能。铅能够干扰肾脏细胞内钙离子的动员, 抑制肾脏细胞对钙离子的吸收, 进而影响循环中Vit D水平。体外铅处理的肾脏细胞后肾脏细胞金属硫蛋白 (MT) mRNA表达增加而MT蛋白的表达无变化, 这表明Pb对MT的表达发挥着双重作用, 促进肝脏和肾脏MT基因的转录, 抑制肾脏MT mRNA的翻译, 抑制MT蛋白的表达, 从而对肾脏造成损伤[1]。乙酸铅能造成HK-2细胞乳酸脱氢酶 (LDH) 外漏增加, 细胞上清液丙二醛 (MDA) 水平上升, 细胞内活性氧 (ROS) 生成增加, 还原型谷胱甘肽 (GSH) 水平改变, 线粒体内膜心磷脂 (CL) 氧化损伤, 诱发HK-2细胞凋亡及坏死, 且凋亡率远较坏死率高。氧化应激介导HK-2细胞线粒体损伤, 从而启动线粒体途径的细胞凋亡可能是铅致肾细胞毒作用机制之一[2]。而本研究中, MTT以及流式结果显示, Pb 10μmol/L组较对照组在各个时间点细胞的存活率显著降低 (P<0.01) , 凋亡率显著升高 (P<0.01) 。
HGF又称离散因子 (scatter factor, SF) , 是一种多效应生物活性因子, 最初作为肝细胞有丝分裂原从肝部分切除大鼠的血液中分离, 其活性不具种属特异性并可刺激肝细胞合成DNA[1]。HGF表达于正常的肾脏的肾小球系膜细胞、间质成纤维细胞核内皮细胞。HGF作为肾脏的保护因子, 可在肾纤维化中发挥特异作用, 肾纤维化的发生并非单一机制作用, 涉及到炎症、凋亡和纤维化等多个阶段[3]。
HGF作为一种抗纤维化细胞因子在多种慢性肾脏病中能够阻止肾脏的纤维化发生和发展。在肾纤维化中HGF能通过核转运阻断活化的Smad2/3, 从而阻止其结合到靶基因的启动区[4]。在单侧肾切除和急性肾衰竭中HGF的mRNA的表达和血浆中HGF的水平显著升高;其通过促进肾脏上皮的再生并抑制有肾毒素、肾缺血和单侧肾切除术引起的肾脏衰竭综合征, 促进由于服用抗癌药物引起的肾损伤的肾上皮细胞的再生并通过抗凋亡作用抑制上皮细胞和内皮细胞的死亡。
而本研究MTT检测统计结果显示, Pb 10μmol/L组的细胞的存活率在6、12、24、48 h均显著于低于HGF+Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 同时流式凋亡检测结果显示, Pb 10μmol/L组的凋亡率在6、12、24、48 h均显著于高于HGF+Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 表明HGF蛋白对铅中毒引起的肾脏损伤具有一定的保护作用。
Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡的研究热点之一, Caspase被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者, 而Caspase-3是检测早期细胞凋亡的活性或其表达的重要指标[9]。PI3-kinase-Akt信号通路是一种存活信号同时在调节MC细胞的凋亡中发挥着关键的作用, 而NF-γB或Bad是PI3-kinase-Akt通路下游重要的信号成员, HGF能够促进PI3K活化[10], 抑制TGFβ1表达, 从而抑制Caspase-3, 而抑制细胞凋亡;Akt诱导NF-γB的激活和Bad磷酸化从而促进细胞的凋亡[11]。本研究中荧光定量检测凋亡基因Caspase-3显示, HGF+Pb 10μmol/L组Caspase-3基因的表达水平显著低于Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 提示HGF在铅中毒引起的肾脏损伤中具有较好的抗凋亡作用。
综上所述, 多效应细胞因子HGF对铅引起的肾脏毒性有较好的保护作用, HGF有可能成为防治铅以及其他病理因素引起的肾脏的损伤的一种新的策略。
参考文献
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