血清淀粉样蛋白

血清淀粉样蛋白（共6篇）

血清淀粉样蛋白 篇1

肝癌是消化系统常见癌症之一, 具有病情进展迅猛, 病死率高的特点, 因此, 早期诊断对于病情的控制具有重要意义。目前肝癌主要依靠监测甲胎蛋白 (AFP) 动态变化作出诊断, 但AFP特异性不高, 给诊断上带来一定的困难。据报道, 肝癌患者血清淀粉样蛋白A (SAA) 、α1酸性糖蛋白 (α1-AG) 水平均较良性肝病患者和健康人群显著升高, 对于肝癌的诊断具有重要意义[1,2,3,4]。本文采用免疫透射比浊法对肝癌、良性肝病患者以及健康人群血清SAA和α1-AG含量进行检测, 以探讨其临床应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

本组254例患者均为我院住院患者, 男158例, 女96例, 年龄23岁~78岁。其中, 肝癌患者138例, 肝硬化患者67例, 急性肝炎患者49例。102例健康者均为我院体检正常体检者, 肝癌患者诊断均符合国际抗癌联盟 (UICC) 肝癌诊断标准, 肝炎患者诊断均符合2000年9月西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议方案的诊断标准[5]。本研究获医院伦理委员会批准, 并与研究对象签署知情同意书。

1.2 检测方法

采集研究对象空腹静脉血5m L, 3000转r/min离心15 min, 取血清当日完成检测。SAA、α1-AG检测均采用BNP全自动蛋白分析仪 (Siemens) 及配套试剂检测;AFP采用罗氏公司的电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用方差分析和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清SAA、α1-AG检测结果比较 见表1。

注:q、P为肝癌患者与健康人对照组比较检验值, q1、P1为肝癌患者与肝硬化组比较检验值, q2、P2为肝癌患者与与急性肝炎组比较检验值。

2.2 不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平比较

不同AFP水平的2组患者SAA、α1-AG差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

3 讨论

3.1 血清SAA、α1-AG水平可用于肝癌诊断

α1-AG是肝脏分泌的一种蛋白质, 是血清黏蛋白的主要成分, 为人类血浆中含糖量最高、酸性最强的糖蛋白。作为一种急性时相蛋白, 正常人血清中α1-AG含量较低, 在感染、肿瘤发作时其浓度升高, 而在慢性肝炎、肝硬化患者血清中其含量显著降低。本文中, 肝癌患者的血清α1-AG水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) , 且健康人群血清α1-AG水平高于良性肝病患者, 与上述结论相符。

血清SAA主要由肝细胞合成, 主要功能为酶类胞外基质降解的诱导、脂类的代谢和转运以及对炎症细胞的趋化作用。本文表明, 肝癌患者血清SAA水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) ;但是良性肝病患者血清SAA水平和健康人群没有明显差异。因此, 血清α1-AG、SAA可作为诊断肝病的特异性指标。

3.2

SAA、α1-AG协同AFP检测可显著提高肝癌诊断率肝癌病情进展迅速、病死率高, 因此, 早期诊断对于病情的控制具有重要意义。但目前肝癌的诊断主要依赖于AFP, 特异性差、检出率低, 因此急需一种特异性较强的指标。SAA、α1-AG水平在不同AFP水平的肝癌患者中差异不显著 (P>0.05) , 可与AFP相互补充提高肝癌的诊断率。

综上所述, 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。

摘要：目的 探讨血清淀粉样蛋白A (SAA) 和α1酸性糖蛋白 (α1-AG) 对于肝癌诊断的临床意义。方法 采用免疫透射比浊法对138例肝癌患者、67例肝硬化患者、49例急性肝炎患者及102例健康人血清SAA、α1-AG的含量进行检测, 采用电化学发光法对肝癌患者血清AFP含量进行检测, 并对检测结果进行分析。结果 肝癌组、肝硬化组、急性肝炎组及健康人对照组血清SAA水平分别为 (16.98±2.84) 、 (3.56±0.16) 、 (3.78±0.28) 、 (3.24±0.21) mg/L, α1-AG水平分别为 (0.93±0.17) 、 (0.40±0.27) 、 (0.64±0.17) 、 (0.74±0.16) g/L。肝癌组血清SAA与α1-AG水平显著高于肝硬化组、急性肝炎组、健康人对照组 (P<0.05) ;不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平无显著性差异 (P>0.05) 。结论 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。

关键词：肝癌,诊断,淀粉样蛋白A (SAA) ,α1酸性糖蛋白 (α1-AG) ,甲胎蛋白 (AFP)

参考文献

[1]Bachtiar I, Santoso JM, Atmanegara B, et al.Combination of alpha-1-acid glycoprotein and alpha-fetoprotein as an improved diagnostic tool for hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta., 2009, 399 (1-2) :97-101.

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[3]Le L, Chi K, Tyldesley S, et al.Identification of serum amyloid A as a biomarker to distinguish prostate cancer patients with bone lesions[J].Clin Chem, 2005, 51 (4) :695-707.

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[5]成军, 张玲霞, 斯崇文, 等.第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议纪要[J].中华传染病杂志, 2001, 19 (1) :53-55.

血清淀粉样蛋白 篇2

1 对象与方法

1.1 对象

AD组30例,其中,男19例,女11例;年龄60~98岁,平均(70.21±15.26)岁;病程3~10年。全部病例均符合精神疾病诊断和统计手册Ⅳ(DSM-Ⅳ)关于AD的诊断标准,根据简易精神状态量表(MMSE)作出痴呆严重程度的判断(MMSE总分为30分,24~30分为异常,18~23分为轻度痴呆,10~17分为中度痴呆,<10分为重度痴呆)。

对照组30例,其中,男18例,女12例;年龄60~94岁,平均(69.38±13.32)岁。均为我院内科非神经系统疾病住院或门诊患者,智能检查均正常,无痴呆临床表现。

1.2 方法

采用RIA检测血清Aβ含量,抽取受检者外周不抗凝静脉血2 ml,分离血清,专用塑料试管、-20℃冰箱低温密封闭保存。用中国九鼎医学生物工程有限公司生产的β-淀粉样蛋白放射免疫测定试剂盒测定。

1.3 统计学处理

用SPSS 11.0软件对所得数据进行统计学处理,得出智能正常老年对照组与AD组患者血清Aβ含量的平均值及标准差,两组进行F检验,并比较血清Aβ含量;三组(轻、中、重)AD患者各自计算出其平均值及标准差,进行F检验,并两两比较其结果,以表明Aβ含量水平与痴呆严重程度的关系,P<0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 各组间性别、年龄、病程比较

各组间患者的性别、年龄分布、病程比较,无显著性差异(P>0.05)。

2.2 AD组与对照组Aβ含量比较

AD组和对照组血清Aβ含量分别为(1.36±0.60)μg/L和(0.72±0.26)μg/L(表1)。AD组与对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。

2.3 AD患者血清Aβ含量与疾病严重程度的关系

AD轻、中、重三组患者血清Aβ含量分别为(1.12±0.23)、(1.31±0.36)、(1.58±0.52)μg/L(表2)。三组与对照组比较,有显著性差异(均P<0.01);三个轻、中、重亚组间比较,有显著性差异(P<0.05),其他无显著性差异(P>0.05)。

与对照组比较,*P<0.01

3 讨论

由于AD与增龄有密切关系,随着人类寿命的普遍延长,AD的发病率也大大增加。AD的主要病理特征是在大脑皮层和海马出现Aβ聚集形成的老年斑(SP),Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结(NFT)以及脑皮层和海马区神经细胞减少。随着研究的逐渐深入,越来越多的证据表明Aβ在AD的发生、发展中起主导作用。Aβ的神经毒性涉及复杂的分子机制,包括破坏细胞内的Ca2+稳态、促进自由基的形成、降低K+通道的功能、增强致炎细胞因子引起的炎症反应等。

最近的一项研究通过电子显微镜固态磁共振的方法对Aβ40进行检测,结果表明,在同一区内Aβ40存在多种形态和分子结构,不同形态和分子结构的Aβ40的神经毒性有明显差异[2];还有研究证实,凝聚的Aβ无论电子显微镜下可以看到的Aβ纤维,还是电镜下缺乏可见形态的Aβ原纤维,对神经元都具有毒性[3]。但是Aβ寡聚体的毒性比Aβ纤维的毒性大很多,可以快速引起大量的神经细胞死亡[4]。另外,有研究发现,高胆固醇饮食可以呈年龄依赖性地增强Aβ的毒性作用[5]。现已明确了4种能影响APP/Aβ代谢通路,导致AD患者脑内Aβ释放增多和(或)沉积增加的基因,即APP、早老素-1(PS-1)、早老素-2(PS-2)和载脂蛋白E(apo E)基因[6]。目前发现有5种APP基因突变导致AD发生。除了APP基因突变造成的Aβ过量产生以外,Aβ自身的清除和降解代谢障碍也是Aβ沉积的重要原因。一项新的研究显示,Aβ可以抑制脑中大分子量蛋白酶的活性,从而使Aβ无法降解,这样Aβ就进入了一个沉积的恶性循环[7]。另一项针对单核-巨噬细胞的研究显示,AD患者单核-巨噬细胞对Aβ的吞噬清除能力下降,导致Aβ无法及时有效地清除,进而产生免疫反应[8]。Cardoso等[9]发现在AD患者的血小板和脑中COX发生了特异性的下降。Aβ本身可以产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),也可以通过多种途径诱导ROS的产生,使神经细胞胞质中自由基浓度升高,从而使脂质过氧化,形成脂质过氧化物,如醛基、酮基等。研究证实,APP和Aβ氧化胆固醇可以产生7β-羟基胆甾醇,7β-羟基胆甾醇可以在纳摩尔浓度即产生神经毒性,并且进一步产生氧化应激[10]。另一项新的研究表明,APP也可以通过酪氨酸激酶通路激活单核细胞和小胶质细胞,导致炎症因子的大量释放,同时引起Aβ的产生和沉积[11]。许多临床研究亦表明,AD患者血清Aβ含量明显增高,且Aβ浓度较高的患者,痴呆的临床症状较为典型[12]。

APP是一种广泛存在于全身组织细胞膜上的跨膜糖蛋白。Aβ为APP的跨膜分泌产物,AD患者淀粉样蛋白生成途径异常活跃,并在中枢神经系统聚集形成老年斑,推断AD患者血液及脑脊液中Aβ含量会发生不同的变化,为AD的一个外周生物标志物。因此,测定血液中的含量有一定的临床意义。

近年来,由于放射免疫分析技术的发展,利用免疫学上抗原抗体之间反应的高度特异性和放射性同位素检测技术的高灵敏性来测定血清中的Aβ含量,使得检测人群血清中的Aβ成为可能[13]。

血清淀粉样蛋白 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选自2010年10月~2013年9月在本院心内科住院的冠心病患者, 符合2007年中华医学会心血管病学分会不稳定型心绞痛诊断标准。其中男36例, 女26例, 平均年龄 (51.1±2.6) 岁, 随机分成两组:A组 (瑞舒伐他汀钙20 mg) 和B组 (瑞舒伐他汀钙10 mg) , 每组34人。入选者排除瑞舒伐他汀钙过敏者;肝肾功能异常者;感染性疾病;痛风;糖尿病;妊娠期、哺乳期妇女。

1.2 方法

经患者知情同意后, 分别在患者入院后次日清晨及治疗4周后复查时, 抽取空腹静脉血测定肝肾功能、血脂、血糖等常规生化检查, 另抽取空腹静脉血3 ml, 离心取血清置于-70℃冰箱中贮存待测。采用酶联免疫吸附法测定SAA水平。患者均采用抗缺血、抗血小板、抗凝、调脂治疗及对症处理, 调脂治疗根据入选组别不同分别给予瑞舒伐他汀钙每晚口服20 mg或瑞舒伐他汀钙每晚口服10 mg, 住院7~14 d出院。出院后, 持续服用瑞舒伐他汀钙共4周, 复查。

1.3统计学方法

应用SPSS 12.0软件包对数据进行分析。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两组均数间的比较采用t检验。

2 结果

2.1 治疗前两组患者一般资料比较

治疗前, A组与B组之间一般资料比较, 两组间TC、TG、HDL-C、LDL-C、SAA水平, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。

2.2 两组患者治疗前后比较

治疗前后对比, 两组患者的SAA、TC、LDL-C和TG较治疗前明显降低 (P<0.05) , A组比B组降低更显著 (P<0.05) ;两组HDL-c较治疗前均升高 (P<0.05) , A组比B组升高更显著 (P<0.05) 。见表1。

2.3 不良反应

两组患者治疗过程中没有不耐受情况, 治疗后均未见肝肾损害等不良反应。

注:*表示与治疗前相比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;**表示与治疗B组相比较, 差异有统计学意义 (P<0.05)

3 讨论

不稳定型心绞痛是冠心病的严重类型, 其病理基础是粥样斑块的不稳定。研究发现, 在人的动脉粥样硬化斑块内大多数内皮细胞、外膜巨噬细胞、平滑肌细胞及少数泡沫细胞、脂肪细胞中均有SAA m RNA表达, 发现包括SAA在内的几种炎症指标为远期心血管事件发生的预测指标[1]。瑞舒伐他汀是2002年在欧洲获得上市批准的最新他汀类药物, 其可能是通过下调细胞内胆固醇逆转运基因ABCA1和上调胆固醇合成的基因SREBP-2两种途径降低LDL-C浓度, 同时升高HDL-C, 具有治疗高脂血症的双重功效, 发挥抗动脉粥样硬化作用[2,3]。

本研究表明, 冠心病患者血清SAA浓度升高, 治疗前后对比, 两组患者的SAA及各种血脂指标较治疗前降低 (P<0.05) , A组比B组降低更显著 (P<0.05) ;两组HDL-C较治疗前均升高 (P<0.05) , 20 mg治疗组比10 mg治疗组升高更显著 (P<0.05) 。研究结果证实, 相对较高剂量瑞舒伐他汀钙可更好地降低冠心病患者SAA水平, 降低TC及LDL-C, 升高HDL-C, 发挥其抗动脉粥样硬化的重要作用, 较高剂量治疗效果更好。

参考文献

[1]Danesb J, Muir J, Ward M, et a1.Risk factors for coronary head disease and acute-phase proteins.A population-based study.European Heart J, 1999, 20 (13) :954.

[2]Rajendra R, Chandrahasa Y, Xiong D, et al.SREBPs:the crossroads of physiological and pathological lipid homeostasis.Trends Endocrinol Metab, 2008, 19 (2) :65-73.

β-淀粉样蛋白与缺血性脑血管病 篇4

1 β-淀粉样蛋白的生成、结构和功能

β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是β-淀粉样前体蛋白(β-Amyloid precurrsor protein,β-APP)的一种降解产物[1,2],在正常脑组织中及脑脊液中有微量表达,是Alzheimer病老年斑的主要成分,主要包括Aβ1-40和Aβ1-42。

1.1 Aβ的生成和降解

β-APP蛋白有3种并存的分解途径:(1)溶酶体/包涵体代谢途径。溶酶体/包涵体的蛋白酶水解Aβ两端的肽键,生成包含完整Aβ在内的C端片段。由于溶酶体蛋白酶特异抑制剂亮胰蛋白酶肽(leupeptin)不能抑制Aβ的产生,而且纯化的溶酶体中也未检测到Aβ的存在,表明Aβ不是通过溶酶体/包涵体途径生成的。(2)分泌酶代谢途径。APP有三种分泌酶水解方式。α分泌酶水解Aβ内部687Lys～688Leu之间的肽键产生一个长约687个氨基酸的可溶性APP大片段,其作用位点落在APP的Aβ区段,从而可以阻断Aβ的形成。β分泌酶水解670Met2671Asp之间的肽键,生成670个氨基酸的APP片段和带完整Aβ的跨膜C段。后者经γ分泌酶进一步酶切形成Aβ。γ分泌酶可能水解镶嵌于脂质双分子层内的AβC末端氨基酸之间的肽键,形成长度不等的Aβ片段。主要类型有Aβ1-42、Aβ143、Aβ140,正常情况下多数为Aβ40(90%),只有少量Aβ42/43产生。(3)半胱天冬蛋白酶(caspase)代谢途径。研究发现caspase蛋白酶参与体内β-APP的酶切降解,其中以caspase3的酶切活性最强。有实验证实在海马神经元内caspase3识别酶切β-APP胞内羧基末端,形成含Aβ的6.5kD长片段capp6.5和一个3kDa的C端酶切产物capp3。Aβ产生的增加反过来又可激活caspase蛋白酶原(procaspase),释放具有蛋白酶活性的caspase[3]。Aβ的生成是由β分泌酶和γ分泌酶裂解APP所产生的。

1.2 Aβ的结构与聚集

研究显示,Aβ的空间构型明显影响其聚集能力,Aβ的二级结构主要由α螺旋、β折角和β折叠组成[4]。当其二级结构以α螺旋为主时,聚集较慢,而以β-折叠为主时,聚集较快[5]。因此,Aβ聚集的核心事件是Aβ的二级结构由α螺旋向β-折叠的转化,这一转化与多种因素有关,如金属离子()、病理性分子伴侣(载脂蛋白E,淀粉样蛋白P组分)、pH值改变、氧化应激、Aβ浓度升高等。

1.3 Aβ的功能

Aβ确切的功能目前还不清楚,可能具有调节细胞生长和黏附力、建立或保持神经元之间连接的功能,是维持神经功能不可缺少的多肽。还有实验证实,Aβ对神经元具有神经营养和神经毒双重作用,低浓度的Aβ对未成熟分化的神经元表现出营养作用,随Aβ逐渐积累浓度升高,对成熟分化的神经元则呈现出神经毒性,使树突和轴突退缩,导致神经元减少或缺失[6]

2 脑缺血损伤后Aβ表达的变化

多项研究表明,脑缺血后APP表达上调,Aβ增多并且与时程及缺血面积相关,沉积于缺血梗死区周围和胆碱能丰富的区域如海马。Ho等[7]报道,再灌注6 hAβ表达无明显增加,4 d开始增加,8 d达到高峰。再灌注16 d开始下降,35 d继续下降趋于消失[8]。Edward等[9]结扎沙土鼠双侧颈动脉造成短暂性前脑缺血,48 h后Aβ在海马CA1区出现,第4天达到高峰,第7天开始下降。Yokata等[10]研究大鼠短暂性前脑缺血后发现CA1区缺血敏感性神经元中APP的一种毒性裂解片段聚集,7 d后受损神经元死亡,该片段消失。Ishimaru等[11]在沙土鼠前脑短暂性缺血5 min后海马区迟发性神经细胞死亡的研究中发现,3个月时CA1区Aβ免疫活性明显增强,6个月时最强。

3 Aβ在缺血性脑损伤中的作用和机制

在缺血性脑损伤中,对Aβ的毒性作用机制主要详述如下。

3.1 炎症机制

Aβ可以激活补体、星形胶质细胞及小胶质细胞,促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α),IL-1,IL-6及一氧化氮(NO)的表达和释放,可以引起炎症反应[12]细胞膜上有淀粉样β蛋白和载脂蛋白E受体,沉积在神经元周围的淀粉样β蛋白作用于β淀粉样蛋白受体,或通过与载脂蛋白E结合后作用于载脂蛋白E受体,使小胶质细胞活化、增殖,并过量分泌细胞因子如肿瘤坏死因子α,白细胞介素1,8,一氧化氮等介导炎症损伤。其中白细胞介素1过度表达和释放是始动环节,除上调小胶质细胞和星形胶质细胞表达细胞因子,如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、γ干扰素等之外,还诱导补体、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基、前列腺素、一氧化氮、S100β、β淀粉样蛋白前体等生成增加[3]这些分子通过作用于胶质细胞或神经元,促使其他炎症分子的产生,这种交互作用促成了慢性炎症产物分别在阿尔茨海默病病理损伤的不同阶段起作用,并贯穿其病理发展的全过程。

3.2 Aβ在迟发性神经细胞死亡中的作用

1982年Kirino[14]首次提出迟发性神经细胞死亡(delayed neuronal death,DND)的概念。完全性或不全性脑缺血再灌注损伤能导致DND,急性脑缺血后48～72 h,海马CA1区锥体细胞死亡,其过程有许多神经毒性物质参与。有研究结果显示,Aβ的表达与海马CA1区神经细胞迟发性死亡在时间上具有一致性。既往研究结果显示,细胞外谷氨酸的增加是导致DND的主要因素。脑缺血可致病变区神经元持续性去极化,大量释放Glu[15]。脑缺血时能量耗竭造成Glu能量依赖式重吸收障碍,缺血所导致的胞浆膜完整性损害造成细胞内Glu以不依赖的方式透过胞浆膜释放到细胞外液中[16],这些均可引起胞外Glu的增多。

3.3 细胞凋亡

越来越多的研究发现脑缺血再灌注损伤可诱导神经细胞凋亡[17]。哺乳动物细胞凋亡中,caspase家族具有非常重要作用,其中caspase3是细胞凋亡的关键酶和“执行者”。rupinski等[18]采用免疫组化双染证明TUNEL阳性细胞在梗死区和梗死周边区表达,与caspase表达一致。在缺血性神经损伤过程中,抑制caspase3活活性可产生明显的神经保护作用[19,20]。有研究表明,caspase3可直接作用于APP。Gervais等[21]研究结果显示,APP能被caspase3直接有效地剪切,这种剪切可被caspase3的特异性抑制剂Z-DEVD-CHO抑制caspaste3对APP的剪切破坏了细胞内APP的正常代谢过程,从而向着生成Aβ的方向进行,生成的Aβ具有神经毒性,是细胞凋亡的信号。通过刺激和活化凋亡通路中的上游caspase,经酶级联放大反应激活caspase3,从而加速APP的水解、Aβ的生成和聚集,进而促进了神经细胞的凋亡,这是一个正反馈的调节过程。

3.4 对血管舒缩功能的影响

Aβ可以增强血管的收缩性,Aβ升高后可通过去甲肾上腺素或其他内源性收缩活性物质导致神经元缺血而死亡。合成的Aβ可以使孤立的大动脉和人脑动脉收缩,削弱内皮细胞依赖的乙酰胆碱引发的血管扩张[22],Zhang等[23]用过度表达APP的转基因小鼠MCAO模型来研究缺血性脑损伤后Aβ对血管活性和血,流量的影响和机制。研究发现,Aβ降低了乙酰胆碱(ACh)对血管的活性,破坏了脑血管的调节,降低了梗死区边缘小动脉的舒张能力,阻碍了侧支循环的建立,因此使缺血半影区脑血流(CBF)明显减少,加重了缺血性脑损伤。Deane等[24]也证实Aβ可以通过内皮素-1(Endothelin-1)作用于血管内皮细胞,使血管收缩,从而降低脑血流量。

血清淀粉样蛋白 篇5

关键词：广西巴马小型猪,SAP,克隆,序列分析

血清淀粉样P物质 (serum amyloid pcomponent, SAP) 为血清正常糖蛋白, 与经典的CRP (C反应蛋白) 构成Ca2+依赖性配体结合的血清正五聚蛋白家族, 其系统发生学非常保守, 具有重要生理功能[1,2,3]。近年来, 随着分子生物学技术的发展, 对其三维结构、结合配体及与疾病的关系等方面展开了较为深入细致的研究, 表明它与机体炎症反应以及遗传性、获得性淀粉样变密切相关 [4,5,6,7] 。在炎症过程中, 许多炎症细胞因子、过敏毒素及糖皮质激素可诱导急性事相反应物 (APR) 的产生。APR具有广泛的非特异防御功能, 可以直接中和炎症物质, 降低局部组织损伤的程度, 并参与组织的修复和再生[5]。在人类, SAP虽然不是主要的APR, 但可能在局部被诱导或被不同的细胞因子所诱生而发挥重要作用。研究还发现, SAP可与所有类型的含淀粉样的原纤维结合, 并且在淀粉样沉淀中广泛存在。SAP可与细胞外淀粉样纤维结合抵抗蛋白酶作用, 保护淀粉样纤维不被降解, 因此与体内淀粉样沉淀的持续存在有关[6]。SAP还特异性地存在于动脉粥样硬化斑块, 与动脉粥样硬化的发病机理及血浆脂蛋白的代谢密切相关。

广西巴马小型猪是优良的试验用小型猪品种。研究克隆了广西巴马小型猪的SAP基因cDNA全序列, 为进一步构建广西巴马小型猪SAP基因相关疾病模型奠定了基础。

1 材料

1.1 组织样品

来自于广西大学巴马小型猪猪场封闭群的血液组织。

1.2 菌种和质粒

大肠杆菌DH5α, 广西大学动物遗传育种实验室保存;pMD18-T 载体, 宝生物工程 (大连) 有限公司生产。

1.3 酶和主要试剂

M-MLV反转录酶, Promega公司产品;琼脂糖, BIOWEST AGAROSE公司产品;胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉, 德国 OXOID公司产品 ;PCR Taq Mix和Tap酶, 广州东盛生物公司产品;DNA胶回收纯化试剂盒、微量质粒抽提试剂盒和DL-2 000 Marker, 杭州博日 (BioFlux) 生物有限公司产品。

2 方法

2.1 引物的合成

应用Oligo6.0引物设计软件, 参考GenBank报道的猪SAP基因编码区序列设计1对特异性引物 (由上海捷瑞生物有限公司合成) , 序列为上游引物5′- ACCACTGTGCTATCTGACC -3′, 下游引物5′- AATGTTTGGGATTATGAGC -3′, 包含了巴马小型猪SAP基因的cDNA全序列。

2.2 猪血液总RNA的提取

总RNA的提取按照TIANGEN生物工程有限公司生产的RNA提取试剂盒提供的方法进行。

2.3 SAP 基因的RT-PCR

2.3.1 cDNA的合成

取总RNA 5 μL, 加入5×Buffer 5 μL、dNTPs (10 mmol/L) 3 μL、RNA酶抑制剂 (40 U/μL) 1 μL、Oligo DT18 (25 μmol/L) 1 μL、M-MLV RT酶 (200 U/μL) 1 μL 、DEPC处理ddH2O 9 μL 。反转录 (RT) 程序:25 ℃ 10 min, 37 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min。

2.3.2 PCR反应

取反转录产物5 μL, 上、下游引物 (25 μmol/L) 各1 μL, 2×PCR TaqMix 12.5 μL, ddH2O 5.5 μL。反应程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性 45 s, 57.8 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 72 ℃后延伸10 min。终产物在2%琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。

2.4 SAP基因的克隆

2.4.1 PCR产物的回收、提纯

按照DNA胶回收纯化试剂盒说明书提供的方法进行。

2.4.2 目的片段与pMD18-T载体的连接

取10×Ligation Buffer 4 μL, 加入pMD18-T 载体 1 μL、纯化后产物 5 μL, 用封口胶密封, 于4 ℃过夜连接 。

2.4.3 重组质粒的转化、鉴定

将重组质粒转化到E.coli DH5α受体菌, 铺板, 挑单个菌落进行摇菌, 以重组菌液为模板, 反应体系和PCR程序同2.3.2。终产物在2 %琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。

2.5 PCR扩增产物克隆片段的测序

将PCR鉴定正确的阳性菌液交由北京诺赛生物科技有限公司和上海鼎安生物科技公司进行测序。

3 结果与分析

3.1 巴马小型猪总RNA的提取

经1%的琼脂糖凝胶 (DEPC处理) 电泳检测, 结果见图1。

1.血液RNA提取结果。

3.2 巴马小型猪SAP cDNA的RT-PCR扩增

在750～1 000 bp之间扩增出明显的单一条带, 与预期相符, 见图2。

M.DL-2 000 Marker;1, 2.SAP的RT-PCR结果。

3.3 重组质粒的PCR鉴定 (见图3)

M.DL-2 000 Marker;1～3.阳性菌液PCR产物。

3.4 序列测定

将测定结果通过DNAStar软件进行分析, 再通过Meg Align程序进行比较, 结果表明该核苷酸序列与普通猪的SAP基因区序列同源性达99.1%, 说明所克隆的片段为巴马小型猪SAP cDNA序列。序列分析还发现:广西巴马小型猪SAP cDNA的序列与普通猪相比, 在64～200 bp之间多了106个碱基, 为SAP基因的第一内含子;在537 bp处发生碱基突变, 为同义突变, 使碱基对由CTG变成CTA, 但氨基酸没有发生变化。试验克隆出的巴马小型猪SAP cDNA序列为928 bp, 见图4。

4 同源性比较分析

用DNAStar生物分析软件Meg Align程序中的Aligment Report对测序所得的巴马小型猪SAP基因编码区序列与GenBank发表的其他物种的SAP cDNA序列进行同源性比较, 结果见图5。

进化树分析结果表明, 巴马小型猪与普通猪的亲缘关系较近, 与人类的亲缘关系较远, 见图6。

5 讨论

试验将巴马小型猪SAP cDNA与其他动物进行同源性比较, 结果表明:巴马小型猪SAP cDNA序列与普通猪、人类同源性分别为99.1%、76.9%。与普通猪相比, 只有1处发生碱基突变, 在537 bp处为同义突变, 使密码子由CTG变成CTA, 但氨基酸没有发生变化。表明SAP在哺乳动物中有较高的同源性, 可能在动物的发育中发挥重要作用, 所以在动物进化过程中承受较大的选择压力, 有高度的保守性。

参考文献

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血清淀粉样蛋白 篇6

1 材料与方法

1.1 试验动物

采用200~250 g、健康雄性SD成年大鼠, 由浙江省医学科学院实验动物中心提供, 按标准大鼠饲料常规饲养。

1.2 仪器设备和试剂

Aβ25~35购自Sigma公司, Beclin1 (H-300) 兔多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology产品;Morris水迷宫 (中国医学科学院产品) 、脑立体定位仪 (NAR ISA IGE SN-2) 。

1.3 AD模型制备

SD大鼠, 经Morris水迷宫测试判定其空间辨别性学习记忆能力, 淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠, 将选出的大鼠随机分为2组, 即模型组 (AD) 、对照组 (NS) , 每组12只。AD组双侧海马区注射点 (AP-3.5mm, ML±2.0mm, DV2.7mm) [5]用微量进样器 (上海高欣玻璃仪器厂产品) 注射5μL (10μg) Aβ25~35 (聚集态的Aβ25~35形成) , 10 min内注射完毕。NS组注射等量的生理盐水。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。动物自由摄食、饮水。

1.4 Morris水迷宫行为学试验

1.4.1 定位航行试验。

水池分为N、E、S、W 4个象限。试验前一天将大鼠放入水池 (不含平台) 自由游泳2 min, 使其熟悉并适应水迷宫环境。试验历时5 d, 每天分上午 (n-1) 、下午 (n-2) 2个时间段, 每段分别训练4次。训练开始时将平台置于SW象限, 每个时段分别从池壁4个起始点将大鼠面向池壁放入水池, 记录每次找到平台的游泳路径[5]。如大鼠在120 s内找不到平台, 由试验者将其引上平台, 潜伏期记为120 s, 并记录为1次寻找站台错误, 每次间隔4 min让大鼠休息, 再进行下次试验[6,7]。

1.4.2 空间探索试验。

在第5天下午第5次训练时拆除水下平台, 然后任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中, 测其120 s内在各象限的游泳距离及占总距离的百分率, 以及120 s内跨越各象限平台相应位置次数及占总次数的百分率, 并记录大鼠120 s内搜索平台的路线图。

1.5 大鼠脑组织Beclin-1表达水平检测

免疫组化SP法检测大鼠脑组织中Beclin-1的表达:切片经二甲苯脱蜡, 酒精脱水后, 3%过氧化氢液中封闭内源性过氧化酶活性, 置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液 (p H值6.0) 中, 抗原修复后, 滴加山羊血清工作液, 封闭非特异性抗原。滴加Beclin-1多克隆抗体, 工作稀释度为1∶50, 37℃恒温箱内孵育, 4℃湿盒内过夜, 滴加生物素化二抗, 滴加链亲和素-生物素过氧化物酶复合物, DAB显色, 适时终止。苏木素复染, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 封片, 镜下观察。每批试验均设有阴性对照, 以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。染色阳性结果为细胞膜或细胞质突起着棕黄色。每只大鼠重复观察2张切片, 每张切片随机选取5个视野, 应用Image Pro Plus 5.0图像分析系统计数每个高倍 (×400) 视野阳性细胞个数, 取平均值代表每只大鼠的阳性染色强度。

1.6 统计学处理

采用SPSS16.0软件分析, 计量资料试验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 用多因素重复测量方差分析及t检验进行2组间比较。

2 结果与分析

2.1 Morris水迷宫行为学试验

2.1.1 各组大鼠在Morris水迷宫中寻找平台轨迹。

每天的游泳轨迹显示, 正常对照组第4天由随机式转为直线式 (图1) , 而模型组一直为随机式 (图2) 。研究结果表明, 海马注射β淀粉样蛋白 (25-35) 后可导致大鼠空间学习记忆能力明显下降。

2.1.2 定位航行试验不同时间的错误次数。

随着训练次数的增加, 各组大鼠寻找站台的错误次数逐渐减少[7]。由重复测量资料方差分析知, 5个时点间F=4.836 (P<0.01) , 可知5个时段错误2次;经2组间比较 (F=3.512, P<0.05) , 显示2组间错误次数差别显著。经不同时点2组间比较, 除第1天对照组低于模型组但无显著差异外 (P>0.05) , 第2~5天对照组和模型组组之间差异显著 (P<0.05) (表1) 。

(次)

注:*表示差异显著 (P<0.05) 。下表同。

2.1.3 空间探索试验。

当拆除水下平台后, 模型组大鼠大多沿池壁运动, 运动轨迹随机分布[7]。模型组大鼠在120 s内的游泳距离占总距离的百分率最低。对照组大鼠停留搜索时间较长, 游泳距离明显长于模型组 (P<0.01) (表2) 。

(%)

注:**表示与对照组差异极显著 (P<0.01) 。下表同。

在120 s内跨越各象限平台相应位置次数占总次数的百分率中, 模型组各个象限之间无显著差异 (P>0.05) 。对照组大鼠跨越SW平台位置次数最多, 游泳轨迹集中在SW, 其余象限较少 (P<0.01) , 与模型组2组间差异极显著 (P<0.01) , 具体如表3所示。结果表明, AD模型大鼠经过平台空间位置记忆的储存能力明显低于对照组。

(%)

2.2 脑组织Beclin-1表达

由图3可以看出, 模型组大鼠脑组织极少有深褐色Beclin-1阳性细胞表达, 对照组Beclin-1阳性染色为在细胞膜或细胞质内出现棕黄色颗粒, 较模型组明显增多。Beclin-1阳性细胞计数结果如表4所示, 对照组大鼠脑组织Beclin-1阳性细胞计数明显多于模型组 (P<0.05) 。模型组中Beclin-1表达下调或缺失。

注:A—模型组, B—对照组。

(±s, n=12)

3 结论与讨论

AD是一种慢性的中枢神经系统炎症反应, 包括局灶性的脑损伤和高度难溶的Aβ沉积[8,9,10]。表现为多种大脑高级功能紊乱包括记忆、思维、定向、理解、计算、学习能力、语言和判断功能的障碍。自噬是细胞维持稳态和对不良环境的一种防御机制, 参与清除细胞废物、结构重建和生长分化等, 同时自噬又参与多种疾病的病理过程, 无论是自噬过度还是不足都可导致疾病发生。随着自噬的生理机制不断被阐明, 其在阿尔茨海默病中的作用得到广泛的重视。自噬功能在AD中确切作用的研究还仅处于起始阶段。其对Aβ、tau蛋白和神经元变性死亡的作用还没有得到完全的阐明。有学者提出自噬功能具有保护作用, 但其也可能是一种致病因素。近年来的研究显示, 自噬对于致病性Aβ和细胞骨架相关tau蛋白的生成和代谢都有密切的关系。Pickford报道Beclin-1在AD病人的早期表达下降, 在APP转基因小鼠体内, 自噬可以调节AD发病机制中起核心作用的Aβ的聚集[11,12]。该验使用凝聚态Aβ25~35通过立体定位进行海马注射, 复制AD模型, 该造模方法的建模药物是在AD发病机制中起核心作用的Aβ, 且凝聚态的Aβ25~35聚集性较好, 可很好的沉积于脑局部, 因而产生的病理变化接近临床变化。

试验结果表明, AD模型大鼠在Morris水迷宫中寻找平台的轨迹始终为随机式, 寻找平台错误次数较对照组也明显增多, 且在不同象限的活动时间基本相同, 表明AD模型大鼠空间学习记忆能力明显下降[1]。与之相对应的, AD模型组大鼠脑组织内Beclin-1的表达下调和缺失。Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白 (25-35) 致神经元可塑性降低的关键环节。

AD模型大鼠学习记忆能力的下降可能与大鼠脑组织内自噬水平的降低导致的脑内炎症及脑内Aβ沉积清除减少有关[1]。可见, 脑内局部炎症与Aβ沉积既是引起AD退行性病变和痴呆的必要因素, 又可以导致AD的神经退行性变, 引起学习记忆能力的下降, 但其确切作用机制尚待进一步研究。

摘要：研究β淀粉样蛋白 (25-35) 对阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测, 观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明:模型组的学习记忆功能明显低于正常组, 模型组Beclin-1表达明显降低 (P<0.01) 。海马CA1区注射β淀粉样蛋白 (25-35) 大鼠学习记忆力下降, Beclin-1表达下调, 提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白 (25-35) 致神经元可塑性降低的关键环节。

关键词：阿尔茨海默病,β淀粉样蛋白 (25-35) ,Beclin-1

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