肿瘤抑制因子P53

肿瘤抑制因子P53（精选4篇）

肿瘤抑制因子P53 篇1

肺癌肿瘤抑制因子-1 (tumor suppressor in lung cancer 1, TSLC1) 是2001年Pletcher等[1]通过物理和测序绘图方法, 在大量的DNA序列中从人工酵母染色体上分离出1.6 Mb片段, 转染到非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 细胞株A549中, 导入裸鼠体内后能完全抑制肿瘤生长及转移作用, 推测其抑癌作用是通过细胞-细胞或细胞-亚细胞间的相互作用。Murakami等[2]于2002年通过功能性互补方法, 转染正常11号染色体长臂DNA片断到NSCLC细胞株A549, 然后将转染细胞注入裸鼠后背, 以观察肿瘤是否形成来判断该DNA片断是否包含抑癌基因, 结果发现和证实了人染色体11q23.2处的一个崭新的肿瘤抑制基因, 它能明显抑制肺癌细胞株的恶性生长, 命名为肺癌肿瘤抑制因子-1 (TSLC1) 。以后相继在不同的实验室和不同的部位发现了人染色体11q23.2这个抑癌基因, 分别命名为:免疫球蛋白家族4 (immunoglobulin superfamily 4, IGSF4) 、精子生成相关免疫球蛋白类超家族 (spermatogenic immunoglobulin superfamily, SgIGSF) 、突触间黏附分子1 (synaptic adhesion molecule 1, SynCAM1) [3] 。现就TSLC1在肿瘤中的研究进展综述如下。

1TSLC1的结构

TSLC1属于免疫球蛋白超家族, 位于染色体11q23.2, 全长大于300 kb, 含12个外显子, 其中外显子8具有8a、8b和8c 3种不同拼接亚型, 上皮细胞只表达外显子8a。其转录产物为4.4 kb或1.6 kb长的mRNA前体, 翻译生成442个氨基酸残基的跨膜糖蛋白, 蛋白相对分子质量在上皮细胞约为75 kD, 中枢神经系统中约70 kD, 睾丸组织中约100 kD。蛋白相对分子质量不同的原因主要是翻译后修饰以及不同拼接形式所引起。TSLC1蛋白含胞外区、跨膜区和胞质区。胞外区含373个氨基酸, 并通过二硫键形成3个免疫球蛋白C2型结构域;跨膜区为一疏水的α螺旋;胞质区羧基端含有PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1) 和FERM (protein4.1/ezrin/radixin/moesin) 结合模体, 并能与相应蛋白结合发挥其特殊功能。通过FERM结合模序, TSLC1可直接与DAL-1/4.1B蛋白 (differentially expressed in adenocarcinoma of the lung ) 相互作用;通过PDZ 结合模序, TSLC1 可与属于膜相关鸟苷酸激酶同系物家族 (membrane-associated guanylate kinase, MAGuK) 的MPP3蛋白发生作用, 激活下游蛋白发挥信号传导作用。在裸鼠试验中证实去除FERM、PDZ结合模序的TSLC1丧失了抑瘤活性[4]。因此, TSLC1胞浆内的FERM-和PDZ-的结合模序对肿瘤抑制活性、细胞黏附作用是必需的。

2TSLC1的失活

TSLC1的失活机制主要表现为启动子甲基化和杂合性缺失。当前研究均集中于显示TSLC1的缺失与启动子甲基化的密切关系[5]。DNA甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常, 这是近年发现的细胞癌变的重要步骤。在真核生物中, 最重要的甲基化碱基是胞嘧啶, 通常发生在胞嘧啶 (CpG) 双核苷区域, CpG常在胞嘧啶甲基化成5′-mCpG。研究发现:DNA的高甲基化可以抑制转录因子与它的结合, 因而抑制抑癌基因的转录。同时甲基化状态的改变与基因缺失的发生有密切关系, TSLC1基因杂合性缺失位于11q23处, 在原发性非小细胞肺癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌中TSLC1位点出现杂合性缺失分别为42 %、33 %、17 %、33 %[6]。

3TSLC1与肿瘤

TSLC1最初是在肺癌中发现其表达异常, 随后在脑膜瘤、成人型T 细胞性白血病、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌和鼻咽癌等肿瘤中也发现了该基因的表达异常。

3.1 肺癌

在对肺癌的研究中, Kikuchi等[7]通过单链构象多态性分析和亚硫酸氢钠测序法对103例原发性非小细胞肺癌进行了TSLC1启动子甲基化的研究:发现44 % (45/103) 的病例TSLC1启动子发生了甲基化, 其中68例肺腺癌有29例TSLC1启动子发生了甲基化 (43 %) , 26例肺鳞癌有14例TSLC1启动子发生了甲基化 (54 %) , 2例肺腺鳞癌有1例TSLC1启动子发生了甲基化 (50 %) , 7例肺大细胞癌有1例TSLC1启动子发生了甲基化 (14 %) , 且TSLC1启动子甲基化在男性病例比女性病例要高, 由此研究者考虑是否TSLC1启动子甲基化与吸烟有关, 研究结果表明:TSLC1启动子甲基化易发生在吸烟较重的原发性非小细胞肺癌病人 (吸烟指数≥800) , 且与吸烟的烟龄和每天吸烟数目相关。研究者还对TSLC1启动子甲基化对非小细胞肺癌病人预后的影响进行了研究发现:TSLC1启动子的甲基化意味着更短暂的无病生存期, TSLC1的表达水平可以作为肺腺癌预后的参考指标。还有学者对38例肺腺癌病人的肺癌组织进行了研究:运用免疫组化方法发现TSLC1蛋白表达于正常的肺组织, 分布于支气管和肺泡上皮细胞的侧膜以及支气管与支气管浆液腺的细胞与细胞边界处, 而在肺癌组织中表达减少或是缺失, 运用Western blot方法对正常的肺组织和肺癌组织中TSLC1蛋白分析结果和运用免疫组化的得出的结果是一致的, TSLC1蛋白随着病理分级、T分期、N分期的增高和淋巴结转移及血管转移而表达减少, 并且研究者把肺癌患者按TSLC1的表达水平70 %、20 %～70 %、小于20 %分为三个组, 在对4年存活率的分析中各自为84 %、28 %、7 %, 提示TSLC1蛋白的表达与患者预后有密切关系, 在肺腺癌病人中, TSLC1蛋白的高表达预示着长的生存时间, 而TSLC1蛋白表达下降或是缺失预示着很差的预后。有学者用免疫组化方法检测93例外科手术切除的肺腺癌时发现:64.5 % (60/93) 的肺腺癌缺少TSLC1蛋白的表达, 其中70.0 % (41/54) 男性病例TSLC1蛋白表达缺失, 而此现象仅存在于48.7 % (19/39) 女性病例中, 并且通过单变量与多变量生存分析认为TSLC1蛋白可以作为判断肺腺癌病人生存率的独立指标。进一步分析发现TSLC1蛋白的失表达与男性患者的预后关系密切, 而在女性患者不确定, 由此认为TSLC1 缺失多发生于男性患者, TSLC1蛋白在肺腺癌中表达与性别有关联。TSLC1蛋白的表达与年龄、临床分期、淋巴结转移、局部侵润、血管转移没有关系。研究还发现TSLC1蛋白与基因P27、P53、Ki-67在肺腺癌的发生、发展过程中没有相互作用关系, 而以前的研究已经证实P27蛋白、P53蛋白、Ki-67蛋白参与了肺腺癌发生、发展[8]。由此认为TSLC1的失表达是通过一条独立的途径导致癌细胞的增殖。。

3.2 脑膜瘤

脑膜瘤早期基因研究主要是2型神经纤维瘤病基因 (NF2) 和DAL-1/4.1B基因失表达, 有报道DAL-1/4.1B蛋白可以与TSLC1相互作用, 参与其抑瘤功能[9]。Surace等[10]应用Western 印迹和免疫组化方法对脑膜瘤与TSLC1进行了研究发现:TSLC1蛋白在正常的脑脊膜上表达, 123例脑膜瘤中, 48 %的Ⅰ级良性脑膜瘤、69 %的Ⅱ级非典型脑膜瘤及85 %的Ⅲ级恶性脑膜瘤均存在TSLC1蛋白表达的缺失, TSLC1蛋白的表达随肿瘤恶性程度的增高而下降, 而在恶性脑膜瘤细胞株 (IOMM-Lee、CH157-MN、175) 中tslcl则完全不表达。缺乏tslcl表达的IOMM-Lee细胞株中导人重新构建的tslcl质粒表达载体, 能够有效抑制细胞增殖。并且认为DAL-1/4.1B蛋白与TSLC1蛋白在脑膜瘤的发生、发展过程中没有联系。在高等级的脑膜瘤患者中tslcl缺失更普遍, tslcl缺失可以导致患者生存率明显下降。总之, tslcl在脑膜瘤的发病过程中可能发挥着重要的作用。

3.3 食管癌

Ito等[11]对食管鳞状上皮细胞癌的研究中, 通过RT-PCR观察到有75 %的食管癌细胞株和50 %的食管癌患者TSLC1 mRNA表达缺失, 而在正常食管上皮及其衍生出来的细胞系TSLC1 mRNA有明显表达, 并且TSLC1的失表达与食管癌浸润的深度和转移有很明显的关系, 而与年龄、性别、组织分化程度等没有关系。运用Kaplan-Meier生存率分析法发现:有TSLC1表达的食管癌患者的生存率高于没有TSLC1表达的食管癌患者, TSLC1表达可以做为判断食管癌预后的一个独立的标记物。TSLC1mRNA在食管癌中的失表达主要与启动子甲基化有关。通过DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化, TSLC1 mRNA又从新表达。通过流式细胞术分析重新导入TSLC1的食管癌鳞状上皮细胞, 发现细胞大部分集中在G1期, 说明TSLC1具有抑制癌细胞生长的能力, 并且其中一种机制是限制癌细胞于G1期。运用免疫荧光法发现TSLC1蛋白以交错的结构聚集在细胞膜之间, 提示TSLC1蛋白具有细胞粘附作用[12]。这些发现提示:TSLC1可以作为一个治疗食管癌的新的基因靶位。

3.4 鼻咽癌

Lung等[13]进行了鼻咽癌与TSLC1的相关性研究, 运用RT-PCR发现高达87 %的鼻咽癌病人有TSLC1基因表达的下调或缺失, 运用组织芯片技术和免疫组织化学技术发现:TSLC1蛋白在正常的鼻咽部黏膜上皮中100 %表达, 而在鼻咽癌患者中43 %的病例TSLC1蛋白表达减少, 21 %的病例TSLC1蛋白表达缺失, 其中35 %的有淋巴结转移的鼻咽癌病人存在TSLC1蛋白的表达缺失, 而没有转移的原发鼻咽癌病人TSLC1蛋白的表达缺失为12 %, 两者之间有统计学意义, 提示由于TSLC1参与细胞间粘附, TSLC1的失表达产生粘附作用的破坏而导致肿瘤细胞向局部侵袭和远处转移, TSLC1蛋白可以考虑作为一个判断鼻咽癌患者是否存在有淋巴结转移的危险性的指标。通过对导入野生型TSLC1的鼻咽癌细胞系进行体外克隆形成试验发现:TSLC1的导入抑制了鼻咽癌细胞系的克隆形成能力, 进一步研究发现TSLC1抑制癌细胞于G1期内, 并且在没有血清的条件下, 诱导了凋亡。这些都证明TSLC1是鼻咽癌发生的抑癌因子。

3.5 白血病

成人T淋巴细胞白血病 (adult T cell leukemia, ATL) 由人类嗜T淋巴细胞病毒1型 (human Tcellleukemia virus type 1, HTLV- 1) 感染引起, 正常及活化的T细胞不表达TSLC1。Sasaki等[14]在研究成人T淋巴细胞白血病时发现:相对于正常CD4+淋巴细胞, ATL细胞上TSLC1表达至少上调30倍, 在8例原发性ATL细胞及5种ATL细胞株中均发现TSLC1的异位高表达, 而在2种急性T细胞型淋巴母细胞白血病 (T-cell acutelymphoblastic leukemia, T-ALL) 细胞株、34 例无HTLV-1 感染的其他种类淋巴细胞白血病中及10 种正常人的CD4+淋巴细胞都没有检测到TSLC1的表达, 当把TSLC1重新导入ATL细胞株ED细胞后, 细胞自身聚合和粘附血管内皮细胞的能力发生显著增强, 推测TSLC1参与伴HTLV-1感染的ATL的发生过程, 因此, TSLC1的异位表达为急性ATL提供了一个新的标记物, TSLC1也可能参与恶性ATL所导致的组织侵袭。

3.6 胰腺癌

Shimizu等[15]通过PCR研究胰腺腺癌中TSLC1甲基化情况发现:在17个胰腺癌细胞系中有4个细胞系发生了CpG岛的甲基化, 而且在这些甲基化的细胞系中TSLC1失表达。在91例原发性胰腺腺癌中有25例发生了TSLC1启动子的甲基化, 在CINⅢ中有27 %发生了甲基化, 而在CINⅠ、CINⅡ和正常胰腺上皮中无甲基化发生, 由此得出结论:在胰腺癌的发生过程中, TSLC1的失表达是通过TSCL1基因5’端的CpG岛甲基化实现是很常见的事件, 并且是发生在胰腺癌形成的晚期。刘志清等[16]对42例胰腺癌、11例胰腺炎组织和9例胰腺正常组织中的TSLC1蛋白和DAL-1/4.1B蛋白表达进行了免疫组化研究发现:TSLC1、DAL-1/4.1B蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率均明显低于在正常胰腺组织和胰腺炎组织中的表达, TSLC1和DAL-1/4.1B蛋白的异常表达均与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关;而与患者的性别、年龄、部位和病理分型无关. 在42例胰腺癌中TSLC1与DAL-1/4.1B蛋白表达呈显著正相关。提示:TSLC1蛋白可以作为判断胰腺癌恶性程度的一个重要的生物学指标, TSLC1蛋白可能与DAL-1/4.1B蛋白共同参与胰腺癌的发生、发展和转移。

3.7 肝癌

Qin等[17]通过将人类正常肝脏细胞表达的TSLC1 RNA经过逆转录、扩增由pCI-neo表达载体转染到人类肝癌细胞系HepG2作为实验组, 由只导入pCI-neo表达载体的肝癌细胞系HepG2作为对照组, 由没有任何处理的肝癌细胞系HepG2作为空白对照, 进行了TSLC1与肝癌的研究, 发现在细胞形态上实验组要比对照组和空白对照聚集紧密, 并且实验组的细胞增殖明显受到了抑制, 试验组在G0-G1期的细胞数目比例为63.66 %±3.83 %, 对照组和空白对照分别为47.45 %±0.91 %、54.47 %±0.96 %;试验组在S期细胞数目比例22.90 %±6.04 %, 而对照组和空白对照分别为36.58 %±0.61 %、33.61 %±2.99 %。实验组和对照组之间差异有统计学意义, 实验组细胞凋亡的数目明显高于对照组和空白对照组。由此作者认为:TSLC1在体外导入肝癌细胞系HepG2强烈的抑制了肝癌细胞系HepG2的增殖并且介导了肝癌细胞的凋亡, TSLC1在肝癌中发挥了肿瘤抑制作用。He等[18]构建了SD55-TSLC1, SD55-TSLC1即是TSLC1基因插入到双调控溶瘤腺病毒载体Ad.SP-E1A, E1B (Δ55) , 然后将SD55-TSLC1进行了在体外和感染了Huh7肝癌细胞株的裸鼠的抗肿瘤实验, SD55-TSLC1表现了很好的抗肿瘤性且对肝正常细胞很小几乎可以忽略的损害, 提示溶瘤腺病毒是TSLC1基因很好的载体, SD55-TSLC1可能成为临床治疗肝癌很好的选择。

3.8 乳腺癌

Heller等[19]对乳腺癌与TSLC1和DAL-1的表达进行了研究:在8个乳腺癌细胞系中, 有5个乳腺癌细胞系中TSLC1失表达 (63 %) , 有6个乳腺癌细胞系中DAL-1失表达 (75 %) , 其中有4个乳腺癌细胞系TSLC1启动子发生甲基化 (50 %) , 有6个乳腺癌细胞系DAL-1启动子发生甲基化 (75 %) ;在95例原发性乳腺癌标本中, 48 %的病例发现有TSLC1启动子甲基化, 27 %的病例发现有DAL-1启动子甲基化, 并且Ⅲ期的乳腺癌较I期和II期更易发生启动子的甲基化, 其中TSLC1启动子甲基化与雌激素受体和孕激素受体的失表达相关。TSLC1和DAL-1共同参与了乳腺癌的发生, 他们的表达下降或是失表达是由于启动子的甲基化导致的。Allinen等[20]通过研究认为:TSLC1启动子超甲基化是继抑癌基因TSLC1发生杂合性缺失后对乳腺癌发生的另一种促进途径。

3.9 胃癌

Honda等[21]通过单链多态性构象分析和直接测序法对10个胃癌细胞系和93个原发性胃癌中TSLC1启动子甲基化状态进行了研究, 在10个胃癌细胞系有2个发生了TSLC1启动子甲基化, 分别是KATO-Ⅲ和ECC10两个细胞系, 他们的TSLC1等位基因仍存在, 但TSLC1蛋白失表达;有16 %的原发性胃癌的TSLC1启动子发生甲基化, TSLC1等位基因也存在, 但在胃的正常上皮中没有发现TSLC1启动子发生甲基化现象。这些结果说明:在胃癌中TSLC1不表达是由于TSLC1等位基因的启动子甲基化导致的。

3.10 宫颈癌

Tamura等[22]应用亚硫酸氢盐修饰DNA序列检测了不同宫颈组织中TSLC1基因启动子甲基化的情况, 在高级CIN中为35 %, 而宫颈癌中是58 %, 而在正常宫颈组织和低级CIN中没有检测到。表明TSLC1基因高甲基化频率随疾病的严重程度而增加。高级CIN中TSLC1基因甲基化频率比永生化细胞中的低而且端粒末端转移酶活性和其反转录基因增加, 这表明TSLC1启动子甲基化可能发生在细胞永生化之后。TSLC1基因在91 %的宫颈癌细胞株中表达沉默, 但在非致瘤性HPV永生化的细胞株中无一例表达沉默。这些数据也表明TSLC1基因表达沉默可能与HPV永生化导致瘤性表型的转化有关。国内的Yang等[23]也对TSLC1与宫颈癌的发生进行了研究, 通过实时荧光RT-PCR方法检测了不同宫颈组织中TSLC1的表达, 在宫颈癌中TSLC1失表达率为77 %, 在宫颈CINⅢ TSLC1失表达率为73 %、CINⅡ为26 %、CINⅠ为22 %, 而在正常的宫颈上皮组织和宫颈炎症上皮组织中未发现有TSLC1失表达。这些结果表明:TSLC1失表达易发生于高级别的宫颈上皮内瘤变和宫颈癌, TSLC1失表达是宫颈癌发生过程中的早期事件, TSLC1基因的表达水平与宫颈癌的进展有密切关系。

3.11 前列腺癌和膀胱癌

Shimizu等[24]研究发现, 75 %的前列腺癌细胞系存在着TSLC1的表达缺失或低表达, 前列腺癌组织tslc1的低表达与tslc1启动子高甲基化密切相关, 约32 %的病例启动子出现高甲基化, 启动子的高甲基化不仅出现在高分级的肿瘤中, 而且在相对早期的肿瘤中也能发现。导入TSLC1的裸鼠肿瘤的生长受到了抑制, TSLC1的突变参与了前列腺癌的发生。Hellwinkel等[25]研究认为TSLC1的CpG岛的甲基化情况可以作为膀胱癌检测和诊断的分子标记物。

4展望

TSLC1 作为一种新的抑癌基因参与细胞间黏附、细胞运动、信号转导以及免疫调节。它在多种肿瘤中呈现异常表达, 其对肿瘤的影响主要表现为抑制瘤细胞增殖及诱导凋亡、改变瘤细胞的生长特性及基因表达和抑制上皮间质转化。TSLC1 的缺失与启动子甲基化关系密切, 但其发挥抑癌作用的分子机制及信号转导途径尚需要更多的实验研究。TSLC1在多种肿瘤中扮演的是抑癌基因的角色, 但是在ATL中却扮演的是癌基因的角色, TSLC1的具体作用还有待进一步研究[26]。Fukuhara等[27]研究发现TSLC1抑瘤途径不是如K- ras或p16的直接作用, 而是和体内某些细胞生长的过程有关, 所以, 为在体外能够抑制肿瘤生长而对细胞没有任何毒性提出一种新的分子机制, 把TSLC1作为治疗性靶基因, 对细胞没有毒性可能更有益于避免患者在化疗治疗肿瘤时的不良反应。在前列腺癌发生的初期阶段可以应用抗雄激素药物治疗, 但这些药物对于不依赖于雄激素生长特性的浸润性前列腺癌没有明确疗效TSLC1在前列腺癌PPC-1细胞株中有抑癌活性, 值得注意的是PPC-l细胞株是不依赖于雄激素生长的浸润性前列腺癌中提取出的, 因此, TSLC1可能作为一个治疗前列腺癌的候选靶基因[24]。肺癌患者术后TSLC1的表达水平和预后不良有关, 表明TSLC1可以作为控制肿瘤生物侵袭性的重要的受体蛋白和预测患者预后的重要的生物标记。其临床意义在于可以预测出有复发的可能的患者性, 并给予辅助治疗。而且, TSLC1的重新表达能够明显抑制恶性细胞表型的生长, 其原因可能是TSLC1使凋亡蛋白半胱天冬酶 (apoptotic protease caspase - 3) 活性增高伴随着其多聚酶底物的裂解, 这种抗增殖作用和诱导细胞凋亡的活性也表明TSLC1蛋白也可能成为治疗NSCLC和其他人类肿瘤的靶基因[28]。总之, 进一步研究TSLC1将有助于了解肿瘤发病机制, 从而可能为指导临床诊断和治疗提供新的思路, TSLC1表达变化可预测多种肿瘤的临床进展及预后情况, 异位表达的TSLC1及下游蛋白产物也为基因治疗提供了潜在分子靶点, 同时也能扩展人们对理解肿瘤作为一种常见的疾病的视野, 对TSLC1功能的深入研究可能对探讨肿瘤的发生发展过程具有重要意义。

肿瘤抑制因子P53 篇2

依赖性受体Unc5H家族在无配体Netrin-1作用下可指引细胞走向凋亡, 起到条件性肿瘤抑制基因的作用。既往研究证明Unc5H4基因在低危神经母细胞瘤中表达明显高于其在高危NB中的表达水平, 且高Unc5H4表达与NB患儿长期生存相关[2]。而P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因, 在所有恶性肿瘤中50%以上会出现P53基因的突变, 说明P53基因的改变可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。本实验观察应用si RNA沉默P53表达及P53缺失的NB细胞系中转染P53表达后, 在DNA损伤时Unc5H4的表达与P53的关系, 从而探讨依赖性受体Unc5H4的表达及诱导凋亡与P53之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE细胞株 (中国科学院上海细胞库) ;p SUPER-P53质粒 (Oligo Engine) ;pc DNA3.1-P 53质粒 (Santa) ;ADR (浙江海正药业) ;RPMI 1640及DMEM培养基 (美国Gibco公司) ;胎牛血清 (奥地利PAA Laboratories公司) ;Lipofectamine 2000转染试剂 (Invitrogen) ;G418 (美国Gibco公司) ;抗P53抗体 (DO-1, Onco gene Research Products) ;抗Unc5H4抗体 (Santa Cruz, CA, USA) 。

1.2 仪器

二氧化碳 (CO2) 培养箱 (SHEL, 美国) ;超净工作台 (苏州安泰公司) ;超低温冰箱 (Forma Scientific, 美国) ;倒置相差显微镜 (Olympus) ;PCR热循环仪 (美国Applied Biosystems公司) ;低温高速离心机 (美国Beckman公司) ;微量加样器 (Eppendorf, 德国) ;细胞培养瓶及培养板 (Corning) 。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y及SK-N-BE细胞复苏与传代培养

将-80℃冻存的细胞株取出, 37~40℃水域融化, 将细胞悬液移至15 m L离心管中, 分别将SH-SY5Y细胞及SK-N-BE细胞加入无血清的RP-MI及DMEM培养基中, 离心清洗1次, 将细胞分别加入含10%胎牛血清的培养基于37℃、5%CO2培养箱中传代培养, 待细胞汇合率达到80%以上时用胰蛋白酶进行消化传代, 以稳定生长的第3~5代细胞制备细胞悬液。

1.3.2 质粒转染

用Lipofectamine 2000试剂进行质粒转染, 具体操作依照Lipofectamine 2000试剂盒附带操作规程进行。

1.3.3 沉默P53基因的稳定细胞系的建立SH-SY5Y

细胞分别转染空质粒 (p SUPER) 和抑制P53表达的质粒 (p SUPER-P53) 。转染48 h后, 用含终浓度500μg/m L G418的新鲜培养基换液后, 培养14 d, 挑取抗G418的细胞克隆继续培养, 挑选一个阳性克隆, 继续培养。

1.3.4 实验分组及处理

在对照组和稳定沉默P53基因的SH-SY5Y细胞中以时间依赖模式 (0 h和24h) 给予ADR刺激, 并在m RNA和蛋白水平检测P53和Unc5H4的表达。在P53缺失的SK-N-BE细胞中外源转入P53基因表达, 以时间依赖模式 (0、12和24 h) 检测P53和Unc5H4在m RNA和蛋白水平的表达。

1.3.5 RT-PCR参照试剂盒使用方法

通过RNessy Mini Kit提取总RNA, 并用随机引物和Super Script逆转录酶得到c DNA。经PCR扩增的第1链来检测目的基因的表达水平。引物及PCR条件见附表。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后, 用溴乙锭显色。

1.3.6 蛋白质印迹按时间依赖模式收获细胞

细胞经冷冻1 h PBS液清洗后在SDS细胞裂解液中裂解, 再用蛋白检测染液测定蛋白浓度, 等量蛋白质含量 (30~50μg) 的细胞裂解液加样于7.5%SDS聚丙烯酰胺, 电泳分离后转移至PVDF膜, 用含0.3%脱脂牛奶的TBS封闭非特异吸附, 分别加入抗P53抗体 (DO-1) 及抗Unc5H4抗体, 抗体室温作用1 h, 洗膜, 并用相应二抗作用, 在ECL系统显色。

2 结果

2.1 沉默P53基因表达后DNA损伤未能诱导Unc5H4表达

应用si RNA沉默P53表达的SH-SY5Y稳定细胞克隆中, 采用时间依赖性模式进行ADR诱导DNA损伤, 24 h未检测到Unc5H4的表达, 而含P53正常表达的对照组在24 h时间点可在m RNA及蛋白水平诱导Unc5H4的表达。见图1。

2.2 P53基因表达重建后可诱导内源性Unc5H4的表达

在P53缺失状态的SK-N-BE细胞中转染P53基因, 于转染后0、12和24 h时间点检测P53及Unc5H4表达。而随着P53表达的重建, 可诱导内源性Unc5H4基因在m RNA及蛋白水平的表达。见图2。

应用si RNA-P53质粒及G418筛选技术, 在SH-SY5Y细胞中建立P53沉默的稳定细胞, 沉默P53基因表达后DNA损伤未能诱导Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达, 而对照组应用ADR作用24 h时能够诱导Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达。

在SK-N-BE细胞中转染1.0μg pc DNA3.1-P53质粒, 于0、12及24 h时间点检测P53及Unc5H4的表达。随着P53表达的重建, 可诱导出内源性Unc5H4在m RNA及蛋白水平的表达。

3 讨论

肿瘤的发生、发展是细胞失去控制, 无限积累的过程, 包括细胞的异常增殖和凋亡受抑。P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因, 在所有恶性肿瘤中50%以上会出现P53基因的突变, 说明P53基因的改变可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。P53介导的细胞信号传导途径在调节细胞正常生命活动中起着非常重要的作用, 它与细胞内其他信号传导通路间的联系十分复杂, LEVINE等学者提出了“P53基因网络”的概念[3]。已知P53凋亡途径包括线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径[4]。随着研究的不断进展, 新型P53通路不断被发现。

依赖性受体Unc5H家族在神经系统发育过程中对轴突的延伸、神经元的迁移等起着至关重要的作用[5]。Unc5H家族成员在特异性配体Netrin-1存在时, 向细胞传达有关分化、增殖及游走等正向信号, 而当缺乏Netrin-1表达时, 指引细胞走向凋亡, 从而发挥条件性肿瘤抑制基因的作用[6]。既往研究证明Unc5H4基因在低危NB中表达明显高于其在高危NB中的表达水平, 且高Unc5H4表达与NB患儿长期生存相关[2], 且Unc5H4能够抑制NB细胞的迁移和侵袭, 并诱导NB细胞凋亡[7]。

本研究为进一步研究条件性肿瘤抑制基因Unc5H4与P53的关系, 在含有野生型P53的人NB细胞系SH-SY5Y细胞中, 应用si RNA技术建立沉默P53基因表达的稳定细胞, 以时间依赖模式在有/无ADR刺激下检测内源性Unc5H4的表达情况, 发现沉默P53基因表达后, 与对照组相比, DNA损伤未能诱导Unc5H4的表达。笔者在P53缺失型的人NB细胞系SK-N-BE细胞中转染P53质粒, 以时间依赖模式在有/无ADR刺激下检测Unc5H4的表达情况, 发现恢复P53基因的表达后, DNA损伤能够在m RNA及蛋白水平诱导Unc5H4的表达, 从而证明Unc5H4在无配体作用下的促凋亡作用是依赖P53的正常功能完成的, Unc5H4是P53的新型调控基因。为进一步解释NB的发生、发展机制及筛选有效的NB预后标志物和靶向治疗提供依据。

参考文献

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肿瘤抑制因子P53 篇3

Survivin基因编码的survivin蛋白, 是凋亡抑制蛋白 (IAP) 家族中的最小成员, 以同源二聚体形式存在。不同于IAP其他家族成员, survivin N端有一杆状病毒IAP重复序列 (BIR) , 由3股反平行β片层和4个α螺旋组成。Survivin参与多种细胞进程, 它的BIR区域在细胞有丝分裂过程中起重要作用。Survivin是迄今所发现的最强的凋亡抑制因子, 它可通过抑制癌细胞中不同效应蛋白酶caspase的活性来干扰细胞凋亡。Survivin可结合X染色体连锁凋亡抑制蛋白 (XIAP) , 形成复合物以抑制XIAP通过泛素蛋白酶体通路降解, 并且能抑制Capase-9的活性[1]。更多研究表明, survivin参与细胞自体吞噬, 其下调会引起细胞凋亡。且survivin可与多种DNA损伤修复相关因子作用, 从而协助核中DNA修复。

2 Survivin在肿瘤中的靶向作用

由于survivin在多种肿瘤细胞中高表达, 而在癌旁组织及正常组织中低表达或者无表达。这一特异性可使其成为肿瘤标志物, 近几年一直是研究抗肿瘤药物的热点, 以下介绍近来靶向survivin药物及技术的研究进展。

2.1小分子抑制剂

2.1.1 YM155:YM155 (1) 通过抑制survivin启动子活性而发挥作用, 体内外都能有效抑制IAP家族, 作为一线survivin特异抑制剂被广泛研究。YM155可有效抑制多种人类肿瘤细胞株, 且不受抑癌基因p53基因状态的限制。Ⅰ期临床研究结果显示, YM155用于非小细胞肺癌、晚期前列腺癌、霍奇金淋巴瘤患者中, 肿瘤萎缩变小且持久缓解。针对29例不可切除Ⅲ或Ⅳ期黑色素瘤的Ⅱ期临床试验中, 虽耐受性良好, 但只有1例患者出现部分应答, 未达到预期治疗终点[2]。对紫杉醇预处理的CRPC患者静注本品的Ⅱ期临床试验中, 25%患者病情维持稳定在18周以上, 且耐受性良好, 有疲劳、恶心、厌食等不良反应。此外YM155/多西他赛联用治疗CRPC的效果仍被评估中[3]。

2.1.2 FL118:FL118 (2) 是结构上类似于依利替康和拓扑替康的新型survivin小分子抑制剂, 它可以0.1~1 nmol/L浓度选择性地抑制survivin启动子活性, 且不受p53状态的限制。同时, FL118可抑制其他肿瘤细胞表达生存关键基因, 如XIAP、Mcl-1和cl AP2。在人类肿瘤异种移植模型中, 相较于伊立替康、5-FU等, FL118显示出更好的抗肿瘤活性, 相伴而来的不良反应是暂时性体质量下降。最新研究表明, FL118抗肿瘤活性高度依赖其一级结构和空间构型, 因此可以FL118母核为先导物, 设计和合成一系列有前景的衍生物用于筛选和深入研究。总之, FL118有望成为进一步临床研究的候选药物[4]。

2.1.3 4, 6-二 (取代苯基) -3-氰基吡啶-2-酮类化合物:Wendt等通过[13C, 1H]-核磁共振方法筛选发现两个系列小分子可特异性作用于survivin二聚体连接处[5], 即N-芳基吲哚类 (3) 和4, 6-二 (取代苯基) -3-氰基吡啶-2-酮类化合物 (4) , 它们是不同类型的靶向survivin的结合物, 也可以作为研究survivin蛋白生化作用的探针。进一步研究发现4, 6-二 (取代苯基) -3-氰基吡啶-2-酮衍生物5与survivin亲合作用更为明显, 这些为筛选以survivin为靶的治疗癌症化学小分子提供了全新的结构类型, 这方面的研究报道值得跟踪与关注。

2.1.4 UC112 (6) :UC112[6]在IC50范围为0.7~3.4μmol/L时, 可有效抑制P-糖蛋白过表达的多药耐药肿瘤细胞的生长, 强力激活caspase-3/7和caspase-9, 且可以低达1μmol/L浓度选择性抑制survivin表达。在人体黑素瘤A375异种移植模型中, 单独使用本品, 可有效抑制肿瘤生长, 降低XIAP及survivin表达。

2.2 Survivin反义寡聚核苷酸:除用survivin小分子抑制剂靶向survivin外, 靶向survivin的反义寡聚核苷酸 (ASODN) 也可降低survivin的表达并增强恶性肿瘤放化疗敏感性。Survivin ASODN能够诱导肿瘤细胞自发性凋亡, 引起细胞有丝分裂失败, 抑制肿瘤形成和生长。

LY2181308是2’-O-甲氧乙基修饰的18-mer结构 (5’-TGTGCTA TTCTGTGAATT-3’) 。LY2181308可与通过碱基互补配对的survivin转录物的3’-未翻译区域选择性结合, 进而由RNase H破坏survivin RNA。LY2181308也同样可诱导癌症细胞中多倍体形成和caspase-3的活化。在临床前试验中, 脂质体/LY2181308复合物能以低于100 nmol/L有效抑制多种癌症细胞株。同时, 体内施用本品也可有效靶向癌细胞。在针对人类黑色素瘤 (YUSAC-2) 异种移植小鼠模型中施用本品, 可有效降低肿瘤生长速率。给人结肠癌 (SW480) 异种移植的小鼠施用本品, 可显著延迟肿瘤生长。在针对实体恶性肿瘤的Ⅰ期临床试验中, 本品单药治疗最大750 mg, 耐受性良好, 毒性可控[7]。但在CRPC患者进行的Ⅱ期临床试验中, LY2181308与多烯紫杉醇/强的松联用, 结果并不令人满意。且患者出现如嗜中性白细胞减少症、血小板减少的不良反应。因此, 亟须进一步试验来研究因LY2181308引起血小板减少的机制[8]。

2.3免疫治疗法:Survivin-2B80-88是一种人类白细胞HLA-A24特异性抗原肽, 是IAP家族成员, 它可被CD8+T淋巴细胞识别从而诱导其产生针对survivin的特异性细胞毒性T细胞 (CTLs) 。在9例尿路上皮细胞癌症患者接种此疫苗的临床试验Ⅰ期中, HLA-A24/survivin-2B80-88多肽四聚物分析显示, 5例患者CTLs特异性抗原肽水平显著增加。1例肿瘤体积轻微减小, 整个试验无严重不良反应。可改善癌症患者生存状况, 安全有效[9]。将survivin-2B80-88/IFA/IFNα复合疫苗接种到胰腺癌患者身上, 50%以上患者产生免疫应答, 治疗效果良好[10]。提示survivin可作为一种新的肿瘤相关抗原用于肿瘤免疫基因治疗, 抑制其表达从而抑制恶性肿瘤的发生发展。

3结语

Survivin, 既可调节细胞周期又能有效阻断多条凋亡途径, 因其最强的凋亡抑制作用在肿瘤治疗中占据着关键地位。Survivin在肿瘤细胞中的分布特点及表达特性, 提示其具有检测恶性肿瘤指标的巨大潜力。在临床研究中, 有些与肿瘤细胞作用的具体机制、相关途径仍需进一步研究。

综上所述, 目前Survivin反义寡聚核苷酸用于治疗肿瘤的临床试验表明, 存在的问题较多, 如抑瘤作用不明显和不良反应较多、较明显, 成为该方面研究停滞不前的原因。以survivin为靶的小分子药物和免疫治疗法的研究近年来发展较快, 它们的临床研究结果给人们以很大的鼓舞, 同时结果也提示我们, 小分子药物可能与其他抗肿瘤药物联合使用才能发挥survivin抑制剂的最大功效, 并可抵御耐药性。然而以survivin为靶的小分子抗肿瘤药物缺乏结构的多样性, 这将成为以后研究的一个重要方向。

摘要：Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成员, 参与细胞分裂和增殖过程调节, 在细胞凋亡抑制中起重要作用。Survivin在大多数已分化组织中低表达甚至不表达, 而在多数肿瘤细胞高表达, 这一特异性分布与表达使靶向survivin抗肿瘤疗法成为药学领域的研究热点。本文综述了survivin的结构和基因特性, 主要介绍survivin的功能及其在肿瘤中的靶向作用等方面的近年来研究进展。

关键词：Survivin,凋亡抑制,肿瘤治疗

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肿瘤抑制因子P53 篇4

1 肿瘤特异性抗原研究概况

T细胞能识别多种肿瘤抗原,其中可用于临床的不多。现有肿瘤疫苗分为特定抗原的疫苗与全细胞性疫苗两类,诱发或增强体内免疫系统对肿瘤的反应,但抗原的输送仍是待解决的问题。通常采用的载体有炎症细胞因子、树突状细胞(DC)和调节抗原递呈细胞,也可通过编码过的病毒和DNA作载体[2,3]。DC作为特异抗原呈递细胞一直受到重视。研究发现DC可诱导并激活T细胞,但具体递呈效果及在不同成熟阶段激活能力的差异尚未明确。实际制备的DC功能不强及中、晚期患者常见的免疫抑制体质都会影响疫苗有效性。另外,可增强T细胞和APC功能的佐剂已引起人们的兴趣。佐剂与抗原混合激活免疫过程中间物,间接强化T细胞,刺激作用较强,有效增强免疫反应。

2 细胞凋亡调节分子与细胞毒疗法

肿瘤细胞凋亡过程被阻断或抑制,原因是关键信号分子缺乏。细胞凋亡调节分子有IAP和Bcl￣2家族成员两种[4]。

细胞毒疗法关键在于诱导肿瘤细胞完成程序死亡。现临床应用的抗癌药物多通过类似机制进行治疗。此方案失效多因长期使用药物产生的耐药性,不同药物间的交叉耐药更降低了治疗效果。研究证实凋亡缺陷可使肿瘤细胞对化疗和放疗产生抗性[5]。目前抑制抗凋亡分子的表达已成为极受重视的策略,主要手段是抑制其合成[6]。

3 Bcl￣2与IAP研究

肿瘤细胞的存亡与抗凋亡分子有着密切的联系,本类蛋白分子是治疗性抗癌疫苗的最佳候选者。最近的研究也证明凋亡调节分子作为肿瘤抗原被识别后可有效介导癌细胞的死亡[7]。

4 Bcl￣2家族蛋白的应用研究

通过攻击Bcl￣2 mRNA起作用的反义寡核苷酸在治疗骨髓瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌等方面已进入临床试验,对部分实体瘤也达到了Ⅱ期临床阶段。体外实验和相关模型中此类药物对细胞毒药物表现出增强,因此临床常配合使用以提高疗效。

以Bcl￣2和Bcl￣XL分子为靶向的小分子药物开发设计也受到了重视。研究凋亡信号发现细胞内有很多抵抗这两种物质的分子,如BH3占据相关蛋白质结合点抵消抗凋亡作用;也有分子诱导Bax等表达加快癌细胞凋亡。目前研究正筛选可模拟天然多肽的物质,期望达到更好的治疗效果[8]。

普遍认为,肿瘤细胞中高表达的抗凋亡分子如Bcl￣2家族蛋白使凋亡过程难以发生,导致化疗耐药性和药物敏感度降低。检测结果表明血液肿瘤和实体瘤中的表达水平更高。经Bcl￣2致敏,T细胞可发展为片段特异性有效,更强烈地发生免疫反应。因此Bcl￣2家族蛋白可能成为免疫治疗中的重要靶分子。

5 IAP与细胞凋亡的应用研究

Survivin是凋亡抑制因子IAP家族的新成员。它可延长细胞生存期,是迄今最强的凋亡抑制因子。放疗和化疗都可使IAP表达上升而抑制凋亡,出现耐药性。统计表明Survivin的表达关系复发率和患者生存期,抑制IAP的表达或功能将恢复药物敏感性[9]。

Survivin在细胞分裂和死亡中有双重作用,且在肿瘤细胞中优先表达。部分报道认为正常细胞也有表达,但未检出。研究显示[10]恶性肿瘤中Survivin都表达极高,贯穿肿瘤细胞的整个生命周期。Survivin可作为肿瘤抗原。研究显示Survivin在食管癌中可定位,其异常表达与食管癌的发生发展紧密相关,且可作为一种诊断参考指标。研究检测Survivin编码的表达,显示预警和癌细胞转移提示,体外实验证实DC可快速且有效呈递Survivin。

患者机体会产生对Survivin的免疫,但存在个体差异。HLA分子在不同患者身上也表现不同的限制,多数患者的免疫系统需要策略性、针对性强化。临床统计证明,经刺激和强化的T细胞可有效杀死癌细胞且不产生不良影响。使用具备HLA￣A2限制性的Survivin表位序列多肽,通过自身DC进行呈递。结果证实,患者体内能够针对Survivin进行表位的T细胞大量增加,呈现强阳性。取样染色显示T细胞同时可渗透进软组织。此疗法的优点在于不会对造血干细胞产生影响。临床中患者多数处于中晚期阶段,效果下降。但可看出作用于凋亡调节分子,且含有多重表位的疫苗有广泛的抗癌和治疗效果,可尝试探讨此方案与传统细胞毒疗法结合的可能。若选择两种以上的抗凋亡因子制成疫苗,将会增强疫苗的效果。通过对肿瘤抗原的相关研究,相信随着科学的发展,攻克肿瘤将不再是难题。

摘要：阐述了T细胞抗原的研究结果,主要涉及到B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(即Bcl-2)家族蛋白及凋亡蛋白抑制因子(即IAP)。

关键词：凋亡蛋白抑制因子,Bcl-2家族蛋白,肿瘤,免疫治疗

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