血清α-淀粉酶（共7篇）
血清α-淀粉酶 篇1
肝癌是消化系统常见癌症之一, 具有病情进展迅猛, 病死率高的特点, 因此, 早期诊断对于病情的控制具有重要意义。目前肝癌主要依靠监测甲胎蛋白 (AFP) 动态变化作出诊断, 但AFP特异性不高, 给诊断上带来一定的困难。据报道, 肝癌患者血清淀粉样蛋白A (SAA) 、α1酸性糖蛋白 (α1-AG) 水平均较良性肝病患者和健康人群显著升高, 对于肝癌的诊断具有重要意义[1,2,3,4]。本文采用免疫透射比浊法对肝癌、良性肝病患者以及健康人群血清SAA和α1-AG含量进行检测, 以探讨其临床应用价值。
1 资料和方法
1.1 一般资料
本组254例患者均为我院住院患者, 男158例, 女96例, 年龄23岁~78岁。其中, 肝癌患者138例, 肝硬化患者67例, 急性肝炎患者49例。102例健康者均为我院体检正常体检者, 肝癌患者诊断均符合国际抗癌联盟 (UICC) 肝癌诊断标准, 肝炎患者诊断均符合2000年9月西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议方案的诊断标准[5]。本研究获医院伦理委员会批准, 并与研究对象签署知情同意书。
1.2 检测方法
采集研究对象空腹静脉血5m L, 3000转r/min离心15 min, 取血清当日完成检测。SAA、α1-AG检测均采用BNP全自动蛋白分析仪 (Siemens) 及配套试剂检测;AFP采用罗氏公司的电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测。
1.3 统计学方法
计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用方差分析和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清SAA、α1-AG检测结果比较 见表1。
注:q、P为肝癌患者与健康人对照组比较检验值, q1、P1为肝癌患者与肝硬化组比较检验值, q2、P2为肝癌患者与与急性肝炎组比较检验值。
2.2 不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平比较
不同AFP水平的2组患者SAA、α1-AG差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。
3 讨论
3.1 血清SAA、α1-AG水平可用于肝癌诊断
α1-AG是肝脏分泌的一种蛋白质, 是血清黏蛋白的主要成分, 为人类血浆中含糖量最高、酸性最强的糖蛋白。作为一种急性时相蛋白, 正常人血清中α1-AG含量较低, 在感染、肿瘤发作时其浓度升高, 而在慢性肝炎、肝硬化患者血清中其含量显著降低。本文中, 肝癌患者的血清α1-AG水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) , 且健康人群血清α1-AG水平高于良性肝病患者, 与上述结论相符。
血清SAA主要由肝细胞合成, 主要功能为酶类胞外基质降解的诱导、脂类的代谢和转运以及对炎症细胞的趋化作用。本文表明, 肝癌患者血清SAA水平显著高于良性肝病患者及健康人群 (P<0.05) ;但是良性肝病患者血清SAA水平和健康人群没有明显差异。因此, 血清α1-AG、SAA可作为诊断肝病的特异性指标。
3.2
SAA、α1-AG协同AFP检测可显著提高肝癌诊断率肝癌病情进展迅速、病死率高, 因此, 早期诊断对于病情的控制具有重要意义。但目前肝癌的诊断主要依赖于AFP, 特异性差、检出率低, 因此急需一种特异性较强的指标。SAA、α1-AG水平在不同AFP水平的肝癌患者中差异不显著 (P>0.05) , 可与AFP相互补充提高肝癌的诊断率。
综上所述, 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。
摘要：目的 探讨血清淀粉样蛋白A (SAA) 和α1酸性糖蛋白 (α1-AG) 对于肝癌诊断的临床意义。方法 采用免疫透射比浊法对138例肝癌患者、67例肝硬化患者、49例急性肝炎患者及102例健康人血清SAA、α1-AG的含量进行检测, 采用电化学发光法对肝癌患者血清AFP含量进行检测, 并对检测结果进行分析。结果 肝癌组、肝硬化组、急性肝炎组及健康人对照组血清SAA水平分别为 (16.98±2.84) 、 (3.56±0.16) 、 (3.78±0.28) 、 (3.24±0.21) mg/L, α1-AG水平分别为 (0.93±0.17) 、 (0.40±0.27) 、 (0.64±0.17) 、 (0.74±0.16) g/L。肝癌组血清SAA与α1-AG水平显著高于肝硬化组、急性肝炎组、健康人对照组 (P<0.05) ;不同AFP水平肝癌患者血清SAA、α1-AG水平无显著性差异 (P>0.05) 。结论 肝癌患者血清SAA和α1-AG水平显著升高, 对肝癌的鉴别诊断具有重要意义。如果将SAA、α1-AG、AFP联合检测, 则可大大提高肝癌的诊断率。
关键词：肝癌,诊断,淀粉样蛋白A (SAA) ,α1酸性糖蛋白 (α1-AG) ,甲胎蛋白 (AFP)
参考文献
[1]Bachtiar I, Santoso JM, Atmanegara B, et al.Combination of alpha-1-acid glycoprotein and alpha-fetoprotein as an improved diagnostic tool for hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta., 2009, 399 (1-2) :97-101.
[2]Kim KA, Lee EY, Kang JH, Diagnostic accuracy of serum asialo-alpha1-acid glycoprotein concentration for the differential diagnosis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta, 2006, 369 (1) :46-51.
[3]Le L, Chi K, Tyldesley S, et al.Identification of serum amyloid A as a biomarker to distinguish prostate cancer patients with bone lesions[J].Clin Chem, 2005, 51 (4) :695-707.
[4]Cho WC, Yip TT, Yip C, et al.Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling[J].Clin Cancer Res, 2004, 10 (1 Pt 1) :43-52.
[5]成军, 张玲霞, 斯崇文, 等.第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议纪要[J].中华传染病杂志, 2001, 19 (1) :53-55.
α-淀粉酶的应用与发展 篇2
α - 淀粉酶是一种从微生物到高等植物广泛遍布的酶, α - 淀粉酶作为酶类的一种, 被应用于各个领域, 在医药和食品行业等更是被广泛应用。可以说随着 α - 淀粉酶的更多研究与提取方式的高效发展, 其被应用的行业也会随之产生进步, 而目前大规模生产 α - 淀粉酶的方法是微生物发酵法, 虽然说α - 淀粉酶在植物和动物中也能够提取, 但是自从第二次世界大战后抗生素出现, 微生物发酵法也成为了大规模生产的主流。
1 α - 淀粉酶的诞生与应用
100 年前, 人类就根据酶制品的特殊性质在食品工业方面进行应用。各类的酶制剂有很多种, 可以说酶制剂在食品工业中发挥着无可取代的作用。而最近的几十年在食品工业方面, α - 淀粉酶主要被广泛应用于烘焙工业中, 主要是用于面包的加工, 起到的作用很大, 比如能增加面包的体积, 面质松软可口, 通过对面包组织结构的改善, 改变其柔软度与外表光泽, 还能够提高面包的保质期和保鲜期, 酶类特殊的作用更是能够提高面包的发酵速度。在食品工业中, 尤其是烘焙产业中, α - 淀粉酶主要是从大麦麦芽以及各种真菌和细菌中提取的, 虽然说在1995 年美国就已经批准 α - 淀粉酶可以用于烘焙工业了, 但是真正证实其安全性却是在1963 年由英国证实, 到如今, 关于 α - 淀粉酶在食品工业的应用已经在全球展开。
在清洁行业, α - 淀粉酶也有着很好的作用。在社会飞速发展的今天, 清洁剂与人类生活息息相关的, 过去人们没有良好的清洁剂, 使用自动刷碗机进行清洁, 但是由于需要用到高温, 容易使清洁剂产生有害物质, 这会导致损害人的身体, 还会对陶瓷、木质的餐具产生一定的损伤, 但是 α - 淀粉酶由于其温和无害的性质, 加入到清洁剂中也会将这一特性延展, 并且清洗时不需要用到高温, 而且清洗效果很出众, 现如今的洗衣粉中就有着 α - 淀粉酶的加入。如今 α - 淀粉酶几乎应用到了大部分的清洁剂中。
在造纸工业中, α - 淀粉酶一直是改良纸张涂层淀粉的重要物质。造纸工业各个环节层层紧扣, 纸的质量就是极其重要的一环, 而在提升纸质环节, 在加工方面将纸张上涂抹淀粉就是相当重要的, 这种涂抹的浆糊有着很好的保护纸张表面的作用, 可以使其免受机器加工的损伤, 同时也能将纸质进行改良, 使纸张的硬度和受用度都能得到提高。但是人们平时所用的淀粉却有着很高的局限性, 比如浓度太高, 在这种情况下, 就需要加入 α - 淀粉酶来对淀粉进行降解, 使其浓度能够达到造纸工业的标准。当然, 制作不同类型的纸张需要的淀粉浓度是不同的, 对于 α - 淀粉酶的需求也不同。所以在造纸工业上, 如何能够将 α - 淀粉酶进行最为有效的利用也是关键。
在生物工程行业, α - 淀粉酶也有着广泛的应用。由于近几年来生物工程发展迅猛, α - 淀粉酶在此领域的应用价值也被逐渐挖掘出来, 主要是被应用在医药和临床行业。在医药方面, α - 淀粉酶主要用于助消化剂和一些有助消化的药物, 因为其特有的耐酸性, 再经过适当的开发会非常适合胃酸性环境。在临床方面, 目前已有的进展是将 α - 淀粉酶开发为液体稳定试剂应用于全自助生化分析仪临床化学系统, 而且已经取得了一定成效。
2 α - 淀粉酶的发展展望
α - 淀粉酶在我国的应用开始于1965 年, 刚开始只有一家厂家生产这种酶类, 到了1967 年, 才将应用真正实现, 主要还是用于制药行业, 比如葡萄糖。我国将 α - 淀粉酶更多的应用与其他领域是在20 世纪80 年代后, 在酒精发酵、酱油制造等方面都应用了 α - 淀粉酶, 并且沿用至今。
根据 α - 淀粉酶的本身性质不同, 分别有耐热性、耐碱性、耐酸性的 α - 淀粉酶。耐热性 α - 淀粉酶主要是应用在食品工业, 微生物发酵法是主要的提取方法, 随着技术的进步, 这种淀粉酶会越来越被高效的利用, 成本也会逐渐降低; 耐碱性 α -淀粉酶主要应用于清洁剂、洗涤剂等, 目前已经延伸到了纺织工业、人造棉、垃圾处理等领域; 耐酸性 α - 淀粉酶在制药行业有着很好的用处。但是目前来说, 其本身提取比较困难, 成本相当昂贵, 所以关于耐酸性 α - 淀粉酶的制备是很重要的。
α - 淀粉酶已经成为工业应用中不可或缺的一部分, 关于其研究也在有条不紊的进行中。虽然说如今生物工程技术不断发展, 其用于制药方面的作用也与日俱增, 但是在食品工业以及清洁剂领域同样有着很重要的地位, 而且相信随着时间的推移, 将会被应用于更多的领域, 为人类社会的进步作出更大的贡献。
摘要：α-淀粉酶在自然界中是广泛存在的, 在微生物、高等植物的体内, 都可以寻找到α-淀粉酶的身影。随着人们对这一物质的研究, α-淀粉酶开始在医药和食品行业得到了广泛的应用。主要针对α-淀粉酶的应用与发展进行分析。
关键词：α-淀粉酶,应用,发展
参考文献
[1]钱莹, 段钢.新型耐酸真菌淀粉酶在麦芽糖生产上的应用[J].食品与发酵工业, 2008 (2) .
[2]纪建海, 王彦霞, 闵伟红.谷朊粉和真菌α-淀粉酶在面粉中的应用前景[J].粮食加工, 2006 (2) .
血清α-淀粉酶 篇3
α-淀粉酶 (1, 4-α-D-glucan-glucanhydrolase, EC3.2.1.1) 是一种淀粉水解酶, 它催化多糖内部α-1, 4葡萄糖苷键的水解, 水解产物保留α-异头物构型。大多数α-淀粉酶是金属酶, 其催化活性、结构完整性及稳定性需要Ca2+的存在。α-淀粉酶是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一, 在食品、纺织、医药和饲料等工业中都有非常重要的应用。目前, 淀粉酶已经占据了世界所有酶制剂产量的30%[1]。迄今为止, 国内外已经有相当多关于淀粉酶的研究报道。近些年来, 具备特殊性质的α-淀粉酶受到越来越多的关注。研究人员通过克隆表达技术获得一些耐酸[2]、耐碱[3]、耐高温[4]的α-淀粉酶, 并对其性质进行了初步研究。为了更多地发掘这些性质特殊的α-淀粉酶, 研究人员把研究重点放在从极端环境中筛选获得特殊菌种[5,6,7], 而对于在某些性质更具优势的芽孢杆菌来源的α-淀粉酶研究较少[8]。本研究应用基因重组技术, 克隆了来源于B.amyloliquefaciens DMS 7的α-淀粉酶基因, 并在大肠杆菌中进行了诱导表达, 对该基因产生的α-淀粉酶的酶学性质进行了分析研究, 为后续的研究奠定基础, 同时对于包涵体的高效变性复性策略进行了初步探索研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens DSM 7) 、大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21 (DE3) 、表达载体p ET-22b (+) 均为作者实验室保藏。
1.1.2 试剂
Ex Taq DNA聚合酶、核酸限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ, T4DNA Ligase、DNA Marker、Protein Marker购自Ta KaRa公司产品;质粒提取试剂盒、凝胶回收纯化试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自美国OMEGA公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;Na N3、Triton X-100、Glycine、L-Arginine、考马斯亮兰R-250等购自Solarbio公司;Urea购自上海生工生物工程有限公司。
TE缓冲液:1 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris-HCl, p H 8.0。
裂解缓冲液:0.5 mol/L Na Cl, 20 mmol/L Tris-HCl, p H 8.0。
包涵体洗涤缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 5 mmo/L EDTA, 0.1%NaN3, 0.5%Triton X-100, pH 8.0。
包涵体溶解缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L Glycine, 8.5 mol/L Urea, pH 8.0。
透析复性缓冲液:0.1 mol/L Tris-HCl, 0.4 mol/L L-Arginine, 4.0、2.0、1.0、0 mol/L Urea, p H 8.0。
1.1.3 仪器设备
广州市博造机械设备有限公司HNY-310C恒温培养箱;美国BIO-RAD公司S1000TMPCR仪, Gel Doc XR+凝胶成像系统, Mini P-4电泳系统;上海金鹏分析仪器有限公司RDY-SP1Z型水平电泳仪;苏州净化设备有限公司SW-CJ-2FD型超净工作台;德国EPPENDORF EPORATOR电转化;仪宁波新芝生物科技scientz-ⅡD超声波细胞粉碎机;德国Heraeus台式离心机Pico&Fresco型超速冷冻离心机。
1.1.4 培养基
LB培养基:按照《分子克隆实验指南》配置。需要时添加终浓度为100μg/m L氨苄青霉素 (AMP) 。
1.2 方法
1.2.1 细菌基因组DNA的提取及质粒DNA的快速提取
按照OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒及质粒DNA提取试剂盒说明书进行。
1.2.2 α-淀粉酶基因 (amy) 的克隆及重组质粒p ET22b-amy的构建
根据NCBI已公布的Bacillus amyloliquefaciens DSM 7全基因组序列 (Gen Bank No.FN597644.1) 中α-淀粉酶基因序列设计引物。上游引物P1:5’-GGAATTCCATATGAATG-GCACGCTGATGCAGTATTTTG-3’, 下划线为NdeⅠ酶切位点, 下游引物P2:5’-CCGCTCGAGTTTCTGAACATAAATG-GAGACGGAC-3’, 下划线为XhoⅠ酶切位点。以Bacillus amyloliquefaciens DSM 7基因组DNA为模版, 以P1、P2为上下游引物, 用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增不包含信号肽序列的结构基因amy。PCR扩增条件:94℃5min;94℃30s, 55℃30s, 72℃1min30s, 循环数30;72℃8min。取PCR产物电泳, 电泳分离并切胶回收大小为1 500bp左右的片段。回收纯化后与提取的质粒p ET-22b (+) , 分别用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切, 酶切产物经纯化回收后, 用T4DNA连接酶于16℃连接过夜, 构建重组质粒p ET22b-amy, 连接反应完成后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 氨苄抗性平板筛选阳性转化子, 转化子提取质粒, 分别进行PCR和双酶切鉴定, 鉴定正确的质粒送上海生工生物工程公司测序。
1.2.3 工程菌BL21/p ET22b-amy的构建及α-淀粉酶的诱导表达
取构建好的重组质粒p ET22b-amy转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) , 转化液均匀涂布于氨苄抗性平板上, 37℃培养过夜, 形成单菌落。随机挑取单菌落, 接种至10 m L的LB液体培养基中, 37℃振荡培养过夜, 然后按1%接种量转接于装有100 m L LB培养基的500 m L三角瓶中继续振荡培养3~3.5h, 直至OD600约为0.6时, 加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导3h后, 8 000 r/min冷冻离心3min, 所得菌体沉淀用TE缓冲液洗涤2次后, 同条件离心得菌体。
1.2.4 包涵体的制备
将菌体重悬于裂解缓冲液中, 冰浴下进行超声破碎。破碎策略:3s工作, 5s间歇, 99个循环, 400W功率。破碎完成后, 11 000 r/min冷冻离心30min得到粗包涵体。取粗包涵体, 加入适量包涵体洗涤缓冲液, 充分重悬, 用移液器反复吹打洗涤, 11 000 r/min冷冻离心10min收集沉淀, 重复洗涤3次, 最后一次洗涤时包涵体洗涤缓冲液不含Triton-X100。称取适量洗涤后的包涵体重悬于100 mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L Glycine, p H 8.0的缓冲液中, 吹匀, 以边滴加边搅拌的方式溶于包涵体溶解缓冲液中, 并将浓度调整至1.0 mg/m L。4℃搅拌溶解过夜, 11 000 r/min冷冻离心15min, 除去不溶物, 收集上清进行复性操作。
1.2.5 包涵体的透析复性
将去除杂质的上清液装入透析袋中 (孔径14 k Da) , 依次用含有4.0、2.0、1.0 mol/L尿素和不含尿素的透析复性缓冲液于4℃进行搅拌透析, 每个浓度梯度透析12 h。
1.2.6 SDS-PAGE分析及α-淀粉酶活力测定
蛋白质浓度测定:采用Bradford法, 以牛血清白蛋白BSA作为标准。SDS-PAGE (分离胶浓度为10%, 浓缩胶浓度为5%) , 检测蛋白的表达情况。α-淀粉酶活力测定采用Yoo[9]改良法进行。
1.2.7 α-淀粉酶结构性质的生物信息学分析
通过在线生物信息学软件, 对α-淀粉酶的一些结构性质进行了预测, 包括α-淀粉酶的二级结构 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 、疏水性分 (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 及三维结构 (http://swissmodel.expasy.org/) , 相关预测结果为后续的研究奠定基础。
2 结果与分析
2.1 α-淀粉酶基因 (amy) 的PCR扩增与pET22b-amy表达载体的构建
采用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒提取解淀粉芽孢杆菌基因组DNA, 然后以基因组DNA为模板, 通过PCR扩增获得淀粉酶基因, 电泳结果显示得到大小约1 500 bp的DNA片段 (图1) 。将PCR扩增的amy基因序列双酶切后插入到表达载体pET-22b (+) 中, 构建重组质粒p ET22bamy, 双酶切重组质粒鉴定结果表明成功连接上目的基因 (图2) 。经测序, 克隆的淀粉酶基因序列与Gene Bank解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列一致。
注:M:250 bp DNA Ladder Marker;1、2:α-淀粉酶基因PCR产物。Note:M:250 bp DNA Ladder Marker;1, 2:PCR products of amy gene.
注:M1:λ-HindⅢdigest DNA Marker;M2:250 bp DNA Ladder Marker;1、2:质粒p ET22b-amy双酶切产物。Note:M1:λ-HindⅢdigest DNA Marker;M2:250 bp DNA Ladder Marker;1, 2:Enzyme digest products of p ET22b-amy.
2.2 α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的诱导表达
转化子E.coli BL21 (DE3) 于LB培养基上培养适当时间, 加入IPTG进行诱导表达3 h, 离心收集菌体, 菌体重悬后经超声破碎处理, 离心分离上清液和沉淀并分别测定酶活及进行SDS-PAGE分析。酶活测定结果表明, 经IPTG诱导的重组菌的细胞破碎液上清及沉淀均无α-淀粉酶活性。SDS-PAGE电泳结果见图3, 在相对分子量54.8 k Da附近出现了明显的蛋白表达条带 (泳道3) , 与理论推导的淀粉酶分子量相一致。在此诱导条件下, α-淀粉酶以包涵体形式表达, 灰度分析表明其含量达到总蛋白的74% (泳道3) 。
注:M:Marker;1、2:对照组细胞破碎总蛋白;3:诱导细胞破碎总蛋白;4:诱导细胞破碎离心上清;5:诱导细胞破碎离心沉淀;6、7:洗涤后的沉淀;8、9:包涵体透析复性产物。Note:M:Marker;1, 2:Total cellular protein of control group;3:Total cellular protein of induced group;4:Centrifuged supernatant of induced group;5:Centrifuged precipitate of induced group;6, 7:Precipate after being washed;8, 9:Refolding products of isolated inclusion bodies.
2.3 包涵体的制备及透析复性
细胞破碎液沉淀经含有适量表面活性剂Triton X-100的包涵体洗涤缓冲液反复洗涤几次后, 得到较为纯净的包涵体 (图3泳道6、7) 。将包涵体重悬于100 mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L Glycine, p H 8.0的缓冲液中并调整至合适的浓度, 以缓慢滴加的方式溶于含8.5 mol/L尿素的包涵体溶解缓冲液中, 4℃搅拌溶解过夜, 离心除去不溶物, 采用不同尿素浓度的复性缓冲液进行透析, 每个梯度透析12 h, 缓慢除去变性剂, 促使变性的蛋白质重新折叠成具有活性的天然蛋白质空间结构。透析完成后, 进行α-淀粉酶活性测定及SDS-PAGE电泳分析。透析复性及酶活测定结果见表1。SDS-PAGE电泳显示在相对分子量54.8 k Da附近出现非常明显的蛋白条带 (见图3泳道8、9) 。
2.4 α-淀粉酶结构性质的生物信息学分析
通过生物信息学软件, 本研究对α-淀粉酶的一些结构性质进行了预测, 包括α-淀粉酶的二级结构 (见图4) 、疏水性分析 (见图5) 及三维结构 (见图6) , 相关预测结果为后续进一步研究奠定基础。图4显示, 该α-淀粉酶的二级结构包含较多的α螺旋及β片层结构, 且β片层结构多集中在C末端。亲水性/疏水性分析 (图5) 显示, 该α-淀粉酶由较多亲水性氨基酸组成, 最终可能会表现出较强的亲水性。三维结构分析 (图6) 表明, 该α-淀粉酶具有糖苷水解酶13家族的典型结构特征, 包含A、B、C三个结构域, 结构域A由 (β/α) 8桶 (TIM barrel) 、N末端和活性位点组成[10];结构域B、C位于结构域A的两侧, 构成底物结合区域, 并被认为对于不同α-淀粉酶的底物特异性差异具有重要意义[11];图中的4个黑色小球代表的是Ca2+的结合位点。
3 讨论
本研究中, 通过PCR扩增得到了解淀粉芽孢杆菌DSM 7α-淀粉酶基因全长序列, 其序列由96bp信号肽序列和1 446bp结构基因组成, 将去除信号肽序列的结构基因插入p ET-22b (+) 表达载体成功地在大肠杆菌中进行了表达。SDS-PAGE电泳分析结果显示重组蛋白表达量非常高, 占细胞总蛋白的74%, 但是基本上都以包涵体形式存在。曾尝试通过优化IPTG浓度、诱导温度及摇床转速等诱导条件提高可溶性表达水平, 但效果不明显。柳辉等[12]、施碧红等[13]将α-淀粉酶基因克隆p ET表达载体, 转入大肠杆菌中进行表达, 同样出现了包涵体表达的问题。包涵体表达曾被认为是非常不合需求的、蛋白表达的死胡同[14], 但是越来越多的研究表明, 包涵体可以通过一系列精密的溶解、重折叠和纯化等程序恢复活性。已有研究报道中采用了多种策略进行复性研究[15,16,17,18], 如透析法、柱上复性法、稀释法等, 虽然成功复性了一些包涵体, 但仍存在复性步骤复杂、复性效率较低等问题。本研究通过一种简单的透析复性方法, 成功复性了α-淀粉酶包涵体, 获得了具有活性的α-淀粉酶, 复性效率为22.78%, 酶活测定显示其酶活力为102.4 U/m L。这与谢光蓉等[19]、王彩澜等[20]在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶达到的酶活力相比, 有一定差距, 可能与表达宿主不太合适有关。后续工作准备将此基因转入枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌中进行分泌表达。本研究成功克隆及表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶, 并建立了一种简单高效的透析复性方法, 为后续的研究工作奠定了基础。
摘要：[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达, 建立有效的透析复性方法, 获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板, PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因, 克隆至p ET-22b (+) , 转化E.coli BL21 (DE3) , IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况, 采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白, 相对分子量约为54.8k Da, 成功复性包涵体, 复性效率为22.78%, 重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达, 包涵体经透析法成功复性, 获得具有催化活性的重组淀粉酶。
血清α-淀粉酶 篇4
关键词：稻芽,炮制品,α-淀粉酶活性,比色法
稻芽(稻芽)为禾本科植物稻Oryza sativa L.的成熟果实经发芽干燥而得。中国药典收载了其生稻芽、炒稻芽及焦稻芽等常用的3种炮制品具有的不同功效:生稻芽具有和中消食,健脾开胃的功效,用于食积不消,腹胀口臭,脾胃虚弱,不饥食少;炒稻芽偏于消食,用于不饥食少;焦稻芽善化积滞,用于积滞不消[1]。目前关于稻芽不同炮制品的α-淀粉酶活性的研究,尚未见国内外有相关文献的报道。本研究采用国家标准《谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定比色法》[2]中的方法,对稻芽加热炮制前后3种炮制品的α-淀粉酶活性进行了研究,为探讨其炮制机制提供实验依据。
1实验材料
1.1 仪器
UV-9200双光束紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);AR1140型分析天平(上海力衡仪器仪表有限公司);HHD-2型电热恒温水浴锅(无锡沃信仪器有限公司)。
1.2 试药
稻谷购于长沙市望城县黄金乡,经湖南中医药大学药学院杨梓懿教授鉴定为禾本科植物稻Oryza sativa L.的成熟新鲜干燥果实;试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1 不同炮制品的制备[3]
2.1.1 生稻芽
取新鲜成熟而饱满的净稻子,用清水浸泡至六七成透,捞出,置能排水的容器(竹匾)内,覆盖,每日淋水1～2次,保持湿润,2、3 d后待须根长至1 cm时,取出干燥,除去杂质。
2.1.2 炒稻芽
取净生稻芽置炒制容器内,用文火加热,炒至表面深黄色,大部分暴裂,并有香气逸出时,取出晾凉,筛去灰屑。
2.1.3 焦稻芽
取净生稻芽置炒制容器内,用中火加热,炒至表面焦黄色,大部分暴裂,并有焦香气逸出时,取出晾凉,筛去灰屑。
2.2 α-淀粉酶活性的测定[2]
2.2.1 试液的配制
碘贮备液的制备称取11.0 g碘化钾溶于少量水中,加入5.50 g结晶碘,搅拌至碘完全溶解,定容至250 ml,置于棕色瓶中,在暗处贮存即可。碘稀释液的制备,称取40.0 g碘化钾溶于水中,加4.00 ml碘贮备液,并稀释至1L即得(用时现配,不可过夜)。缓冲液的制备,称取164 g无水乙酸钠溶于水中,加入120 ml冰乙酸,用水定容至1000 ml,即得。β-淀粉酶溶液的制备 称取10 g有酶活性的黄豆粉(过六号筛),加入85 ml水和15 ml 0.05 mol/L硫酸充分搅匀,静置15 min,抽滤,滤液即为β-淀粉酶溶液。
β-极限糊精溶液的制备,称取5.00 g可溶性淀粉于小烧杯中,加入约20 ml水混匀,将其边搅拌边缓慢倒入盛有100 ml沸水的500 ml烧杯中,并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至烧杯中,继续搅拌并加热,缓慢煮沸2 min。加盖表面皿,在自来水中冷却至30 ℃以下,加入25 ml缓冲溶液及50 mlβ-淀粉酶溶液,在室温下放置20 h,加入1勺浮石粉,将此溶液在10 min之内缓慢煮沸,然后继续沸腾5 min以上。冷却至30℃以下,用水定容至250 ml,摇匀,过滤。滤液中加几滴甲苯,此溶液的pH值应为(4.7±0.1),在25℃以下可连续使用5 d。
2.2.2 供试品溶液的制备
称取稻芽炮制品样品粉末(过二号筛)约5 g(精确到0.05 g),倒入300 ml锥形瓶中,加入预热到30℃的0.2%氯化钙溶液100 ml,充分摇匀,置于30 ℃水浴中,在15、30、45 min时从水浴中取出,上下颠倒锥形瓶10次,重新置于水浴,共提取60 min。取出,过滤,即得α-淀粉酶供试品溶液。
2.2.3 α-淀粉酶活性的测定
空白调整吸取0.2%氯化钙溶液2.0 ml加到10.0 ml稀碘溶液中,然后以适量的水(V0)稀释,混匀后达到20℃,在分光光度计下575 nm处测定,调整其吸光度为零。
底物溶液的校准,分别吸取5.0 mlβ-极限糊精溶液和15.0 ml 0.2%氯化钙溶液于100 ml烧杯中,混匀。吸取2.0 ml混合液至另一100 ml烧杯中,加入10.0 ml稀碘溶液及适量的水,混匀置于20℃水浴中,在波长575 nm处,按上述“空白调整”的溶液为参比,测其吸光度。调整加水量,使测得的吸光度在0.55～0.60之间,记下此时的加水量V0,并用它调整空白溶液的加水量,V0即为该β-极限糊精测试时的加水量。
活性测定,将供试品溶液和β-极限糊精溶液分别置于30℃水浴中,10 min后快速吸取5.0 ml β-极限糊精溶液至盛有15.0 ml供试品溶液的锥形瓶中,加塞后摇匀。在加液的同时,用秒表计时。吸取10.0 ml稀碘溶液于各个50 ml量瓶中,加入水V0 ml,混匀加塞后置于20℃水浴中,每隔5 min或10 min进行下列操作:吸取2.0 ml混合液到一个盛有10.0 ml稀碘溶液和V0 ml水的50 ml量瓶中,摇匀后置于水浴,使之达到20 ℃后,测其吸光度(见表1),并按公式(1)计算α-淀粉酶活性,结果见表2。
式(1)中:A--α-淀粉酶活性,U;
m-100 ml氯化钙提取的试样质量,g;
h-试样中水分含量,%;
f-酶提取液的稀释倍数;
t1、t2-不同的反应时间,min;
D1、D2-时间t1、t2时的吸光度;
b-lgD对t曲线的斜率的绝对值。
将表2结果通过SPSS 17.0软件分析可知,稻芽各炮制品的α-淀粉酶活性具有显著性差异。稻芽经加热炮制后,其α-淀粉酶的活性随加热程度的增加而降低。
3讨论
本研究采用国家标准《谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定比色法》[2]中的方法,本法准确可靠、简便可行,可广泛用于发芽类炮制品中α-淀粉酶活性的测定。
通过对稻芽3种炮制品α-淀粉酶活性的比较,发现生稻芽酶活性最高,随加热炮制程度的增加,而α-淀粉酶活性降低。可证实稻芽、麦芽等经炒制后开胃消食作用增强,不是由其淀粉酶起主要作用。
参考文献
[1]中国药典委员会.中国药典.北京;化学工业出版社,2010:352.
[2]国家标准.谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定比色法(GB/T5521-2008).国家标准化管理委员会,2008.
血清α-淀粉酶 篇5
1 仪器与材料
山楂(市售),α-淀粉酶(湖南尤特尔生化有限公司提供),60%乙醇溶液(V/V),蒸馏水,3,5-二硝基水杨酸试剂(取3,5-二硝基水杨酸1.0 g,溶于20 ml的1 mol/L氢氧化钠中,加入50 ml蒸馏水,再加入30 g酒石酸钾钠),麦芽糖,淀粉,pH梯度缓冲溶液(用0.2 mol/L Na2HPO4与0.1 mol/L柠檬酸按比例配制)。
2 方法与结果
2.1 山楂提取物的提取
2.1.1 麦芽糖标准曲线的制作
应用DNS法[5,6]以光密度值OD为纵坐标(Y),麦芽糖含量为横坐(X)标绘制标准曲线。结果显示,麦芽糖标准曲线为Y=7.664 1X-0.057 3,r=0.993 5,线性关系良好。
2.1.2 山楂提取物的提取
准确称取2 g山楂粗粉,用12倍量60%的乙醇在90℃下各回流提取2次,每次1 h,合并提取液,过滤,浓缩干燥,得到山楂提取物。
2.2 山楂提取物对α-淀粉酶促反应影响的单因素试验
2.2.1 山楂提取物浓度对α-淀粉酶活性的影响
将山楂提取物用10倍稀释法稀释成浓度依次为0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1、0.000 01、0 mg/ml溶液,在试管中按表1条件依次加入试剂,并加入不同稀释梯度的山楂提取物0.2 ml进行反应,同时以0.2 ml蒸馏水取代山楂提取物在相同条件下进行酶促反应作为空白对照,每个反应重复3次。结果显示,在山楂提取物浓度为0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1、0.000 01、0 mg/ml时α-淀粉酶活性分别为(608.43±2.70)、(514.33±3.44)、(489.37±2.38)、(458.75±4.51)、(439.27±3.24)、(437.36±3.68)mg/(g·5 min),表明加入的山楂提取物对α-淀粉酶活力有明显的促进作用,且随着山楂提取物浓度的降低,促进作用减弱,山楂提取物对α-淀粉酶活性最适浓度为0.1 mg/ml。
2.2.2 温度对山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影响
按照表1的条件,加入浓度为0.1 mg/ml的山楂提取物,pH为6.0,酶促反应温度分别控制为25、30、40、50、60℃,考察山楂提取物存在下不同温度条件对α-淀粉酶酶促反应的影响,每个温度条件重复3次,结果取均值。结果显示,在以上温度下α-淀粉酶活性分别为(582.14±6.31)、(603.56±4.58)、(678.87±7.49)、(545.43±8.55)、(610.33±5.56)mg/(g·5 min),结果表明在山楂提取物存在下α-淀粉酶活性最高的温度为40℃。
2.2.3 pH大小对山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影响
按照表1的条件,加入浓度为0.1 mg/ml的山楂提取物,反应温度为60℃,分别用pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲液配制酶液和山楂提取物,考察山楂提取物存在下不同pH条件对α-淀粉酶酶促反应的影响,每个pH条件重复3次,结果取均值。结果显示,在以上pH条件下α-淀粉酶活性分别为(175.62±4.24)、(581.33±3.75)、(620.12±1.36)、(539.57±7.61)、(675.72±2.82)mg/(g·5 min),表明α-淀粉酶作用的最适pH为7.0。
2.3 山楂提取物对α-淀粉酶促反应影响的正交试验
根据单因素试验结果,按照表2设计正交实验因素水平表,摸索最佳酶促条件。正交实验结果,见表3。
由表3可知,影响酶活的因素重要性依次为pH>山楂提取物浓度>温度。促进α-淀粉酶活力的最佳组合为A2B1C1,即pH为6.8,温度为40℃,加入稀释5倍的山楂提取物,即相当于加入生山楂量∶α-淀粉酶=88.900∶0.001,α-淀粉酶活力最高。
按照A2B1C1条件进行验证试验,平行3次,酶活力分别为687.521、685.241、688.275 mg/(g·5 min),平均酶活力为687.021 mg/(g·5 min),证明酶促反应实验的重复性好,酶活力高。
3 讨论
由于被动大量摄入谷物类、高蛋白类食物所致的食物结构不合理现象在婴幼儿中显得很突出,导致消化不良现象经常发生,由此引发了一系列的消化道疾病,因此,如果以消肉食的山楂和消化谷物类的α-淀粉酶制备成复合消化剂,可以同时解决蛋白质和淀粉类食物的消化不良问题。
作为生物催化剂的α-淀粉酶的活性受到很多因素的影响,其中最大的影响是pH值。添加了山楂提取物后,对其合适添加量的确定及温度也很重要。正交试验优化了这三个因素的影响。Ga2+对α-淀粉酶活性具有促进作用,本实验中对Ga2+浓度进行了试验,发现Ga2+浓度的变化不是主导因素。通过合理的工艺设计,可以将本实验中优化的配方与条件进行规模化生产。
本实验得到的最优条件是将山楂用12倍量60%的乙醇在90℃下回流提取2次,每次1 h,将滤液减压浓缩干燥既得山楂提取物;山楂提取物与α-淀粉酶的复合制剂配方为pH为6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解酶,温度不超过40℃,山楂提取物添加量为20%浓度,此配方可以制备成服用方便的口服液。
摘要：目的:通过了解山楂提取物对α-淀粉酶活性的影响获得山楂提取物与α-淀粉酶的复合制剂配方原则。方法:通过正交实验法研究不同山楂60%乙醇回流提取物浓度、反应温度、pH对α-淀粉酶活性的影响。结果:pH 6.8、温度40℃、加入20%的山楂提取物的α-淀粉酶反应活性最高。结论:该试验结果为山楂α-淀粉酶复方制剂的配制提供了有价值的配方和配方条件。
关键词：山楂提取物,α-淀粉酶,正交实验法,复合制剂
参考文献
[1]董英杰,张乃先,张明磊,等.大果山楂叶黄酮成分研究[J].沈阳药科大学学报,1996,13(1):31-33.
[2]张培成,徐绥绪.山楂叶化学成分研究[J].药学学报,2001,36(10):754-757.
[3]英锡相,李绍维,林延会,等.山楂叶植物学及化学成分研究近况[J].辽宁中医学院学报,2001,3(2):98-99.
[4]王慧超,陈今朝,韩宗先.α-淀粉酶的研究与应用[J].重庆工商大学学报:自然科学版,2010,27(4):368-372.
[5]田芳年,马连荣,莫肖云,等.DNS法测定红枣总糖含量[J].化工技术与开发,2009,38(9):45-47.
血清α-淀粉酶 篇6
α-淀粉酶是酿酒大曲中的重要指标, 也是大部分酒厂衡量大曲质量的指标。酱香型白酒固态发酵过程中, 耐高温α-淀粉酶能在55℃甚至更高温度下继续分解粮食中的淀粉, 提高粮食利用率。而在液态白酒生产过程中加入耐高温α-淀粉酶, 采用“中温蒸煮”法, 有利于浓醪发酵并稳定出酒率, 提高基酒的质量[5]。目前我国的白酒行业存在的问题是粮耗高, 以及粮食利用率不高等问题, 因此提高白酒原料利用率和产品质量将是今后白酒行业发展的重要方向。研究以前期从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象, 利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出高产α-淀粉酶的菌株, 以期提高基酒的质量和白酒原料利用率。
1 材料与方法
1.1 材料
酱香型高温大曲:由河南省驻马店市某酒厂提供。
培养基:淀粉琼脂筛选培养基 (牛肉膏0.5%, 蛋白胨1%, 氯化钠0.5%, 可溶性淀粉2%, 琼脂粉2%, 121℃, 灭菌20 min) ;种子液培养基 (牛肉膏0.5%, Na Cl 0.5%, 可溶性淀粉0.5%, 蛋白胨1%, 调p H 7.0) ;基础发酵培养基 (麸皮10 g, K2HPO40.02 g, Mg SO40.02 g, KNO30.3 g, 水6 m L) ;斜面保藏培养基 (牛肉膏5 g, 蛋白胨10 g, Na Cl 5 g, 琼脂20 g, 水1 L, p H7.0, 1×105Pa, 灭菌20 min) 。其他试剂均为分析纯试剂。
仪器:LDKM-40KCS立式压力蒸汽灭菌锅, 上海申安医疗器械厂;SHP-250FE智能生化培养箱, 上海三发科学仪器有限公司;ZWY-240恒温振荡培养箱, 上海智城分析仪器有限公司;SW-CJ-2FD超净操作台, 苏州苏洁净化设备有限公司;JB5374-91电子天平, 梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司;PHS-3C精密p H计, 上海仪电分析仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 α-淀粉酶透明圈初筛和酶活复筛
将初期已筛选得到的8株产酱香细菌分别接种到种子液培养基上进行活化, 37℃培养18~20 h, 然后分别稀释涂布于淀粉琼脂筛选培养基上, 置于50℃恒温培养箱中培养48 h后, 挑出各菌株的单菌落平板, 用卢氏碘液喷洒染色至碘液将平板覆盖均匀, 静置1 min, 产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株。最后挑选出产生透明圈的菌株, 测定菌落直径 (D1) 和透明圈的直径 (D2) , 并计算其HC值 (D2/D1) 。根据各菌种透明圈的大小, 初步评价各菌株产淀粉酶的能力[6]。
将初筛菌种接种到种子培养基中, 37℃, 160r/min, 摇床培养12 h。按照5%的接种量将种子液接到三角瓶固料培养基中, 50℃培养48 h。称取3.0 g固体发酵物, 置于100 m L容量瓶中, 用水定容, 混匀后在室温 (30℃) 下放置20 min, 每隔3min振荡1次, 最后用滤纸过滤, 取滤液测其淀粉酶活性[7,8]。
固体发酵α-淀粉酶酶活力测定:采用3, 5-二硝基水杨酸显色法[9]。麦芽糖标准曲线见图1。
1.2.2 高产α-淀粉酶菌株鉴定
菌落形态观察及生理生化鉴定, 参照《伯杰细菌鉴定手册》[10]。另外对该菌株进行分子生物学鉴定, 菌体总DNA的提取[11]:菌株基因组用Sigmen Bacteria DNA Kit提取, 具体操作步骤按照试剂盒附带的说明书进行。16S r DNA测序由南京金瑞斯生物工程有限公司完成。将测序结果与NCBI中的BLAST结果对比, 用Neighbor-Joining[12]构建目标菌的系统发育树。
1.2.3 高产α-淀粉酶菌株产酶发酵条件研究
通过单因素试验, 分别研究不同氮源 (尿素, 硫酸铵, 硝酸铵, 黄豆, 蛋白胨) 、不同碳源 (高粱, 麸皮, 可溶性淀粉, 葡萄糖) 、初始p H值 (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) 、不同接种量 (3%, 5%, 7%, 9%, 11%, 13%, 15%) , 不同发酵时间 (24、36、48、60、72、84、96 h) 对产酶的影响, 将目标菌株活化后, 按5%的接种量接入250 m L三角瓶基础发酵培养基。培养到最优产酶时间后, 测定发酵液的淀粉酶活性, 再进一步通过正交试验法确定最优发酵培养基。
2 结果与分析
2.1 高产α-淀粉酶酶活菌株的筛选
前期已从高温大曲中筛选得到8株产酱香的细菌, 对8种菌透明圈的大小进行了比较, 其中GX05的比值较大, 为1.49。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低, 但不能完全代表菌株产酶能力, 因此又通过固态发酵复筛测定酶活, GX05菌株酶活最高, 固态发酵酶活为66.55 U/g, 与初筛结果一致见表1。
2.2 菌种鉴定结果
从形态观察看该菌菌落大小适中, 中央有突起, 圆形, 规则, 颜色呈灰白色, 不透明。显微镜观察菌体特征是杆状, 革兰氏阳性菌, 其部分生理生化特征见表2。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌的描述, 初步确定GX05为芽孢杆菌类。
16S r DNA序列是细菌鉴定的重要指标, 已成为现代细菌分类的重要手段。本研究通过扩增菌株GX05的16S r DNA序列, 得扩增结果;将该片段用NCBI的Blast软件进行核苷酸同源性比对, 得出其分类地位的系统发育树。系统发育树见图2, 菌株扩增结果见图3。该菌株与Bacillus pseudomycoides DSM 12442T相似度为99%, 综合形态学及生理生化试验结果, 可以初步判定GX05为假蕈状芽孢杆菌。
2.3 单因素优化结果
2.3.1 不同氮源对酶活的影响
保持碳源不变, 选取不同的氮源, 接种5%的种子液于发酵培养基中, 测定α-淀粉酶酶活力, 结果如图4所示, 其中以尿素为氮源时淀粉酶活力最高, 硫酸铵次之, 因此选择尿素为最佳氮源。
2.3.2 不同碳源对酶活的影响
在最佳氮源确定后, 改变固体发酵培养基中的碳源, 当以葡萄糖为碳源加入固体发酵培养基培养48 h时, 酶活力最高, 其他碳源对酶活力的增加效果不明显。最终选择葡萄糖为最佳碳源, 如图5。
2.3.3 初始p H的影响
选用上述优化好的碳源和氮源, 调节培养基的初始p H, 在其他成分及培养条件不变的情况下测定发酵24 h的酶活力, 其中当初始p H为6.0时, 有利于产生α-淀粉酶, 此时产酶活力最高。因此选择发酵初始p H为6.0, 见图6。
2.3.4 不同接种量对酶活的影响
经优化后的培养基, 按照不同比例的接种量3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%, 接入种子液, 50℃培养52 h后测定酶活力。结果如图7所示, 接种量为11%时酶活力为最好。随着菌体接种量的增大, 培养基的消耗速度也在加快, 这样不利于产物的合成, 因此接种量为11%最合适。
2.3.5 不同发酵时间对酶活的影响
结合已经确定的最佳发酵条件, 通过调整不同的发酵时间24、36、48、60、72、84、96 h后, 对酶活力进行测定。由图8可知, 产酶适宜发酵时间为60~84 h, 在此时间范围内, 产酶能力逐渐增强, 并且在72 h时酶活力达到最高, 但是72 h过后, 产酶能力增速放缓, 因此确定发酵时间为72 h。
2.4 正交试验
综合以上各单因素试验结果, 选定尿素为最佳氮源, 葡萄糖为最佳外加碳源, 选择p H (A) 、接种量 (B) 、发酵时间 (C) 设计3因素3水平的L9 (33) 正交试验 (表3) , 试验结果见表4。
依据正交试验的直观分析结果, 3个因素对α-淀粉酶酶活力的影响大小依次为:发酵时间 (C) >p H (A) >接种量 (B) , 其中发酵时间对淀粉酶酶活的影响较为显著。由表4可知, 4号试验组组合酶活力大小最高, 为175.99 U/g。由均值K得出的最佳组合为A2B3C2, 即p H值为6, 接种量13%, 培养时间72 h。在此条件下进行验证试验, 酶活为180.12 U/g。由表5正交试验方差分析可知, 发酵时间对发酵产物α-淀粉酶酶活的影响显著, p H值和接种量对试验的结果没有显著性影响。
注:*表示对酶活影响显著 (P<0.05)
3 结论
从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象, 利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株, 酶活为66.55 U/g, 经鉴定为假蕈状芽孢杆菌属 (Bacillus pseudomycoides) 。同时对该菌株产酶条件进行研究, 最适条件为外加碳源为葡萄糖, 外加氮源为尿素, 初始p H6, 接种量13%, 培养时间72 h, 此时酶活可以达到180.12 U/g。国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等[13]从土壤中筛选出1株能产2种α-淀粉酶的脂肪芽孢杆菌, 测定其发酵液酶活为70 U/m L。卢涛等[7]分离到1株产α-淀粉酶的凝结芽孢杆菌, 经过诱变筛选后发酵液酶活达100 U/m L。李习等[6]从白云边高温大曲中筛选出1株高产α-淀粉酶活力的地衣芽孢杆菌, 并利用该菌制备功能性强化麸曲模拟酒厂的固态发酵过程, 通过气相色谱分析得到加入该菌株强化麸曲的基酒的出酒率高, 总酸和总酯含量也较高。
血清α-淀粉酶 篇7
关键词：血清淀粉酶,同工酶,多态性,藏羊
血清淀粉酶 (Serum amylase, AMY是一种水解多糖分子α-1, 4糖苷键的内淀粉酶, 属于一种α-淀粉酶。家畜血清淀粉酶的多态性最早由Ashton在牛中报道的。当时他将其命名为线蛋白 (Theread protein) [1], 以后才证实它是一种AMY[2]。尽管Fechther在1986年已经提出绵羊AMY存在9种电泳表型[3], 但以后对绵羊AMY多态性的研究很少。直到19世纪80年代, Pοжkов及其同事对有蹄动物AMY进行了比较电泳研究[4,5], 提出了有蹄动物AMY有AMY1AMY2和AMY3 3种同工酶的见解。在国内虽然有不少人研究绵羊遗传多态性, 但有关青海刚察县泉吉乡藏羊AMY方面的研究报道并不多见。鉴此我们对青海刚察县藏羊进行了血清淀粉酶多态性的研究, 为刚察藏羊的生化遗传多态性研究增加了血清淀粉酶同工酶方面的资料。
1 材料与方法
1.1 试验动物
从青海省刚察县泉吉乡种羊场随机选取藏羊84只 (全部临床健康) , 试验藏羊终年在海拔高度3 300 m以上地区放牧饲养。
1.2 样本采集
于清晨出牧前从藏羊颈静脉采集血液5 mL, 以3 000 r/min离心分离出血清, 并保存备用。
1.3 电泳
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法分离AMY变异体。电泳时所用的分离胶浓度为70 g/L, 浓缩胶浓度为3.5 g/L。分离胶缓冲系统为pH8.9的Tris-柠檬酸纳缓冲液。浓缩胶缓冲系统为pH6.8的Tris-柠檬酸纳缓冲液。电极缓冲液系统为pH9.0的硼砂-硼酸缓冲液。凝胶均按100∶2的比例加入75 g L的可溶性淀粉溶液.电泳时起始电压为160V, 15 min后转为200 V, 稳压电泳4 h。
1.4 孵育和显色
将电泳胶板分别放在pH5.0 0.15mol/L的加钙和不加钙的醋酸-醋酸钠缓冲液, 37℃水浴中孵育1 h, 再用稀碘溶液显色, 不着色的区带为AMY活性区。
1.5 AMY型判定
根据AMY泳动速度, 从阳极到阴极在最前头的区带为AMY1, 在最后面的区带为AMY3, 在中间的区带为AMY2。
1.6 数据分析
根据AMY有3种同工酶, AMY2受一对等位基因AMY2A和AMY2O的支配, AMY2A对AMY2O呈显性。AMY2O等位基因频率q等于实测AMY2O表型频率的平方根, 即q=姨R。等位基因AMY2A的基因频率按公式:p=1-q计算。藏羊AMY2表型的地区差异用χ2检验统计分析。
2 结果
2.1
青海刚察藏羊AMY按电泳速度从阳极到阴极依次有AMY1, AMY2和AMY3 3种同工酶。AMY1呈单态, 是泳动速度最快的一条区带, 在有钙离子和没钙离子的孵育液中都显现酶活性。AMY2存在多态性, 其泳动速度居中, 在没有钙离子的孵育不显现酶活性, 据此可分为显现酶活性的AMY2A和不显现酶活性的AMY2O 2种表型。AMY3位于分离胶的起始部呈单态 (图1) 。
注:1.AMY2O 2.AMY2A 3.AMY2O
2.2 青海刚察藏羊AMY2的表型频率和基因频率
见表1。
3 讨论
3.1
本试验结果表明青海刚察藏羊的AMY存在AMY1, AMY2和AMY3 3种同工酶, AMY2同工酶只有在加钙离子的孵育液中显现酶活性。AMY1和AMY2同工酶只有一条活性区带, 呈单态。AMY2有显现酶活性的AMY2A和不显现酶活性的AMY2O 2种表型, 表现出多态性, 该结果与张才骏等[6]在夏×藏一代羊中、三角城藏羊、治多藏羊、达日藏羊、青海细毛羊、引入青海的新疆细毛羊中的研究结果一致, 表明刚察藏羊AMY存在3种同工酶AMY1、AMY2和AMY3, AMY2同工酶存在两种表型即AMY2A和AMY2O。Poжков等[4]通过淀粉凝胶电泳和丙烯酰胺凝胶电泳的比较研究, 指出绵羊的AMY存在AMY1, AMY2和AMY3 3种同工酶, 并指出这3种同工酶都呈单态, 但AMY2只有39%的绵羊呈显现酶活性, 由此认为尽管绵羊AMY2呈单态, 仍可分为-/-, -/+和+/+三种基因型, 后两种基因的表型是显现酶活性。本试验在青海刚察藏羊中的研究结果支持Poжков关于绵羊AMY存在3种同工酶, 即受3个位点的基因控制的假设。然而我们通过试验证实绵羊AMY2位点受一对等位点基因AMY2A和AMY2O的支配, 其中AMY2A对AMY2O呈显性。因此显现酶活性的AMY2A表型应包括AMY2O/AMY2A和AMY2A/AMY2A两种基因型, 不显现酶活性的AMY2O是AMY2O/AMY2O基因型。本次试验结果还跟Fechthe[3]提出的绵羊AMY由A, B, C, AA, AB, AC, BB, BC和CC九种表型构成多态性的结论;伊镇华等[10]提出的绵羊AMY受AMY1, AMY2, AMY3, AMY4, AMY5和AMY6 6个等位基因点控制的假设不一致。
3.2
由试验数据得出刚察藏羊AMY2A和AMY2O的基因表型频率是27.38%和72.62%, AMY2A和AMY2O基因频率分别是0.1478和0.8522。将基因表型频率和基因频率分别带入公式h2+2hk+k2, 其结果都等于1。表明藏羊AMY2的多态性服从Hardy-Weinberg定律:h2+2hk+k2=1。
3.3
根据Gebicke-Hǎrter等在牛中的研究报道AMY1和AMY3在没有钙离子的孵育液中也能显现酶活性, 而AMY2必须在有钙离子的孵育液中显现酶活性。我们在本次实验中的结果与他们研究结果相同。由此提示利用不同的缓冲液系统研究羊AMY同工酶的多态性时可以用加钙离子的方法将能同时测出AMY1, AMY2和AMY3, 并能将它们区分开。
3.4
张才骏等提出藏羊AMY2位点两种表型分布与海拔高度无任何关系, 在他们研究的3个羊群中治多藏羊和达日藏羊生活地区海拔高度在4 000m以上, 三角城藏羊生活地区海拔高度在3 200 m以上。本次试验的刚察藏羊生活地区在3 300 m以上, 将青海刚察藏羊与以上三角城藏羊、治多藏羊、达日藏羊相比较差异不显著 (表3) , 与张才骏等得出的结论相一致。
只、%
参考文献
[1]张才骏, 李成魁, 卢福山, 等.夏×藏一代羊血清淀粉酶活性及同工酶.青海畜牧兽医杂志, 1999 (6) :3～5
[2]张才骏, 李军祥, 高福卿, 等.青海藏羊血清淀粉酶多态性的研究.青海畜牧兽医杂志, 1994 (5) :7～9
[3]张才骏, 张武学, 张贞林, 等.青海细毛羊血清淀粉酶的多态性研究.中国养羊, 1994 (4) :22～25
[4]张才骏, 张武学, 刘从明.引入青海的新疆细毛羊生化遗传多态性的研究.Ⅳ.血清淀粉酶.青海畜牧兽医学院学报, 1995 (1) :10～25
[5]张才骏.岩羊血液生化遗传多态性的研究.中国动物检疫, 2001 (12) :25～27