酶分子改造（精选7篇）
酶分子改造 篇1
淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的混合物, 工业用的大多数淀粉质原料以支链淀粉为主, 约有75% ~85%, 支链淀粉是由若干个 α - l, 6 糖苷键和 α -1, 4 葡萄糖链结合而成的高度分支多糖, 如不能被分解则会影响淀粉的利用率。普鲁兰酶是种能够专一性切开支链淀粉分支处的 α - 1, 6 - 糖苷键, 对水解支链结构的 α - 1, 6 糖苷键具有很强的作用, 能够剪下整个侧支以形成直链淀粉[1,2], 配合糖化酶和 α - 淀粉酶使用, 可以增加淀粉的利用率, 提高生产效率。曾有研究报道木薯淀粉在糖化开始时将普鲁兰酶与葡萄糖淀粉酶一起加入, 能加速淀粉和糊精的水解, 缩短糖化时间 ( 从72 h减少到48 h) , 增加葡萄糖的产率[3]。
目前已经发现许多能够产普鲁兰酶的微生物, 但是大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。在同步糖化发酵中, 配合糖化酶使用的普鲁兰酶如能具有与糖化酶相似的作用温度和作用pH, 则能实现淀粉质原料的充分利用, 大大开拓其市场。现在市场上所用普鲁兰酶均从丹麦诺维信公司进口, 该公司生产的普鲁兰酶在中国乃至世界市场占据了很大的份额。由于B. naganoensis的普鲁兰酶具有很好的酸性pH而受到关注, 近几年, 我国学者利用基因工程技术构建基因工程菌株也取得了一定的进展, 但只局限于实验室研究且酶活较低。为了改变对进口产品的依赖, 寻找一条国产化的道路, 作者进一步对长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因进行了初步改造, 从Bacillius naganoensis中克隆出原长普鲁兰酶基因和N -末端234 个碱基切除的普鲁兰酶基因, 经改造的普鲁兰酶基因比野生型基因小, 有利于质粒的稳定, 实现其在原核系统中的高效表达, 对酶学性质进行研究, 为普鲁兰酶酶制剂的开发及工业化生产、应用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒
菌株B. naganoensis ATCC 53909 购自德国。大肠杆菌JM109 和BL21 ( DE3 ) 、载体pET - 22b ( + ) 为作者实验室保藏。
1. 1. 2 酶和主要试剂
rTaq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ、均购于TaKaRa公司; 抗生素A、IPTG购自Sigma公司; 凝胶回收试剂盒、纯化试剂盒、质粒提取试剂盒为TG公司产品。
1. 1. 3 培养基
LB培养基 ( g / L) : 酵母粉5, 胰蛋白胨10, NaCl 10, pH值7. 0; 添加2% 琼脂为固体培养基。
1. 1. 4 引物
据引物设计原则和要求, 设计如下实验所需PCR引物:
pulA – F1: GTAGAATTCAGATGGGAACACCACAAAC;
pulA – F2: GTAGAATTCCATCGATTTAAGCAAAGG;
pulA – R: GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT。
1. 2 方法
1. 2. 1 大肠杆菌基因组DNA的提取、质粒酶切、连接、转化、大肠杆菌感受态制备
均按照文献[4]进行。
1. 2. 2 pulA基因重组表达质粒的构建
以B. naganoensis基因组DNA为模板, 以pulA – F1、pulA– F2、pulA - R为引物, 扩增pulA、pulA234 目的基因。反应体系: 每个反应30 个循环, 每个循环包括94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸2. 75 min; 最后72℃延伸10 min, 首次循环在95℃下预变性2 min。
胶回收目的片段, 将PCR扩增出来的pulA、pulA234 目的基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, 与经同样酶切的质粒pET -22b ( + ) 连接, 转化感受态细胞JM109, 菌体电泳、提质粒、酶切验证, 筛选得到的重组质粒命名为pET22b - pulA、pET22b- pulA234。
1. 2. 3 重组菌表达及其产物的SDS - PAGE电泳分析
将重组质粒pET22b - pulA, pET22b - pulA234、空载体pET - 22b ( + ) 为对照, 转化大肠杆菌BL21 ( DE3) , 挑单菌落转化子到液体LB ( 含氨苄青霉素) 培养基中, 37℃振荡培养至OD600为0. 4 时, 加浓度为1 mol/L的IPTG 100 μl, 37℃、220r / min进行诱导表达, 诱导14 h后, 取40 μl的发酵液和10 μl5 × 上样缓冲液, 混匀、煮沸10 min, 然后12 000 r / min离心10min, 取15 μl上清进行SDS - PAGE电泳分析。
1. 2. 4 普鲁兰酶酶活力测定[5]
取适当稀释的粗酶液100 μl, 底物pH 4. 6 的柠檬酸- 磷酸缓冲液 ( 含1%普鲁兰糖) 300 μl, 60℃条件下反应10 min, 加入400 μl DNS终止反应后于沸水浴煮沸5 min, 冷却, 在540nm波长下检测反应液的吸光度值。
酶活单位定义: 在相应条件下, 每分钟分解普鲁兰所释放的还原糖, 其还原力相当于1μ mol葡萄糖所需的酶量, 以1 U表示[5]。
1. 2. 5 重组酶学性质分析
在35 ~75℃的范围内进行酶反应最适温度的测定, 温度的稳定性采用将酶液分别置于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃ 、65℃ 下保温10 min, 冷却, 测定其残留酶活; 酶反应最适pH的测定在4. 0 ~ 6. 5 的范围内进行, pH稳定性的测定采用将酶液在与pH值3. 8、4. 2、4. 6、5. 0、5. 4、5. 8、6. 2、6. 6 的柠檬酸- 磷酸缓冲液混合, 室温下保温60 min后, 测定其残留酶活。
1. 2. 6 金属离子对普鲁兰酶酶活力的影响
将配制好的Na、Zn2 +、Fe3 +、Fe2 +、Co2 +、Mg2 +、Cu2 +、Ca2 +、Mn2 +分别与酶液和底物混合 ( 反应体系中, 金属离子终浓度为5 mmoL/L, 以不加金属离子CK为对照) , 反应10 min, 测定酶活力。
2 结果与分析
2. 1 pulA基因的PCR扩增
以B. naganoensis基因组DNA为模板, 以pulA – F1、pulA– F2、pulA - R为引物, 在rTaq酶作用下, PCR扩增普鲁兰酶目的基因, 扩增出的pulA、pulA234 目的基因片段大小为2. 7kb、2. 5 kb, 与预计大小一致。
2. 2 重组表达质粒的构建和酶切鉴定
将PCR扩增出来的pulA、pulA234 目的基因用EcoRⅠ和Xho Ⅰ进行双酶切, 与经同样酶切的质粒pET - 22b ( + ) 连接, 转化感受态细胞E. coli JM109, 菌体电泳以空质粒为对照选有滞后的转化子提质粒, 经测序正确的质粒命名为pET22b -pulA、pET22b - pulA234, 该重组质粒构建过程如图1。
重组质粒pET22b - pulA、pET22b - pulA234 的酶切验证如图2。结果表明, 重组质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后, 各产生2. 7 kb和5. 4 kb、2. 5 kb和5. 4 kb两条带, 分别与pulA、pulA234 和空载线性pET - 22b ( + ) 大小一致, 可见目的基因已经连接到载体pET - 22b ( + ) 上。测序分析结果也与GenBank数据库公布的序列一致, 可用于表达。
2. 3 普鲁兰酶基因的诱导表达
将重组质粒pET22b - pulA、pET22b - pulA234 和pET22b ( + ) 空质粒分别转化大肠杆菌BL21 ( DE3) , 重组菌经IPTG诱导表达之后, 对发酵液进行酶活力的测定, 与原始酶相比, 突变体发酵液的酶活为原来的19 倍, 所得样品进行SDS -PAGE分析, 与大肠杆菌BL21 ( pET) 相比得到了分子质量对应的目的蛋白带, 结果见图3。
2. 4 酶学特性的研究
2. 4. 1 酶反应最适温度研究
在pH 4. 6 缓冲液 ( 含1% 普鲁兰糖) 溶液、不同温度下测定酶活力, 以最高酶活为100%, 结果如图4 所示。由图4 可知, 该酶反应的最适温度为60℃, 在50 ~ 60℃ 保持有80% 以上的酶活。
M: λ HindⅢ DNA Marker; 1: PET22b - pulA recombinant plasmid digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 2: PET22b - pulA234 recombinant plasmid digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 3: Empty plasmid pET22b ( + ) digested by EcoRⅠand XhoⅠ.
M: Protein markers ( kDa) ; 1: E. coli BL21 ( pET22b ( + ) ) ; 2: E. coli BL21 ( PET22b - pulA) ; 3: E. coli BL21 ( PET22b - pulA234) .
2. 4. 2 酶反应温度稳定性研究
将酶液在35 ~65℃水浴保温10 min, 立即置于冰水中冷却, 在60 ℃下测定残余酶活, 以最高酶活为100%, 结果见图5。结果表明, 菌株的普鲁兰酶的温度稳定性较差, 40 ~ 55℃迅速失活, 60℃保温10min, 酶活仅存10%。
2. 4. 3 酶反应最适pH研究
用不同pH的缓冲液配制1%普鲁兰糖溶液, 温度60℃下测定酶活力, 溶液pH范围为4. 0 ~6. 5, 以最高酶活为100%, 结果如图6 所示。由图6 可知, 该酶反应的最适pH为4. 75, 在pH 4. 0 ~5. 0 都保持有80%以上的酶活。
2. 4. 4 酶的pH稳定性研究
将酶液在不同pH值的缓冲溶液 ( NaH2PO4- 柠檬酸缓冲体系) 中室温放置60min, 调pH 4. 6 测剩余酶活, 以最高酶活为100%, 结果见图7。由图7 可知, 在pH 3. 8 ~6. 6 时该酶有90% 以上的相对活性, 具有很好的耐酸性。
2. 4. 5 金属离子对酶活的影响
在反应体系中加入不同的阳离子Na+、Zn2 +、Co2 +、Fe3 +、、Fe2 +、Mg2 +、Mn2 +、Cu2 +、Ca2 +, 使其终浓度为5mmoL/L, 测定定酶活力, 以不加阳离子的空白对照 ( CK) 为100 %, 结果见图图8。由图8 可知, Cu2 +、Ca2 +对酶有明显的激活作用, 而Na、Zn2 +、Co2 +、Fe3 +、Fe2 +、Mg2 +、Mn2 +对酶有抑制作用。
3 讨论
来源于B. naganoensis的普鲁兰酶, 由于其具有很好的酸性pH而受到关注。利用基因工程技术在宿主中表达普鲁兰酶已成为研究热点。2011 年, 路福平等人[1]在大肠杆菌表达系统中对长野芽孢杆菌普鲁兰酶进行了表达, 发现粗酶液的酶活力比出发菌株提高了37 倍; 2013 年, 张燕[6]等人又对产酶培养基进行了优化, 获得最佳的产酶条件; 实验采用分子生物学技术, 参考Bacillus deramificans和Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶基因定点突变以及N - 末端改造[7], 对普鲁兰酶做了初步改造, 切除N - 末端78 个氨基酸残基, 进一步在大肠杆菌中了实现了B. naganoensis普鲁兰酶突变体pulA234 的成功表达, 得到酶活力较原始菌株提高19 倍的重组酶, 该酶具有良好的pH和酸稳定性, 是酸性偏中温酶, 最适作用pH为4. 6~ 5. 0, 在pH 3. 8 ~ 6. 6 范围内处理1 h, 酶活力还能达到最大酶活力的90 %以上。由于普鲁兰酶主要应用于以淀粉为主要原料的加工业, 为了可以更好的将普鲁兰酶与糖化酶配合使用, 实现淀粉质原料在同步糖化发酵中的充分利用, 因此开发高活力、性能好的普鲁兰酶将具有非常大的市场前景。本实验通过对长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因作初步的改造和研究, 为该酶的进一步高表达研究和工业应用奠定了基础。
摘要：目的:通过缺失原酶上氨基酸残基, 提高普鲁兰酶的酶活, 并对其突变体重组酶进行酶学特性研究。方法:以Bacillius naganoensis基因组DNA为模板, PCR扩增大小为2 781 bp的普鲁兰酶编码基因, 并通过PCR方法缺失原酶上的前78个氨基酸残基, 获得突变体PulA234, 将编码基因酶切连接到表达载体pET-22b (+) , 转化Escherichia coli BL21 (DE3) 。IPTG诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE和酶学特性研究。结果:突变体发酵液的酶活是原酶的19倍, SDS-PAGE电泳结果显示有明显特异性条带, 分子质量约为100 kDa。该突变酶的最适反应温度为60℃, 最适pH为4.75, 在pH 3.86.6范围内活性稳定, Cu2+、Ca2+对酶活有激活作用。结论:经改造的重组酶酶活力有所提高, 具有良好的pH和酸稳定性, 为普鲁兰酶酶制剂工业化生产及应用奠定基础。
关键词：普鲁兰酶,长野芽孢杆菌,酶分子改造,酶学性质
参考文献
[1]路福平, 刘逸寒, 张艳, 等.高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法[P].CN 102226166A, 2011-10-26.
[2]Jensen BF, Norman BE.Bacillus adidopullulytiaus pullulanse application and regularory aspecis in the food industry[J].Process Biochem, 1984, (19) :129-134.
[3]温其标, 陈玲, 罗发兴, 等.普鲁兰酶对木薯淀粉糖化的影响[J].粮食与饲料工业, 1997, (12) :33-34.
[5]Bibel M, Brett C, Gosslar U, et al.Isolation and analysis of amylolytic enzymes of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritime[J].FEMS Microbiol Lett, 1998, (158) :9-15.
[6]Yan Zhang, Yi-han Liu, Yu Li, et al.Extracellular expression of pullulanase from Bacillus naganoensis in Escherichia coli[J].Ann Microbiol, 2013, 63:289-294.
[7]Turkenburg JP, Brzozowski AM, Svendsen A, et al.Structure of a pullulanase from Bacillus acidopullulyticus[J].Proteins, 2009, 76 (2) :516-519.
酶分子改造 篇2
1 酶催化合成方法
酶催化合成可以采用具有不同官能团的引发剂(如醇类或者芳香树脂),进行催化开环聚合,合成具有不同端基的功能高分子,如羟基、羧基等,这些基团的引入可改变聚合物的亲水性和生物降解性,拓宽了聚合物的应用领域[7]。
1.1 不同反应时间合成不同端基的高分子
以甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)作为引发剂,固定化脂肪酶Novozym-435为催化剂,内酯如ε-己内酯(CL)和ω-十五内酯(PDL)可进行开环聚合反应[8],不同的反应时间,将得到不同端基的聚合物。将实验设计为3个反应时间段,分别为24h、48h和72h,如图1所示,其中,R基团可为H或甲基丙烯酸酯基团,PDL(m=11),CL(m=2)聚合物分子量取决于单体与引发剂的摩尔比率。CL的开环聚合可以由HEA或HEMA引发,聚合所得的材料可以进一步用于接枝共聚。
1.2 不同引发剂合成遥爪聚合物
12-内酯(DDL)在脂肪酶lipase-B的催化下,同时加入引发剂乙烯基丙烯酸甲酯,可制备甲基丙烯酸酯型聚酯大分子单体。当使用癸二酸二乙烯酯作为引发剂时,则可以聚合生成两端带有羧酸基团的遥爪型聚酯[9](反应图略)。
Magnus Eriksson 等以2-羟乙基甲基丙烯酸乙酯(HEMA),乙二醇,己二酸二乙烯酯为反应单体,固定化脂肪酶Lipase B为催化剂,在60℃下进行“一锅法”减压聚合反应(72mbar)[10],反应24h,单体转化率可达95%,所得产物中以丙烯酸甲酯为端基的占90%。
2 酶催化法直接缩合反应
2.1 酶催化法合成高聚物
以固定化酶Novozyme-435为催化剂,在液-固混合体系中1,4-丁二醇与丁二酸缩聚经酶催化合成聚丁二酸丁二酯(PBS)[11],得到最佳反应条件为:丁二酸与1,4-丁二醇的物质的量的比为17∶23,Novozyme-435用量为底物总质量的7%,聚合温度为65℃(反应方程略)。以底物总质量200%的二苯醚为反应介质,真空条件下聚合48 h,PBS的最大Mw可达到50800(Mw/Mn=1.36)。实验表明,影响PBS聚合效果的最主要因素是丁二酸在反应介质中的溶解程度和副产物水的去除程度。
2.2 酶催化法合成齐聚物
2.2.1 二元酸酯与二元醇反应
采用酶催化法,在无机和有机溶剂中,以脂肪酶Novozyme-435为催化剂,丁二酸二乙酯和l,4-丁二醇(1,4-BDO)为单体,制备聚丁二酸丁二醇酯(PBS)[12],Mw分别达到2009和5295,如图2所示。研究结果表明:80℃时脂肪酶表现出最好的催化活性;70℃时所合成PBS的Mw/Mn最佳,并且Mw随反应时间的增加而增加;同时得到高Mw和低Mw/Mn的良溶剂是二苯醚;水含量、反应物浓度和酶浓度分别是影响Mw,Mw/Mn和产率的主要因素。
2.2.2 羟基羧酸聚合反应
Rajesh Mathur等[13]采用酶催化聚合方法,以2-氨基-4-甲硫基丁酸即L-蛋氨酸(Met)和2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMB)为单体合成低分子量的齐聚物,实验结果表明,HMB处于Met 和HMB共聚物链的末端。
Matsumura等[14]采用不同碳链的羟基酸为研究对象,如12-羟基十八酸、12-羟基十二酸、12-羟基-cis-9-十八烯酸和16-羟基十六酸,以脂肪酶CC(Candida Cylindracea)催化剂,研究表明,十二羟基酸在异辛烷中,温度为35℃下反应72h,得到了分子量1260的聚羟基酸酯齐聚物,转化率高达99%。
3酶催化聚合与原子转移自由基聚合(ATRP)相结合的方法
酶是一种生物催化剂,与传统的化学金属有机催化剂相比具有环境友好、反应条件温和、反应效率高、作用底物专一和资源可再生等优点。大分子单体可以通过活性聚合的方法制备,如活性自由基聚合[15,16,17]。将这两种方法结合可以获得多种功能高分子嵌段物。
3.1 AB型嵌段功能高分子的合成
沙柯等[18,19]利用酶催化和ATRP方法将2,2,2-三氯-10-羟基癸酸(HD)和苯乙烯合成了AB型嵌段共聚物 PHD-b-PSt,产物可在水溶液中自组装形成纳米胶束。产物通过红外等表征手段证明了嵌段共聚物的存在,该共聚物具有微相分离结构,是由部分结晶的PHD引起。
聚己内酯(PCL)与聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)[20,21]首先通过酶催化开环聚合,生成端基为三氯取代基的PCL形成的大分子引发剂,再进行原子转移自由基聚合,就可得到一种新型嵌段块的碳氢化合物组成的共聚物(PCL-b-PGMA),动力学分析可得该聚合反应是可控的,该聚合物可在水溶液中自组装形成纳米胶束(聚合过程图略)。
3.2 ABA型功能高分子的合成
采用固定化酶Novozym-435催化1,10-癸二酸与l,10-癸二醇酶可得到端基为羟基的聚酯(PSD),再用α-溴代丙酰溴将聚酯的端羟基官能化形成双官能度引发剂,在CuCl/bpy体系中,与苯乙烯进行ATRP反应便得到三嵌段共聚物:聚(苯乙烯)-聚(1,10-癸二酸/1,10-癸二醇酯)-聚(苯乙烯)(PSt-b-PSD-b-PSt)[22]
3.3 A2BA2型功能高分子的合成
采用酶催化剂Novozym-435,乙二醇引发己内酯(ε-CL)酶促开环聚合,再用三乙胺作催化剂,将PCL端羟基与2,2-二氯代乙酰氯反应,生成四官能度大分子引发剂,引发甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)的ATRP聚合,合成了H型三嵌段共聚物(PGMA)2-b-PCL-b-(PGMA)undefined。嵌段共聚物的结构通过核磁共振和凝胶渗透色谱(GPC)得到了确证,其分子量分布为1.32,分子量为32000。此嵌段共聚物分子量可控,多分散度低,具有良好的生物相容性,在药物传输、生物酶固定和生物医学材料等方面具有一定的应用价值,如图3。
3.4 ABCBA型功能高分子的合成
采用脂肪酶促开环聚合(eROP)和ATRP,可以合成对称线性CBABC型三元共聚物,该共聚物由聚(环氧乙烷)(PEO)、聚己内酯(PCL)和聚苯乙烯(PSt)组成[24]。首先,端基为二羟基的PEO在生物酶Novozyme-435催化下首先引发的c-CL的开环反应,随后,由此产生的二羟基终止共聚物 PCL-b-PEO-b-PCL 转化为以溴结束并与之形成了α-溴丙酰溴酯化嵌段大分子,再加入苯乙烯,进行ATRP反应获得共聚物PSt-b-PCL-b-PEO-b-PCL-b-PSt,动力学分析表明它是一种有活性的可控自由基聚合。A-B-C-B-A型共聚物的自组装在水介质中进行,可形成球形胶束、棒状胶束、囊泡和片层。
3.5 具有特殊分子结构的功能高分子的合成
Y形嵌段共聚物是一种特殊的星形聚合物,由于其独特的形态和相行为已引起关注。Zhang和Li等[25,26]结合eROP与ATRP方法,将己内酯(CL)与GMA聚合得到Y型嵌段共聚物,反应中Novozym-435催化己内酯形成大分子引发剂,在进行ATRP反应,与GMA形成共聚物。经GPC测试,其分子量分布小于1.4,说明聚合反应可控性好。共聚物在水溶液中自组装,其胶束形态可为球形、片层等。
超支化脂肪族聚酯P(ε- CL)[27]的合成,首先采用Novozyme-435对BHB(2,2-双(羟甲基)丁酸)与己内酯进行ROP聚合,对含有端羟基的P(ε- CL)链进行α-溴丙酰溴处理,就可获得超支双官能大分子(如可用于St的ATRP聚合)。以CuCl/HMTETA为ATRP合成体系中的催化剂,也获得超支化聚合物聚苯乙烯-b-聚(2,2-双(羟甲基)丁酸)。
梳形共聚物具有很高的分子内有序性,它有异乎寻常的固态及液态性能。刘瑞雪等[28]以ε-CL,丙烯酸乙烯脂和聚乙二醇单甲醚等为反应物,在Novozym-435的催化下,先合成丙烯酰氧基聚己内酯-b-聚乙二醇单甲醚大分子单体(MPEG-b-APCL),再以MPEG-b-APCL作为大分子单体进行原子转移自由基聚合,得到带有接枝链的梳形共聚物。
4 结语
酶催化反应往往具有高选择性、高转化率、反应条件温和、耗能低,副反应和副产物少等优点,合成的聚合物具备良好的生物可降解性。酶催化聚合反应由于酶的价格偏高、实验条件限制等原因,工业上很少采用酶催化聚合获得功能高分子。然而,最新的技术已经可以采用连续填充床反应器或者微反应器等使连续生产得以进行,生产成本将降低且产品质量更加稳定。相信不久的将来,在工业上实现酶催化连续生产制备功能高分子。
摘要：酶催化聚合是一种新型的聚合方式,它在温和的反应条件下进行,与传统聚合工业中的金属有机催化剂相比,天然的生物酶具有高效性、高选择性、绿色环保性等优点。本研究主要综述酶催化合成新型功能高分子的研究进展。
酶分子改造 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2006年10月—2009年10月收住院的56例脑梗死患者, 起病在72h内, 符合1995年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准, 均经颅脑CT或MRI扫描证实。按就诊先后随机数字表, 分为巴曲酶联合低分子肝素钠治疗组 (治疗组) 和低分子肝素钠治疗组 (对照组) 。治疗组28例, 男16例, 女12例;年龄40～80岁, 平均 (66.6±9.0) 岁。对照组28例, 男17例, 女11例;年龄43～79岁, 平均 (65.7±9.7) 岁。排除年龄超过80岁, 既往有脑脑梗死史、短暂性脑缺血发作、近期曾做过大手术或有严重外伤、凝血机制障碍有出血倾向、消化性溃疡、心源性脑栓塞、大面积脑梗死、血浆纤维蛋白原 (FIB) 浓度过低 (<1g/L) 的患者。
1.2 方法
1.2.1 进展性脑梗死的诊断
起病6h后病情仍在进展, 符合下列条件之一: (1) 瘫痪肢体肌力较入院时下降Ⅱ级或Ⅱ级以上; (2) 神经性功能缺损评分 (SSS评分) 增加9分或以上, 或SSS评分增高≥18%。颅脑CT复查排除梗死后出血、其他血管发生了新梗死、严重脑水肿或因严重的感染、高热、心功能不全所致的病情进展即诊断为进展性脑梗死。
1.2.2 治疗方法
在常规治疗基础上, 治疗组第1天给予巴曲酶 (DF-521, 北京托毕西药业有限公司) 10BU+0.9%氯化钠注射液150ml静脉滴注, 在60min内滴完, 第2、3天各5BU静脉滴注, 并给予低分子肝素钠2500单位2次/d, 腹部皮下注射, 连用7d。对照组在常规治疗的基础上, 给与低分子肝素钠2500单位, 腹部皮下注射, 2次/d, 连用7d。
1.3 观察指标
采用全自动凝血分析仪监测治疗前及治疗结束后次日凝血活酶时间 (PT) 、凝血酶时间 (TT) 、活化部分凝血活酶时间 (APTT) 及血浆纤维蛋白原 (FIB) 。用药期间密切观察有无颅内出血及其他脏器出血情况, 1周内反复查颅脑CT, 症状加重者立即复查。根据1995年第四次全国脑血管病会议修订的脑脑梗死SSS评分标准和治疗效果制定标准及日常生活能力评分标准, 评定治疗前及治疗后4周神经功能缺损情况及日常生活能力。
1.4 统计学方法
计量资料以 (
2 结果
2.1 进展性脑梗死发生情况比较
治疗组有1列 (3.6%) 发生进展性脑梗死, 而对照组有7例 (24.1%) , 两组比较差异有统计学意义 (χ2=4.97, P<0.05) 。
2.2 两组疗效比较
两组治疗前SSS评分间差异无统计学意义 (P>0.05) 。治疗后4周治疗组SSS评分显著低于对照组, 差异有统计学意义 (t=4.77, P<0.01, 见表1) 。
2.3 治疗组治疗前后凝血功能变化
治疗组治疗12h后PT、TT、APTT延长, FIB浓度降低, 与治疗前比较差异有统计学意义 (t=3.44～13.28, P<0.01) 。但均在正常范围内 (见表2) 。
2.4 副作用
治疗组在治疗过程中未发现有颅内出血及内脏出血者, 仅见腹壁青紫者10例。
3 讨论
近年来, 国内外大多数学者认为溶栓疗法可能成为急性脑梗死最有效、最有前途的治疗方法, 溶栓治疗应在发病6h内完成。然而, 国内脑梗死患者6h内就诊率仅为15%, 85%的患者就诊时已错过最佳的治疗时机。进展性脑梗死多数发生在病后6h～1周, 其原因有血栓的扩展, 血管或侧支血管的阻塞, 脑水肿, 严重的感染及高热, 另外还有心功能不全, 并发出血及肿瘤等, 但大多数系因血栓扩展所致。进展性脑梗死发生率较高, 颈内动脉系统约占28%, 椎基底动脉系统约占54%。阻止症状的加重和进一步恶化, 使神经功能缺损在短期内得到较明显的恢复, 将可挽救更多的脑梗死患者, 减少残疾率, 提高脑梗死患者生活质量, 减轻社会和家庭负担。近3年来, 我们采用巴曲酶联合低分子肝素钠治疗进展性脑梗死, 取得了满意的疗效。
巴曲酶分子结构为单链糖蛋白, 其肽链有231个氨基酸组成, 相对分子质量36000。资料表明, 巴曲酶有广泛的生物学效应, 除降解血浆纤维蛋白原, 促进t-PA释放外, 还具有降低血黏度、外周血管阻力和扩张冠状动脉等作用。研究发现, 在脑梗死后单独使用巴曲酶颅内出血不增加, 巴曲酶和尿激酶联合应用也不增加颅内出血[3], 提示巴曲酶具有较好的安全性。低分子肝素钠具有抗因子Xa、抗凝血酶 (FIIa) 活性作用, 并能促进组织因子途径抑制物 (TFPI) , 较普通肝素的出血副作用少, 能预防溶栓后在梗死。此外, 我们选用巴曲酶联合低分子肝素钠治疗进展性脑梗死, 并与低分子肝素钠随机对比研究。结果显示, 治疗后4周治疗组患者SSS评分显著低于对照组, 说明巴曲酶联合低分子肝素钠能促进缺血性脑梗死患者神经功能恢复。同时, TT、PT、APTT轻度延长, 但均在正常范围内。此外, 治疗组出血副作用相对较轻, 末发生颅内及其他脏器出血等严重副作用。总之, 巴曲酶联合低分子肝素钠预防进展性脑梗死是安全、有效的。
参考文献
[1]王维治.神经病学[M].北京:人民卫生出版社.2006:740.
[2]国红, 张晓燕, 王新德, 等.急性脑卒中患者来诊时间和CT确诊时间的观察[J].中华神经科杂志, 1996, 26 (6) :332-335.
酶分子改造 篇4
1实验
1.1原料及试剂
1-[2-(4-苯基偶氮苯氧基)乙基]吡啶溴化铵(AZO)和含碲金刚烷客体分子(ADA-Te)均根据本课题组前期报道的方法合成[16]。枯烯过 氧化氢 (CUOOH)、4-硝基苯硫 酚(NBT)、3-羧基-4-硝基苯硫 酚 (TNB)、氮异丙基 丙烯酰胺(NIPAM)和双氧水从南宁蓝天实验设备有限公司购买。图1为各试剂的结构示意图。
1.2实验仪器
紫外可见光光谱仪 (普析T6新世纪);pH计 (MettlerToledo320);动态光散射仪(Malvern-ZetaSizerNanoZS);核磁共振仪(BRUKERAM-500);凝胶色谱仪(日本岛津SHIMASDZUCBM-20Alite);冻干机(北京四环LGJ-10C);扫描电子显微镜 (JEOLFESEM6700F);透射电子 显微镜 (JEOLJEM3010)。
1.3聚合物的合成及表征
聚合物利用原子转移自由基聚合 (ATRP)技术进行合成。其中,大分子引发剂(CD-Br)和环糊精主体聚合物(PNIPAM-CD)根据本课 题组前期 报道的方 法合成[16]。PNIPAM-CD的合成路 线见图2。GPC表征结果 如下:Mn为14730,Mw为15030,PDI为1.021,聚合度为117。
1.4仿生硒酶的结构性质表征
为了验证PNIPAM-CD中的环糊精与ADA-Te中金刚烷形成复合物,利用同样能够和环糊精复合的1-[2-(4-苯基偶氮苯氧基)乙基]吡啶溴化铵(AZO)为竞争客体分子进行表征,测试的相关复合物溶液按如下方法制备。
复合物1:将主体聚合物PNIPAM-CD(0.001mmol)和AZO(0.0005 mmol)溶解在0.5 mLD2O中,20℃超声20min形成待测试的复合液。
复合物2:将主体聚合物PNIPAM-CD(0.001mmol)和ADA-Te(0.0005mmol)溶解在0.5mLD2O中,20℃超声20min形成复合液(PNIPAM-CD-Te)。然后,再向复合体系中加入AZO(0.0005mmol),20℃超声20min形成待测试的复合液。
利用核磁分析AZO的芳环部分化学位移的变化来证明复合物的形成。
此外,仿生硒酶的LCST测试、SEM测试、动态光散射测试和酶活力分析均按照前期报道的方法进行[15,16]。
2结果与讨论
2.1仿生硒酶的制备及结构表征
对天然GPx的结构表征表明,对GPx催化活力起决定作用的是其硒代半胱氨酸部位[17]。前期研究表明,与含硒类仿生硒酶相比,含碲仿生硒酶具有更高催化活力[3,12,14]。因此,在本工作中,设计合成了修饰有金刚烷的客体分子ADATe来模拟天然GPx的催化中心(如图1所示),并合成了修饰有环糊精的聚氮异丙基丙烯酰胺主体聚合物(PNIPAMCD),用以研究其聚合物骨架对GPx催化活力的调控机制。以ADA-Te和PNIPAM-CD为组装基元,利用环糊精与金刚烷的主客体作用制备了温度响应的超分子仿生硒酶 (PNIPAM-CD-Te),其制备过程如图3所示。
为了证明PNIPAM-CD-Te中环糊精/金刚烷复合物的形成,利用AZO作为竞争客体分子,通过核磁检测AZO中芳香环化学位移的变化,间接证实复合物的形成。如图4所示,复合物1和复合物2中,AZO中芳香环化学位移明显不同。与复合物2相比,复合物1中AZO的Ha、Hb、Hc、Hd的化学位移明显向低场移动,Hg的化学位移明显向高场移动,Hh 的信号峰为包峰。复合物1中系列核磁信号的变化是由于在复合物1中,AZO与环糊精形成复合物导致的。而在复合物2中,PNIPAM-CD的环糊精空腔被ADA-Te所占据,不能再与AZO复合,这与已报道的实验结论一致[15,16]。因此,以上实验结论可以证明PNIPAM-CD-Te中的环糊精与ADA-Te的金刚烷形成了 主客体复 合物,即成功地 制备了PNIPAM-CD-Te。
此外,通过测定PNIPAM-CD和PNIPAM-CD-Te的LCST的变化,复合物的形成得到了进一步证实。首先,测试了600nm下PNIPAM-CD和PNIPAM-CD-Te的透光率随温度变化的趋势(图5),其中,PNIPAM-CD和PNIPAM-CDTe的LCST分别为32.4℃和31.7℃。PNIPAM-CD-Te的LCST比PNIPAM-CD的LCST更低,这可能是由于疏水客体分子ADA-Te的引入使PNIPAM-CD-Te的疏水性更强所致,类似的实验现象同样已有报道[15]。这一结论进一步证实了PNIPAM-CD-Te被成功地制备出来。
2.2仿生硒酶的酶学性质分析
本研究中,PNIPAM-CD-Te的催化活力是在Hilvert教授报道方法的基础上加以改进测定的[18],酶催化反应式见图6,催化活力是假设一个碲原子为仿生硒酶的一个催化中心来进行计算的,各种条件下测定的催化活力如表1所示。
首先,从表1可见,以TNB、CUOOH为底物在25~45℃间选择不同温 度对PNIPAM-CD-Te的催化活 力进行测试,其催化活力随温度的升高逐渐改变。为了更加直观地反映PNIPAM-CD-Te催化活力随温度变化的趋势,绘制了如图7所示的催化活力随温度变化 曲线。当温度 低于32℃时,随着温度的 升高,PNIPAM-CD-Te的催化活 力缓慢增加;而当温度升高到32~37℃之间时,催化活力 大幅度增加;当温度达到37℃以上并继续升 高时,催化活力 略微降低。由此可见,PNIPAM-CD-Te的催化活力 表现出了 典型的温度响应特性。
其次,由表1可见,PNIPAM-CD-Te在37℃时具有最高催化活力。因 此,本研究在37℃条件下,以TNB和CUOOH为底物对PNIPAM-CD-Te的饱和动力学等酶学性质进行测试。如 图8所示,固定底物TNB的浓度 (0.15mmol·L-1),改变CUOOH的浓度(0.05mmol·L-1,0.10mmol·L-1,0.25mmol·L-1,0.5mmol·L-1,1.0mmol·L-1,2.5mmol·L-1,5.0mmol·L-1)测得PNIPAM-CD-Te催化反应的饱和动力学,其表观动力学常数为:Vmax=15.52μmol·L-1·min-1,kcatapp=15.52 min-1,KmCUOOH=501.9-μmol·L-1,kcatapp/KmCUOOOH=3.09×104(mol·L-1)-1·min-1,PNIPAM-CD-Te展现出典型的酶催化饱和动力学行为。
2.3仿生硒酶的催化机制研究
由图7可见,PNIPAM-CD-Te表现出典 型的温度 响应催化活力。对于天然酶而言,细微的结构变化可能导致天然酶催化活力的较大变化。因此,预测温度响应过程中,PNIPAM-CD-Te自组装结构的变化可能是导致其催化活力具有温度响应特性的根本原因。
为了证明这一预测,对不同温度下PNIPAM-CD-Te的自组装结构进行了表征。如图9所示,利用动态光散射仪对不同温度下溶液 中PNIPAM-CD-Te的水合半 径进行了 测试。其中,25℃、28℃、35℃、37℃和45℃下的水合半径分别为7.5nm、8.75nm、91.35nm、105.7nm和295.4nm。综合分析图7和图9可见,当温度低于PNIPAM-CD-Te的LCST时,PNIPAM-CD-Te的水合半径较小(小于10nm),即聚合物骨架和GPx催化中心(ADA-Te)均匀分散在溶液中,没有形成聚集态,此时催化活力较低。随着温度的升高,当温度高于PNIPAM-CD-Te的LCST时,PNIPAM-CD-Te的水合半径迅速变大,形成水合半径约100nm的聚集体。图10为37℃测得的扫描电镜照片,可以直观地观察到此时PNIPAM-CD-Te形成了100nm左右的球状组装体。此时,聚集体的形成是由于温度响应后PNIPAM-CD-Te骨架由亲水性转变为疏水性导致的。在此条件下,聚合物骨架和GPx催化中心形成紧密的聚集结构,疏水的聚合物骨架在催化中心周围形成疏水微环境,能够更加有效地识别酶催化底物,因此催化活力得到迅速提高。而当温度达到37℃以上并继续升高时,催化活力 略微降低,这可能是 由于温度 较高时,PNIPAM-CD-Te会形成更大尺寸的聚集体(水合半径约300nm),会将部分催化中心包埋在聚集体中,阻碍催化中心与底物结合,进而在一定程度上会降低催化活力。由此可见,在温度响应过程中,聚合物自组装结构发生变化,会形成有利于酶催化反应进行的疏水微环境,进而有利于增加酶催化活力。根据上述实验结果,绘制了温度响应过程中聚合物自组装结构的变化调控仿生硒酶催化活力的示意图(见图3)。
为了进一步证实聚合物自组装结构变化过程中,形成的疏水微环境对调控催化活力的重要作用,设计了4个不同的活力测试体系进行研究。如图11所示(催化速率见表1),CUOOH,TNB体系,v0=4.92μmol·L-1·min-1;H2O2,TNB体系,v0=1.83μmol·L-1·min-1;CUOOH,NBT体系;v0=5.24μmol·L-1·min-1;H2O2,NBT体系,v0=2.79μmol·L-1·min-1。与TNB不同是,NBT少一个羧基,因此NBT的水溶性相对较差。而NBT作为底物的催化活力比TNB作催化底物的活力更高(图11,A<C,B<D),这说明PNIPAM-CD-Te中形成的疏水环境对疏水性强的底物具有更强的结 合能力,进而催化 活力更高。与 此类似,CUOOH和H2O2 的不同是,枯烯基的存在使CUOOH的疏水性更强,CUOOH作为底物的催化活力比H2O2 作催化底物的活力更高(图11,A>B,C>D)。这也是由于CUOOH是疏水的分子,其与PNIPAM-CD-Te内部形成的疏水微环境正好匹配,PNIPAM-CD-Te对CUOOH底物的结合能力更强导致的。所以,CUOOH作为底物的催化活力更高,这也进一步证明了在温度响应过程中,疏水微环境的形成对提高疏水底物的反应速率具有重要作用。
因此,综合以上分析可以得出结论,温度响应过程中聚合物自组装结构的变化是导致PNIPAM-CD-Te催化活力具有温度响应特性的根本原因。
3结论
(1)利用核磁表征证明PNIPAM-CD-Te中的环糊精与ADA-Te的金刚烷形 成了主客 体复合物,通过测定PNIPAM-CD和PNIPAM-CD-Te的LCST分别为32.4℃和31.7℃,其LCST的不同进一步证实复合物的形成,即PNIPAM-CD-Te被成功制备。
(2)利用动态光散射表征表明,25℃、28℃、35℃、37℃和45℃下,PNIPAM-CD-Te的水合半 径分别为7.5nm、8.75nm、91.35nm、105.7nm和295.4nm;水合半径的变化证明PNIPAM-CD-Te聚合物骨架在温度响应过程中会发生自组装结构的变化。
(3)以TNB、CUOOH为底物在25~45℃间选择不同温度对PNIPAM-CD-Te的催化活 力进行测 试。研究表 明,PNIPAM-CD-Te的催化活力在25~45℃内具有典型的温度响应特性,37℃时具有最高催化活力(υ0=4.97 mmol·L-1·min-1);同时,PNIPAM-CD-Te还展现出典型的酶催化饱和动力学行为。
酶分子改造 篇5
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2005年5月至2008年5月期间共收治的60例UPA患者, 除外急性心肌梗死及使用东菱可栓酶、肝素的禁忌证。其中初发劳力型心绞痛24例, 恶化劳力型心绞痛11例, 梗塞后心绞痛25例, 其中男46例, 女14例;平均年龄62±7.5岁。按时间顺序随机分组:治疗组、对照组各30例, 两组年龄、性别、类型、病情无显著性差异 (P>0.05) 。均具有可比性。
1.2 治疗方法
治疗组在常规治疗基础上加用东菱克栓酶首剂量为10U溶于250 ml生理盐水缓慢静脉滴注 (1 h以上) 。以后5U隔天一次共二次。多在治疗后1 d显效, 以发病6 h内开始治疗者为佳。低分子肝素钙5000 U脐周皮下注射, 2次/d, 连用7 d, 7 d内监测2次凝血酶时间。对照组仅给常规心绞痛药物 (静滴硝酸脂制剂, 口服β受体阻滞剂, 转换酶抑制剂及抗血小板聚集药)
1.3 疗效评价
①显效:心绞痛基本小于或减少80%以上, 休息时心电图恢复正常或大致正常;②有效:心绞痛减少50%以上, 心电图ST段改善≥50%, T波由低平变为直立;③无效:达不到上述标准。
1.4 统计学方法
计量资料以均数±标准差
2 结果
2.1 心绞痛缓解情况
见表1。
注:与对照组比较*P<0.01
2.2 心电图改善情况, 见表2。
注:与对照组比较, *P<0.01
2.3 不良反应
治疗组仅见1例牙龈岀血, 两组血凝4项指标、肝肾功能及血尿常规均无明显变化。
3 讨论
UAP的主要发病机制为冠状动脉内粥样斑块破裂出血, 胶原纤维暴露, 诱发局部血小板聚集及凝血系统激活等一系列反应, 同时血栓素A2及5-羟色胺等缩血管物质释放, 前列环素减少, 引起冠状动脉痉挛, 形成不全阻塞性血栓即白色血栓, 而AMI大多数为红色血栓, 且UAP血栓形成是一连续的、亚急性过程。具有反复性和进行性特点[2]。按AMI溶栓方案不易维持疗效, 且临床上尚有争议。我们遵循随机对照原则, 在常规治疗基础上, 加用东菱克栓酶联合低分子肝素钙治疗UAP 30例连续治疗一周, 达到充分溶解血栓、改善血流作用。后者还具有抑制血小板、凝血酶原和凝血因子, 降低血液粘稠度, 促进侧支循环的作用, 结果令人满意, 临床症状和心电图改善总有效率分别达93.3%和86.7%, 未见严重的岀血等不良反应。因此东菱克栓酶联合低分子肝素钙治疗UAP及预防UAP进展为AMI, 方法简便。安全可靠, 疗效满意, 适合基层医院推广应用。
关键词：东菱克栓酶,低分子肝素,不稳定型心绞痛
参考文献
[1]陈红林, 等.不稳定性心绞痛溶栓治疗现状的评述.中华心血管病杂志, 1997, 25:409-410.
酶分子改造 篇6
固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料。无机载体具有造价低廉、表面性质易调控、化学稳定性好、环境友好等优势, 倍受关注, 是生物酶分子固定化载体的重要研究方向[6]。其中介孔载体具有均匀可调的孔道、多变的组成、较大的孔容、很大的比表面积和较高的热稳定性, 在释放催化、药物分离等领域有着非常重要的应用前景[7—14], 在固定化酶载体中很有应用前途[15]。自1992年[16,17]首次合成介孔氧化硅以来, 便在吸附[18]、催化[19]、分离[20]等领域得到广泛应用。1996年Díaz等[21]首次利用介孔载体MCM—41进行酶的固定化, 此后, MCM、SBA等不同系列的介孔载体均成功应用于固定化酶, 成为固定生物酶分子的主要支撑载体[22,23]。
SBA系列中介孔分子筛SBA—15由于孔道表面具有丰富的弱酸性自由硅羟基, 可作为活性点与一些功能有机分子反应, 引入酸性碱基、疏水或亲水基团及选择性的吸附基团等, 形成新的稳定性较强的功能材料, 成为固定化酶的优良载体[24—26]。本文以功能化介孔分子筛SBA—15为核心, 介绍有关功能化SBA—15用于固定化不同酶分子的研究新进展。
1 酶固定化方法
常用的酶的固定化方法分为:物理方法 (如吸附法﹑包埋法等) 和化学方法 (如交联法﹑共价结合法) 。物理方法是利用分子筛表面的弱酸性硅羟基 (—Si OH) 与酶分子的氨基通过氢键等作用而将酶分子固定于载体表面。化学方法是将酶分子通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上, 或连接到无机载体上而制成不溶性的酶的方法。如图1所示, 生物酶在介孔材料上的固定化方法主要有四种:吸附法, 共价键合法, 交联法, 包埋法[27]。
(a吸附法;b包埋法;c交联法;d共价键合法)
王炎等[28]通过物理吸附法将漆酶固定到MCM—41上, 结果表明:当p H为3、酶/载体为62.5 mg/g、吸附时间为12 h时, 漆酶的固定效果最好, 且酶活回收率为50%, p H和热稳定性均比游离酶好。Li等[29]将猪胰脂肪酶 (PPL) 吸附固定在SBA—15上, 结果表明:SBA—15的孔道内部固定了PPL酶且保持了其规则的介孔结构, 60℃仍然保持很好的热稳定性;且反应2 h后仍保持63%的活性。Liu等[30]利用结构形态不相同的介孔氧化硅吸附固定溶菌酶, 结果表明:孔径和孔容最大的载体酶的吸附量最大, 达536 mg/g;表面粗糙的载体吸附速率很高。高波等[31]研究了不同孔径介孔载体材料对青毒素G酰基酶 (PGA) 的包埋固定, 结果表明:孔径为12 nm的SBA—15固定PGA的稳定性优于孔径为6 nm的SBA—15和孔经为24.5 nm的MCF, 可能原因是孔径过小使酶只能在外表面吸附, 孔径过大则容易使酶泄露。Takimoto等[32]利用不同孔径的SBA—15载体材料通过包埋法固定纤维素酶, 结果表明:孔径越大, 载酶量越大, 且当孔径为8.9 nm时固定的纤维素酶活力最高。
Salis等[33]研究利用功能化的介孔载体材料通过化学吸附法固定漆酶, 发现固定化过程达到平衡的时间约为100 min, 该类载体固定化酶的酶活力最大达217 k U/g。Gao等[34]将皱褶假丝酵母脂肪酶吸附固定到载体材料SBA—15上, 通过加入壳聚糖和戊二醛对固定的酶进行交联反应。结果表明:给固定化酶活高于游离酶, 且在连续使用6次后其活力仍然保持在80.5%。Kannan等[35]利用碳化二亚胺对介孔材料SBA—15和MCF表面进行修饰, 并对碱性丝氨酸内肽酶交联固定, 研究固定化酶的动力学参数。Lu等[36]利用不同的有机基团对MCF进行表面修饰, 这样可以减弱酶吸附过程中酶分子间的抑制效应, 有利于溶菌酶的固定。王华等[37]通过微波辐射法共价固定青毒素G酰基酶 (PGA) 得到固定化PGA, 其相对活力比常规固定化方法提高了34.5%, 且大大缩短了酶的固定化时间。
与游离酶相比, 酶固定化后, 由于载体的保护作用避免了多种不利因素对酶的影响, 使酶活性构象的牢固程度得到增强, 酶与酶之间的相互作用得到限制。其中尤以化学固定法作用最好, 该方法可以将载体材料功能基团与生物酶上非活性基团通过交联或共价结合法牢牢的固定到一起, 充分保留酶分子的活性结构中心, 增强酶的稳定性, 实现生物酶的可重复利用, 使其与底物和产物容易分离, 降低生产成本。
2 介孔分子筛SBA—15功能化与酶固定
介孔分子筛SBA—15上含有大量硅羟基[38] (孤立的硅羟基—Si OH、孪式的硅羟基=Si OH和氢键的羟基) , 其中自由硅羟基 (孤立的硅羟基—Si OH和孪式的硅羟基=Si OH) 具有高的化学反应活性, 而氢键的羟基则没有化学活性, 但氢键的羟基在受热等作用下可以转变成自由硅羟基。具有化学活性的自由硅羟基是介孔分子筛SBA—15表面化学改性的基础, 通过其与活性组分相互作用成键, 把催化活性位引入SBA—15的孔道或骨架中, 就可完成对其改性[39,40]。
2.1 SBA—15的功能化改性
介孔分子筛SBA—15的功能化是把功能基团引入介孔材料内形成复合材料。目前, 介孔分子筛SBA—15的功能化修饰方法主要有两种:直接合成 (one-potsynthesis) 法和合成后修饰 (post-synthesis) 法[41]。直接合成法是指在合成介孔分子筛SBA—15的前驱体溶液中, 通过前驱体的原位水解及由此产生的3价金属离子或具有氧化还原性能的变价金属离子等与硅骨架结合可以引入酸性中心或具有氧化还原活性的催化活性中心[42];或者直接加入一定比例含有有机官能团的硅烷偶联剂, 使之与硅源在胶束周围共聚, 直接将有机基团锚定在SBA—15上, 形成功能化的介孔分子筛SBA—15。该方法将功能性前驱物充分分散在溶液中, 得到表面功能团分布较均匀的功能化SBA—15, 并保持了介孔结构的完整性。因此, 广泛应用于多种官能团如氨基[43—46]、羧基[47]、烷基[48]、乙烯基/烯丙基[49]、巯基[50]等的表面修饰。
合成后修饰法是指, SBA—15上的活性硅羟基Si—OH和金属氯化物、金属醇盐、有机金属化合物及金属的配合物等物质在合适的反应条件下进行接枝反应, 以M—O共价键的形式将金属或金属离子固定在SBA—15的骨架上, 形成活性中心[51];或者将含有不同功能性有机官能团的硅烷组分和原始介孔分子筛SBA—15在惰性气氛保护、在合适溶剂 (如苯、甲苯、二甲苯、环己烷、己烷等惰性溶剂) 回流条件下, 利用硅烷偶联剂与SBA—15上硅羟基发生缩聚反应, 将不同有机官能团锚定在介孔分子筛SBA—15上, 合成功能化SBA—15, 如图2所示。
2.2 功能化SBA—15固定化酶
功能化后的介孔分子筛SBA—15以化学键合的方式固定生物酶, 即生物酶分子上非活性部位功能基团与SBA—15载体表面活性基团进行直接或间接地化学键合的方法。通过此方法制得的固定化酶结合牢固、不易洗脱、固定化时间短、稳定性高。目前对介孔分子筛SBA—15进行功能化的方法主要有掺杂金属离子和结合有机功能基团 (如—NH2、—COOH、—CH=CH2、—SH、—C6H5等) , 并且已经用于不同种生物酶的固定化。
2.2.1 氨基功能化SBA—15固定化酶
氨基功能化的介孔分子筛SBA—15固定化酶是在SBA—15上引入氨基, 改善生物酶分子与SBA—15的亲和作用, 提高固定化酶的活性, 减少生物酶分子的脱附, 同时增强固定化酶的稳定性。用有机硅烷功能化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 在SBA—15上引入功能化—NH2基团的方法在强酸性条件下易得易控制[53,54]。对介孔氧化硅孔道表面进行氨基化易带正电荷, 有利于阴离子的固定化, 而氨基作为碱性有机官能团, 本身适合于酶类等蛋白质分子的固定[55,56]。
Na等[57]通过共缩聚法将木瓜蛋白酶与1, 2-二 (三乙氧基) 乙烷和丙基三甲氧基硅烷相互作用固定在介孔材料上, 当加入10 mol%的丙基三甲氧基硅烷时木瓜蛋白酶的活性最高, 相对于游离的酶来说, 其热稳定性、p H稳定性、循环能力、储存时间等均有很大提高。Dong等[58]用氨基功能化的介孔氧化硅SBA—15作为支撑材料来吸附肌红蛋白, 并用戊二醛通过共价交联将溶菌酶固定在SBA—15上, 用3, 3'-二甲氧基联苯胺、H2O2和溶壁微球菌分别对肌红蛋白的过氧化物酶活性和共价固定的溶菌酶的抗菌活性进行表征, 结果表明:最终产物不仅表现出好的肌红蛋白的过氧化物酶活性, 而且还具有溶菌酶的抗菌活性。Abdullah等[59]用后合成法合成的氨丙基改性SBA—15固定化皱褶念珠菌脂肪酶, 相对于游离酶更稳定, 重复使用4次后活性可保持90%。Manyar等[60]用接枝APTES的SBA—15物理吸附猪胃蛋白酶并研究了其催化活性。
Yiu等[24]以3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 为功能化试剂分别用原位合成法和嫁接法合成介孔分子筛SBA—15, 并固定化胰蛋白酶, 原位合成法载酶量为78%, 嫁接法载酶量为82%。Hudson等[61]用6种氨基改性介孔材料对氯过氧化物酶 (CPO) 的固定化进行研究, 结果显示:载体孔口大小和CPO分子直径相当时的固定化酶用20次后仍有活性。Jung等[62]用3-氨基丙基三甲氧基硅烷 (ATS) 和γ- (甲基丙烯酰氧) 丙基三甲氧基硅烷 (GTS) 对改性SBA—15来固定氯过氧化物酶 (CPO) 和葡萄糖氧化酶 (GOx) , 并通过吲哚氧化测定生物催化效果。结果发现:改性SBA—15固定化酶可以存储几周而不失活, 且在持续反应条件下固定床反应器的测试表明共价结合的酶比物理吸附的酶的流失趋势小。 (此处有删除) 王放等[63]通过N- (2-氨乙基) -3-氨丙基三甲氧基硅烷 (AAPTS) 对有序介孔材料Zr-Ce-SBA-15 (ZCS) 和SBA—15进行氨基功能化, 并对胃蛋白酶进行固定化研究, 结果表明:AAPTS的引入没有破坏介孔结构, 介孔孔道内成功固定上胃蛋白酶, 且对牛血红蛋白具有稳定活性。
由上述内容可知, 用氨基功能化试剂对介孔分子筛SBA—15改性后, 通过化学键合法固定生物酶, 可以得到较好的初始酶活性和载酶量, 增强生物酶分子与分子筛SBA—15的结合力。化学键合法不仅可降低固定化生物酶的脱附量和生物酶分子的流动性, 而且还使所得的固定化酶的重复使用率提高, 但是该方法也对固定化酶再生带来一定的困难。
2.2.2 羧基功能化SBA—15固定化酶
通过含有双羧基或多羧基功能基团的功能化试剂对介孔分子筛SBA—15进行表面基团改性, 使其表面产生功能基团羧基—COOH, 该功能基团可以与蛋白质分子上的带电荷的非活性基团或剩余氨基酸发生氢键、静电和亲水等作用, 从而提高介孔分子筛SBA—15固定化酶的载酶量和稳定性。Chen等[64]报道了有机磷水解酶 (OPH) 可以自然的包埋在羧基—COOH功能化的介孔氧化硅SBA—15上, 并且表现出很强的生物酶的特殊活性。用分光镜法和圆二色谱法研究OPH和介孔氧化硅之间的相互作用, 结果表明:OPH和HOOC-SBA-15的相互作用导致了蛋白质的固定和合适的构象变化从而使OPH固定在拥挤的闲置空间, 增强了生物酶的特殊活性。Yiu等[24]以4-氰丙基三乙氧基硅烷 (TS-BN) 为功能化试剂, 分别用原位合成法和嫁接法合成介孔分子筛SBA—15固定化胰蛋白酶, 结果表明:原位合成法载酶量为70%, 嫁接法载酶量为97%。而以HOOC-SBA-15固定青霉素酰化酶的载酶量达100%, 固定化酶的活性为73.1 U/g[65]。Lei等人[66]在羧基和氨基功能化改性的介孔分子筛SBA—15上固定有机磷水解酶, 相对于游离的有机磷水解酶来说, 固定化后的酶的活性增加了2倍。Liu和Yang等通过2-氰乙基三乙氧基硅烷 (2-cyanoethyltriethoxysilane) 和正硅酸乙酯 (TEOS) 共缩聚的方法得表面氰基化的介孔硅载体材料, 并利用浓硫酸的强氧化性将氰基—CN氧化成所及—COOH, 最终制得羧基化的介孔氧化硅材料[67,68]。Lei等[69]用嫁接—CH2—CH2—COOH官能团的介孔氧化硅固定化有机磷水解酶, 结果该酶的活性提高了1倍。又于2010年研究用硅烷化介孔氧化硅载体固定化抗体材料, 研究发现该类抗体发挥出更好的治疗作用, 同时还发现通过改变载体表面的有机功能团可以控制抗体的固定速率和稳定性。与氨基介孔分子筛SBA—15固定化酶相比二者的固定化生物酶活性和载酶量大致相同, 均有较好的固定化酶催化效果和可重复利用的效果。
2.2.3 其他功能化SBA—15固定化酶
其他功能化介孔分子筛SBA—15如掺杂金属离子、乙烯基、苯基、环氧基等的功能化SBA—15用于生物酶固定化研究的报道相对较少, 但相关改性研究较多。将金属离子导入介孔分子筛SBA—15骨架结构中可以增加SBA—15的缺陷数量, 可引入Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Mn、Mo、Ni、Nb、Ti、V、W、Zr等金属, 增加表面的吸附性能, 同时引入氧化还原性能[70—74], 改变SBA—15的某些骨架和孔道特性, 使其具有活性中心, 从而使介孔分子筛SBA—15的性能发生改变, 提高SBA—15的载酶量和固定化酶反应活性。裴金凤等[75]以聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (P123) 嵌段共聚物为模板剂, 正硅酸乙酯 (TEOS) 为硅源, Fe (NO3) 3·9H2O为铁源在酸性条件下合成Fe-SBA-15介孔分子筛并对其性能进行表征。结果表明:合成的样品具有有序的六方介孔结构并且铁含量的不同对SBA—15的孔径及其比表面积均有影响, 在苯羟基化反应中表现出良好的催化活性, 最高转化率可达32.16%。Terrés等[76]用Al-MCM-41和不同孔径的SBA—16固定氯过氧化物酶 (CPO) , 结果显示:Al-MCM-41和孔径大小为9 nm的SBA—16固定化CPO的活力和稳定性最好。
Chong等[77]用氨基、苯基、乙烯基、巯基、氰基改性的SBA—15固定青毒素G酰基酶 (PGA) , 发现乙烯基化的SBA—15固定化酶有很高的初始酶活 (67.7 U/mg) 。王伟等[78]采用γ-氯丙基三乙氧基硅烷 (CPTES) 改性的介孔硅材料SBA—15对猪胰脂肪酶进行固载实验, 发现改性后的SBA—15在脂肪酶活性、p H环境适应性、热耐受性和可操作性都优于改性前的, 在最优条件下的酶活力提高超过60%。皇艳蕾等[79]在酸性条件下用正硅酸乙酯 (TEOS) 和苯基三乙氧基硅 (PTES) 直接缩合制备了苯基改性的中孔分子筛Ph-SBA-15, 并对改性后的样品进行了表征。结果表明:在300℃下焙烧后, 模板剂被脱除, 而苯基可完整保留, 苯基改性的SBA—15分子筛具有有序结构, 且进一步用氯磺酸磺化改性后, 可得到苯磺酸化的分子筛, 其酸度可达4.19 mmol/g。张泽忠等[80]以甲基三乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷为改性剂, 采用直接缩合法制备得到甲基及苯基改性的介孔氧化硅材料CH3-SBA-15和Ph-SBA-15, 结果表明:SBA—15表面成功引入甲基及苯基功能团, 且其孔道结构没有破坏。郭风等[81]通过正硅酸乙酯 (TEOS) 和2-氰乙基三乙氧基硅烷 (CTES) 共缩聚的方法制备得到了嫁接有氰基功能团的介孔氧化硅载体材料。
孔道表面含有环氧基团的介孔氧化硅载体材料, 25℃左右时该环氧基团会发生开环并和生物酶分子的非活性官能团氨基发生共价结合而固定酶分子[82,83]。Sun等[84]用环氧乙烷修饰的载体介孔Si O2固定青毒素G酰基酶 (PGA) , 在操作条件温和时, 局部功能化Si O2更高效。利用SBA—15的大比表面进行环氧基功能化, 产物均匀有序, 对青霉素酰化酶具有良好的固定化作用[85]。Blanco等[86]将正辛基三乙氧基硅烷改性的介孔分子筛Si O2用于固定南极假丝酵母脂肪酶, 最大吸附量达200 mg蛋白/g, 在酯化反应中有很好的操作稳定性和热稳定性。徐坚等[87]对介孔分子筛SBA—15进行甲基、己基和巯丙基等有机官能团改性, 发现巯丙基改性的SBA—15介孔材料表现出对皱褶念珠菌脂肪酶优异的吸附能力, 其制备得到的固定化酶具有较高的活力回收率 (58.37%) 和很高的催化活性 (816.67 U/g) 。
Pérez-Quintanilla等[88]以接枝共聚法成功将2-巯基苯并噻唑 (2-mercaptobenzothiazol) 嫁接到表面被氯丙基修饰的MCM—41和SBA—15上。Zhao等[89]通过2- (4-苯磺酰氯) 乙基三甲基硅酸酯 (CSPTMS) 制备得到苯磺酸基改性的介孔氧化硅材料SBA-15-Ph-SO3H。Yang等[90]利用3-巯丙基三甲氧基硅烷 (MPTMS) 对SBA—15表面进行修饰, 再氧化及酸化作用得到比表面积高、粒径均匀、结构远程有序及热稳定性好的载体材料SO3H-SBA-15。Liu等[91]将嫁接有甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷 (MAPTMS) 的SBA—15通过2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸和偶氮二异丁氰的脱氧作用后制得SBA-15-poSO3H, 其对多种不同的生物大分子如酶类等蛋白质的吸附量都很高。
研究设计新型功能化介孔分子筛SBA—15, 使其能够在温和条件下固定化生物酶分子, 酶分子不会因为存在盐类或底物浓度高等因素而脱落, 具有优良的操作稳定性。该类载体为生物酶的固定化提供了适宜的微环境, 有利于改善生物酶与功能化SBA—15载体的亲和作用和结合方式。因此, 不同基团功能化的介孔分子筛SBA—15是目前研究的热点所在。
3 结语
本文综述了不同生物酶分子在不同功能团改性的介孔分子筛SBA—15上的固定化研究进展, 不同的功能化试剂改性的SBA—15对生物酶分子的固定化作用不同, 载酶量、酶活性、操作稳定性和重复利用率等也不尽相同。通过不同功能基团功能化的SBA—15固定生物酶分子, 有效的改善了传统单纯SBA—15固定化酶的酶分子与载体的结合力弱的缺点, 制备得到了操作稳定性高、催化活性高和重复利用次数多等的固定化酶。然而, 由于固定化酶过程的条件要求高、操作步骤繁琐以及不同功能性基团容易影响酶分子的空间构象而影响酶的反应活性等缺点, 研究简单易行、适用范围广的功能化介孔分子筛SBA—15固定化酶仍存在很大发展空间, 同时, 除催化酶促反应之外该类固定化酶在生物传感器、生物燃料电池等方面的应用前景也十分广阔。
摘要：介孔材料具有均匀可调的孔道、较大的孔容和很大的比表面积, 是固定化酶的重要载体。其中, 介孔分子筛SBA—15上含有大量具有化学活性的自由硅羟基, 可以通过化学修饰引入功能化基团来改善SBA—15的表面微环境及其与生物酶分子的亲合作用, 实现生物酶和载体材料的共价结合, 进而提高固定化生物酶的催化活性, 具有很高的实用价值, 得到了长足发展。综述了近年来介孔分子筛SBA—15的功能化改性及其酶固定化的研究进展, 着重介绍了—NH2和—COOH功能化SBA—15在固定化生物酶上的研究现状, 并展望了其发展前景。
酶分子改造 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院在2011年12月~2013年12月期间收治的86例急性心肌梗死患者作为研究对象, 经心电图检查, 符合急性心肌梗死的诊断标准, 采用随机数字表法分为对照组与观察组, 各43例。对照组男28例, 女15例, 年龄47~78岁, 平均年龄 (59.7±7.8) 岁;心肌梗死位置位于前壁19例, 高侧壁13例, 下壁5例, 下壁右室4例, 其他部位2例。观察组男23例, 女20例, 年龄45~79岁, 平均年龄 (60.3±7.7) 岁;肌梗死位置位于前壁18例, 高侧壁13例, 下壁6例, 下壁右室4例, 其他部位2例。两组患者的年龄、性别等一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
对照患者给予瑞替普酶 (北京爱德药业有限公司) 静脉溶栓联合普通肝素进行常规治疗, 10 MU瑞替普酶溶于10 ml水中静脉推注>2 min, 30 min后重复1次。使用单独的静脉通路, 不和其他药物混合进行给药, 溶栓后进行静脉滴注普通肝素。观察组患者给予低分子肝素联合瑞替普酶进行治疗, 观察组溶栓后给予低分子肝素 (杭州赛诺非民生盛制药有限公司) , 12 h给予腹壁皮下注射5000 U, 注射10 d, 24 h后改为每12小时给予腹壁皮下注射5000 U, 注射10 d。
1.3 疗效判定标准
临床疗效:显效为开始溶栓24 h之内胸痛彻底消失;有效为开始溶栓24 h之内胸痛迅速减轻;无效为开始溶栓24 h之内胸痛无明显变化。总有效率= (显效+有效) /总例数×100%。血管再通率:通过血管造影, 结合自身感觉和心电图进行判断血管再通情况, 记录血管再通情况。
1.4 统计学方法
采用SPPS18.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用采用 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床疗效比较
观察组患者显效18例 (41.9%) , 有效15例 (34.9%) , 无效11例 (25.6%) ;观察组显效24例 (55.8%) , 有效17例 (39.5%) , 无效2例 (4.7%) 。观察组治疗总有效率95.3%明显高于对照组76.7%, 差异具有统计学意义 (P=0.029<0.05) 。
2.2 两组血管再通情况比较
观察组冠状动脉再通率86.05% (37/43) 明显高于对照组65.11% (28/43) , 差异具有统计学意义 (P=0.0239<0.05) 。
3 讨论
急性心肌梗死是冠状动脉的急性闭塞所导致的病变, 急性心肌梗死主要病理是冠脉血栓形成和动脉内粥样斑块破裂, 冠状动脉血栓闭塞导致心肌的血流中断, 致使心肌缺氧缺血而坏死, 患者表现出乏力、胸闷、供血不足以及气促等一系列临床症状[2]。临床主要表现为心律失常、心力衰竭、急性循环功能障碍、胸骨后持久剧烈疼痛、白细胞计数上升、发热、心肌急性损伤与坏死及血清心肌损伤标记酶的上升的心电图进行性变化[3]。不仅如此, 急性心肌梗死的主要治疗就是再通闭塞的冠状动脉, 使患者的血流恢复, 及时挽救濒临死亡的心肌, 因此, 溶栓的时间越早越好。
临床常见的溶栓类药物较多, 包括尿激酶、链激酶和瑞替普酶等药物。瑞替普酶作为一种非糖基化纤溶酶原激活物, 能够将患者机体内的纤溶酶原转化为纤溶酶, 降解纤维蛋白并溶于水, 从而达到溶解血栓的目的[4]。瑞替普酶本身对纤维蛋白特异性较高, 但纤维蛋白大量存在时能够提高与纤溶酶原的亲和力, 而纤维蛋白少量或不存在时, 被激活的纤维蛋白原很少, 提高了用药的安全性。低分子肝素是一种安全高效的抗凝剂, 具有显著的活性因子, 较短的分子链能够持久对抗Xa分子活性, 强烈抑制机体内血栓, 且不影响凝血系统[5]。本研究显示观察组治疗总有效率95.3%明显高于对照组76.7%, 观察组冠状动脉再通率86.05% (37/43) 明显高于对照组65.11% (28/43) , 表明观察组在提高临床疗效和提高冠状动脉再通率方面具有非常重要的作用。
综上所述, 低分子肝素钙联合瑞替普酶能够改善急性心肌梗死患者的临床症状, 促进冠状动脉再通, 在促进患者早期康复和提高患者的生存质量方面具有重要作用。
参考文献
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[2]许晨.尿激酶与低分子肝素钙联用治疗急性心肌梗死的临床效果分析.中西医结合心血管病杂志 (电子版) , 2014 (12) :85-86.
[3]桑志武.阿替普酶联合低分子肝素钙治疗急性心肌梗死的临床疗效观察.实用心脑肺血管病杂志, 2013, 21 (4) :87-88.
[4]陈哲.尿激酶联合低分子肝素钙治疗急性心肌梗死的临床观察.实用心脑肺血管杂志, 2012, 20 (11) :1802.