淀粉水解酶（共8篇）
淀粉水解酶 篇1
利用α-淀粉酶和糖化酶双酶协同作用把淀粉液化、糖化步骤合二为一，一步实现淀粉到葡萄糖的转化，可简化工艺过程，提高生产效率。但淀粉是一种多晶高聚物，其颗粒由结晶区和非晶区(无定形区)构成，淀粉的结晶结构使淀粉酶无法直接作用于原淀粉。研究新技术手段破坏淀粉结晶结构，提高化学反应活性，实现无蒸煮液化、糖化，是研究者感兴趣的问题。机械活化(Mechanical Activation)是一门新兴交叉边缘技术，是指固体物质在摩擦、碰撞、冲击、剪切等机械力作用下，使晶体结构及物化性能发生改变，使部分机械能转变成物质的内能，从而引起固体的化学活性增加。机械活化应用于淀粉的双酶水解研究少有报道。本文采用高效液相色谱对机械活化木薯淀粉双酶水解组分进行分析探讨，以对淀粉水解糖成分进行进一步的阐述。
1 试验材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪，G1311A四元泵，示差折光检测器，Agilent HPLC2D色谱工作站;葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖(均为色谱纯)，北京康林科技有限责任公司;乙腈(色谱纯，0.45μm滤膜过滤)，Fisher公司;超纯水(0.45μm水性滤膜过滤);木薯淀粉，工业级，广西明阳生化科技股份有限公司;α-淀粉酶，BR，广东环凯微生物科技有限公司(酶活力为2000U/g);糖化酶，BR，北京奥博星生物技术有限责任公司;DF2101B集热式恒温磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂;HZ010t恒温振荡水槽，上海市试验仪器总厂;802B离心机，上海安亭科学仪器厂;机械活化装置，参见文献6。
1.2 色谱条件
色谱柱：大连依利特Hypersil NH2柱(5μm, 250mm×4.6mm i.d.);流动相：乙腈/水=70/30 (V/V);柱温：30℃;流速：1.0mL/min;压力：5.3MPa。
2 试验内容与结果
2.1 标准曲线绘制
准确称取葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖适量于5mL干净容量瓶中，以超纯水溶解并定容至刻度。分别取2、4、6、8、10μL进样，进样时经0.45μm针头过滤器过滤，得HPLC图。
1.葡萄糖2.麦芽糖3.麦芽三糖4.麦芽四糖
计算峰面积，做图，得标准曲线方程，分别为(Y为峰面积，X为浓度)：
葡萄糖：Y=7573.17X+516.18
麦芽糖：Y=7479.58X-6822.37
麦芽三糖：Y=7593.63X-3195.0
麦芽四糖：Y=6610.3X-5762.25
2.2 双酶协同作用糖化液的制备
分别称取原淀粉(沸水浴糊化15min)和活化60min淀粉样品(沸水浴糊化15min/不糊化)配成浓度7.2mg/mL的淀粉溶液。取20mL上述淀粉溶液分别注入20mm×200mm带刻度的试管中，加入5mL pH值4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，将试管放入55℃恒温水浴振荡器中振荡预热10min，然后同时加入5Uα-淀粉酶和25U糖化酶，反应30min后，立即取出在沸水中加热15min灭酶终止反应，冷却后离心。离心液经0.45μm滤膜过滤，取5μL进样做色谱分析。
2.3 试验数据与分析
对木薯淀粉双酶水解液进行液相色谱分析，结果如图2所示。
计算峰面积，由标准糖曲线方程，计算各组分的含量，结果见表l。
1.葡萄糖2.麦芽糖3.麦芽三糖4.麦芽四糖
由表1可知：糊化木薯原淀粉、糊化与未糊化的活化60min木薯淀粉双酶作用下水解液中的葡萄糖含量依次为12.37%、21.24%、18.55%，活化淀粉水解成分中葡萄糖含量均较高，这主要是经机械活化处理后淀粉分散性更好，水溶性提高，与酶能更充分接触反应，证实机械活化处理对淀粉有强烈的活化影响作用。
3 结论
(1)淀粉的双酶协同水解，可以得到较高的葡萄糖成分，低聚糖的成分减少，说明糊精和低聚糖大部分转变成葡萄糖。
(2)活化淀粉未经糊化处理也能达到较好的水解作用，这为淀粉不经糊化直接进行酶解工艺提出了创新可行性。
机械活化应用于淀粉酶解具有广阔的研究前景，它有望突破以往淀粉水解所必须的糊化、液化、糖化的固有思路，为淀粉水解及淀粉糖系列产品、乳酸、酒精等的生产提供新思路，开拓了一个崭新的研究领域，从而为开发淀粉水解新工艺、创新淀粉水解新方法提供了理论基础。
参考文献
[1]Mitsura Monma, Yoshihiro Yamamoto, Norio Kagei, et al.Raw starch digestion by-amylase and glucoamylase from chalara para-doxa[J].Starch, 1989, 41 (10) :382-385.
[2]Nebesny E.Changes of carbohydrates and molecular structure of dextrins during enzymatic liquefaction of starch[J].Starch, 1992, 44 (10) :398-401.
[3]邓宇.淀粉化学品及其应用[M].北京:化学工业出版社, 2002.
[4]Renata C B, Bozena R, Salah L, et a1.Degradation of chitosan and starch by360kHz ultrasound[J].Carbohydrate Polymers, 2005, 60 (2) :175-184.
[5]Gunaratne A, Hoover R.Effect of heat-moisture treatment on the structure and physicochemical properties of tuber and root starches[J].Carbohydrate Polymers, 2002, 49 (4) :425-437.
[6]胡华宇, 黄祖强, 童张法, 等.双酶协同水解机械活化玉米淀粉的研究[J].粮油加工, 2008 (6) :92-96.
[7]Huang Z Q, Lu J P, Li X H, et al.Effect of mechanical activa-tion on physico-chemical properties and structure of cassava starch[J].Carbohydrate Polymers, 2007, 68 (1) :128-135.
[8]胡华宇, 关欣婵, 张清丽, 等.木薯淀粉酸化机械活化复合变性制备糊精的研究[J].粮油加工, 2010 (9) :76-79.
[9]胡华宇, 黄祖强, 童张法, 等.机械活化木薯淀粉无液化直接糖化的研究[J].粮油加工, 2008 (9) :97-100.
淀粉水解酶 篇2
一实验目的：
（1）通过实验，了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基本原理；
（2）掌握淀粉酶解法制备淀粉糖浆的实验方法，
（3）熟悉淀粉水解产品的葡萄糖值测定方法。
一 实验原理
发酵生产中，部分产生菌不能直接利用淀粉。也基本上不能利用糊精作为碳源。因此，当淀粉作为原料时，必须现将淀粉水解成葡萄糖才能共发酵使用。在工业上将水解淀粉为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化”。可用来制备淀粉水解糖的原料很多，主要有山芋，玉米，小麦，等含淀粉的原料。水解淀粉为葡萄糖的方法有三种，即酸解法，酶解法，酶酸法及双酶法。本实验采用的是双酶法将淀粉水解成葡萄糖。首先利用的是α-淀粉酶将淀粉液化，转化为糊精及低聚糖，使淀粉可溶性增加；接着利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解，转化为葡萄糖。
二 实验器材
1，实验材料
玉米粉 α―淀粉酶（u／g） 糖化酶（50000 u／g） 碘液（11g碘加22gkl，用蒸馏水定容至500ml）
2，仪器设备
恒温水浴槽 真空泵 抽滤纸及布氏漏斗 比色卡、
四实验方法：
淀粉在常温下不溶于水，但当水温至53℃以上时，淀粉的物理性能发生明显变化。淀粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性，称为淀粉的糊化
淀粉糊化温度必须达到一定程度，不同淀粉的糊化温度不一样，同一种淀粉，颗粒大小不一样，糊化温度也不一样，颗粒大的`先糊化，颗粒小的后糊化。
取50克淀粉置于400毫升烧杯中，加水200毫升，搅拌均匀，配成淀粉浆，用5% Na2CO3调节pH=6.2―6.3，加入1毫升5%CaCL2溶液，于90-95℃水浴上加热，并不断搅拌，淀粉浆由开始糊化直至完全成糊。加入液化型α---淀粉酶1克，不断搅拌使其液化，并使温度保持在70℃。然后将烧杯移至电炉加热到95℃至沸，灭活10分钟。过滤，滤液冷却到55℃，加入糖化酶1克，调节pH=4.5，于60-
大学网65℃恒温水浴中糖化3-4小时，即为淀粉糖浆，若要浓浆，可进一步浓缩。三 操作步骤
50克淀粉置于400毫升烧杯中，加水100毫升，搅拌均匀，配成淀粉浆，用5% Na2CO3调节pH=6.2―6.3，加入1毫升5%CaCL2溶液，于90-95℃水浴上加热，并不断搅拌，淀粉浆由开始糊化直至完全成糊。加入液化型α---淀粉酶1克，不断搅拌使其液化，并使温度保持在70℃。然后将烧杯移至电炉加热到95℃至沸，
灭活10分钟。过滤，滤液冷却到55℃，加入糖化酶1克，调节pH=4.5，于60-65℃恒温水浴中糖化3-4小时，即为淀粉糖浆，若要浓浆，可进一步浓缩。
1，液化：称取50g玉米粉与烧杯中，加水至100ml，用纯碱调节PH到6.2-6.4，再加入适量的氯化钙。使钙离子浓度达到0.01mol�uL，并加入一定量的α-淀粉酶（控制5-8u�ug淀粉） ，搅拌均匀后加热至65℃，保温1.5h’左右，用碘液检验，达到所需的液化程度后升温到100℃，灭菌5-10min
2，碘液检验的方法：在洁净的比色卡上滴入1-2滴碘液，再滴待检的液化液，若反应液呈橙黄色或棕红色即液化完全。
3，糖化：将上述的液化液冷却至60℃，用10％柠檬酸调解PH至4.0-4.5按100u／g淀粉的量加入糖化酶，并于55-60％保温糖化至糖化完全。糖化结束后升温至100℃，灭酶5min。
淀粉水解酶 篇3
高分子或颗粒态有机物因相对分子质量较大不能透过细胞膜, 而不能为细菌直接利用, 它们在水解阶段被细菌胞外酶分解为小颗粒。例如纤维素被纤维素酶水解为纤维二糖与葡萄糖, 淀粉被淀粉酶分解为麦芽糖和葡萄糖, 蛋白质被蛋白酶水解为短肽和氨基酸。这些小分子的水解产物能够溶于水并透过细胞膜为细胞所利用。因此, 水解酸化主要用于改进废水的可生化性, 为废水的有效处理创造良好的条件, 研究表明水解过程尤其是难降解物质的水解过程通常比生物生长过程慢, 因此被认为是含高分子有机物或悬浮物废液厌氧降解的限速阶段, 特别是脂类在20℃以下的转化速率非常慢[1,2]。所以水解反应的研究在废水处理中具有广泛而重要的应用价值。一般认为有机物水解降解途经为:首先水解反应器中的大量微生物将进入水中的颗粒物质、胶体物质和大分子物质迅速截留和吸附, 即生物吸附过程, 截流下来的物质吸附在水解污泥的表面, 在大量水解细菌的作用下将大分子、难于生物降解的物质转化为易于生物降解的小分子物质后, 大部分重新释放到溶液中, 在较大的水力负荷下随水流移出系统。
尽管水解酸化废水处理技术已研究和应用多年, 但多是对工艺流程、工艺参数等实际应用技术的研究, 旨在针对废水处理过程的水解机理的研究却非常有限[3]。水解机理的研究主要是集中在食品发酵领域[4,5,6]或化学、生物学科目的教学实验中[7,8,9,10], 对动力学过程研究较少涉及, 而且在水解机理研究中较少有人将吸附作为胞外酶水解的前提步骤进行分析, 对吸附研究的文章多数是从等温吸附热力学角度进行吸附剂类型、影响因素、反应条件以及对重金属吸附等方面的研究[11,12,13,14,15], 动力学研究涉及较少。本文将着重从动力学角度研究淀粉水解过程中不同阶段吸附、水解、降解的动力学方程。
本文实验以可溶性淀粉为基质, 吸附过程中淀粉颗粒被吸附到污泥表面, 溶液中的淀粉浓度降低。在吸附的同时, 在污泥表面同时发生水解反应, 淀粉水解酶将淀粉逐步水解:淀粉→糊精→麦芽糖→葡萄糖, 水解最终产物葡萄糖一部分进入细胞内部, 被微生物吸收降解产生新细胞和能量, 大部分水解产物 (包括部分中间产物) 重新回到溶液中, 同时水解污泥又吸附淀粉在其表面, 当吸附达到最大值时, 达到吸附平衡即动态平衡。因此, 本研究将按生物吸附、淀粉水解和生物降解3个步骤进行分析。
2 实验材料及方法
2.1 接种污泥
取自贵州牛羊肉生产厂的生产废水处理站调节池。
2.2 实验试剂
可溶性淀粉、重铬酸钾、邻菲罗啉、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、硫酸银、硫酸、磷酸二氢钾、硝酸钠、碘、碘化钾。
2.3 仪器
FA2104S电子天平、CT4D离心机、UV7500分光光度计、SA31振荡机。
2.4 实验方法
重铬酸钾法—微波快速消解法测定COD。碘显色法测定淀粉浓度。
配制浓度为1 000 mg/L左右的淀粉溶液, 分别装在250 mL的烧杯中。淀粉溶液体积为150 mL, 每个烧杯中加入50 mL的水解污泥, 在振荡器上振荡不同时间后, 通过离心机离心, 取上清液测溶液中的淀粉浓度和COD。
2.5 实验安排
根据文献资料和本实验的探索性实验, 本实验进水淀粉浓度为1 000 mg/L左右, 分别采用反应时间150 min、间隔5 min采样1次和反应时间24 min、间隔3 min采样1次, 以研究水解反应全过程和重点研究吸附阶段的动力学方程。
3 结果和讨论
3.1 实验结果
根据上述实验安排进行实验得出结果, 分别用溶液中COD浓度和淀粉浓度 (用COD表示) 表征出来 (
图1、2) 。
3.2 实验分析
3.2.1 实验分析的假设和数据的物料衡算
在研究水解污泥水解反应动力学之前, 首先进行以下假设: (1) 水解污泥对淀粉的捕捉和吸附是瞬间进行的。 (2) 系统运行的温度恒定。因为许多系数是温度的函数, 为了考虑温度随时间的波动, 应该以速率的有关表达式详细表述此项功能。 (3) pH值恒定而且接近中性。尽管pH值影响许多系数, 但很少有表达式可用来表达这种影响, 因此假定pH值恒定。 (4) 在反应初始阶段没有考虑淀粉的生物降解, 即假设速率表达式中的系数是恒定值。 (5) 模型中没有考虑N、P、其他物及营养物对有机物质的去除及细胞生长的限制, 有足够的无机营养物保证生长平衡。 (6) 水解污泥的菌种在反应中不发生改变。以上假设表示本试验不考虑底物浓度梯度、反应器构造等对污泥性能的影响。
本实验的主要测试数据为不同反应时间的淀粉浓度和COD, 需要对数据进行处理, 以得到所需要的淀粉吸附量、水解量和降解量。下面对溶液中的COD进行物料平衡计算。
COD进水= COD溶液+COD吸附 (1)
COD溶液= COD淀粉+COD水解 (2)
COD进水= COD总淀粉 (3)
COD溶液为实验过程中在取样时间测定的溶液COD。
3.2.2 吸附动力学研究
主要研究淀粉水解过程中的吸附平衡过程吸附反应速率的动力学方程拟合。水解污泥对淀粉的吸附过程是一个动态过程, 目前, 针对活性细菌的吸附机理和速率而建立描述吸附反应速率的动力学方程有很多, 本文将采用Lagergren的一级吸附速率方程, 其表达式为:
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线性整合后为:
log (undefined
二级吸附速率方程表达式为:
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线性整合为:
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方程式中qeq和q分别表示在吸附平衡和时间t时水解污泥吸附淀粉的吸附量 (mg/g) , k1, ad是此阶段的吸附常数 (1/min) , k2, ad是二级吸附常数 (g/ (mg·min) ) 。这两个方程已经用在许多吸附体系中, 如藻类等[16]。
通过前述水解污泥的水解淀粉过程可以看出, 在反应时间为24 min时淀粉的减少量趋于零, 说明吸附过程趋于平衡, 而27 min之后淀粉的减少率增加, 说明由于水解作用的滞后性, 水解继续进行淀粉的吸附平衡被打破, 进而在30～60 min之间达到水解和吸附的动态平衡。但是30 min后生物的降解作用影响逐渐加剧, 淀粉吸附的数据与水解、降解的数据拆分逐渐困难。因此, 本文对水解污泥的淀粉吸附过程的动力学研究假定反应24 min时达到吸附平衡, 在此过程中主要发生吸附和水解过程, 忽略淀粉水解产物 (葡萄糖) 的生物降解过程。
下面进行吸附动力学方程拟合。
一级吸附速率方程拟合结果:
log (qe-q) =2.452 2-0.079 5 t
qe=283.70 mg/g k1, ad=0.183 1/min
R2=0.958 3
二级吸附速率方程拟合结果:
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R2=0.984 9
通过分析可知, Lagergren一级吸附速率方程和二级吸附速率方程都可以拟合吸附平衡过程, 而二级吸附速率方程的相关系数 (R2=0.984 9) 优于一级吸附速率方程的相关系数 (R2=0.958 3) 。Lagergren一级吸附速率方程描述的是准一级反应过程, 与真一级反应速率不同, 在拟合图中lnqe项有时不等于直线的截距, 二级吸附速率方程的优点是在拟合时不需要用到平衡吸附量, 而用它的线性方程又可以计算平衡吸附量, 这为平衡吸附量不好确定的吸附体系提供了方便。
3.2.3 胞外酶水解动力学研究
确定水解反应的模型可以通过多项式拟合的方法, 在反应条件的参数输入后, 确定了模型参数, 再将其带入模型。即在反应参数确定后, 使模型的参数模型也得到确定, 可通过多项式的形式, 给出在该条件下反应时间对水解度的关系图。对于一组数据{ (Xi, Yi) , i=1, 2, …, N}, 若希望采用多项式模型对数据组进行描述, 且拟合目标是对于形
如y (x) =f (a, x) =a1xn+a2xn-1+…+anx+an+1的n阶多项式模型, 求取参数a1, a2, …, an, an+1使得离差量最小。模型多项式的阶次取得太低, 拟合就粗糙;阶次太高, 拟合过头, 将使数据的噪声也被纳入模型, 因此在拟合过程中要判断模型多项式的阶次是否取得合适。本研究中在进水淀粉浓度为1 000 mg/L的条件下进行水解反应, 对淀粉水解度 (%) 和反应时间t通过多项式形式进行拟合。
首先估计参数的离差, 然后确定多项式阶数 (图5) ;拟合结果见图6, 有:
A =[-0.000 2 0.01 -0.192 4 1.528 2 0.508 8]
DA =[0.000 3 0.012 7 0.196 9 1.057 1 1.597 9]
则四阶多项式模型为y=-0.000 2 x4+0.01 x3-0.192 4 x2+1.528 2 x+0.508 8
通过以上分析可知:淀粉的水解过程是一个趋于动态平衡的过程, 该过程反应速率受前一个吸附过程吸附速率、基质浓度、传质速率等条件的影响;对水解过程的实验数据进行多项式拟合可以得到四阶多项式方程, 能够拟合淀粉的水解反应过程, 但距离指导生产设计和应用尚存在一定差距。
3.2.4 降解机理动力学研究
为确定淀粉水解酸化过程中COD降解反应的级数, 首先设S0为进水中COD的初始浓度 (即反应时间为0时的浓度) , St为反应时间t时的浓度。
以ln (S0/St) 对t作图, 确定水解酸化过程中有机物降解反应的级数。
从图7可看出, COD反应级数为1级, 呈直线关系。
在求解降解速率常数时, 采用长间隔法计算已得到精度较高的结果。1级反应为:
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式中:k1——反应速率常数, 1/min;
S0 ——进水中COD浓度, mg/L;
Si ——第i时溶液中的COD浓度, mg/L;
n ——试验数据个数;
ti——第i个反应时间。
计算出COD的反应速率常数k1, COD为0.000 569/min。
根据化学反应动力学及对COD降解反应级数的确定和反应常数的计算值, 建立有机物的降解反应动力学方程式St=S0e-kt。
4 结论
(1) 经过对水解池污泥的驯化, 水解污泥的性能得到改善, 污泥内的菌种得到优化, 具有良好的吸附和水解性能。水解污泥在较短时间内COD去除率可以达到28.2%, 而随着水解作用的加强, 溶液内COD增高, 最终由于微生物对有机物的降解作用COD呈降低趋势, 但是降解作用有限, 当反应时间为150 min时, COD去除率为30%。
(2) 对吸附平衡过程中的动力学方程拟合采用Lagergren的吸附速率方程q, 其一级吸附速率方程和二级吸附速率方程都可以拟合淀粉吸附平衡过程, 而二级吸附速率方程优于一级吸附速率方程。 二级吸附速率方程可以计算出平衡吸附量。
(3) 对水解过程的实验数据进行多项式拟合可以得到四阶多项式方程y=-0.000 2 x4+0.01 x3-0.192 4 x2+1.528 2 x+0.508 8, 能够拟合淀粉的水解反应过程。淀粉的水解过程是一个趋于动态平衡的过程, 该过程反应速率受前一个吸附过程吸附速率、基质浓度、传质速率等条件的影响, 在现有实验条件下进行多项式拟合存在误差, 距离指导生产设计和应用尚存在一定差距。
影响淀粉盐酸水解的主要因素 篇4
关键词：淀粉水解,盐酸浓度,水解温度,水解时间
多糖是生物体中广泛存在的物质, 是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的生物大分子[1, 2]。植物多糖按其功能可分为不溶性多糖, 贮存性多糖和具有复杂生理功能的多糖。从20世纪70年代开始逐渐发现植物多糖及其水解产物具有多方面的药理作用, 如增强免疫、抗肿瘤、活血抗栓、降血压、降血脂等, 特别是其水解物, 分子量低, 可渗性好, 抗原性好。因此近年来植物多糖水解及其产物的研究日益受到人们的重视。食品中淀粉含量的测定是食品检测分析中常规分析项目之一。淀粉作为从淀粉制备葡萄糖一直以来是葡萄糖生产的主要途径之一。食品中淀粉含量的测定方法有多种, 其中国家标准法中有酶水解法和酸水解法两种[3]。尽管酶解淀粉生产葡萄糖成为比较普遍的方法, 但是淀粉酸水解法因其操作较酶水解法简单快速而被人们广泛采用。然而酸水解法仍然有一些问题值得探讨, 比如盐酸浓度及水解温度对水解速度的影响等[4]。这些关键性问题的解析对教学实验以及工业应用都有一定的参考价值, 而目前仍无文献对其进行详细的讨论, 笔者通过实验初步探索了影响面粉盐酸水解的因素, 为实验教学和工业化生产奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
722分光光度计 (上海菁化科技仪器有限公司) , 比色杯, 比色管, 容量瓶, 试管, 水浴锅。浓盐酸、氢氧化钠、3、5二硝基水杨酸, 酒石酸钾钠等均为国产分析纯。面粉购自农贸市场。
1.2 不同浓度盐酸对淀粉水解的影响
准确称量10份0.1g的面粉, 分别加入4m L不同浓度的盐酸 (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mol/L) , 即为待分析的10组淀粉水解反应管。每管分别在反应5min、10min、15min和20min四个时间点取样进行定量和定性分析。
1.3 不同水解温度对盐酸水解速度的影响
称取四份0.1g面粉, 分别加入4m L 2.5mol/L的盐酸溶液, 同时置于50、60、75、85、100四种水浴锅中进行水解。20min后取样进行定性和定量分析。
1.4 淀粉水解液的定性分析
取碘-碘化钾试液, 与少量淀粉水解液混合, 观察呈色反应。
1.5 淀粉水解液的定量分析
首先制备葡萄糖标准曲线。将淀粉水解液离心, 准确移取一定量的上清液, 用氢氧化钠中和。加入3、5-二硝基水杨酸试剂, 混匀后放入沸水浴中反应5min, 取出后冷却, 用比色管定容至25m L。在540nm下测定溶液的吸光值。与葡萄糖标准曲线比较后得到准确的糖含量。
2 结果
2.1 不同浓度盐酸对淀粉水解的影响
从水解反应产生的颜色来看, 各组淀粉水解液反应10分钟后, 盐酸浓度大于或等于3.5mol/L的反应管呈现出黄色。且盐酸浓度越高, 颜色越深。反应20分钟后, 盐酸浓度达到3.0mol/L即开始呈现出淡黄色, 而盐酸浓度低于3mol/L的反应管始终为无色。定量结果显示, 浓度大于3mol/L的盐酸溶液催化淀粉水解10min后即反应完全。然而反应溶液呈现黄色, 且颜色的深浅与盐酸浓度成正相关。值得注意的是, 浓度大于3.5mol/L的盐酸催化淀粉水解随着水解时间的延长, 葡萄糖的表观回收率先增加后减少 (表1, 图1, 图2) , 可能是发生了副反应消耗掉了部分葡萄糖。浓度大于或等于2.5mol/L的盐酸催化淀粉水解20分钟后, 水解基本完全, 回收率基本达到峰值 (表1, 图1) 。对10组水解5分钟后的样品进行分析, 发现葡萄糖的收率与盐酸浓度基本成线性关系 (表1) 。
2.2 淀粉完全水解所需时间与盐酸浓度的关系
本文结果显示, 淀粉水解反应速度与盐酸浓度成正比 (表1, 图1) 。因此, 淀粉水解完全所需时间长短与所用盐酸的浓度相关, 本实验结果显示完全水解0.1g面粉, 2.5 mol/L盐酸需要15min, 3mol/L盐酸需要10min, 而5 mol/L盐酸只要5min (表1) 。水解完全后, 延长水解时间可增加副反应产物, 而且此效应随着盐酸浓度的增加而增加, 导致葡萄糖的表观收率降低 (图3) 。然而当盐酸浓度控制在3mol/L以下, 很少有副反应发生, 离心后可得到无色透明的葡萄糖液。过低的盐酸浓度大大降低水解反应的速度, 0.5mol/L的盐酸催化反应20min后, 反应只进行了近20%左右 (表1) 。
2.3 温度对淀粉盐酸水解的影响
本文选用2.5mol/L盐酸溶液来试验温度对淀粉水解的影响。结果显示, 水解20min后, 50℃的样品组的淀粉几乎未发生水解, 葡萄糖的收率只有0.55%, 100℃的样品几乎完全水解, 葡萄糖的收率达77.50% (表1) 。淀粉水解速度与温度近似线性关系 (图4) 。
3 讨论
实验证明, 盐酸浓度是影响面粉水解的主要因素之一。淀粉水解的速度随盐酸浓度增加而增加, 然而副反应也随之增加, 导致面粉中淀粉含量测定结果发生偏差, 同时副反应产物给后续的工业纯化增加难度和成本。权衡水解速度与副反应发生率是非常必要的, 本文发现2.5mol/L的盐酸在催化面粉水解方面具有比较优势。
高浓度的盐酸水解淀粉时, 由于有色副产物的产生, 水解刚完全时, 表观葡萄糖收率会稍偏高, 但随着时间的进一步延长, 产生葡萄糖被消耗, 表观葡萄糖随之下降。
水解温度是影响淀粉盐酸水解的另一个重要因素。淀粉盐酸水解在低于50℃的温度下很难进行, 较高的温度对水解有利, 综合来看控制水解温度在100℃为宜。
综上所述, 使用2.5mol/L的盐酸溶液, 在100℃的温度下, 结合淀粉与盐酸溶液的比例调整水解时间, 可以得到准确的实验结果和优质的水解产物。
参考文献
[1]Hanspeter Schmidt, Manon Haccius.EU Regulation/Organic Farming, A legal and Agroecological Commentary on the EU council Regu2lat ion (EEC) No.2092/91, Weikersceim:Margraf Verlag, 1998.
[2]缪月秋, 顾龚平, 吴国荣.植物多糖水解及其产物的研究进展.中国野生植物资源, 2005, 24 (2) :4-7.
[2]谢玉玉, 王娟芳, 黎艳, 郭新锋, 崔治清, 朱保安, 王晓军.提高保水剂中淀粉水解率的研究.安徽农业科学, 2009, 37 (7) :2838-2847.
盐酸水解制备红薯微孔淀粉的研究 篇5
而近年来对改性的淀粉研究,采用酸水解来获得微孔淀粉取得很大的进展[5,6,7]。我国具有丰富的红薯资源,本文旨在利用盐酸水解制备红薯微孔淀粉,深入研究了对影响制备红薯微孔淀粉的各因素,如盐酸浓度、反应温度、淀粉浓度和反应时间,考察了微孔淀粉的吸附性能,获得最佳的工艺条件,为红薯淀粉的综合利用和研究提供了参考价值。
1实验药品与仪器
1.1实验原材料及药品
红薯淀粉(食品级),福建塞翁福食品股份有限公司; 天生一级花生油 ( 食品级),福建天生农业股份有限公司; 盐酸 (AR),Na OH碱液(AR),天津市永大化学试剂有限公司。
1.2实验仪器
DHG - 9070电热恒温干燥箱,上海君竺仪器制造有限公司; HH - 4电热恒温水浴锅,上海君竺仪器制造有限公司; 电子天平,上海越平科学仪器有限公司; 恒温磁力搅拌器,常州国华电器有限公司; 真空抽滤机,巩义市英峪予华仪器厂。
2实验方法
2.1红薯微孔淀粉的制备
称取25. 00 g的红薯淀粉(干基),置于250 m L锥形瓶中, 用一定浓度的盐酸溶液60 m L,将其调成均匀淀粉溶液,置于恒温水浴锅中,同时用恒温磁力搅拌器搅拌,调节好温度和转速,准确计时。反应一定时间后,即用饱和碳酸钠溶液中和盐酸以终止反应。用真空抽滤器抽滤,并用蒸馏水洗涤数次。在55 ℃ 恒温干燥箱中,将制取的改性淀粉放入干燥至恒重,研钵粉碎后,即得微孔淀粉。
2.2单因素实验
以盐酸浓度、反应温度、淀粉浓度、反应时间为制备条件的四个影响因素,保持以上四个条件中的三个条件为定值,而改变另一个条件做不同水平下的实验。
2.3正交实验
通过初步筛选四个条件中最适合梯度值,选择4因素3水平既有[L9(34)]进行正交实验,然后通过正交表格分析产品得率和吸油率的每个平行实验的总量,并分析总量的均值,然后算得极差可以分析出最佳的实验条件组合。
2.4产品得率
2.5吸附性能表征
微孔淀粉的吸附性能可以用吸油率进行表征:
精确称取烘干后的恒重样品质量m1(g),恒温下与食用油搅拌混合30 min,用真空漏斗抽滤,直至没有液滴滴下,精确称量其质量为m2(g)。按以下公式计算吸油率(S):
3单因素实验
以吸油率为主要考核指标。通过对盐酸浓度、反应温度、 淀粉用量、反应时间四个影响因素条件,改变其中一个条件其他条件不变,进行实验。
3.1盐酸浓度的影响
称取25. 00 g红薯淀粉,在温度为40 ℃ 、反应时间为4 h的条件下,通过改变盐酸浓度来制备红薯微孔淀粉,并对制得微孔淀粉的吸油率与盐酸浓度的关系进行实验。获得相应实验结果。原淀粉吸油率为17. 4% 。盐酸按1. 0% ,1. 5% ,2. 0% , 2. 5% ,3. 0% 的浓度变化进行实验。由图1可以看出,盐酸浓度对红薯微孔淀粉的形成和吸油率的影响较大。在盐酸浓度为1. 5% 时,吸油率最高。因此确定以盐酸浓度1. 5% 为适宜条件,获得相应产率89. 7% 。
3.2反应温度的影响
称取25. 00 g红薯淀粉,在最适盐酸浓度1. 5% ,反应时间4 h的条件下,通过控制反应温度来制备红薯微孔淀粉,得出如图2所示结果。从图2可以发现,随着温度升高,微孔淀粉产率增大,可能是由于温度升高盐酸的水解作用增强。温度高于40 ℃ 时,吸油率渐渐下降,是因为随着温度的升高,慢慢地接近了淀粉的糊化温度。从图2可以发现,反应温度为40 ℃ 时,微孔淀粉的吸油率最大,获得相应产率为89. 7% ,所以确定适宜反应温度为40 ℃ 。
3.3淀粉浓度的影响
在最适合的盐酸浓度1. 5% 、最适合的反应温度40 ℃ 、反应时间4 h的条件下,通过改变红薯淀粉用量制备微孔淀粉, 获得对应的产物吸油率,试验情况见图3。由图3可知,产物的吸油率随着淀粉用量的的增加,是先上升后下降的,在淀粉用量为20 g时,制得的微孔淀粉吸油率最高。初步确定微孔淀粉的吸油率最大时所对应的最适合的反应淀粉浓度为20 g,获得相应产率为87. 2% 。
3.4反应时间的影响
称取20. 00 g红薯淀粉,在最适合盐酸浓度1. 5% 、最适合的温度40 ℃ 条件下,通过改变反应时间制备微孔淀粉。并对制得微孔淀粉的吸油率与反应时间的关系进行实验研究,绘制得曲线图4。结合图4可以综合确定当微孔淀粉的吸油率最大时所对应的最适合反应时间为8 h,获得相应产率为89. 0% 。
4正交试验
通过初步筛选,考察盐酸浓度、反应温度、淀粉用量、反应时间为影响酸法制备红薯微孔淀粉的四个主要因素。设计四因素三水平即为[L9(34)]进行正交实验,结果见表1。
由正交实验表格可以得出各种因素对红薯微孔淀粉的吸油率的影响力顺序依次为: 盐酸浓度 > 反应时间 > 反应温度 > 淀粉浓度,即为A > D > B > C; 得到吸油率的最佳工艺条件组合为: 1. 5% ,45 ℃ ,20 g,8 h,即为A1B2C2D2。在所选实验范围内,影响微孔淀粉吸油率的因素中,盐酸浓度的极差最大, 它对实验效果影响最大; 反应时间对微孔淀粉的形成也至关重要; 淀粉用量的极差最小,它对实验效果影响最小。
5结论
通过实验可以得出:
(1) 获得红薯微 孔淀粉最 优的工艺 条件为: 盐酸浓度1. 5% 、反应温度45 ℃ 、淀粉用量为20 g、反应时间8 h。对应微孔淀粉产率为91. 4% ; 吸油率为23. 6% 。
(2) 影响微孔淀粉吸油率的因素顺序为: 盐酸浓度 > 反应时间 > 反应温度 > 淀粉用量。
参考文献
[1]李永平,于丽薇,黄雨洋.微孔淀粉颗粒结构及其吸附性能的研究[J].现代食品科技,2010,26(4):383-386.
[2]唐洪波,王晓宇,李艳平.疏水微孔糯玉米淀粉的制备工艺[J].农业工程学报,2012,28(15):270-274.
[3]张煜,孙波,蔡柏岩,等.微孔淀粉包埋乳酸菌提高其耐热性的研究[J].中国乳品工业,2012,40(4):21-23.
[4]陆冬梅,杨连生.微孔木薯淀粉吸附特性研究[J].应用化工,2005,34(4):205-208.
[5]刘雄,阚建全,陈宗道,等.酸法制备微孔淀粉的技术研究[J].食品科学,2003,24(10):81-83.
[6]唐忠锋,王继虎.酸法优化木薯微孔淀粉的工艺及性能研究[J].粮食与饲料工业,2008(10):26-28.
淀粉水解酶 篇6
本文采用双酶法来水解米糠淀粉,双酶法水解淀粉主要包括糊化、液化和糖化[9]。由于糊化时,会出现粘度增大的现象,导致无法搅拌,所以将糊化和液化同时进行,即一步法糊化和液化。本文主要对液化工艺进行了研究,在单因素的基础上,运用响应面法进行优化,得到最优的液化工艺条件,为工业米糠淀粉酶法生产葡萄糖提供生产理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜米糠:湖北宏凯工贸有限公司;Termamyl SC(耐温型淀粉酶):诺维信酶制剂公司;Dex-trozyme DX(新型糖化酶):诺维信酶制剂公司;盐酸(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠(分析纯):国药集团化学试剂有限公司
1.2 仪器与设备
DELTA 320pH计:梅特勒-托利多中国;电子天平BT224S:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SiGMA 6-16大容量离心机:德国CHRIST冻干机有限公司;SBA-40D生物传感分析仪:山东省科学院生物研究所;DF-1型集热式磁力搅拌器:江苏金坛市金城国际实验仪器厂;PAL迷你数显折射计:广州市爱宕科学仪器有限公司
中草药粉碎机:天津市泰斯特仪器有限公司
1.3 实验方法
1.3.1 评价标准
米糠淀粉水解程度用DX值表示:
其中葡萄糖含量利用SBA-40D生物传感分析仪测定;干物质含量利用PAL迷你数显折射计来测定。
1.3.2 工艺路线
将新鲜米糠粉碎,过50目筛,水洗3次去除灰分等杂质。然后调至一定的醪浓度,调pH值。加热至一定的温度后,加入Termamyl SC(耐温型淀粉酶)一步法糊化和液化。液化一段时间后过滤,得到滤液,将滤液灭酶后,再调至一定的pH值,加热至一定温度后,加入Dextrozyme DX(新型糖化酶)糖化,糖化结束后再灭酶,浓缩,得到浓缩糖浆。
1.3.3 液化单因素试验
① 酶用量:称30g过50目筛的米糠,分别加100g水洗3次,洗去灰分等其它杂质。然后加水使醪浓度为10%,再加入10mL 0.1mol·L-1CaCl2,以提高Termamyl SC酶的活性。调pH=6.0,T.SC酶用量分别为0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.15%,控制温度在90℃,液化时间120 min,每10min取样,测DX值。
② 醪浓度:称30g过50目筛的米糠,加100g水洗3 次,洗去灰分等杂质。醪浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%,加入10mL0.1mol·L-1CaCl2,提高Termamyl SC酶的活性。调pH=6.0,Termamyl SC酶用量为0.1%,温度90℃,液化时间120min,每10min取样,测DX值。
③ pH:称30g过50目筛的米糠,加100g水洗3次,洗去灰分等杂质。加水使醪浓度为25%,加入10mL 0.1mol·L-1CaCl2,pH分别为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4,Termamyl SC酶用量分别为0.1%,以提高Ter-mamyl SC酶的活性。控制温度在90℃,液化时间120min,每10min取样,测DX值。
④ 温度:称30g过50目筛的米糠,加100g水洗3次,洗去灰分等杂质。加水使醪浓度为25%,然后加入10mL 0.1mol·L-1CaCl2,以提高Ter-mamyl SC酶的活性。调pH=6.0,Termamyl SC酶用量为0.1%,控制温度分别为80℃、85℃、90℃、95℃、100℃,液化时间120min,每10min取样,测DX值。
1.3.4 液化响应面试验设计
根据单因素试验结果,选取酶用量、醪浓度、pH、温度做4因素3水平试验,以液化液DX值为响应值,利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken试验对液化工艺进行响应面优化。Box-Behnken试验设计见表1。
2 结果与分析
2.1 液化单因素试验结果
2.1.1酶用量对液化DX值的影响
如图2所示,随着酶用量的增加,酶促反应迅速增加,DX值升高,酶用量在0.025%~0.075%之间时,DX值增加较快;当酶用量在0.075%~0.125%之间时,DX值增加速度减慢。 由于酶用量为0.075%时碘试不合格,并且考虑到降低成本,所以选择酶用量为0.1%。
2.1.2 醪浓度对液化DX值的影响
由图3可知,醪浓度在5%~25%之间时,液化DX值随着醪浓度的增大呈逐渐上升的趋势,当醪浓度达到25%时,DX值达到最大,继续增加醪浓度DX值开始下降。这可能是因为当底物浓度过大时,高温液化会导致底物过于稠密,增加了搅拌的难度,不利于酶与底物结合,使酶无法发挥最大的作用[10,11]。因此,控制醪浓度在25%。
2.1.3 pH对液化DX值的影响
由图4可知,当pH=5.5时DX值较低,DX值随着pH值的增加而增大。pH值在5.6~5.9之间时,DX值增大幅度较小,当pH达到6.0时DX值达到最大;继续增大pH值,DX值降低,说明6.0为液化酶的最适pH。这可能是由于pH过高或过低会引起酶的活性中心或酶分子构象变化,从而影响酶与底物的结合能力和催化能力,导致酶的活力降低[12,13],因此选取pH =6.0。
2.1.4 温度对液化DX值的影响
由图5可知,温度对液化的影响较大。在80~90℃之间时,随着温度的升高,DX值增大,在90℃时DX达到最大值;继续升高温度,DX值降低。这可能是因为随着温度的升高,淀粉分子的运动加强,酶与淀粉分子接触几率增加,反应速率加快,使DX值增大[14];另一方面,随着温度升高,逐渐接近酶的最适温度,因此DX值也升高,但超过90℃后,酶逐渐变性失活,导致反应速率下降[15]。所以选取温度为90℃。
2.2 液化响应面试验结果
2.2.1 试验结果及方差分析
通过单因素试验得到的较优的液化工艺条件为酶用量0.1%、醪浓度25%、pH=6.0、温度90℃。在单因素的基础上,利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken试验对米糠淀粉液化工艺进一步优化,选取酶用量(A)、醪浓度(B)、pH(C)、温度(D)进行4因素3水平试验,以液化DX值作为响应值。Box-Behnken试验设计及结果如表2 所示。利用Design Expert软件对表2中的试验结果进行回归分析,得到二次多项回归方程:DX=6.23+0.28A + 0.11B + 0.15C - 0.49D - 0.41AB -0.045AC - 0.043AD - 0.15BC + 0.032BD +0.56CD-0.59A2-0.24B2-0.76C2-0.60D2,方差分析如表3所示,回归项中p<0.000 1,说明所选择模型极为显著。失拟项p=0.086 8>0.05,这说明失拟项P差异不显著;决定系数R2=0.929 8,校正决定系数R2adj=0.859 6,说明该模型能够解释85.96%的变化,以上参数表明该二次回归模型能够拟合酶用量、醪浓度、pH、温度对DX值的影响,因此可用此模型对液化DX值进行分析和预测。
2.2.2 曲面图及等高线分析
通过Design Expert 8.0.6软件可以得到曲面图及等高线图,如图6~图11所示。通过曲面图可以直观的看出各因素及其交互作用对液化DX值的影响,曲面越陡表明因素对响应值的影响越显著[16]。等高线的形状可以看出两因素之间交互作用的强弱,椭圆形表示两因素之间的交互作用较强,圆形则表示两因素之间的交互作用较弱[17,18]。
2.2.3 最优工艺条件的预测及验证
运用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行优化预测,得到液化工艺最优条件为:酶用量0.11%、醪浓度25.04%、pH=5.98、温度87.71℃,在此条件下预测液化DX值为6.374 54%。
根据实际试验的可操作性,将液化工艺条件改为:酶用量0.11%、醪浓度25%、pH=6.0、温度88℃,在此条件下对模型的预测参数进行了三次平行验证试验,得到液化DX平均值为6.54%,与模型预测值较接近,说明Box-Behnken设计优化得到的液化工艺条件是可靠的。
2.3 对最优条件下得到的液化液进行糖化
以DX值为糖化效果的评价指标,取最优液化工艺条件下得到的液化液100g,调pH至4.5,控制温度在60℃,糖化酶用量0.03%,糖化48h后,取样测葡萄糖含量、干物质含量,计算DX值。通过两次平行实验,得到最终糖化DX平均值为97.07%。
3 结论
高温酸法水解制备低分子量淀粉 篇7
现代淀粉水解工业即是通过控制水解条件,将淀粉根据应用的需要进行适度水解,获得不同分子量的适用产品,用作脂肪代用品、药物原料等[2,3,4]。目前常用的工艺主要有酶水解和酸水解。酶水解的产品外观好,质量容易控制,但是操作过程比较复杂,成本较高[5,6,7]。酸处理则是所有淀粉改性方法中最古老的一种,其主要优点是在不显著影响颗粒结构的基础上改变淀粉的功能特性,且成本较低。但是酸水解反应过程难以控制,后处理比较烦琐[8,9,10]。我们对常规酸水解的工艺条件进行了改进,在较高的温度下进行酸水解,则可以比较好地避免上述问题。采用高温低酸的反应条件,通过不同的反应时间控制产品分子量,最后的盐、酸量均很少,基本不需要后处理步骤。
1 材料与方法
1.1 材料
普通玉米淀粉(GB8885-88,武汉市太阳行食品有限责任公司),使用前用乙醇煮沸脱脂30min。
1.2 试剂与仪器
盐酸,氢氧化钠,乙醇;Agilent 1100高效液相色谱(配备GPC软件)。
1.3 实验方法
1.3.1 淀粉糊化
称取淀粉加适量水配制成淀粉乳液,在糊化温度之上恒温糊化60 min,使淀粉均匀分散。
1.3.2 淀粉水解
在淀粉乳液中加入适量盐酸,在要求的温度下进行水解反应,每30min取样1m L测定产物的分子量。
1.3.3 分子量的测定
分子量测定采用GPC方法,以葡聚糖为标样。色谱柱TSK-GEL G4000PWXL,柱温35℃;流动相为0.025 mol/L醋酸钠溶液,流速0.5 m L/min;检测器RID温度35℃。样品测试前用Na OH中和,0.45μm滤膜过滤。
2 结果与讨论
2.1 糊化对水解的影响
淀粉在常温下不溶于水,但当水温达到一定温度以上时,淀粉的物理性能发生明显变化。生淀粉的胶束结构全部崩溃,淀粉分子形成单分子,并为水所包围而成为溶液状态。由于淀粉分子是链状甚至分支状,彼此牵扯,因而形成的溶液为具有粘性的糊状。这种淀粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性,称为淀粉的糊化(Gelatinization)。淀粉糊化温度必须达到一定程度,不同淀粉的糊化温度不一样,同一种淀粉,颗粒大小不一样,糊化温度也不一样,颗粒大的先糊化,颗粒小的后糊化[11]。为了使淀粉水解反应完全,在水解前需要使其分散均匀,因此必须将淀粉糊化。如图1所示,分别在糊化前后的淀粉乳液中加入适量盐酸配成0.50mol/L HCl水解液,60℃水解5h,每1h取样3m L测定分子量。糊化后的淀粉在5h内水解效果明显,在1h时水解产物分子量146 278,5h后分子量降为10878,得到均匀的低分子量淀粉溶液。而没有糊化的淀粉溶液中水解产物的分子量在水解反应过程中基本没有变化,始终处于10 000左右。水解反应5h后,仍有大量的淀粉不溶于水,沉积于反应容器的底部。因此为了提高酸水解反应的效率,必须在水解前将淀粉糊化。
2.2 糊化条件的确定
分别在水浴90℃(A)、油浴125℃(B)和2atm、125℃(C)条件下糊化淀粉1h,然后加入盐酸至0.5mol/L,在60℃下水解5h,取样测定分子量,结果如图2所示。三种糊化条件处理后的淀粉,水解产物的分子量随水解时间的增加而减小;但在同一时刻,A、B、C三种处理后的淀粉水解产物的分子量几乎一样。这表明,糊化工艺对水解的结果影响不大,因此从经济角度考虑,选择90℃糊化淀粉1h即可。
2.3 正交试验考察淀粉水解影响因素
淀粉糊化后加入适量盐酸开始水解。以水解温度、酸的浓度和水解时间为因素,分别取50℃、100℃;0.1mol/L、0.3mol/L和1h、3h三个水平,做正交实验考察水解反应的影响因素。通过极差分析可知,对淀粉水解影响最大的因素是反应的温度。提高水解反应的温度,可以大大缩短反应的时间和降低盐酸的用量,有利于工业生产,并能简化后续的中和及脱盐等步骤。因此在常压下水解,选择100℃为最佳的水解温度。
2.4 盐酸浓度对产物分子量的影响
淀粉糊化后加入盐酸分别至0.0001mol/L、0.001mol/L、0.01mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/L,100℃水解1h后测定产物分子量,如图3所示。当盐酸浓度高于0.1mol/L时,水解速度过快,反应1h后水解产物的分子量均在10 000以下,不利于控制产物的分子量。同时酸用量的增加会给后继中和以及脱盐的步骤带来压力,因此应尽可能选择较低浓度的盐酸进行水解。但是采用0.0001mol/L和0.001mol/L的盐酸时水解速度又过慢,产物的分子量在150000以上,且反应瓶底有部分的糊化淀粉凝胶块沉淀。这说明酸的浓度不足以使淀粉充分反应,该条件下淀粉水解不均匀。所以,综合考虑水解速度及反应产物的性状,选择0.01mol/L盐酸为最佳的酸用量。
2.5 水解时间对产物分子量的影响
在100℃下用0.01mol/L的盐酸水解糊化后淀粉,每0.5h取样,中和后用GPC测定产物分子量,结果如图4。水解0.5h时,产物在GPC图谱中有四个峰,分子量分布很宽,该产物不具备应用价值。随着水解时间的增加,产物高分子量部分越来越少,而较低分子量部分显著增加,分子量分布也逐渐变窄。
A:0.5h B:1.0h C:1.5h D:2.0h E:2.5h F:3.0h G:3.5h H:4.0h I:4.5h J:5.0h
将水解产物的分子量Mw与水解时间t分别取对数后作图,如图5所示,ln(Mw)=10.97-1.44×ln(t)(r=0.999)。这表明Mw与t具有呈乘幂关系,即Mw=5.8×104×t-1.44,根据该公式,可以计算任意水解时间的产物分子量,有效地指导高温酸法水解制备需要分子量的淀粉。
3 结论
在酸法水解淀粉的工艺中,为了使淀粉水解均匀,首先必须将淀粉糊化,糊化工艺对水解无影响。在水解反应的各因素中,反应温度的影响最大,因此为了降低盐酸用量,加快反应速度,简化后继操作,选择100℃为水解温度。水解中盐酸用量过高或过低均不利于控制反应,这里选择0.01mol/L为最佳的反应浓度。在该水解条件下,产物分子量与反应时间具有呈乘幂关系,即Mw=5.8×104×t-1.44,该公式可以有效地指导高温酸法水解制备指定分子量的淀粉。
参考文献
[1]罗明朗.淀粉水解产品的生产与应用[J].粮食与饲料工业,1995(7):37-41.
[2]KIM HYL,HYEON WY,LIM HS,et a1.Replacement of shorten-ing in yellow layer cakes by corn dextrin[J].Cereal Chemistry,2001,78(3):267-271.
[3]郝晓敏,王遂.酶法制备玉米淀粉糊精的性质研究[J].食品工业,2007(6):15-17.
[4]徐立宏,张本山,高大维.羟乙基淀粉的制备与应用[J].粮食与饲料工业,2001(11):1-3.
[5]徐正康,黄立新.中国淀粉水解工业发展及其展望思考[J].现代食品科技,2009,25(8):855-859.
[6]张剑,易华锋,张开诚,等.双酶法水解玉米淀粉的工艺研究[J].酿酒科技,2009(3):95-97.
[7]王磊,林奇.板栗淀粉酶水解工艺条件研究[J].食品与机械,2010,26(1):152-156.
[8]BILIADERIS CG,GRANT DR,VOSE JR.Structural characteriza-tion of legume starches[J].Cereal Chemistry,1981,58(6):502-507.
[9]KOMIYA T,NARA S.Changes in crystallinity and gelatinization phenomena of potato starch by acid treatment[J].Starch,1986,38:9-13.
[10]ROBYT JF,CHOE J,FUCHS EB,et a1.Acid modification of starch granules in alcohols:efects of temperature,acid concen-tration,and starch concentration[J].Carbohydrate Research,1996,281:203-218.
单酶水解蚕蛹蛋白工艺条件研究 篇8
本文采用中性蛋白酶与碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白制备复合氨基酸, 以水解液中氨基氮总量与总氮的比值为指标, 通过单因子试验和正交试验考察酶解温度、时间、底物浓度及加酶量诸因素对酶解反应的影响, 确定了蚕蛹蛋白单酶水解的最适酶解条件。所制备的氨基酸可望直接应用于食品、医用工业, 为蚕蛹蛋白产业化开发, 解决丝厂副产品出路问题提供了一条崭新的途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料、试剂与仪器
1.1.1 原料
干桑蚕蛹, 购于湖州宝锌生物技术有限公司。
1.1.2 试剂
中性蛋白酶:由淀粉液化芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:活力>100, 000WU/g, 外观为淡黄色粉末状固体 (精制中性蛋白酶的活力以WU来表示, 一个WU指在p H7.5、温度30℃的条件下, 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量) ;碱性蛋白酶:由地衣芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:酶活力58, 000DU/g, 在p H8.5、温度40℃的条件下, 1ml2%的酶溶液生成0.400消光度差时, 表示酶制剂有1000DU;两种酶均购买于中国无锡杰能科技生物工程有限公司。
本试验使用的其它化学试剂:浓硫酸、Cu SO4、K2SO4、硼沙 (Na2B4O7·10H2O) 等均为分析纯, Na OH溶液 (40%、0.1N) 、0.1N的HCl溶液、2%硼酸溶液、50%乙醇溶液、40%的中性甲醛溶液、混合指示剂 (0.2%溴甲酚绿-乙醇溶液与0.2%甲基红-乙醇溶液按5:1比例混合) 、0.1%百里酚酞乙醇溶液、0.1%中性红。
1.1.3 主要仪器和设备
日立 (Hitachi) 835-50型氨基酸自动分析仪;电热恒温干燥箱, 上海跃进医疗器械厂;LD4-2A型离心机, 北京医用离心机厂;AB204型电子天平, 上海市实验仪器总厂;SHH-W-420恒温振荡水浴箱, 河北省黄骅市渤海电器厂;磁力搅拌器, 法国制造;p H-2型酸度计由上海第二分析仪器厂生产;LNK-801B型远红外消煮炉, 四平市电子仪器厂;改良式凯氏定氮仪, 中草药粉碎机, 电炉;滴定装置, 定量瓶、移液管、三角瓶、烧杯等。
1.2 方法
1.2.1 蚕蛹蛋白质含量的测定
1.2.1. 1 干蚕蛹粉的制备
用中草药粉碎机将干蚕蛹粉碎, 过80目筛, 装入干净的三角瓶备用。
1.2.1. 2 蚕蛹粗蛋白质含量的测定
采用凯氏定氮法[1], 按照GB5009.5-85测定, 将含氮量乘以6.25即为蛋白质的含量。
1.2.2 蚕蛹蛋白酶解的工艺流程
称量干蛹粉样品→按固液比加蒸馏水→搅拌调p H值→封口→巴氏灭菌→蛋白质熟化→冷却至恒温→加酶摇匀→水解→水解液加热灭酶→离心分离→测定上清液氨基氮含量、氨基酸组成。
游离氨基酸分析:采用LC-8800全自动氨基酸分析仪分析, 色谱条件:钠型阳离子交换树脂4.6×60, 流动相为柠檬酸三钠缓冲液;四元梯度洗脱, p H3.2~4.9;检测波长为:510nm, 流速为0.4ml/min, 柱温为50℃;柱的衍生条件为:反应液A:390g茚三酮/L丙二醇甲醚;反应液B:醋酸钠/醋酸:丙二醇甲醚为60:40;反应温度为135℃;流速为0.35 ml/min。
1.2.3 蚕蛹蛋白酶不同条件下的水解
试验
1.2.3. 1 水解温度
取自制干蚕蛹粉6份, 在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃6个水平下进行酶解。底物浓度10%, 即固液比1:9 (每份10g, 加入90ml蒸馏水) ;粗蛹蛋白经过85℃处理20min熟化变性;分别加入中性蛋白酶或碱性蛋白酶, 加酶量为2.0g/100g干基;中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解时, p H值分别恒定为7.0、8.0, 以40%Na OH溶液或1:4盐酸调节, 每隔1小时调1次。酶解6h后, 煮沸5mim, 灭酶并除去未水解的蛋白质, 冷却后用3000r·min-1离心分离5min, 取上清液。沉淀用适量蒸馏水洗涤1次, 合并上清液, 并记录体积。采用甲醛滴定法测定氨基氮含量, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适温度。
1.2.3. 2 水解时间
取自制蛹蛋白粉4份, 每份10g, 分别在50℃进行酶解, 其它处理同上, 到达设定时间后, 取上清液用甲醛滴定法测定其氨基氮含量, 并计算氨基总量/总氮值, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适水解时间。
1.2.3. 3 底物浓度
取自制干蚕蛹粉4g、6g、8g、10g、12g, 分别按4%、6%、8%、10%、12%加入蒸馏水96ml、94ml、92ml、90ml、88ml, 在50℃酶解6h, 其它处理同上, 确定最适酶解底物浓度。
1.2.4 蛋白酶水解蚕蛹蛋白的正交试验设计
本试验采用L16 (45) 表[2]正交设计法, 对水解时间、酶解温度、底物浓度、加酶量 (中性蛋白酶或碱性蛋白酶) 等4个条件进行优化试验, 设计了4因素4水平正交试验, 见表1。
1.2.5 氨基氮含量的测定
采用甲醛法测定水解液中氨基氮的含量。
1.2.6 水解率的计算
水解率= (氨基氮总量/总氮量) ×100%。
氨基氮总量/总氮量= (水解液体积×氨基氮的含量) / (样品重量×总氮含量) 。
1.2.7 氨基酸组成的测定
采用氨基酸自动分析仪测定水解液中游离氨基酸的含量。
2 结果与分析
2.1 蚕蛹粗蛋白含量
采用凯氏定氮法测定实验室制备的干蚕蛹粉, 其粗蛋白含量为50.6%。
2.2 蚕蛹蛋白在不同条件下的酶解结果
2.2.1 温度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响
从表2可见, 温度对酶水解蚕蛹蛋白的影响十分显著。随着温度不断升高, 氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值逐渐增大, 中性蛋白酶在酶解温度为60℃、碱性蛋白酶酶解温度为50℃时达到最大值, 其后如温度继续升高反而下降。主要是因为温度升高使酶蛋白变性, 活力减弱, 氨基酸因为发生美拉德反应而损失。因此, 水解蚕蛹蛋白时, 采用中性蛋白酶的最佳酶解温度为60℃, 碱性蛋白酶酶解温度以50℃为宜。
从温度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图1可见, 碱性蛋白酶的水解高峰要早于中性蛋白酶, 在30℃~60℃条件下, 水解率明显高于中性蛋白酶, 而60℃以上酶基本失活, 水解率下降。
2.2.2 时间对蚕蛹蛋白酶解结果的影响
由表3可看出, 随着水解时间的延长, 蚕蛹蛋白水解液中的氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值有所增加, 但8h后水解速度增幅下降, 10h与8h比较仅增加0.005、0.006 (中性蛋白酶水解) 及0.004、0.005 (碱性蛋白酶水解) 。说明随着时间延长, 氨基氮含量增加, 酶的活力受到抑制, 水解效率下降。因此, 两种蛋白酶水解时间8h较为适宜。
时间对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图2表明, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 增幅大于中性蛋白酶, 延长水解时间可适当提高碱性蛋白酶的水解率。
2.2.3 底物浓度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响
由表4可见, 随着底物浓度的增加, 水解液中氨基氮含量不断升高, 氨基氮总量/总氮量的值逐渐下降。底物浓度较低时, 酶与底物形成一对一的络合物酶活力最强, 水解率最高;一旦底物浓度超过酶的“饱和”值, 酶的稳定性下降, 且随着水解产物的增加, 酶活力受到抑制, 故底物浓度不宜太高。而底物浓度太低时, 氨基酸得率少, 水解效率低;适当增加底物浓度可提高氨基氮得率。本试验底物浓度以4%时水解率最高, 12%时其氨基氮含量最大。
由底物浓度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图3可见, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 随着底物浓度的增加降幅小于中性蛋白酶, 表明在同样底物浓度下水解效率要高于中性蛋白酶, 为增加氨基氮得率, 碱性蛋白酶水解时可适当提高底物浓度。
2.3 蚕蛹蛋白酶解条件正交试验优化确定
为了进一步确定中性或碱性蛋白酶单酶水解蚕蛹蛋白的最佳条件, 根据单因素试验结果开展正交试验, 结果见表5。
2.3.1 中性蛋白酶最佳水解条件确定
见表6, 对中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白的氨基氮总量/总氮量的值进行级差分析表明:水解时间 (A) 、酶解温度 (B) 、底物浓度 (C) 、加酶量 (D) 对水解结果的影响, 各因素的主次顺序为C>B>D>A, 即底物浓度>酶解温度>加酶量>水解时间, 底物浓度影响最大, 是重要影响因素, 水解时间影响最小。最佳条件组合为A3B3C1D2或A3B3C1D3, 为降低成本、减少用酶量, 宜选择前者, 即在16个处理中最优处理组合11号。在水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基时, 水解效果最佳, 在此条件下水解率为34%。考虑操作方便及经济实惠, 水解时间控制在6~8h范围便可。
单位:h, ℃, %, g/100ml。
2.3.2 碱性蛋白酶最佳水解条件确定
对碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白正交试验所得氨基氮总量/总氮量的值进行极差分析, 结果见表7, 最优水平组合为A3B3C1D2, 与中性蛋白酶水解条件一致, 在16个处理中最优处理组合为11号。即水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 水解率为43%。各因素的主次顺序为C>A>B>D, , 即底物浓度影响最大, 加酶量影响最小, 在生产中原料充裕情况下, 为降低成本, 可适当减少酶的使用量。
2.4 中性蛋白酶最佳水解结果
中性蛋白酶按优化试验条件水解蚕蛹蛋白, 水解液经离心和过滤后, 取上清液用氨基酸分析仪测定其游离氨基酸含量, 结果如表8所示, 水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量0.768~13.701mg/100ml之间, 占氨基酸总量的36.982%。其氨基酸组成均衡, 水解产品可作为食品营养添加剂, 分离提纯后可作为医疗保健用品, 有广阔的应用前景。
注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。
2.5 碱性蛋白酶最佳水解结果
碱性蛋白酶在优化条件组合下水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 结果如表9所示, 色氨酸未检测, 水解液中含有17种氨基酸, 总含量为120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量在1.380~13.735mg/100ml之间, 占氨基酸总量的33.967%。必需氨基酸的比例接近于WHO/FAO制定的理想蛋白质组成标准, 该法是一种较为理想的蚕蛹蛋白水解方法。
注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。
3 小结
3.1
中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=7时, 最佳酶解条件为:酶解温度60℃、水解时间8h、、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 增加底物浓度可提高水解效率, 水解时间不宜太长。
3.2
碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=8时, 最佳酶解条件与中性蛋白酶相近, 延长水解时间, 酌情减少加酶量, 可降低水解成本。
3.3
利用蛋白酶单酶按正交试验优化条件组合水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 中性蛋白酶及碱性蛋白酶水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml、120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量分别在0.768～13.701mg/100ml、1.380～13.735mg/100ml之间, 分别占氨基酸总量的36.982%、33.967%。
3.4
蛋白酶水解蚕蛹蛋白是开发蚕蛹蛋白资源的有效途经, 且碱性蛋白酶优于中性蛋白酶。据报道, 蚕蛹蛋白质含有18种氨基酸, 组成合理, 比例均衡, 其中必需氨基酸含量之和超过40%, 非常符合FAO/WHO提出的氨基酸模式, 本试验酶解结果与其基本一致。表明酶解蚕蛹蛋白有利于保存其营养成分, 水解产物氨基酸组成合理, 可作为食品营养添加剂或分离提纯后可作为医疗保健用品, 如进一步制成氨基酸衍生物其应用领域将更为广阔。
3.5
本试验水解蚕蛹蛋白所得氨基酸含量偏低, 有待于进一步改进其工艺流程, 以提高蚕蛹蛋白的利用率。
参考文献
[1].徐秀兰主编.生物化学实验与指导[M].北京:中国医药科技出版社, 1994.17～21
[2].王钦德, 杨坚主编.食品试验设计与统计分析[M].北京:中国农业出版社, 2003.506