胰岛样细胞

胰岛样细胞（精选7篇）

胰岛样细胞 篇1

骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能,在特定条件下可向多种细胞分化,是组织工程及基因治疗的理想靶细胞。干细胞的诱导分化、移植已应用于多种临床疾病治疗及多种组织坏死疾病的研究[1,2,3,4]。本实验将大鼠骨髓MSCs诱导分化为胰岛样细胞,鉴定诱导细胞并检测诱导细胞的功能,旨在为治疗糖尿病开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

周龄Wistar大鼠,购于吉林大学实验动物中心。DMEM培养基、B27(Gibcol公司),4’,6’-二乙酰基-2-苯基吲哚 (DAPI Roch) ,Percoll分离液、双硫腙 (DTZ) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子 (EGF)、胎牛血清、活化素、胰岛素、DMSO 、IBMX (Sigma公司), 地塞米松, Western blot 检测试剂盒(博士德公司)。

1.2 胰腺条件培养液的制备

将本校实验动物部提供的20只健康Wistar周龄大鼠处死,无菌条件下取胰腺组织,匀浆器研磨,离心取上清,滤器抽滤,-70℃反复冻融、1 500 r/min离心10 min,去上清冻存备用。

1.3 大鼠骨髓MSCs的分离、扩增培养

采用本室常规培养、扩增法。将周龄大鼠脱臼处死,75%酒精消毒,无菌条件下取股骨,用DMEM(低糖)培养液反复冲洗髓腔,尼龙网过滤细胞。加等体积的percoll分离液,2 000 r/min离心20 min,收集细胞的界面层,以5×106/ml接种于培养瓶中,加入20%胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2对其进行纯化、培养、传代。

1.4 体外诱导MSC向胰岛样细胞转化

取第3代骨髓MSC胰酶消化,制成单细胞按2×105/ml接种于6孔板中。分成3个实验组、1个对照组,使用无血清的低糖培养基培养2~3 d。3个实验组分别加bFGF、EGF、B27进行诱导培养6~7 d,免疫细胞学检测诱导细胞nestin表达情况。然后换用无血清高糖的培养基,并添加胰腺条件培养液、HGF(10 ng/ml)、2%B27、ActiveA、β巯基乙醇及尼克酰胺,继续培养6~7 d,对照组不加任何因子。

1.5 双硫腙染色鉴定胰岛样的细胞团

将诱导的细胞用缓冲液冲洗后,加1 ml 10 μg/ml双硫腙液,37℃孵箱孵育20 min,倒置显微镜观察细胞。

1.6 免疫细胞化学鉴定胰岛素和胰岛素样生长因子抗原表达

诱导后的细胞盖片,95% 乙醇固定,PBS洗3次,3%H2O2-甲醇液处理30 min,PBS洗3×5 min,0.25%tritonx-100,5%的DMSO溶液孵育10 min; PBS洗3×5 min,滴加5%~10%正常血清,室温,封闭30 min;滴加抗鼠胰岛素抗体,4℃过夜; PBS洗3×5 min,滴加合适FITC标记的二抗,37℃孵育30 min;PBS洗3×5 min,0.25%tritonx-100,5%的DMSO溶液孵育10 min; PBS洗3×5 min,滴加5%~10%正常血清,室温,封闭30 min;滴加抗鼠胰岛素样生长因子抗体,4℃过夜; PBS洗3×5 min,滴加合适FITC标记的二抗,37℃孵育30 min,封片。通过激光扫描共聚焦显微镜镜下观察。

1.7 Western blot检测胰岛样细胞胰岛素的表达

诱导分化2 w后,未诱导MSC为对照组,诱导分化细胞为实验组,以正常胰岛细胞为阳性对照,进行Western blot检测胞浆蛋白。离心收获细胞,用800 μl TEN洗脱,3 000 r/min离心5 min,弃上清。沉淀细胞用裂解缓冲液裂解后5 000 r/min离心5 min,取上清提取蛋白。将提取的蛋白定量,SDS-PAGE电泳,加封闭液室温封闭2 h,加入胰岛素抗体,加入二抗反应液,DAB显色。同时对凝胶染色,检查蛋白质转移是否完全。使其与抗体结合显色照相分析结果。

2 结果

2.1 MSCs的分离、扩增培养

经percoll分离液分离的细胞24 h后有少量梭型细胞贴壁,72 h后贴壁生长,成圆形、椭圆形、椭圆形、梭形不等。细胞达80%融合后用0.25%胰酶消化,传代继续扩增培养。传代后贴壁细胞大都成梭形。流式细胞仪鉴定所得细胞不表达CD45、CD44,CD34表达甚微。表明所得细胞是骨髓中一群处于未分化状态的幼稚干细胞。

2.2 体外诱导MSC向胰岛样细胞转化

在诱导的过程中MSC的形态渐渐发生变化,最初大多数细胞呈长梭形,少数细胞呈多角形或圆形,见图1、图2。诱导的骨髓MSCs免疫组化表达nestin。1 w后的细胞明显增多,已经聚集成团,见图3。2 w后部分细胞聚集呈悬浮状。

2.3 双硫腙特异染色

将诱导2 w的细胞进行双硫腙染色,倒置显微镜下观察,大部分细胞团都呈亮红色,见图4,表明诱导的细胞胞浆中含有锌离子。未诱导的MSC双硫腙染色阴性。

2.4 免疫组化鉴定胰岛素和胰岛素样生长因子抗原表达

将诱导分化2 w的细胞进行双重荧光标记免疫细胞化学染色,通过激光扫描共聚焦显微镜检测,第一通道FITC(异硫氰酸荧光素),荧光色为苹果绿,表示有胰岛素表达;第二通道Cy3(吲哚碳花青甙)荧光色为红色,显示胰岛素样生长因子表达,见图5。未诱导的细胞无表达。

2.5 Western blot胰岛素水平测定

结果发现,阳性对照组胰岛素有微弱表达,诱导分化为胰岛样细胞的实验组胰岛素表达阳性,未诱导的MSC胰岛素表达阴性,见图6。

注:1.对照组:未诱导的骨髓MSCs; 2.实验组:诱导分化后的骨髓MSCs; 3.阳性对照组:正常胰岛细胞。

3 讨论

MSC为多胚层细胞祖细胞的集合体,具有明显的可塑性,不同的细胞因子作用,导致MSC向不同的细胞系分化[5]。已证实可向心肌细胞、肝细胞及神经样细胞等转化,因此,它具有可向胰岛细胞的祖细胞转化的可能。

胰岛细胞主要是由α、β、γ、pp 4种细胞组成,将MSC体外诱导分化为胰岛细胞需要适宜的微环境。据报道大鼠MSC可以诱导转化为神经元细胞,而胰岛细胞最初发育阶段的形态与神经细胞非常相似[6],因此有人推断细胞分化过程中胰岛样细胞可能来源于神经元样细胞[7]。某些神经生长因子及必要的微环境也是胰腺发育的重要因素。nestin阳性细胞是在神经干细胞中发现的一种中间丝蛋白,已被确认为一种神经干细胞标志,由nestin阳性胰腺导管上皮样细胞诱导分化得到胰岛细胞亚群[8],因此认为nestin是胰岛干细胞的分子标志,可能有促进MSC向胰岛细胞分化的作用。MSC的可塑性表现在它们可在新的微环境中生成新组织所必需的细胞株。也可用随机抑制、随机诱导来解释,在转录水平和细胞因子水平进行调控。

本实验对MSC体外诱导胰岛细胞的培养体系进行了初步探讨。由于某些神经生长因子及必要的微环境也是胰腺发育的重要因素。EGF、bFGF具有扩增神经干细胞的功能[9,10],所以笔者首先将MSCs在无血清的DMEM培养基中培养,筛选nestin阳性细胞,使用EGF、bFGF进一步将MSC诱导成为nestin阳性细胞。另外,骨髓基质干细胞不仅可分化为中胚层细胞如脂肪细胞、软骨细胞,也可以分化为肝细胞等内胚层细胞;而肝细胞和胰岛细胞来源于同一祖细胞,肝细胞中的干细胞也可以转分化为胰岛细胞[11,12],因此笔者选择使用HGF和较特异的胰岛细胞分化剂尼克酰胺及胰腺组织条件培养液促进MSC向胰岛细胞分化。高糖培养基的使用,是因为提高葡萄糖浓度可以刺激MSC诱导分化。尼克酰胺又可以促进高糖诱导分化的细胞聚集,加快胰岛样细胞团的形成,增加胰岛细胞分化的数量,促进分化细胞的成熟[13]。地塞米松、B27、胰岛素可营养细胞并维持各种离体细胞的生长。活化素等因子可促进β细胞分化[14]。经诱导分化而来的胰岛样细胞,要经过一定的细胞因子(大部分是生长因子)作用后才能成熟,产生比较强的分泌胰岛素的功能。这是由于这些细胞因子在体外提供了使细胞成熟的环境,其中葡萄糖是强力促胰岛素分泌细胞成熟剂。在条件培养液中应该存在胰岛细胞生存的营养素及细胞生存因子。因此,胰腺条件培养液不仅提供了MSCs向胰岛细胞转化的细胞因子,还为所要诱导的MSC创造一个模拟体内的适宜体外胰岛细胞生存的微环境,MSCs可以分化成胰岛样细胞团的研究结果表明了微环境对MSCs的定向诱导分化起着重要作用,也为实现糖尿病患者用自体干细胞治疗自身疾病开辟了一条新途径。

在培养和诱导MSC的过程中,大多数MSC的形态由长梭形变成圆形并逐渐聚集。由于胰岛细胞中含有丰富的锌离子,双硫腙与其结合使细胞变成红色,因此双硫腙染色被认为是鉴定胰岛细胞较特异的方法。实验证实,多数细胞双硫腙染色阳性,证明体外诱导分化的MSC具有胰岛细胞的特性,说明大鼠MSC可在体外诱导分化为胰岛样细胞;在诱导分化的第一阶段(第一周),免疫组化、Western blot检测所诱导的细胞胰岛素有微弱表达;第二阶段(第二周),胰岛素表达增强,说明细胞已进入成熟阶段具有胰岛细胞的分泌功能。

由于胰岛细胞的增殖分化涉及很多营养素及细胞因子,所以弄清胰腺的发育机制,进一步优化微环境及促进诱导细胞的成熟将成为今后的工作重点,对今后诱导分化骨髓MSC向胰岛样细胞转化具有十分重要的意义。

胰岛样细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

新生Wistar大鼠 (同窝别, 出生后第7天) 、胎牛血清 (美国sigma) 、DMEM培养液 (美国Gibco公司) 、链霉素、青霉素、IL-1β、胶原酶 (美国sigma) , DAB (中山) 、Ⅱ型胶原一抗、二抗 (美国sigma) 、甲苯胺蓝、MMP-1 ELISA检测试剂盒 (美国sigma) 、MMP-1原位杂交试剂盒 (美国sigma) , IGFⅡ、倒置显微镜、酶标仪、96孔细胞培养板、CO2培养箱、超净工作台。

1.2 实验方法

1.2.1 体外培养关节软骨细胞

在无菌条件下取新生Wistar大鼠 (出生后第7天) 双后肢股骨髁软骨, GBSS平衡液漂洗4次后剪碎组织, 使用0.05%的透明质酸酶37.5℃消化6min, 0.2%胶原酶37℃振荡消化。4h后收集关节软骨细胞, 使用离心机1500r/min离心3min, 沉淀物用磷酸盐缓冲液 (PBS) 悬浮3次, 离心后至细胞沉淀, 使用10%胎牛血清DMEM液悬浮关节软骨细胞倒置显微镜下计数, 并且按照5×105/ml的细胞浓度移入细胞培养瓶中, 定时更换培养液待关节软骨细胞增殖为单层。胰蛋白酶消化, 按1×105/ml的浓度传代。将培养的第二代关节软骨细胞用于实验研究[3,4]。

1.2.2 实验分组与方法

待细胞贴壁增殖成单层细胞, 更换为0.1%牛血清清蛋白 (BSA) DMEM培养基中培养24h, 以去除内源性生长因子的影响, 然后更换含IL-1β1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的培养基, 每一浓度分别作用于8孔, 另设8孔对照组。分别于24h、48h、72h后留取培养细胞上清液[5]。

1.2.3 ELISA技术检测MMP-1基因蛋白

对离心后的关节软骨细胞培养上清液进行检测, 取100μl关节软骨细胞上清液并加入大鼠MMP-1单克隆抗体包被的96孔酶标板中, 在室温下孵育120min, PBS洗涤4次, 生物素化抗体工作液密封板。然后在室温下孵育60min, PBS洗涤4次添加酶结合物工作液封板。最后在室温下孵育30min, PBS洗涤4次加显色剂避光室温20min, 呈现蓝色后加终止液, 混匀后在酶标仪450nm处读取光密度 (OD) 值。

1.2.4 原位杂交检测方法

关节软骨细胞培养48h贴壁, 固定后进行MMP-1mRNA原位杂交。使用Cmais-2000型图像分析系统, 每组均为4个观测孔, 同时每孔随机选定2个观测视野, 选择切片的空白区域进行图像校正并调整光源及灰度, 由计算机图像分析系统自动计算出应性物质每200倍视野下平均OD值[6]。

1.3 统计学方法

应用SPSS15.0统计软件进行统计学分析, 计量资料采用F检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-1β对软骨细胞分泌MMP-1蛋白的影响

用酶联免疫吸附法检测IL-1β作用于关节软骨细胞后MMP-1基因蛋白的表达情况, IL-1β增加了体外培养关节软骨细胞MMP-1基因蛋白的分泌量, 组间比较差异有统计学意义 (P<0.05, 见表1) 。

注:与IL-1β0ng/ml比较, *P<0.05

2.2 IGFⅡ对关节软骨细胞MMP-1mRNA基因蛋白表达的影响

用原位杂交技术检测关节软骨细胞中MMP-1mRNA基因蛋白的表达, IL-1β可提高体外培养关节软骨细胞MMP-1mRNA基因蛋白的表达程度, 而IGF-Ⅱ可减弱MMP-1mRNA基因蛋白的表达情况, 在关节软骨细胞培养48h后可减弱MMP-1mRNA基因蛋白的表达情况。组间比较差异有统计学意义 (P<0.05, 见表2) 。

注:与IL-1 IL-1β0ng/ml+IGFⅡ10μg/ml比较, *P<0.05

3 讨论

关节软骨细胞是关节软骨的三大重要组成成分之一、软骨修复及损伤的主要标志, 同时也是软骨代谢活动的主要场所。MMPs家族对细胞外基质具有显著的分解作用, 对关节软骨的破坏有着极为重要的作用, 家族中的MMP-1基因蛋白又称为间质胶原酶, 有很多的MMP-1基因蛋白在病理组织中呈现出高表达, 而在正常关节软骨组织中却很难发现, 这极可能是与关节软骨组织中的表达浓度过低或者是与关节软骨组织中金属蛋白酶结合有着重要的关系[7]。

越来越多的资料证实了IL-1β对OA病变发生、发展有着重要的作用, 因为这些结果不仅被用于评价OA患者的病变程度, 也为临床上评价预后、防治病情的恶化指明了方向。因为IL-1β在OA的发生和发展过程中起着极为重要的作用, 被广泛的用于OA体外模型的构建, 同时在OA的病理改变中也发挥着极为重要的作用[8,9]。IL-1β是关节软骨细胞中胶原酶的有力刺激因子。在OA发病过程中, 关节软骨细胞在IL-1β因子的刺激下, 能够合成类型和数量异常的基质成分, 并且能够导致关节软骨基质丧失其固有的性质及特性[10,11]。IL-1β炎性因子在一定条件下还可以减少Ⅱ型胶原蛋白mRNA基因蛋白在关节软骨细胞中表达的增加, 同时能够导致金属蛋白酶基因蛋白表达的增加, 导致关节软骨基质的降解。相比之下, 生长代谢因子IGFⅡ可刺激关节软骨细胞基质蛋白的合成, 并减少细胞外基质的降解。

胰岛样细胞 篇3

1资料与方法

1.1一般资料

观察组74例患儿均为2012年3月~2013年3月于解放军第253医院及内蒙古自治区妇幼保健院新生儿科住院患儿, 按照胎龄分为足月窒息组与早产窒息组。足月窒息组34例, 胎龄37~42周;体重2.5~4.0 kg; 男婴16例, 女婴18例。 早产窒息组40例, 胎龄32~ 37周;体重1.8~2.5 kg;男婴22例, 女婴18例。 根据Apgar评分及头颅CT和核磁检查足月窒息组及早产窒息组又分别分为轻度窒息组、中度窒息组及重度窒息组。生后1 min Apgar评分6~7分为轻度窒息组, 生后1 min Apgar评分4~5分为中度窒息组, 生后1 min Apgar评分0~3分为重度窒息组。 对照组37例为同期出生无缺氧窒息史且Apgar评分为8~10分的新生儿, 按照胎龄及体重分为足月新生儿组与早产儿组。 其中足月新生儿组17例, 孕龄37~42周; 体重2.5~ 4.0 kg; 男婴9例, 女婴8例。 早产儿组20例, 孕龄32~37周;体重1.8~2.5 kg;男婴4例, 女婴16例。 均无严重感染、肝脏疾病、先天性畸形及代谢性疾病、染色体异常、母亲内分泌性等疾病。各新生儿组性别、分娩方式、胎龄比较, 差异无统计学意义 (P > 0.05) , 具有可比性。 本研究经医院伦理委员会通过, 并经家属同意签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集观察组与对照组均于生后24 h内取静脉血5 m L, 室温静置2 h离心 (3000 r/min, 10 min, 离心半径10 cm) , 分离血清, 并分置于Eppendorf管中, -70℃冰箱保存待测。

1.2.2检测方法采用双抗体夹心酶联免疫法测定血清MBP、EPOR、IGF-1含量, 试剂盒购自美国CUSABIO公司, 测量范围分别为0.156~15 μg/L, 47~3000 ng/L, 7.8~500 μg/L。 实验步骤严格按照试剂盒说明书要求进行。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两样本均数比较采用t检验, 多样本均数比较采用单因素方差分析 (one- way ANOVA) 。 MBP、EPOR、IGF-1之间的相关性分析采用Pearson相关, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1足月窒息组患儿与足月新生儿组患儿血清MBP、 EPOR、IGF-1水平的比较

足月窒息组MBP、EPOR血清水平明显高于足月新生儿组, 差异有高度统计学意义 (t = 6.974, P < 0.01; t = 3.541, P < 0.01) ;IGF-1水平窒息组与对照组比较显著降低, 差异有高度统计学意义 (t = 7.529, P < 0.01) 。 见表1。

注:MBP:髓鞘碱性蛋白;EPOR:促红细胞生成素受体;IGF-1:胰岛素样生长因子-1

2.2足月窒息组各亚组 (轻、中、重) 患儿血清MBP、E POR、IGF-1水平比较

重度窒息组血清MBP、EPOR水平明显高于轻、 中度窒息组 (P < 0.01) , 中度窒息组血清MBP、EPOR水平高于轻度窒息组 (P < 0.01、P < 0.05) 。 轻度窒息组血清IGF-1水平高于中、重度窒息组 (P < 0.05、P < 0.01) , 且中度窒息组血清IGF-1水平显著高于重度窒息组 (P < 0.01) 。 见表2。

2.3早产窒息组与早产儿组患儿血清MBP、EPOR、 IGF-1水平比较

早产窒息组MBP、EPOR血清水平明显高于早产儿组, 差异有高度统计学意义 (t = 7.676, P < 0.01;t = 4.995, P < 0.01) , IGF-1较早产儿组显著降低, 差异有高度统计学意义 (t = 8.262, P < 0.01) 。 见表3。

注: 与中度组比较, t = -6.648, aP < 0.01;t = -2.599, bP < 0.05;t = 2.070, cP < 0.05。 与重度组比较, t = -13.202, dP < 0.01;t = -7.029, gP < 0.01;t = 7.574, fP < 0.01;t = 11.325, gP < 0.01;t = 6.010, kP < 0.01; MBP:髓鞘碱性蛋白;EPOR:促红细胞生成素受体;IGF-1:胰岛素样生长因子-1

注:MBP:髓鞘碱性蛋白;EPOR:促红细胞生成素受体;IGF-1:胰岛素样生长因子-1

2.4早产窒息组各亚组 (轻、中、重) 患儿血清MBP、E- POR、IGF-1水平比较

重度窒息组血清MBP、EPOR水平高于轻、 中度窒息组, 差异有统计学意义 (P < 0.01或P < 0.05) ;中度窒息组血清MBP、EPOR水平较轻度窒息组血清MBP、EPOR水平明显升高 (P < 0.01) 。 轻度窒息组血清IGF-1水平高于中、重度窒息组 (P < 0.01或P < 0.05) , 中度窒息组血清IGF-1水平显著高于重度窒息组 (P < 0.01) 。 见表4。

注: 与中度组比较, t = 4.892, aP < 0.01;t = 3.863, bP < 0.01;t = 4.855, cP < 0.01。 与重度组比较, t = 5.830, dP < 0.01;t = 4.937, eP < 0.01;t = 7.592, fP < 0.01;t = 3.214, gP < 0.01;t = 2.733, hP < 0.05;t = 2.937, kP < 0.05;IGF-1;MBP: 髓鞘碱性蛋白;EPOR: 促红细胞生成素受体;IGF-1:胰岛素样生长因子-1

2.5相关性分析

对血清MBP、EPOR、IGF-1水平进行相关性分析, IGF-1与MBP、EPOR呈明显的负相关 (r = -0.694, P < 0.01;r = -0.489, P < 0.01) , MBP与EPOR呈明显的正相关 (r = 0.687, P < 0.01) 。 从三种因子的相关性关系可以看出随血清IGF-1降低, MBP及EPOR均升高, 但二者升高的幅度不一致。

3讨论

很多研究已经证明缺氧缺血引起的迟发性脑损伤以细胞凋亡为主, 通常自缺氧缺血后6~12 h开始。 在发生缺血缺氧的病理过程中, 如果及时恢复血流可避免神经细胞死亡。 但是在长时间的严重缺血缺氧后恢复血流反而加剧其损伤程度[4], 可见及时发现窒息的存在并早期评估其窒息程度非常重要。 围生期窒息引起的新生儿缺氧缺血性脑病 (HIE) 是儿科常见病多发病, 也是儿童时期如脑瘫、智力障碍、癫痫等的常见原因之一, 给社会和家庭带来沉重的负担, 同时也降低了国民素质。 HIE逐渐成为近年来国内外研究的热点, 尤其在早期血清学的检测上。 现在研究较多的是MBP、NSE等, 可作为判断中枢神经系统破坏程度的指标, 对判断病情严重程度和预后及指导治疗有重要意义。窒息新生儿产后12 h血清NSE升高, 第1、3天仍维持较高水平, 轻度HIE患儿7 d后恢复正常, 而中重度HIE患儿7 d后仍保持较高水平[5]。 本实验通过免疫酶联反应检测EPOR血清水平旨在寻找一种较NSE敏感或可弥补NSE的潜在缺陷的检测指标。 Nagdyman等[6]研究发现, 窒息后24 h内血清NSE水平不能预测窒息新生儿的长期预后且存在一定的假阳性率[3]。 张志敏等[7]通过结扎足月妊娠待产母鼠双侧子宫动脉制作宫内窘迫大鼠模型, 发现新生大鼠脑组织内EPOR蛋白及m RNA在生后2 h内即迅速增加, 且3 d内持续增加, 7 d仍维持较高水平。 EPOR联合MBP、IGF-1的血清水平, 可能对于辅助诊断新生儿脑损伤具有一定的临床意义。

EPOR在脑内不仅表达于神经细胞而且表达于非神经细胞, 介导促红细胞生成素 (EPO) 的神经保护作用及抗凋亡作用。 EPOR表达缺乏的鼠可以因选择性表达的EPOR而免受缺氧脑损伤, 但是此种EPOR由造血组织控制表达而不是大脑的神经组织[8]。用NO培养神经细胞可诱导EPOR的表达, 即使在没有外源性EPO存在的情况下, 仍然可以发挥其神经保护作用, 使得神经细胞免受缺氧损害[9]。 本研究发现围生期发生窒息的患儿生后24 h内血清EPOR水平较正常足月儿升高, 这与Spandou等[10]、Chen等[11]报道的发生缺血缺氧时EPOR蛋白表达增加相同。 不少实验研究[12,13,14,15]均表明, 重型颅脑损伤患者血清及脑脊液中E- POR的浓度较对照组明显升高, 血清EPOR浓度在24 h升至高峰, 7 d EPOR浓度下降不明显, 仍维持在较高水平。 这说明成人与新生儿一样颅脑损伤后EPOR的表达均增加, 国外有研究证明神经祖细胞较发育成熟的神经细胞EPOR的表达水平明显升高[16], 但不能排除其他组织损伤引起的EPOR升高。 组织、 脑脊液以及血清中EPOR的检测水平在发生缺血缺氧后可能存在一定程度的一致性尚需进一步研究。

IGF-1是一组具有生长激素样促生长作用、又具有胰岛素样调节代谢功能的蛋白。近年来发现IGF-1在中枢神经系统疾病中起重要作用[17], 与新生儿窒息病理过程、HIE发病机制均密切相关。有研究发现胎鼠发育成成年鼠的各个阶段脑组织中都可检测到IGF-1且明显高于成年鼠[18]。本实验中, 血清IGF-1在足月窒息组较足月新生儿组低, 早产窒息组较早产新生儿组低, 这与奚宝珊等[19]、Satar等[20]、Gazzolo等[21]报道相似。MBP是髓鞘蛋白的主要成分之一, 在髓鞘的形成中起着重要作用, 并维持中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定。生理状态下, 脑组织MBP的含量很低, 一般很难测出, 当脑损伤病变累及髓鞘时, MBP可释放入脑脊液和血液中, 导致其含量升高, 故MBP含量变化能特异地反映髓鞘脱失程度进而反映神经组织病损程度, 是中枢神经系统损害和急性脱髓鞘的有效生化指标[22]。本实验研究表明相同胎龄有窒息病史的患儿较同胎龄正常儿MBP、EPOR升高, IGF-1降低, 且差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。国外有研究发现EPO及其受体 (EPOR) 在胚胎和中枢神经系统有表达, 但胎龄越小其在中枢神经系统内表达水平越低[23]。这与本文检测结果相同。早产儿脑损伤主要表现为脑白质损害。早产儿由于其特殊的解剖生理结构, 其脑损伤临床表现与足月儿有很大差别, 在病因、发病机制、神经生理学等方面也有很大不同。新生儿尤其是早产儿血脑屏障发育不完善, 这些均可能成为早产儿MBP、EPOR高于足月儿, IGF-1较足月儿有所降低的原因[24,25,26,27]。也有研究表明低体重儿较正常出生体重儿IGF-1低或小于胎龄儿较适于胎龄儿IGF-1低[28]。本文的不足之处在于没有动态观测三个检测指标的血清水平, 在不同时间点其三者之间是否具有一定的规律性可循, 血清、脑脊液以及蛋白表达水平上三者是否也具有IGF-1与MBP、E-POR呈现负相关, MBP与EPOR呈现正相关的关系, 尚需进一步研究。

胰岛样细胞 篇4

1材料与方法

1.1实验动物与分组

清洁级雄性SD大鼠32只,体重180~220 g,由郑州大学实验动物学部提供[批号SYXK(豫)2005- 0012]。分为假手术组(8只)、UUO模型组(12只)和依那普利组(12只)。UUO模型的制备:10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后,打开腹腔,分离左输尿管,结扎并离断输尿管;假手术组只分离输尿管。每组大鼠于UUO后第14天处死,留取梗阻侧肾组织备用。依那普利组自术前24 h开始给予依那普利10 mg/(kg·d)灌胃,直至造模后第14天;UUO模型组和假手术组只给同量生理盐水灌胃。

1.2主要材料

马来酸依那普利购自江苏扬子江制药股份有限公司,总RNA提取试剂盒(Rneasy Mini Kit试剂盒) 购自美国Qiangen公司,逆转录试剂盒购自美国Promega公司,实时定量逆转录- 聚合酶链反应(meal time-q PCR,RT-q PCR)试剂盒(q-PCR Mix- ture) 购自日本Ta Ka Ra公司,荧光探针实时定量PCR仪(ABI 7900HT)购自美国Applied Biosystems公司,RT-q PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成,鼠抗IGF-1单克隆抗体、鼠抗 α-SMA单克隆抗体和鼠抗E-cadherin多克隆抗体购自美国Abcam公司,鼠抗 β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司,二抗购自美国Sigma公司,增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显色液购自美国Pierce公司。

1.3观察指标及检测方法

1.3.1肾脏组织苏木精- 伊红染色(hema- toxylin-eosin staining,HE) 肾组织以4%多聚甲醛固定,常规包埋、切片,HE染色观察肾组织病理变化,每张标本低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野,依据肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化及间质炎症细胞浸润8项指标来观察肾间质病理改变并进行肾小管间质损伤指数评分[4]。

1.3.2肾脏组织Masson染色肾组织以4%多聚甲醛固定,常规包埋、切片,Masson染色观察肾组织胶原沉积,每例切片低倍镜下观察10个互不重叠的肾小管间质视野,计算每张切片肾间质Masson染色阳性面积占整个视野百分比作为肾间质胶原含量的半定量分析[5]。计分标准如下:0分为无着色;1分为轻度,阳性面积<10%;2分为中度,阳性面积占11%~ 25%;3分为重度,阳性面积占26%~50%;4分为极重度,阳性面积占>50%。

1.3.3 IGF-1的RT-q PCR检测1组织总RNA提取:按Rneasy Mini Kit试剂盒说明书操作,提取组织总RNA,具体步骤如下:取30 mg组织研碎,加入Buffer RLT(600μl),裂解匀浆,室温12 000 r/min离心3 min,取上清液,加等体积70%的乙醇。取700μl到Rneasy spin柱中,室温10 000 r/min离心30 s。加入Buffer RW1(700μl),室温10 000 r/min离心30 s。加入Buffer RPE(500μl),室温10 000 r/min离心30 s。加入Buffer RPE(500μl),室温10 000 r/min离心30 min。加入适量40μl Rnase-free water,室温10 000 r/min离心1 min。抽提的总RNA用紫外分光光度计测光密度值(optical density,OD),比值为1.9~ 2.0。取3μl RNA用1%琼脂糖凝胶电泳,可见5、 18和28 S 3条清晰的RNA带,提示RNA无污染和降解。2c DNA合成:用逆转录试剂盒合成c DNA,再以该c DNA为模板进行RT-q PCR反应操作。RT- q PCR的引物序列如下,β-actin正向引物:5'-GGCC AACCGTGAAAAGATGA-3',反向引物:5'-GACCAG AGGCATACAGGGACAA-3';IGF-1正向引物:5'-C TTTGCGGGGCTGAGCTGGT-3',反向引物5'-CTTCA GCGGAGCACAGTAGA-3'。 3 RT-q PCR检测:在ABI 7900HT荧光探针实时定量PCR仪上进行扩增,96孔板加样,设计复孔和标准曲线,用Se-quence Detection System软件分析各检测样本的循环阈值(cycle threshold,Ct)值(达到一定荧光阈值的循环数),计算2-ΔΔCt,评价IGF-1 m RNA在肾组织中的表达水平。

1.3.4肾组织IGF-1、α-SMA和E-cadherin蛋白的Western blot检测1肾皮质总蛋白质的提取: 取组织块100 mg加入组织总蛋白提取液1 ml匀浆, 冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min离心15 min,取上清液,按Bio-rad蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量分析,取80μl上清液加5×变性缓冲液20μl混匀,100℃下变性10 min。2免疫印迹检测:灌制10%的分离胶和4%的堆积胶,取总蛋白100μg行上样电泳,电泳结束后260 m A电转印90 min至PVDF膜。封闭液(5%牛奶)摇床上封闭2 h,分别加入鼠抗IGF-1单克隆抗体(1∶200)、鼠 α-SMA单克隆抗体(1∶100)和鼠抗E-cadherin多克隆抗体(1∶200),4℃摇床过夜。洗膜后再加相应的二抗,室温孵育1 h,加ECL液后显影、定影,以 β-actin为内参照。将胶片扫描后,采用Quantity One软件分析各条带灰度值,将各目的条带灰度值除以同一标本内参照 β-actin条带灰度值得到比值,将该比值除以同一胶片上假手术组的比值作为该目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用单因素方差分析(One-way,ANOVA),以P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肾脏组织病理改变

2.1.1 HE染色假手术组肾脏未见明显病变,模型组UUO术后第14天,大体观肾皮质变薄,镜下见肾小管上皮细胞空泡变性及炎症细胞浸润,部分小管萎缩,远曲小管、集合管呈囊状扩张,间质可见成纤维细胞增殖和纤维化。依那普利组术后第14天,炎症细胞浸润明显减轻,肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、萎缩、间质纤维化程度较模型组明显减轻。对HE染色进行肾间质损伤指数评分,UUO术后第14天模型组肾间质损伤指数评分(8.68± 1.03)明显大于假手术组[(1.45±0.6)(P =0.000)];经依那普利治疗后,依那普利治疗组评分(7.37±1.22)明显小于模型组(8.68±1.03)(P =0.006)。见图1。

2.1.2 Masson染色普通光学显微镜下观察肾组织Masson染色切片。假手术组肾小球基底膜、肾小管基底膜及系膜基质染成绿色,肾间质无明显胶原纤维;模型组肾间质可见大量染成绿色的胶原纤维;依那普利组肾间质可见少量染成绿色的胶原纤维。对Masson染色进行肾间质胶原相对面积评分,UUO术后第14天模型组肾间质胶原相对面积评分(2.46± 0.16)明显大于假手术组(0.03±0.01)(P =0.000);经依那普利治疗后,依那普利组评分(1.54±0.10)明显小于模型组(2.46±0.16)(P =0.013)。见图2。

2.2 RT-q PCR

UUO术后第14天,模型组梗阻侧肾组织IGF-1 m RNA的表达(0.59±0.13)较假手术组(1.00±0.10) 减少(P =0.030);依那普利组肾组织IGF-1 m RNA的表达(0.83±0.21)较模型组(0.59±0.13)增加(P = 0.172)。见图3。

2.3 Western blot检测

与假手术组大鼠比较,模型组UUO术后第14天IGF-1、α-SMA蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达减少;依那普利组肾组织IGF-1、α-SMA蛋白表达较模型组减少,E-cadherin蛋白表达较模型组增加,差异有统计学意义(P <0.05)。见图4~7。

3讨论

IGF-1是肾脏正常生长所需的一种重要生长因子,IGF-1参与肾脏的发育、肾小管水钠的重吸收、调节肾小球滤过屏障和肾脏内分泌等多种功能。IGF-1生物学行为是通过其受体(IGF-1R) 介导的,而IGF-1与受体间的相互作用通过胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs)来调节。对糖尿病肾病的研究发现,生长激素/ 胰岛素样生长因子-1/ 胰岛素样生长因子结合蛋白(GH/IGF-1/IGFBPs)是糖尿病肾病发生的一个重要因素。

UUO是以进行性肾小管- 间质纤维化为特征的实验性肾病模型,在此过程中,RAS起重要作用[6]。那么UUO术后肾脏局部RAS系统的激活与GH/IGF-1/ IGFBPs轴有无关联,IGF-1对EMT有无影响,本实验将对此进行探讨。

本实验结果显示,伴随着肾组织IGF-1水平增加,EMT增加,IGF-1 m RNA表达并没有增加。进一步说明UUO术后肾脏本身并未过量生成IGF-1,肾组织IGF-1蛋白表达的增加可能是循环血中IGF-1水平提高或肾脏局部IGFBPs表达增加而致IGF-1在肾脏聚集所致。本结果暗示,UUO术后肾间质纤维化组织同样存在GH/IGF-1/IGFBPs轴的反馈调节, 局部IGF-1蛋白或IGFBPs表达增加反馈抑制肾组织IGF-1 m RNA的表达。本结果与HAN等[7]在糖尿病肾病大鼠中的研究一致。依那普利组大鼠肾组织间质纤维化程度较模型组明显减轻,肾组织IGF-1、 α-SMA蛋白表达减少,E-cadherin蛋白表达较模型组增加,IGF-1 m RNA表达较模型组增加。说明ACEI通过抑制RAS系统,减少肾组织IGF-1蛋白的表达, 减少EMT,并且改善肾组织IGF-1 m RNA表达的反馈抑制。

UUO术后,肾组织局部IGF-1表达与肾脏局部RAS系统有密切联系。研究发现,IGF-1能通过有丝分裂原激活的蛋白激酶途径上调血管紧张素Ⅱ受体基因的表达[8]。IGF-1能促进培养的血管平滑肌细胞中血管紧张素的合成。ONDER等[9]发现,原发性高血压患者联合用ACEI可提高IGFBP-3水平,降低循环血中IGF-1水平,该研究结果与本实验的结果一致。UUO早期的血流动力学改变可引起局部和循环血管紧张素Ⅱ水平的升高,进而促使促纤维化因子[如转化生长因子-β1(transforming growth fac- tor-β1,TGF-β1)、结缔组织生长因子、肿瘤坏死因子-α 和核因子 κB等]表达水平上调[10,11]。在UUO模型中,IGF-1和血管紧张素Ⅱ对肾间质纤维化的影响到底谁互为因果,还需要进一步实验证实。

在前期研究中,笔者发现依那普利能抑制TGF- β1/Smads通路的活化,进而抑制EMT[12,13]。IGF-1和TGF-β1对肾间质纤维化的影响存在不同的信号通路,IGF-1主要通过Akt和GSK-3β 磷酸化信号通路,而TGF-β1主要通过Smads和Erk1/2信号通路。 对糖尿病肾病而言,TGF-β1和IGF-1的过度表达是糖尿病肾病病理生理机制的重要环节。本研究发现,对UUO模型而言,IGF-1的过度表达同样参与EMT致肾间质纤维化的病理过程。尽管涉及不同的信号通路,TGF-β1信号通路与IGF-1信号通路在纤维化形成中仍存在广泛的交联对话。UUO模型中, 在肾脏局部RAS系统激活的前提下,IGF-1及GH/ IGF-1/IGFBPs轴的反馈调节参与肾间质纤维化的发生、发展。RAS抑制剂依那普利能通过抑制RAS系统的激活,调节肾脏局部GH/IGF-1/IGFBPs轴,进而抑制肾组织IGF-1的过表达,减轻EMT和肾间质纤维化。

胰岛样细胞 篇5

研究证实, 血液中的IGF-1主要由肝脏分泌。肝脏产生的IGF-1进入血液, 与血液中IGF-1结合蛋白结合, 然后运输到肌肉、骨骼等靶器官上, 发挥其生物学效力。IGF-1的这种作用方式类似于内分泌方式, 被称为内分泌作用。体内很多组织也可以合成IGF-1, 所合成的IGF-1并不进入血液循环, 而是直接在该组织发挥生物学作用, 这种作用方式称为旁分泌或自分泌作用。IGF-1的两种作用方式都同样重要, 不同组织器官中IGF-1两种来源的比例可能不同。IGF-2又称生长调节素A, 是目前所知功能最复杂多样的生长因子, 在啮齿动物中是促进细胞有丝分裂的主要生长因子。不同的组织, 不同的发育时期, IGF-1与IGF-2的作用及水平有相当大的差异。IGF-2的血液浓度在动物胎儿期较高, 是胚胎和胎儿的主要生长因子, 出生后IGF-1的浓度急剧上升, 所以可以推测IGF-2调节出生前生长, IGF-1调节出生后的生长和发育[4]。

1 IGF-1的基因结构和特点

IGF-1基因的保守性非常高, 如大鼠与小鼠间只有一个碱基的差异, 二者与人类分别有3个和4个碱基的差异。该基因包含多个外显子, 啮齿类动物和人类IGF-1基因均由6个外显子组成, 外显子1和2为先导外显子, 包含多个转录起始位点, 能够编码不同的5′-非编码区以及不同的信号肽。

选择性剪接和选择性多聚腺苷酸化是两种常见的真核生物前体m RNA转录后的加工方式, 其结果是从一个前体m RNA产生出不同的成熟m RNA。IGF-1基因的转录具有上述特点, 另外还由于多个转录起始位点的选择性应用, 使得IGF-1基因转录产生多个3′和5′端序列不同的转录物, 再由这些m R-NA翻译出具有不同的信号肽和不同E肽的IGF-1前体, 随后经过剪切加工去除信号肽和E肽, 产生成熟IGF-1[5,6]。

肝源内分泌型IGF-1主要由外显子2起始转录 (又称Class2型转录) , 三个起始位点效率最高的是起始位点2, 由该外显子起始的转录受到生长素GH调控, 尤其在GH依赖的生长发育过程中, GH通过外显子2诱导IGF-1的表达, 构成GH-IGF-1生长调节轴, 对生长发育起重要的调控作用。在局部组织中, 如肌肉、骨骼、神经, 可以通过自分泌或旁分泌的方式产生IGF-1, 这条途径主要由外显子1起始转录 (又称Classl型转录) 。

2 IGF-1的分子结构与特点

IGF-1是生长激素发挥促生长作用的重要调节因子。生长激素具有促进体内蛋白沉积、骨骼生长等功能, 但生长激素的这些功能不是直接的, 而是间接地通过IGF-1作用的结果。由于IGF-1介导的生长激素促进生长作用, 故也称其为生长介素C (SM-C) 。

人的IGF-1分子量为7 649道尔顿为一种HG依赖性的碱性蛋白, 等电点8.6, 内有3个二硫键, 在其组成的70个氨基酸中有48%的氨基酸序列与人的胰岛素前体具有同源性。IGF-1的结构明显类似于胰岛素原, 其分子具有A链和B链间由二硫键连接, 也存在一条连接肽 (C肽) , IGF-1的C肽较胰岛素短, C肽的结构不随生物种属而变异。不仅一级结构, IGF-1的三级结构也与胰岛素相似, 结构中的二硫键可被还原酶降解, 硫氧还蛋白对IGF-1可产生与胰岛素相同的降解作用, 即在NADH存在下, 可迅速地将二硫键还原。目前, 已从不同家畜体组织中分离纯化了IGF-1, 对其性质进行了比较, IGF-1在进化上相当保守。

3 IGF-1的生理功能

3.1 IGF-1与生长发育

生长激素是控制动物整体生长的最重要激素之一, 它具有促进体内蛋白质沉积、骨骼增长和限制脂肪组织增大的功能。生长激素的作用并不是直接的, 而是通过IGF-1的作用的结果, 但这种间接作用的机理尚不清楚。任何肌肉的发育都受到其所附着的骨的限制, IGF-1透过其对于骨中软骨细胞的作用而首先被辨认出来, 已证明IGF-1可刺激软骨细胞的增殖和代谢。IGF-1能激活RNA聚合酶等活性, 促进非组蛋白的磷酸化, 增加m RNA水平, 从而刺激RNA和DNA的合成, 促进细胞的生长和分化。另外, 还证实IGF-1能有效刺激肌肉中卫星细胞的增长[7]。IGF-I能刺激在无血清液体中培养的细胞增殖, 包括各种纤维母细胞、成肌细胞、平滑肌细胞、软骨细胞等。在细胞培养液中一般加入血清就是由于血清中含有IGF-1。

3.2 IGF-1与代谢作用

早期的研究表明蛋白性营养不良的患者总是伴随着低水平的IGF-1。同样体外培养的肝细胞, 在氨基酸浓度只有正常20%的条件下培养, IGF-1的表达量只有正常对照的一半。有证据表明, IGF-1能显著改变正常人机体成分的分布, 包括脂肪减少、肌肉比重增高、体重增加等。IGF-1在低浓度尚未影响到糖代谢时, 就已对蛋白代谢产生了作用。因此, 血清IGF-1水平可以反映机体氮平衡的变化。目前, 血清IGF-1的测定已被作为了解蛋白能量代谢的一个重要指标应用于临床。

GH、IGF-1除能维持人体正常的生长发育外, 还与脂质代谢有关。1989年, Salomom[8]等发现, GH缺乏的患者, 血清胆固醇 (TC) 水平明显升高, 经补充GH之后, 血清TC又显著降低。该研究提示, GH可以调节TC的代谢。随后认识到, 除了GH本身的作用以外, IGF-1的参与可能也是一个重要原因。动物实验证实, IGF-1能明显降低血清TC水平。给健康人补充IGF-1, 血浆脂蛋白LP (a) 、TC、甘油三酯均明显下降。IGF-1对脂代谢的调节, 可能是其综合作用的结果。目前研究最多的是IGF-1和LDL受体的关系。几乎所有的哺乳动物细胞表面都有LDL受体, LDL受体的数量及活性直接影响胆固醇的代谢。

4 IGF-1与临床应用

自上世纪70年代以来, 人们对多种自身免疫性糖尿病动物模型的免疫异常进行了大量研究。1988年, Serreze[9]等就发现肥胖糖尿病 (NOD) 小鼠存在Ts细胞功能缺陷, 并且表明其原因与白介素2减少有关。Ts功能正常又为调节机体“自身”胰岛B细胞抗原 (如表面抗原、胞浆抗原、谷氨酸脱羧酶等) 表达所必需。I型糖尿病患者体内也普遍存在Ts活性的下降。Ts三活性缺陷导致CD4+/CD8+平衡破坏, CD4+介导的免疫反应相应增强, 激发机体免疫系统对B细胞上抗原的反应失控, 以致B细胞大量损坏, 产生糖尿病。I型糖尿病发病后, 长期的胰岛素缺乏可引起胸腺萎缩, 皮髓质宽度和淋巴细胞数量显著下降, 皮髓交界不清, 且有髓质纤维化。而用IGF-1治疗后, 胸腺增大, 组织结构翻转, 皮髓交界变清, 并使CD4+、CD8+T细胞也增加, 同时抑制CD4+细胞的功能, 从而矫正糖尿病的免疫异常。

Kenneth等把IGF-l随机应用于14例重型颅脑损伤病人, 结果表明IGF-1可提高病人的免疫力, 降低伤后全身感染率。Michaelt[10]等认为IGF-1可用来治疗脊髓运动神经元损害疾病, 如脊髓侧束硬化症, 依据是IGF-1可不经血脑屏障而作用于脊髓, IGF-1能防止乙酰胆碱能神经元延伸支配骨骼肌, 逆转或延迟运动神经元的死亡过程。IGF-1作为脑缺血缺氧损伤的保护剂, 对神经元起营养作用已得到关注。同时对IGF-1能否通过血脑屏障的争议可以随着分子生物学技术的应用得到解决。人们设想把IGF-1基因经一定的媒介体导入损伤部位, 高水平表达IGF-1达到治疗作用。

在研究IGF-1临床应用的同时, 人们也注意到了它引起的不良反应和潜在危险。这些副作用包括面和手的水肿、轻度体重增加、呼吸困难、两侧颌骨触痛、关节痛、肌痛、疲劳、心动过速、直立性低血压、注射部位灼痛等。这些副作用常使病人难以忍受痛苦而中止治疗。目前IGF-1的临床应用和可能的潜在危险, 必需通过今后长期临床实际观察获取更多的信息。

5 结语

肉畜、乳用畜的生产与其生长发育、繁殖密切相关, 而生长、发育、繁殖是一个极其复杂的生理过程, 除受到遗传、营养、环境等诸多因素的影响之外, 神经内分泌系统在调节家畜生长发育方面也起到核心的作用, 通过调节内分泌系统的激素水平, 提高动物的生产性能, 已成为畜牧业发展的热点。IGF-1是对动物生长、发育、繁殖与泌乳等密切相关的主要内分泌激素, 对畜牧业的生产具有重要意义。随着重组DNA技术的应用和分子生物学的发展, 相信在不久的将来人们能够设计合成出IGF-1的新型肽变体, 其生物作用更具有选择性, 副作用相对更小, 将为生命科学的进一步发展和人类健康开辟广阔的前景。

参考文献

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[2]李伟, 欧阳潘.HOFMEISTER效应与包涵体的变性和复性.生物技术通讯, 2000 (4) :37-40.

[3]刘建文, 施用晖, 乐国伟.动物生长轴的激素调控.中国饲料, 2003 (14) :7-8.

胰岛样细胞 篇6

1 类胰岛素生长因子1及其受体(IGF-1/IGFIR)

胰岛素样生长因子(IGFs)主要由肝脏产生,是存在于血浆内的一类既有促生长作用,又有胰岛素样作用的多肽,与胰岛素高度同源,空间结构也十分相似[1],已知有胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2(IGF-2)两种类型。IGF-1含70个氨基酸残基,1~29氨基酸段与胰岛素B链相似,42~62个氨基酸段与胰岛素A链相似。IGF-2含67个氨基酸残基,结构与胰岛素原相似。至今测定了多个物种的IGF-1氨基酸序列,各物种间的差异很小,具有高度的保守性,在不同的生物种属之间遗传保守性极高,如人、牛、猪的IGF-1完全相同。IGF-1是骨骼细胞分泌的重要的生长因子,为骨源性生长因子(BDGF)之一,它能以多种形式调节成骨细胞功能、参与骨重建[2]。血液中的IGF-1来源广泛,大部分器官组织都能分泌IGF-1,但IGF-1主要来源于肝脏,这些器官和组织通过自分泌、旁分泌方式分泌IGF-1,然后通过IGF-1调节来发挥生物效应,几乎所有的哺乳动物的细胞都能以自分泌/旁分泌形式分泌IGF-1。这种局部组织旁分泌、自分泌产生的IGF-1,能够在消化道、骨骼、神经等器官及系统的生长、发育和维持方面发挥重要作用。同时IGF-1也是各种组织细胞的有丝分裂原,包括成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等,对成骨细胞有中等促进有丝分裂的作用。

IGFs家族主要包括IGF-1、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IG-FBP)[3]。IGFR是由不同亚基(α、β)通过二硫键连接组成的多聚体,其中α亚基为130 ku,β亚基为95 ku。IGFR具有介导IGF-1的生物学作用,IGFR结构和胰岛素受体相似[4]。现有研究显示,IGFR具有抗调亡和促进细胞生长的作用[5]。IGFBP是IGFs家族中重要的一份子,血液中的IGF-1绝大部分都与IGFBP结合。IGFBP是IGF-1运输和储存的工具。它和IGF-1的高亲和力保护IGF-1不被分解,从而延长IGF-1在机体循环及细胞中的半衰期,降低血液中游离IGF-1浓度,一些动物的游离IGF-1的浓度几乎检测不到。IGFBP通过降低血液中游离IGF-1浓度,从而避免机体受到类似胰岛素过量的负作用,另外有研究显示,IGFBP还能协助IGF-1识别靶细胞,并且IGF-1的活性受IGFBP的调节。

2 IGF-1在GH-IGF生长轴中作用机制的简介

IGF-1是GH-IGF生长轴中的重要调控因子,是GH产生活性的主要介导者,即由垂体分泌的GH刺激合成并释放IGF-1,IGF-1再进一步作用于靶组织而发挥其促进机体生长的效应。IGF-1具有与胰岛素相类似的生物合成代谢的功能[6]。能够提高机体内脂肪、糖原、蛋白质的合成,降低机体内血糖浓度,抑制糖原的分解[7]。IGF-1不仅具有类似胰岛素的代谢活性,而且能够模拟生长激素的生物学效应,对多个器官组织有生物学功能。如173页彩图1所示[8],在GH-IGF轴中,GH先与GHR结合形成配体受体复合物,随后激发一系列生物反应使GH基因表达,再通过信号传递到IGF-1,然后促进IGF-1基因的表达,从而控制IGF-1的合成和释放。IGF-1基因是GH最主要和最重要的目标基因。GH的促生长作用是通过多个组织依赖GH的刺激而产生的IGF-1介导的,GH控制着IGF-1水平,而IGF-1则反馈抑制GH释放。通过这种反馈调节,IGF-1能够在机体内保持一个合理的浓度水平,从而维持机体正常的生长和生理反应,还能使IGF-1更有效地调节糖代谢[9]。在GH-IGF生长轴中,GH处于上游位置,而IGF则处于下游位置。与GH不同的是,IGF-1直接作用于靶细胞,介导GH的生物效应[8]。然而IGF-1同样是需要与IGFR受体结合后才能够发挥其大部分的生物效应,即IGF-1通过IGFR介导发挥广泛的生物学作用[10]。GH与GHBP结合经血液循环至肝脏,与细胞膜表面的GHR结合,启动细胞内的信号转导机制影响生长发育,称为生长轴上游信号传递途径[11]。

IGFs与IGFBP及其受体的结合系统启动细胞内信号传递称为生长轴下游信号传递途径[12]。其作用机理为IGF-1通过IGFBP转运与细胞表面受体结合,通过某种信号转导机制使细胞内某些与能量、蛋白代谢有关的蛋白表达增强,促进细胞能量及蛋白合成增加,并增加葡萄糖转运及磷酸化作用,进而引起细胞合成代谢增强、抑制细胞的凋亡。IGFs在生长轴上的信号转递主要是通过启动2条信号传递锁链,即磷酯酰肌醇-3激酶(PI3-K)激活途径和MAPK激酶激活途径,把有丝分裂和代谢信号传递到细胞核内,从而启动IGFs分泌,促进细胞增殖、分化以及抑制细胞的凋亡。IGF-1与其受体结合后,将首先导致胰岛素底物1(IRS-1)磷酸化,IRS-1被磷酸化后,PI3-K和生长因子结合蛋白2(Grb2)才能够与其结合,由此启动2条信号传递锁链。一条途径是PI3-K被激活并形成磷酸化磷酸肌醇(PIP3),PIP3就是细胞生长的信号,而且PIP3途径是抑制细胞凋亡的最经典途径[13]。另一条途径是激活细胞外信号调节激酶(ERK),ERK把信号传递到细胞核内,有丝分裂过程就启动了[14]。由此可以得出,IGF-1一方面通过增加细胞的有丝分裂,另一方面则抑制细胞的凋亡来促进机体的生长。在体外培养条件下建立的细胞信号传递、诱导细胞凋亡模型中,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Akt)信号途径被认为是IGF-1抑制细胞凋亡的经典途径。IGF-1的生物学功能是促进细胞的生长和增殖,因此IGF-1在细胞有丝分裂中扮演着重要角色,特别是在有丝分裂中的某些阶段起着重要作用。

3 IGF与机体生长发育的关系

国内外大量的研究报道了IGFs对人和动物生长发育过程中的调控作用。这些作用主要通过对肌肉、骨骼、消化道及神经系统的调控而影响机体的生长与发育。

3.1 IGF对机体生长的影响

IGF-1是机体生长、发育和代谢的重要调控因子,同时也是GH启动生物活性的主要介导者,是动物生长的直接调节物。研究表明,IGF-1能够激活RNA聚合酶,调节RNA和DNA的合成,能够促进不同类型细胞增殖和分化,从而促进细胞有丝分裂。在机体生长发育过程中,IGF-1可以促进蛋白质的合成,对蛋白质合成的调控主要是提高蛋白质合成中氨基酸的利用率。抑制蛋白质降解,增加机体蛋白质的沉积。蛋白质的生成量与IGF-1的浓度有关。血液中IGF-1的浓度水平能够反应机体内氮平衡的变化。IGF-1有类似胰岛素作用,能够促进组织摄取葡萄糖,刺激糖原合成和抑制糖原的分解,还能够促进蛋白质和脂肪合成,抑制蛋白质和脂肪分解,减少血液中游离脂肪酸和氨基酸浓度[15]。另外,服用外源性IGF-1来增加游离IGF-1的浓度水平,能够引起肌肉氧化酶的增加及抗疲劳性的增强[16]。研究显示,IGF-1对于在体外培养基中培养的猪孤雌细胞也均有增殖作用。在人和动物幼年期,缺少IGF-1将导致幼年期生长缓慢,而对于患有蛋白质营养不良症的儿童,其结果总是伴随着低浓度IGF-1。而且,IGF-1的分泌是与年龄相关的,它的分泌与年龄的增长是相反的[17]。以上研究显示,IGF-1的分泌与机体的生长是密切相关的。因此,随着现代养殖业的发展,已经有部分企业通过检测血液中IGF-1浓度水平来判断饲养动物的生长性能。

3.2 对骨骼的影响

IGF-1是调节骨细胞功能和代谢的重要因子,对骨细胞的生长发育起促进作用。机体内的IGF-1能促进成骨细胞增殖而抑制破骨细胞的活性[18]。另有研究显示,小鼠缺乏IGF-1将导致软骨细胞增殖的减少及骨细胞凋亡的增加。Y.Kasukawa等[19]研究了IGF-1在体内和体外对骨细胞生长发育的影响。结果表明,无论在体内还是体外,IGF-1均能明显促进骨祖细胞的增殖。IGF-1能够刺激胰岛素受体基质蛋白-1(IRS-1)和胰岛素受体基质蛋白-2(IRS-2),受到刺激后两者能够增加骨的合成代谢,加速骨的转换。同时,IGF-1在骨塑形改建过程中扮演着调节因子的角色,它能够刺激成骨前体细胞复制,阻止胶原酶的转录,促进1型胶原和骨基质的合成,增加软骨基质和蛋白质多糖的合成[20]。而胶原蛋白结构和浓度的改变与骨质疏松的发生有密切的关系。由此,血液中IGF-1的缺乏常常引起骨质疏松症。有学者在对骨质疏松症的治疗过程中发现,外源性的提高机体IGF-1浓度,能够一定程度缓解骨质疏松症。此外,IGF-1可以提高人骨髓间充质干细胞(h MSCs)早期成骨基因的表达,而骨髓间充质干细胞能进一步分化为成骨细胞。因此,IGF-1在骨骼生长发育中有重要的意义。在动物生产中,由IGF-1缺乏引发的骨科类疾病,将对饲养动物的生产性能产生严重影响,从而对生产动物的经济性能产生严重损害。一些动物血清中IGF-1水平已经成为检测动物机体健康与否的一个重要指标。通过外源性注射人工合成的IGF-1能够在一定程度上缓解此类疾病。

3.3 对消化道的影响

IGF-1对新生动物消化道的发育有重要作用。动物试验研究发现,用加入IGF-1的代乳品喂养的新生猪,其肠黏膜、胃及其他多个器官的组蛋白、DNA及RNA含量均升高。研究表明,口服治疗剂量IGF-1和IGFBP时,能刺激新生仔猪胃肠道细胞增生,在此过程中,IGF-1则主要参与促进腺管细胞增殖。D.G.Burrin等人在配方乳中添加IGF-1(3.5 mg/kg)饲喂新生仔猪,4 d后发现,与仅饲喂配方乳的仔猪相比,IGF-1能显著增加仔猪小肠重量及小肠绒毛高度。在哺乳动物中,母乳中IGF-1对新生儿肠道的影响较为明显[21]。V.W.Houle等人研究发现,IGF-1在肠道发育的过程中起促进作用,而不同浓度对肠道不同部位发育是存在差异的。研究发现,低剂量IGF-1能提高小肠绒毛刷状缘酶的活性,而较高剂量的IGF-1则刺激小肠组织生长,IGF-1能显著刺激小肠前部刷状缘酶的活性,而对小肠后部刷状缘酶的活性影响较小。另有研究证实,母乳中的IGFs在新生儿胃肠道内可以稳定存在一定时间,并在30 min内保持较高的生物学活性。由此可以推测,这可能与新生儿胃肠道的消化能力尚未完全成熟,对蛋白类物质的消化能力较弱引起的。根据IGF-1对消化道生长发育影响的机制,在幼龄动物的饲料中添加一定剂量的IGF-1,能够提高一定经济效益。因此,IGF-1在养殖业中有一定的指导意义。

3.4 对神经系统发育的影响

研究报道,IGF-1对中枢神经系统具有营养和保护功能,能够促进多种神经细胞的生长、存活、分化,IGF-1还能够减少缺氧、缺血对神经系统的损害。IGF-1通过提高大脑的合成代谢,促进树突胶质细胞的增殖、生长和发育,以及突触形成和髓鞘生成。J.Mao等[22]研究表明,敲除老鼠的IGF-1基因将导致小鼠大脑髓鞘的生产被弱化。IGF-1不但对脊髓运动神经元有营养保护作用外,对外周神经的存活及功能的维系也是必不可少的。IGF-1能促进外周神经的再生。IGF-1能促进轴突延伸和雪旺细胞增殖,明显促进坐骨神经再生[23]。大量试验证实,IGF-1能抑制多种因素导致的神经细胞凋亡。在低钾导致小脑颗粒细胞神经元凋亡影响的试验中,当培养基中加入IGF-1,丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化水平显著升高,细胞死亡率降低,但无IGF-1时,丝氨酸苏氨酸激酶磷酸化水平显著降低,细胞凋亡增加[24]因此,IGF-1通过抑制神经细胞的凋亡,促进神经细胞的生长和增殖来影响神经系统的运作。

3.5 对生殖系统的影响

在动物的生殖过程中,IGF-1也扮演着重要角色。在这个过程中,主要是对动物机体的卵泡发育黄体的发育和退化等方面起着重要的调节作用[22,25]。在正常生理过程中,任何动物的卵泡均能合成IGF-1。正常卵泡中的IGF-1水平比病变的卵泡高。在IGF-1对卵泡发育影响的体外试验中IGF-1有助于猪卵泡颗粒细胞的增殖,降低凋亡,促进卵泡腔的形成[22]。IGF-1对黄体自发性生长过程的调节有重要意义。研究表明,在黄体期,IGF-与IGFBP参与了孕酮的合成和黄体的自然退化IGF-1能够促进卵母细胞发育,并能提高其发育的成熟率。另外,IGF-1还对动物提高泌乳量有促进作用。由此可以看出,IGF-1在机体生殖的过程中起着正相关作用,对提高经济动物的繁殖率有一定的参考用途。

4 展望

胰岛样细胞 篇7

胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 是一种重要的组织生长因子, 具有类胰岛素及促有丝分裂的作用。IGF-1通过与其受体结合产生生物学效应并受IGF-1结合蛋白调节。正常妊娠母血及脐血IGF-1水平均有升高, 而在妊娠合并糖尿病中其变化不同, 提示IGF-1对妊娠糖尿病的发生发展有重要意义[1], 进一步研究IGF-1水平可为临床早期诊断和治疗这些疾病提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2005年10月—2007年8月, 选择3组住院病例: (1) 正常妊娠组30例; (2) 妊娠期糖尿病 (GDM) 组26例; (3) 妊娠合并糖尿病组20例。以上3组患者孕周均在30周以上。孕妇平均年龄28.2±6.0岁, 平均孕龄37.0±2.0周。

1.2 方法

3组孕妇孕周均在30周以上, 无胎儿畸形、胎膜早破, 无服用影响糖代谢的药物史, 孕期行定期产前检查。

1.2.1 胎儿娩出前静脉血测定。

于分娩前或剖宫产术前抽取孕妇肘前静脉血8 ml, 胎儿娩出后立即抽取脐静脉血8 ml, 以上标本用于测定母血中IGF-I水平, 所有血标本分离出血清, -70°C储存待测;IGF-I测定采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) , 试剂盒由美国DSL公司提供, 操作严格按试剂盒说明进行, 批内差异<7%, 批间差异<10%。

1.2.2 空腹抽静脉血:

测定孕妇肾功能 (尿酸、尿素氮、二氧化碳结合力、空腹血糖和尿微量蛋白) 状态。

1.2.3 查看眼底:

了解视网膜病变的程度。糖尿病视网膜病变分期标准:Ⅰ期:微血管瘤或合并小出血点;Ⅱ期:硬性渗出合并Ⅰ期病变;Ⅲ期:棉絮斑合并Ⅰ期或Ⅱ期病变;Ⅳ期:新生血管或并有玻璃体出血;Ⅴ期:纤维血管增殖膜;Ⅵ期:牵拉性视网膜脱离。

1.2.4 胎儿娩出后相关指标的检测。

记录新生儿体重、胎盘重量和身高, 分析母血与脐血IGF-1水平与新生儿各项指标的相关性, 进一步探讨IGF-1与妊娠糖尿病不良妊娠结局的关系。分析IGF-1与肾功能状态、视网膜病变的分级和新生儿体重等的相关性。

1.3 统计学处理

应用微机进行计量资料的方差分析、两样本均数比较的t检验及χ2检验, 两参数的相关性比较, 采用一元性相关回归分析。

2 结果

2.1 3组孕妇血清、脐血清及羊水中IGF-1水平的比较

GDM组母血清IGF-1水平与对照组比较均有显著性差异 (P均<0.05) , 妊娠合并糖尿病组母血清中IGF-1水平与对照组均有极显著性差异 (P均<0.01) , 说明糖尿病程度越重母胎中IGF-1水平越高, 见表1。

2.2 3组间新生儿指标的比较

GDM组新生儿体重、胎盘重量与对照组比较均有显著性差异 (P均<0.05) ;妊娠合并糖尿病组新生儿体重、胎盘重量与对照组均有显著性差异 (P均<0.05) ;说明糖尿病病变程度越重, 胎儿体重和胎盘重量相对加重。在GDM组、妊娠合并糖尿病组中新生儿身长与对照组均无显著性差异 (可能新生儿身长与遗传因素关系密切) , 见表2。

2.3 3组孕妇眼底病变的比较

对照组眼底检查均正常;而GDM组中有5例为糖尿病Ⅰ级眼底, 2例为糖尿病Ⅱ级眼底;妊娠合并糖尿病组中5例为糖尿病Ⅰ级眼底, 4例为糖尿病Ⅱ级眼底, 2例为糖尿病Ⅲ级眼底, 1例为糖尿病Ⅳ级眼底。说明糖尿病严重程度越高, 眼底病变发生率越高, 病变程度亦越重, 见表3。

例

2.4 孕妇肾功能 (尿酸、尿素氮、二氧化碳结合力、空腹血糖及尿微量蛋白) 状态

GDM组血清尿酸、尿素氮、空腹血糖水平与对照组比较均有显著性差异 (P<0.05) , 二氧化碳结合、尿微量蛋白与对照组比较无显著性差异 (P>0.05) ;妊娠合并糖尿病组血清尿酸、空腹血糖水平与对照组比较均有极显著性差异 (P<0.01) , 二氧化碳结合力与对照组比较均有显著性差异 (P<0.05) , 尿素氮、尿微量蛋白与对照组比较无显著性差异 (P>0.05) , 见表4。

2.5 母血IGF-1与新生儿指标、视网膜病变的分级、肾功能状态的相关性分析

2.5.1 GDM组母血中IGF-1水平与新生儿体重 (r=0.352, P<0.01) 、胎盘重量 (r=0.341, P<0.05) 呈正相关性;妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与新生儿体重 (r=0.374, P<0.05) 、胎盘重量 (r=0.362, P<0.05) 呈正相关性。

2.5.2 GDM组母血中IGF-1水平与视网膜病变无相关性;妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与视网膜病变呈正相关性。说明母血中IGF-1水平可能对母亲视网膜病变的发展过程有不同程度的影响。

2.5.3 妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与空腹血糖 (r=0.346, P<0.05) 呈正相关性。

3 讨论

3.1 IGF-1的作用

IGF-1是一类能刺激糖原、脂质、蛋白质合成及碳水化合物代谢, 抑制脂肪降解, 促进细胞增殖和分化的单肽[2], 是与胰岛素结构类似的一类生长因子。母血IGF-1主要由肝脏产生, 不能通过胎盘屏障, 而胎儿循环中的IGF-1来自于胎儿组织及胎盘[3], 以内分泌作用的形式, 增加蛋白质和糖代谢的合成作用, 促进胎儿自身组织的同化过程。IGF-1及其受体广泛分布于全身各组织, 在局部环境中, 通过旁分泌和 (或) 自分泌机制发挥促有丝分裂及合成代谢作用。正常妊娠妇女血循环中, IGF-1水平逐渐增加, 于妊娠末期达到高峰。研究表明, IGF-1可增加细胞外基质的黏连, 刺激滋养层细胞的侵入及迁移, 促进胚胎早期种植。对反刍动物及灵长类动物的研究证明, IGF-1能促进胎儿主要器官、内分泌腺及骨骼成熟, 调节胎儿正常代谢。

3.2 研究结果

本研究结果显示:母血中存在有IGF-1, 不同妊娠状态IGF-1水平不同。GDM组母血中IGF-1水平均较正常孕妇组高, 有显著性差异 (P<0.05) , 妊娠糖尿病组较正常孕妇组高, 有极显著性差异 (P<0.01) , 表明在此3种妊娠状态下胎儿循环中的IGF-1是胎儿生长发育的主要调节因子, 糖尿病程度越重, IGF-1水平越高, 由此可见:胎儿循环中的IGF-1参与GDM或妊娠合并糖尿病的病理生理过程。

3.3 重要提示

Lauszus等[4]通过对45例I型糖尿病妊娠妇女研究证明, 母血IGF-1含量在整个妊娠期稳步增长55%, 并与新生儿体重正相关, 认为巨大儿发生率增加可能是妊娠早期母体循环中高水平IGF-1刺激胎儿过度生长所致。本研究显示:在GDM组和妊娠合并糖尿病组中新生儿身长与对照组均无显著性差异, 说明IGF-1对新生儿的身长无明显影响 (可能遗传因素对新生儿身长的影响更重要) ;GDM组和妊娠合并糖尿病组新生儿体重、胎盘重量与对照组比较均有显著性差异 (P均<0.05) , GDM组和妊娠合并糖尿病组中母血IGF-1水平均与新生儿体重、胎盘重量呈正相关性, 这一结果提示:母血中的IGF-1可能在调节胎儿和胎盘生长发育中起重要作用。

3.4 流行病学提示

糖尿病损害视网膜主要是由于血糖增高, 小血管管壁增厚, 渗透性增大, 使小血管更易变形和渗漏[5]。本研究结果显示:对照组眼底检查均正常;而GDM组中有5例为糖尿病Ⅰ级眼底, 2例为糖尿病Ⅱ级眼底;妊娠合并糖尿病组中有5例为糖尿病Ⅰ级眼底, 4例为糖尿病Ⅱ级眼底, 2例为糖尿病Ⅲ级眼底, 1例为糖尿病Ⅳ级眼底。说明糖尿病严重程度越高, 眼底病变发生率越高, 病变程度亦越重。GDM组和妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与视网膜病变无相关性, 此结果可能与发生眼底病变的病例数量少有关, 在以后的研究中应扩大研究数目, 以便更准确地完成实验结果。妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与视网膜病变呈正相关性, 说明糖尿病视网膜病进展伴随母血IGF-1水平显著升高, 提示高水平IGF-1可能会加速糖尿病视网膜的发生发展, 具体的作用机制有待于进一步研究。

本研究结果显示:该实验组妊娠糖尿病孕妇未发现患有糖尿病肾病患者, 只是不同程度的肾功能改变或受损;另外, 只有妊娠合并糖尿病组母血中IGF-1水平与空腹血糖 (r=0.346, P<0.05) 呈正相关性, 与其他各类肾功能指标无相关性。

总之, 胎儿循环中的IGF-1是胎儿生长发育的主要调节因子, 糖尿病程度越重IGF-1水平越高;胎儿循环中的IGF-1参与了GDM或妊娠合并糖尿病的病理生理过程。糖尿病视网膜病进展伴随母血IGF-1水平显著升高, 提示高水平IGF-1可能会加速糖尿病视网膜的发生发展;母血IGF-1水平的变化与肾功能的改变无关;在孕晚期可以测定母血IGF-1水平来推测脐血或羊水的IGF-1水平, 为监测和治疗妊娠糖尿病提供有效依据, 进一步研究IGF-1水平可为临床早期诊断和治疗这些疾病提供新思路。

参考文献

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[2]樊庆泊, 边旭明, 郎景和.胰岛素生长因子与胎儿发育[J].中华妇产科杂志, 1999, 34:251-253.

[3]WangHS, ChardT.Theroleofinsulin-likegrowthfactor-1andinsulin-like groqth fsctor-binding protein-1in the control of human fetal growth[J].J Endocrinol, 1992, 132:11-19.

[4]Lauszus FF, Klebe JG, Flyvbjerg A, et al.Macrosomia associated with maternal serum insulin-like growth factor-I and II in diabetes pregnancy[J].Obstet Gynecol, 2001, 97 (5) :734-741.