Fc融合蛋白

Fc融合蛋白（精选3篇）

Fc融合蛋白 篇1

摘要：Fc融合蛋白(Fc-fusion proteins)是近几年发展极快的一种生物制药研究方向。它是以免疫球蛋白的Fc段作为分子伴侣,通过分子生物学手段将功能性蛋白与之融合,从而极大地延长功能性蛋白的半衰期。Fc融合蛋白保持了功能性蛋白的活性,同时兼具免疫球蛋白的半衰期长及具有细胞毒性,生产简易、易于纯化,已成为生物制药领域,尤其是在抗癌药物领域的一颗明星。本文将集中介绍Fc融合蛋白药物的特点、应用、以及发展前景。

关键词：免疫球蛋白,Fc,融合蛋白

近年来,随着生物制药技术的快速发展,全球药物研发的重心正从小分子化药向生物大分子药物转移。但是,除抗体类药物外,大多数蛋白类药物半衰期较短,必须通过频繁给药或提高剂量才能达到预期的治疗效果,这样不仅给病人带来巨大的痛苦、潜在的风险,也给病人带来了巨大的经济负担。因此,如何有效延长蛋白质和多肽类药物的半衰期,成为生物药研发的重要内容。

目前,延长蛋白质和多肽类药物的半衰期可以从三方面入手:a.增加药物蛋白的分子量,减少肾小球的滤过率;b.提高药物蛋白的可溶性及稳定性,防止蛋白药物在体内被降解;c.减少异源蛋白的免疫原性,降低蛋白药物的体内清除率。

1 Fc融合蛋白概述

现阶段研究成果最突出的天然长半衰期蛋白就是Ig G,其体内半衰期长达2-4周。Ig G的超长半衰期源于新生儿Fc受体(Fc Rn)介导的再循环机制。Ig G通过胞饮作用进入小肠上皮细胞内,在早期酸化的内吞体(endosome)中与Fc Rn结合,因此能逃避胞内溶酶体的降解。而在十二指肠中,管腔环境为酸性,Ig G在被细胞内吞之前就已在顶膜表面与Fc Rn结合,从而使Ig G被安全转运到细胞的另一个膜表面,或再次循环到同一膜表面。由于这种结合是p H依赖性的,在胞外p H为中性时,Ig G将脱离Fc Rn再次进入循环。除了胞内Fc Rn的保护机制外,Ig G分子质量较大,肾清除率低,也是其半衰期较长的原因之一。

免疫球蛋白G由在木瓜蛋白酶的水解作用下,会降解为两个Fab`段和一个Fc段。Fc相当于Ig G的重链的CH2和CH3功能区,这一区域包括FcγR和Fc Rn两个不同区域。除前面介绍的Fc Rn介导Ig G的再循环机制外,FcγR主要介导细胞毒作用(ADCC)和补体激活作用(CDC)作用。

Fc融合蛋白类药物系将Ig G中的Fc片段作为融合伴侣,通过DNA重组技术将其直接连接到另一个活性分子上所研制的药物。Fc融合蛋白大大增加蛋白质和多肽类药物的分子量,降低肾小球的滤过率,而Fc Rn介导的再循环机制可以避免蛋白降解,有效延长半衰期,另外人源的Fc片段降低了融合蛋白的免疫原性,防止人体自身免疫系统对药物的消除作用。值得一提的是,蛋白或多肽类药物与Fc融合后稳定性提高;作为一种异源蛋白可在酵母中实现高效分泌表达,当然作为一个生物大分子,高等动物细胞(如,CHO细胞)是更为理想的表达体系;由于Fc片段能与Protein A特异性结合,可利用Protein A亲和色谱对融合蛋白进行分离,使其后期纯化工艺变得简便易行。

2 Fc融合蛋白药物发展现状

Fc融合蛋白技术发展迅速,其融合对象非常广泛,包括受体结构域、配体、抗体片段以、多肽,以及近年来分子展示技术筛选出的模拟肽,已发展为一种可靠的药物研发手段。已经成功上市的药物中,Fc融合蛋白的半衰期都得到了大大提高,如ahatacept的半衰期长达13.1天,aldfacept的半衰期为12天。已上市的依那西普(etanercept)等药物,不仅保留了融合对象的生物活性,还具有Fc的抗体活性,其功效可与当克隆抗体类药物相媲美,上市后市场反应强烈,其中依那西普2010年全球销售额高达73亿美元,超过了利妥昔单抗、英夫利昔单抗等单抗类药物。2011年,融合蛋白药物在美国销售额达43亿美元,是最畅销的4种生物药物之一。截至2011年,共有七种Fc融合蛋白类药物上市,四种进行三期临床研究,另有多种相关药物也相继进入了临床研究阶段。

3 Fc融合蛋白药物存在的问题及改良方向

当然没有任何事物是十全十美的,Fc融合蛋白类药物也存在一些问题,需要不断进行改进完善。

首先,现阶段Fc融合蛋白的半衰期,与天然Ig G还有很大的差距,针对Fc Rn的改造主要是为了增加抗体的稳定性,延长抗体在体内的半衰期。采用点突变技术将250位的苏氨酸突变为谷氨酰胺,将428位的甲硫氨酸突变为亮氨酸,可增加人抗体Fc Rn和人Ig G在酸性条件下(p H6.0)的粘附性,不改变在中性条件(p H7.4)下的粘附力,因此可逃避细胞内涵体介导的清除作用,延长抗体半衰期。

其次,Fc段的FcγR结合域所诱导的细胞毒作用和补体激活作用,对于某些药物毒力不足,对另一些药物却非必须。针对FcγR的改造分为两个方面,一是增强抗体介导的效应功能,即提高抗体介导的ADCC和CDC作用,另外在一些自身免疫性疾病和炎性疾病的治疗过程中,只需发挥抗体阻断配体受体结合作用,而抗体的效应作用是不需要的,甚至会引起副作用,针对这种类型的抗体,则需要对FcγR进行改造以降低或灭活抗体的效应功能。

另外,Fc融合蛋白毕竟是人工产物,在结构的合理性上无法与亿万年的自然进化相媲美,Fc片段可能会在一定程度上影响治疗性分子的活性,这一问题可通过选择不同的Fc亚型来改善,而保留抗体的铰链区可使被融合的2个分子间互不影响,生物活性相比于那些没有连接肽的融合蛋白更显著。Fc融合蛋白多为二聚体形式,过大的分子质量会影响药物分子通过黏膜的速率。

4前景及展望

Fc融合蛋白技术,已经成为前景广阔的生物药研发方向,不断有新药进入临床试验阶段。然而,问题同样存在,如何进一步延长半衰期,如何根据需要调整ADCC和CDC活性,以及新的给药方式,都需要研究人员一步步去解决。但不可否认,Fc融合蛋白技术,所带来的长效生物药,是优于单克隆抗体药物的新型治癌药物,在此基础上可以进一步发展ADC药物,这展示了一个美好、广阔的药物研发空间。

参考文献

[1]Walsh G.Biopharmaceutical benchmarks 2010[J].Nat Biotechnol,2010,28(9):917-924.

[2]Kontermann R E.Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics[J].Curr Opin Biotechnol,2011,22(6):868-876.

[3]张瑜,赵树强,姚文兵,融合蛋白技术在长效药物开发中的应用[J].药学进展,2013,37(9):454-459.

[4]Kuo T T,Aveson V G.Neonatal Fc receptor and Ig Gbased therapeutics[J].MAbs,2011,3(5):422-430.

[5]Kuo T T,Baker K,Yoshida M,et al.Neonatal Fc receptor:from immunity to therapeutics[J].J Clin Immunol,2010,30(6):777-789.

Fc融合蛋白 篇2

BAFF (B cell activating factor blonging to the TNF family) 又称作B淋巴细胞刺激因子 (B lymphocyte stimulator, BLy S) 、TALL-1 (TNF-and APOL-related leukocyte expressed ligand1) 和THANK (TNF homologue that activates, NF-Kb and JNK) [1,3,4,5,6]等, 是肿瘤坏死因子 (TNF) 超家族的一个新成员。在白细胞、脾、等有较高水平表达, 而小肠、胰腺、胎盘、心脏等部位可见低水平表达[2]。BCMA (B cell maturation antigen) 、TACI (transmembrane activator and c AML interactor) 和BR3 (Bly S receptor 3) [6,7]是Blys的三个受体。Bly S对B淋巴细胞的分化、增殖的关键作用是通过这三个受体来调节机体的免疫平衡来实现的[3]。研究发现, Bly S的过量表达与类风湿关节炎 (Rheumatoid Arthritis, RA) 、系统性红斑狼疮 (System Lupus Erythematosus, SLE) 和干燥综合征 (Sjogren’s syndrome, SS) 等疾病的形成有直接的关系[9,10]。目前针对BAFF的拮抗剂成为研究的热点。我们前期基于BCMA和BAFF晶体结构设计的BAFF拮抗肽[11]已经被证明能够有效抑制BAFF与受体BCMA的结合。但因为肽不稳定等因素, 可通过Ig G Fc展示肽来增加其稳定性。这样做面临的问题是:肽-Fc和BAFF受体BCMA-Fc都带有Fc, 不能用抗Fc抗体做竞争酶联免疫吸附测定 (ELISA) 。本研究旨在可溶性BAFF受体[12]末端加上myc标签, 构建BCMA-Fc-myc。为下一步通过竞争ELISA分析BAFF拮抗肽-Fc同BCMA-Fc-myc与BAFF的竞争性结合能力, 从而确定BAFF拮抗肽与BAFF的结合能力及其药用价值提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌BL21和JM109及载体p ET28a来源于作者实验室保存。

1.1.2 试剂

限制性内切酶EcoRⅢ、HindⅠ、T4DNA连接酶购于Ta KaRa公司;质粒提取试剂盒和PCR胶回收试剂盒购于Promega。

1.1.3 仪器

PCR仪、离心机、酶标仪等。

1.1.4 培养基

LB培养基、LB+Kana培养基、2YT培养基。

1.2 方法

1.2.1 p ET28a-BCMA-Fc-Myc质粒的构建

根据myc标签序列 (EQKLISEEDL) 设计扩增BCMA-Fc-Myc引物。上、下游引物分别是:5’-ACGAATTCATGTTG-CAGATGGCTGGGC-3’;5’-CTGAAGCTTCAGATCCTCT-TCAGAGATCAGTTTCTGTTCTTTACCCGGAGACAGGGAG-3’。以p ET28a-BCMA-Fc质粒为模板[11], PCR扩增BCMA-Fc-Myc片段。PCR反应条件:94℃、5min;95℃、30s, 56℃、30s, 72℃、1.5min, 30个循环;72℃、10min。p ET28a载体和PCR产物分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切。将酶切产物于1%的琼脂糖凝中电泳, 在紫外成像仪中将带有目的条带的凝胶切下, 按照凝胶回收试剂盒进行回收。胶回收后, 载体和片段通过T4DNA连接酶在16℃水浴连接10h。连接反应产物转化100μl JM109感受态, 涂布于含kana抗生素的LB平板上。Kana固体培养基平板生长克隆分别使用菌液PCR鉴定和双酶切鉴定。阳性克隆送公司测序鉴定。

1.2.2 融合蛋白的诱导和表达

测序正确的质粒p ET28a-BCMA-Fc-Myc转化表达宿主菌BL21 (DE3) 。挑取6个克隆, 分别接种于2m L LB+Kana培养基中, 37℃振荡过夜。按700μl菌液和300μl 30%甘油的比例保存菌种, 剩余菌液按l:1 000加入IPTG, 37℃振荡诱导过夜, SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达, 挑选高表达克隆。

取高表达克隆菌液20μl接种于2m L LB+Kana培养基中, 37℃培养过夜, 转接于500m L LB+Kana培养基中, 37℃振荡培养至OD=0.5, 加IPTG, 37℃振荡诱导过夜。菌液8000r/min, 4℃离心10min, 得菌体用1×PBS洗涤1次, 然后用50m L 1×PBS重悬, 反复冻溶3次, 冰浴中超声破碎。将破碎后的细胞12 000r/min, 4℃离心10min, 得上清, 4.5mm滤膜过滤, 调p H为8.0。上清过蛋白A亲和层析柱纯化融合蛋白, 1.5 m L EP管收集蛋白洗脱液, 共20管。取1、2、3、5、9、14号管中洗脱液各40μl, 加10μl 5×loading buffer混合均匀, 沸水浴8min, 冰浴2min, SDS-PAGE电泳观察并分析蛋白纯化结果。

1.2.3 ELISA

用包被液稀释BAFF至终浓度为10ng/μl, 取50μl于酶标板中, 4℃18h。用0.5%PBST洗涤酶标板3次, 每次5min。每孔加100μl 1%脱脂奶粉, 37℃, 温育2h封闭。用0.5%PBST洗涤酶标板3次, 每次5min。每孔分别加BCMA-FcMyc或Fc蛋白溶液 (作为一抗, 其中Fc作为对照) 50μl, 37℃, 温育1h。每个蛋白浓度梯度重复3个孔, 蛋白浓度梯度如下:BCMA-Fc-Myc:0、1、10、50、100ng/μl;Fc:0、1、10、50、100ng/μl。用0.5%PBST洗涤酶标板3次, 每次5min。每孔加入1:5 000倍稀释的HRP-GAH-Ig G (作为二抗) 50μl, 37℃, 温育1h。用0.5%PBST洗涤酶标板3次, 每次5min。每孔加入50μL OPD (用底物缓冲液稀释, 终浓度为4mg/1 0m L, 临用前加10-3×体积的30%H2O2) , 37℃避光显色10min。每孔加50μl 1mol/L H2SO4终止反应, 酶标仪检测OD450值。

2 结果与分析

2.1 p ET28a-BCMA-Fc-Myc质粒的构建

PCR扩增得到750bp目的片段 (图1) , 与理论BCMA-Fc-myc基因大小相符。PCR产物与载体p ET28a连接产物转化JM109大肠杆菌。挑取7个克隆做菌落PCR, 结果显示1到7号克隆均为阳性 (图2) 。提取1号克隆质粒, 酶切, 结果有750bp的目的条带 (图3) 。表明构建的p ET28a-BCMA-Fc-Myc质粒正确。将1号克隆送生物公司测序, 序列正确, p ET28a-BCMA-Fc-Myc质粒构建成功。

1为PCR产物条带, 其大小为750bp左右, 和BCMA-Fc大小相同。Lane 1:fragement by PCR, size:750bp, as well as BCMA-Fc.

1~7泳道分别是7个不同单菌落, 1~7号泳道在750bp左右有明显条带。Lanes 1 to 7 are nine different single colony, all of thet lane show an obvious stripe at 750 bp.

2.2 高表达菌株的筛选及融合蛋白的大量表达

在16℃慢速振摇的条件下诱导, BCMA-Fc-Myc不表达。将诱导条件改变为37℃、快速振摇能够诱导出目的蛋白 (图4) 。选取3号菌株进行大量表达, 经蛋白A亲和层析柱纯化, 得到目的条带, 与理论预测的BCMA-Fc-Myc蛋白大小一致, 并且具有较高纯度 (图4) 。

2.3 BCMA-Fc-Myc融合蛋白活性初步鉴定

分别用两种不同二抗做ELISA实验, 检测BCMA-FcMyc蛋白和BAFF的结合。结果显示用抗Myc标签抗体和抗Fc抗体都能检测到BCMA-Fc-Myc蛋白和BAFF的结合 (图6和图7) 。并且在BCMA-Fc-Myc蛋白浓度为50ng∕μl时, BCMA-Fc-Myc蛋白和BAFF的结合达到饱和。而阴性对照Fc不结合BAFF (图6和图7) 。

1号泳道是双酶切后的质粒, 在750bp左右有明显条带。Lane 1 is plasmid enzymed by EcoRⅠand HindⅢ, around 750bp shows an obvious stripe.

1~5号泳道为实验组;6、7号泳道为对照组, 其中7号为PET30aBL21菌株。Lane 1 to 5 are experimental group, Lane 6 and 7 are control group.

3 讨论

系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生和BAFF异常表达与密切相关[13,14,15,16,17,18]。因此, 抑制BAFF成为治疗这些疾病的新策略。拮抗BAFF药物的研究也成为目前一大研究热点。Belimumab是能结合BAFF人源化单克隆抗体, 能够对BAFF引起的自身免疫疾病有很好的治疗效果。2011年3月, Belimumab通过美国食品药品监督管理局 (FDA) 的审评, 这是50多年来首个获准用于治疗狼疮病症的新药[19,20]。小分子多肽具有分子量小、穿透力强等优点, 是拮抗BAFF活性的另一种策略。由于小肽不稳定、半衰期短, 可以用人Ig G Fc片段来展示, 能够很好地解决这些问题。肽-Fc和BAFF受体BCMA-Fc都带有Fc, 不能用抗Fc抗体作竞争酶联免疫吸附测定 (ELISA) 分析拮抗肽-Fc的活性。为此, 在BCMA-Fc末端加上myc标签, 构建BCMA-Fc-myc。可以通过竞争ELISA分析BAFF拮抗肽-Fc与BCMA-Fc-myc竞争性结合BAFF的能力, 从而确定BAFF拮抗肽与BAFF的结合能力及其药用价值提供实验依据。

BCMA-Fc-Myc蛋白可以被小鼠抗Myc抗体识别, 而小鼠抗Myc抗体又可以被HRP标记的山羊抗小鼠Ig G抗体识别, Fc为对照实验。BCMA-Fc-Myc proten can be detected by recognized by mice anti-Myc Ig G monoclonal antibody which can be detected by HRP-labeled goatanti-mice Ig G monoclonal antibody.Fc was a control.Represented data were represented as mean±standard deviations.

在本实验中, 我们通过PCR的方法扩增出了BCMA-Fc-Myc基因片段, 并将扩增片段克隆进p ET28a载体上构建成p ET28a-BCMA-Fc-Myc重组载体。然后将此重组载体导入BL21大肠杆菌表达宿主菌并成功诱导了目的蛋白并纯化获得了较高浓度的目的蛋白。ELISA结合实验显示, 此蛋白和BAFF有较强的结合能力, 在浓度是50ng∕μl时能达到饱和, 和本实验室纯化的BCMA-Fc融合蛋白的结合能力相当[12] (BCMA-Fc蛋白和BAFF的结合也在50ng∕μl达到饱和) 。在BCMA-Fc-Myc融合蛋白中, Myc标签相对于BC-MA-Fc-Myc整个分子来说是非常小的, 而Fc片段是非常大的, Myc标签不能对Fc片段有效覆盖。因此, 我们认为在BC-MA-Fc-Myc融合蛋白中, Fc标签和Myc标签都能都充分的暴露出来。所以, 在ELISA实验中, 我们用分别两种不同的二抗:山羊抗人Ig G抗体和小鼠抗Myc抗体来检测BCMA-FcMyc融合蛋白和BAFF的结合情况。结果显示, 用两种不同抗体检测, BCMA-Fc-Myc融合蛋白结合BAFF的饱和浓度都是50ng∕μl, 这也证明了实验设想的正确性。虽然本实验中, BCMA-Fc-Myc融合蛋白被检测具有较强的活性。但是, BCMA-Fc-Myc融合蛋白的表达量不高。下一步, 我们还要把诱导和纯化条件进一步优化, 以提高表达量。

Fc融合蛋白 篇3

目前已知的摩尔消光系数的测定有几种方法，包括dry weight[1]、nitrogen determination[2]和spectral method[3]，这几种方法都存在蛋白质用量大、过程繁琐等缺点，限制了它们在实验室的使用。

rhEPO-Fc为创新蛋白质药物，拟用于肾性贫血治疗，该药物制剂在临床预试验中表现出长效化特征，该蛋白利用EPO融合Fc片段后以同源二聚体形式存在，理论上其半胱氨酸都以二硫键形成胱氨酸，因此其变性状态下的摩尔消光系数为111280；而二聚体的氨基酸相对分子质量为88629.2。

本研究中，笔者采用Edelhoch法测定rhEPO-Fc的摩尔消光系数，计算得到其溶液百分比消光系数，从而依据公式（1）测定其蛋白质含量；本法具有的优点：在确定溶液百分比消光系数后，不需要任何反应，可直接测定该蛋白溶液的吸收值，从而计算出蛋白质的含量，操作简便、可重复性良好且专属性强。

1 材料与仪器

r h E P O-F c原液（纯度>9 5%，自制），脱盐柱为A m e r s h a m Biosciences产品（货号：52-13080-00）。紫外分光光度计（Beckman DU730）。盐酸胍、氯化钠等均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 rhEPO-Fc消光系数的测定：

将经脱盐得到的rhEPO-Fc水溶液用超纯水稀释3、6、12、24、48倍，分别测定A280。由于在蛋白溶液中蛋白颗粒会出现光散射现象，因此必须对A280进行校正，即扣除光散射值A光散射。A光散射的测定方法是测定溶液在320、325、330、335、340、345、350 nm波长处的吸光度，用线性回归法，以吸光度的对数值与其相对应波长的对数值绘图，获得最适标准曲线，将此标准曲线外推至280 nm波长，从而确定A280光散射。同样，将EPO-Fc蛋白水溶液用相同的稀释倍数溶解在6 mol/L盐酸胍溶液中，分别测定其A28和A280光散射。计算同一浓度的rhEPO-Fc在水溶液和6 mol/L盐酸胍溶液中紫外吸收值的比值，并利用公式（3)(4)(5）计算rhEPO-Fc水溶液中的溶液百分比消光系数。结果：rhEPO-Fc的消光系数为1.3,RSD=0.41%，见表1。

2.2 溶液百分比消光系数测定干扰性试验

2.2.1 糖基化对rhEPO-Fc溶液百分比消光系数的影响：

对于糖蛋白，虽然单糖分子在280 nm处没有紫外吸收值，但是其糖链组成可能会影响到蛋白质的构象，从而影响糖蛋白的紫外吸收值。为了研究糖基化是否对rhEPO-Fc的消光系数存在影响，取rhEPO-Fc蛋白原液，用肽N-糖苷酶F酶切N-糖链，酶切完成后，蛋白质用Protein A柱进行纯化，去除肽N-糖苷酶F和反应缓冲液，用上述方法测定无糖基化的rhEPO-Fc的溶液百分比消光系数，结果为1.2，去除糖基后的rhEPO-Fc消光系数下降了约7%，这说明糖基化会影响糖蛋白的消光系数，但是并不显著，可能是由于蛋白糖基化后构象发生改变引起。

2.2.2 离子强度对rhEPO-Fc溶液百分比消光系数的影响：

取适量的rhEPO-Fc蛋白水溶液，调整A280在0.6～1.4，用不同浓度的氯化钠分别进行倍比稀释，使rhEPO-Fc蛋白溶液中氯化钠的浓度分别为0、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00 mol/L，混合静置2～3 min后用分光光度计分别测定其A280和A280光散射，校正A280，结果见表2,rhEPO-Fc蛋白在0.25～2.00 mol/L的氯化钠溶液中A280值变化不大，而且与在0 mol/L氯化钠溶液中相当，说明2 mol/L以下的氯化钠不影响蛋白质的光吸收值，即不影响其溶液百分比消光系数。见表2。

2.3 浓度测定范围确定：

取适量rhEPO-Fc蛋白原液，用超纯水稀释成浓度为1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg/mL，分别测定其A280和A280光散射。同时，利用rhEPO-Fc溶液百分比消光系数计算理论吸收值，并比较由计算得到的吸收值相对于测定校正吸收值的偏差，结果见表3,rhEPO-Fc浓度在0.02～1.28 mg/mL范围检测紫外吸收值与计算吸收值的相对偏差<4%，因此，在该浓度范围内，紫外法测定该rhEPO-Fc含量是可信的。见表3。

2.4 重复性试验：

分别取同批rhEPO-Fc原液5份，分别测定A280和A280光散射，校正A280，利用公式（1）计算得到原液含量为0.97 mg/mL,RSD=0.65%(n=5），重复性良好。

3 讨论

利用Edelhoch法测定rhEPO-Fc蛋白的摩尔消光系数，操作简便，可用于rhEPO-Fc含量的测定。但考虑到消光系数的专属性，为保证结果的准确，待检样品的纯度应不低于95%，即所含的目标蛋白几乎为rhEPO-Fc的情况下，计算的rhEPO-Fc原液含量才更准确。笔者研究了数十种蛋白质消光系数发现，利用Edelhoch法测定的摩尔消光系数和直接经公式ε=（Trp数量）×5500+(Tyr数量）×1490+(cystin数量）×125计算的摩尔消光系数比较，大部分蛋白的偏差都5%左右，少数蛋白的偏差超过10%，如Rituximab。重组糖蛋白的糖基化程度、糖基化位点及糖基化的类型对其消光系数的影响也不尽相同，如rhEPO-Fc脱糖后的消光系数，相对于脱糖前下降约7%左右，而Rituximab脱糖前后几乎无差异。该方法专属性强、准确度高，可用于纯度高rhEPO-Fc原液或制剂的定量。

摘要：目的 建立紫外法测定重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白(rh EPO-Fc)含量的方法。方法 利用Edelhoch法测定rh EPO-Fc的摩尔消光系数,计算得到其溶液百分比消光系数,并测定rh EPO-Fc溶液A280值,依据公式c=A/ε计算rh EPO-Fc的含量。结果 rh EPO-Fc溶液百分比消光系数为1.3,在0.021.28 mg/m L浓度范围内,测定含量结果偏差<4%。结论 该方法操作简便、专属性强、结果准确可靠,可用于rh EPO-Fc含量测定。

关键词：消光系数,红细胞生成素,融合蛋白

参考文献

[1]Hunter MJ.A method for the determination of protein partial secific volum[J].J Phys Chem,1996,70(10):3285-3292.

[2]Jaenicke L.A rapid micromethod for the deter mi nat ion of nitrogen and phosphate in biological material[J].Anal Biochemis ty,1974,61(4):623-627.